KR100473391B1 - 생리적 특성이 증진된 유산균 분말 및 이의 제조 방법 - Google Patents

생리적 특성이 증진된 유산균 분말 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리적 특성이 증진된 유산균 분말 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 폴리머로 코팅되고, 금속 알기네이트 비드에 포집되어 생리적 특성이 증진된 유산균 분말 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유산균 분말은 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항생물질에 대한 내성이 증진됨으로써 식품, 의약품 및 동물약품 등에 광범위하게 사용될 수 있는 새로운 분말 유산균으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생리적 특성이 증진된 유산균 분말 및 이의 제조 방법{Powder of lactic acid bacteria having improved physiological characteristics and method of preparing the same}
본 발명은 생리적 특성이 증진된 유산균 분말 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 폴리머로 코팅되고, 금속 알기네이트 비드에 포집되어 생리적 특성이 증진된 유산균 분말 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
유산균(lactic acid bacteria)은 인류가 가장 오랫동안 광범위하게 활용하고 있는 미생물 중 하나로서, 발효유 제조, 건강 및 기능성 식품, 정장제, 의약품 및 생균제제로 활용되고 있다. 유산균은 동물의 생장 촉진, 사료 이용효율 증가, 질병에 대한 저항력 증대, 유해세균의 증식 억제, 폐사율 감소 및 부패 독성물질의 생성억제 등의 특징이 있으며, 또한 인간의 장내에 서식하면서 장내 이상발효를 억제하고, 장 기능을 활성화시켜 장 기능 이상을 개선시키는 동시에 섭생활동을 원활하게 유지시키는 역할을 한다. 또한, 유산균은 발효유의 제조, 건강 및 기능성식품, 정장제, 의약품 및 생균제제에 널리 이용되고 있는 매우 중요한 산업용 균주이며, 감염에 대한 저항성, 항암효과, 혈액 내 콜레스테롤 함량의 저하 및 정장 효과와 같은 유익한 작용을 한다고 알려져 있다(Human intestinal microflora in health and disease, Academic Press, 1983, 241∼261; Hentges D. and Hosono A. et al., Agr. Biol. Chem. 1990, 54(7), 1639∼1643). 따라서, 생균제(probiotics)로서의 우수한 특성을 가지는 유산균을 개량, 개발하는 것이 중요한 과제로 부각되고 있다(Klaenhammer T.R., J. Dairy Sci., 1982, 65, 1339∼1349).
유산균은 주로 발효 산물을 이용하는 다른 산업용 미생물과는 달리 생균 자체를 이용하기 때문에 유통 기간 중 생존율의 유지는 매우 중요한 문제이다. 그러나, 유산균은 생균 자체를 이용하기 때문에 경구 섭취시 인체 내의 혹독한 환경, 즉 pH가 3 이하로 내려가는 위장과 소장에서 분비되는 소화효소 및 담즙산에 의해 생육이 저해되어 대장에 도달하는 생균수가 감소할 뿐만 아니라 장내 정착률이 저하된다는 문제점이 지적되고 있다. Roy는 유산균의 생균수에 따른 효능을 보고하였는데, 실제로 현재 시판되고 있는 유산균 발효 우유를 섭취하였을 때 대장에 도달하여 정착하는 유산균의 생균수가 숙주에 유익한 작용을 할 정도의 충분한 양이 되지 못함을 알 수 있다(Roy, J. Dairy Sci., 1990, 73, 1478∼1484). 또한, Berrada 등은 비피더스 발효음료의 제조에 있어서 내산성 보유 균주의 선발이 필요함을 가장 큰 문제점으로 제시하고 있다(Berrada et al., J. Dairy Sci., 1991, 14, 409-413). 이와 같이 유산균은 효용과 가치 면에서 매우 유익한 균임에도 불구하고 상당히 불안정하여 장기간 보관하고 사용하는데 많은 제약이 따르며, 또한 이를 이용한 발효유제품 및 생균제제는 제조과정과 유통기간 중 산소나 산에 의하여 생존율이 크게 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Molder et al, Can. Inst. Food. Sci. Technol., 1990, 39, 900∼907).
유산균은 보통 액상으로 이용되고 있으나, 편의상 또는 장기보존을 위해 분말 형태로 제조하여 이용하기도 한다. 일반적으로 유산균은 동결 건조법 또는 분사 건조법에 의하여 분말 형태로 제조하며, 그 중 동결 건조법은 동결건조용 현탁용액에 미생물을 현탁시켜 동결시킨 후 감압 하에서 건조시키는 방법이다. 그러나, 유산균은 편혐기성이고 주위환경에 매우 민감하기 때문에, 분말 유산균은 저온 및 상온에서 생존율이 저하되어 생균수가 감소하게 된다.
구체적으로, Claude P.C. 등은 동결건조된 유산균의 안정성에 대한 저장온도 및 폴리머의 영향에 대해 연구 결과를 보고하였는데(Claude P.C. et al, Food. Res. Int., 1996, 29, 555∼562), 상기 논문에서 젤라틴으로 코팅된 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)는 20℃에서 저장하여 6 개월 후에는 약 1%, 12개월 후에는 약 0.2%의 생존율을 나타내었다.
Paul B. 등은 단당류(saccharide)를 이용한 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)의 보존 및 안정성에 대해 보고하였는데(Paul B. et al., Cryobiology, 2000, 41, 17∼24), 상기 논문에서 트레할로스(trehalose)로 코팅된 락토바실러스 애시도필러스는 상온(37℃)에서 35일 후 10%의 생존율을 나타내었다.
Kim은 유산균의 캡슐 제조 방법을 보고하였는데(Kim, J. Ind. Microbiol., 1998, 3, 253∼257), 상기 논문에서 카르복실메틸셀룰로오스(carboxylmethylcellulose)로 코팅된 락토바실러스 플란타룸은 32℃ 또는 37℃로 보관할 경우 1 주일만에 생존율이 1% 이하로 급격히 떨어짐을 알 수 있다.
구 등은 알기네이트와 키토산을 사용한 마이크로캡슐화에 의한 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) YIT 9018의 안정성 증진에 관한 방법을 보고하였는데(구 et al., J. Microbiol. Biotechnol., 2001, 11(3), 376∼383), 상기 논문에서 락토바실러스 카제이 YIT 9018의 동결건조시 알기네이트와 키토산을 사용한 마이크로캡슐을 제조하는 방법을 제시하고 있다. 그러나 상기 방법에 의하면, 유산균이 상온에서 21일 경과 후에 최대로 약 30% 밖에 살지 못하는 등 생존율이 매우 낮기 때문에 분말 생균제로 사용하기에는 부적합하다.
상술한 바와 같이, 유산균의 장기보존을 위한 수단으로서 폴리머 코팅이나 알기네이트 포집 기술 등은 이미 알려져 있으나, 그 효과는 매우 크지 않음을 알 수 있다.
한편, 미합중국 특허 제 4,399,2000호에는 배지에 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine)을 첨가함으로써 플라스미드를 가진 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus)를 안정화시키는 방법이 보고되었으나, 상기 방법은 건조시킨 결과를 제시하지 못했으며, 또한 N-아세틸-D-글루코사민이 고가라는 단점이 있다. 또한, 국내특허 제 1997-53312호는 젤라틴으로 코팅된 유산균을 사용하여 위산에 견디고 장내까지의 도달율을 높인 식품류가 보고되었으나, 상기 코팅된 유산균은 인공 위액과 인공 장액에 대한 특이성의 차이가 없이 어떤 환경에서든 10 시간 이상 붕해되지 않음을 실험결과로 보여주고 있으며, 이는 코팅된 유산균이 위나 장의 환경에 따라 민감하게 반응하지 않는 일반적인 코팅에 불과하기 때문인 것으로 사료된다. 따라서 일반적인 알기네이트 비드나 코팅기술을 그대로 적용하는 것은 유산균의 생존율 향상 측면에서 그다지 만족스럽지 못하며 이에 따라 보다 효율적이고 경제적인 유산균 제제의 제조 방법이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하고자 폴리머로 코팅된 유산균이 금속 알기네이트 비드에 포집된 유산균 분말을 제조하였고, 상기 유산균 분말이 유산균의 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항생물질에 대한 내성을 향상시킬 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유산균에 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항생제에 대한 내성을 부여하여 그와 같은 특성이 우수한 분말유산균을 제조하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리머로 코팅된 유산균이 금속 알기네이트 비드에 포집된 유산균 분말을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리머로 코팅된 유산균을 금속 알기네이트 비드에 포집하는 단계를 포함하는 유산균 분말의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 폴리머로 코팅된 유산균이 금속 알기네이트 비드에 포집된 유산균 분말을 포함한다.
본 발명의 유산균 분말은 유산균, 폴리머 및 금속 알기네이트 염으로 구성되며, 이에 더하여 동결보호제를 더 포함할 수 있다.
유산균은 109∼1010 CFU/㎖ 이상으로 농축된 것으로, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비셀라(Weissella) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속의 균주로 이루어진 그룹 중 선택된 1 종 또는 2 종 이상으로 이루어져 있다.
폴리머는 유산균 표면을 코팅하여 생존율을 증가시키는 역할을 하는 것으로, 본 발명에서는 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜, 전분 또는 덱스트란이 사용되며, 그 중 젤라틴 또는 폴리에틸렌글리콜이 바람직하다. 도 4 및 도 5에서 보는 바와 같이, 다양한 종류의 폴리머로 유산균을 코팅하거나 알기네이트 비드만으로 유산균을 포집하여 4℃에서 2 개월 동안 보관한 결과, 젤라틴이나 폴리에틸렌글리콜을 포함한 유산균이 생존율을 유지하는데 가장 우수함을 알 수 있다. 이는 젤라틴이나 폴리에틸렌글리콜이 유산균의 표면에 코팅됨으로써 외부환경에 대한 저항성을 증가시켜 유산균의 생존율이 증가된다.
상기 금속 알기네이트는 금속 알기네이트 비드 형태의 분말 유산균 알긴산금속염과 같은 음이온성 고분자가 금속염의 양이온을 함유하는 염과 반응하는 경우, 가교제로서 작용하여 중합반응을 일으켜 비드를 형성하며, 이와 같이 제조된 금속 알기네이트 비드의 내부에 유산균이 포집됨으로써 유산균의 생존율을 향상시킨다. 또한 본 발명에서는 칼슘염, 나트륨염 또는 스트론튬염이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 칼슘염을 사용한다.
본 발명은 추가로, 동결보호제를 더 포함할 수 있다. 동결보호제는 동결건조시 유산균의 생존율을 증대시키며, 본 발명에서는 탈지유(skim milk) 안정제, 솔비톨 또는 글리세롤이 사용된다.
상기 탈지유 안정제는 탈지유, 수크로스, 아스코스빈산 및 글루탐산으로 이루어져 있다. 구체적으로, 유산균의 생존율을 고려하여, 탈지유 8∼12 중량%, 수크로스 1∼4 중량%, 아스코스빈산 0.3∼0.7 중량% 및 글루탐산 0.3∼0.7 중량%가 바람직하다.
도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이, 상기 농도의 탈지유 안정제가 솔비톨(sorbitol)이나 글리세롤(glycerol) 보다 유산균의 생존율을 유지하는데 더욱 우수함을 알 수 있다.
본 발명의 폴리머로 코팅된 유산균이 금속 알기네이트 비드에 포집된 유산균 분말은 저온 및 상온에서 유산균을 장기간 보존할 수 있다.
도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균 분말은 저온(4℃) 및 상온(30℃)에서 6개월 동안 보관하여도 락토코커스 라피노락티스는 최소 60% 이상, 락토바실러스 플란타룸은 최소 80% 이상의 우수한 생존율을 나타내었다.
본 발명의 폴리머로 코팅된 유산균이 금속 알기네이트 비드에 포집된 유산균 분말은 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항생물질에 대한 내성이 뛰어나므로 인체내에 경구 투여 후 장까지 도달하는데 있어서의 생존율이 종래의 다른 유산균과 비교하였을 때 월등히 뛰어나다(도 8 내지 도 13, 표 2 및 표 3 참조).
또한, 본 발명은 폴리머로 코팅된 유산균을 금속 알기네이트 비드에 포집하는 단계를 포함하는 유산균 분말의 제조방법을 포함한다.
구체적으로, 상기 유산균 분말의 제조방법은
배양 농축된 유산균에 동결보호제를 혼합하는 단계(단계 1),
상기 혼합된 유산균에 폴리머 수용액을 첨가하여 유산균을 코팅하는 단계(단계 2),
상기 코팅된 유산균에 알긴산 수용액을 첨가하는 단계(단계 3),
상기 첨가된 유산균에 금속염을 적하하여 금속 알기네이트 비드를 제조하는 단계(단계 4), 및
상기 금속 알기네이트 비드를 건조하는 단계(단계 5)로 이루어진 유산균 분말의 제조방법을 포함한다.
단계 1은 배양된 유산균을 수집하고, 농축(109∼1010 CFU/㎖)한 후, 동결보호제와 균일하게 혼합한다. 동결보호제는 탈지유 안정제, 솔비톨 또는 글리세롤이 사용된다.
상기 탈지유 안정제는 탈지유 8∼12 중량%, 수크로스 1∼4 중량%, 아스코스빈산 0.3∼0.7 중량% 및 글루탐산 0.3∼0.7 중량%을 혼합하여 제조하며, 바람직하게는 탈지유 10 중량%, 수크로스 2 중량%, 아스코스빈산 0.5 중량% 및 글루탐산 0.5 중량%로 이루어져 있다.
단계 2는 상기 혼합된 유산균에 폴리머 수용액 0.1∼10 중량%를 첨가하고, 균일하게 혼합하여 유산균 표면을 코팅한다. 폴리머는 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜, 전분 또는 덱스트란이 사용되며, 바람직하게는 젤라틴과 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 것이 효율적이다.
단계 3은 상기 코팅된 유산균에 알긴산 수용액 0.5∼2 중량%를 첨가하여 혼합하고,
단계 4는 상기 알긴산 수용액이 첨가된 유산균에 0.01∼1 M의 금속염을 적하하여 금속 알기네이트 비드를 제조한다. 상기 금속염은 칼슘염, 나트륨염 및 스트론튬염으로 이루어진 그룹 중 1 종 이상의 선택된 것을 사용한다.
단계 5는 상기 제조된 금속 알기네이트 비드를 건조하며, 건조 방식은 동결 건조법 또는 분사 건조법을 사용한다. 그 중 동결 건조법은 제조된 금속 알기네이트 비드를 -70℃의 냉동고에서 동결시킨 후, 동결 건조기를 이용하여 감압 상태에서 동결 건조시킨다. 이 때, 압력 및 응집온도는 낮을수록 유리하나, 압력 10 ㎜Hg 및 응집온도 -50℃를 유지시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 금속 알기네이트 비드 형태의 분말 유산균은 알긴산금속염과 같은 음이온성 고분자가 금속염의 양이온을 함유하는 염과 반응하는 경우 가교제로서 작용하여 중합반응을 일으키는 원리에 따라 제조되며, 이 때 첨가되는 폴리에틸렌글리콜이나 젤라틴 등과 같은 폴리머로 유산균 표면을 코팅한 후 상기 코팅된 유산균을 다시 금속알기네이트 비드 형태로 제조함으로써 유산균의 생존율을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유산균 분말을 유효성분으로 함유하는 인체용 정장제 및 생균활성제, 가축용 또는 어류용 생균활성제 및 과채 발효유를 제공한다.
본 발명의 유산균 분말은 독성이 없이 안전하며, 통상적으로 사용되는 공지의 방법을 이용하여 발효유, 인체용 정장제, 가축용 또는 어류용 생균활성제 및 과채 발효유의 원료로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 유산균 분말의 제조 1
본 발명에서는 유산균으로 락토코커스 라피노락티스(수탁번호 : KCTC 3509, ATCC 43920)를 사용하였으며, 표 1에 나타낸 엠알에스(MRS) 액체 배지에 접종한 후 37℃에서 12시간 동안 정치 배양하여 유산균의 농도가 109∼1010 CFU/㎖가 되도록 하였다. 6,000 알피엠(rpm)으로 10분간 원심 분리하여 배양된 유산균을 수집하였으며, 이를 1/10 양의 멸균수나 생리식염수(0.8% 염화나트륨)로 두 번 세척하였다. 유산균의 농도가 1010 CFU/㎖가 되도록 탈지유 안정제를 첨가한 후 교반기를 이용하여 균일하게 교반하였다. 탈지유 안정제를 첨가한 상기 유산균에 각각 폴리에틸렌글리콜(최종농도 10%) 또는 젤라틴(최종농도 10%)을 첨가하여 45분 동안 교반시킨 후 미리 제조된 알긴산(최종농도 1%)을 첨가하여 다시 45분 동안 균일하게 교반시켰다. 페리스타틱 펌프를 이용하여 주사바늘(20 gage)로 상기와 같이 제조된 콜로이드 용액을 0.5 M 염화칼슘 수용액에 떨어뜨려 칼슘 알기네이트 비드를 제조하였다. 상기와 같은 비드의 제조 공정은 도 1에 나타내었다.
엠알에스 배지 조성
성분 농도(g/ℓ)
프로테오스 펩톤 10
우육추출물 10
효모추출물 5
포도당 20
트윈 80 1
구연산암모니움 2
초산나트륨 5
황산마그네슘 0.1
황산망간 0.05
인산나트륨 2
증류수 1 ℓ
<실시예 2> 유산균 분말의 제조 2
락토바실러스 플란타룸(수탁번호 : KCTC 3099, ATCC 8014)을 사용하여, 상기 표 1에 나타낸 엠알에스(MRS) 액체 배지에 접종하여 30℃에서 배양하는 것을 제외하고 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
<실험예 1> 폴리머가 첨가된 알기네이트 비드 내 유산균의 생존율 측정
상기 실시예에서 제조된 알기네이트 비드를 영하 70℃의 냉동고에서 1∼3 시간 동안 동결시킨 후, 동결건조기를 이용하여 10 mmHg의 압력 및 -50℃의 응집온도를 유지시켜 감압 상태에서 10∼16시간 동안 동결건조시켰다. 얻어진 유산균 함유 알기네이트 비드를 멸균된 유리병에 넣고 각각 4℃와 30℃의 항온기에서 보관하면서 2∼3 주 간격으로 500 ㎎씩 채취하였다. 유산균 함유 알기네이트 비드를 10% 수크로오스 용액에서 2시간 동안 현탁한 후 멸균수를 이용하여 연속 희석한 후 엠알에스 평판배지에 도말하고, 30℃에서 16∼20 시간 배양하여 나타난 콜로니 수(Colony Forming Unit, CFU)를 계수하고, 하기 수학식 1을 이용하여 유산균의 생존율을 표시하였다.
상기 식에서, A는 일정한 시간 경과 후 생균수이며, B는 반응 초기의 생균수이다.
그 결과, 도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이, 유산균을 각각 폴리에틸렌글리콜이나 젤라틴과 혼합하여 유산균 표면을 폴리에틸렌글리콜이나 젤라틴으로 코팅하고, 이를 알기네이트에 포집하여 비드 형태로 제조하고, 이와 같이 제조된 폴리머-알기네이트 비드를 동결건조하여 제조된 분말유산균은 저온(4℃) 및 상온(30℃)에서 6개월 동안 보관하여도 락토코커스 라피노락티스는 최소 60% 이상, 락토바실러스 플란타룸은 최소 80% 이상의 우수한 생존율을 갖는 것을 확인하였다.
<실험예 2> 유산균의 내산성 측정
본 발명자들은 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 유산균 분말의 내산성을 조사하고자 하였다. 상기 유산균 분말에 대한 대조군으로는 엠알에스(MRS) 액체 배지에 유산균을 접종하여 30℃에서 12시간 동안 정치 배양하여 유산균의 농도가 109 - 1010 CFU/㎖이 되도록 한 후, 배양된 유산균을 6,000 rpm으로 10분 간 원심 분리하여 수집하고, 이를 멸균수로 두 번 세척하여 회수한 세포를 사용하였다.
내산성 실험은 멸균된 pH 2의 완충용액에 배양세포(대조군)와 유산균 함유 비드 0.5 g을 첨가한 후 30℃ 항온수조에 침지시켜 2시간 동안 방치한 후 멸균수에 일정비율로 희석하여 엠알에스 평판배지에 도말하여 나타난 콜로니 수(colony forming unit, CFU)를 비교함으로써 유산균의 생존율을 표시하였다.
그 결과, 도 8 및 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균 분말은 pH 2의 산도를 가지는 완충용액에서도 락토코커스 라피노락티스의 경우에는 최소 40 내지 50% 이상의 생존율을 보였으며, 락토바실러스 플란타룸의 경우에는 젤라틴으로 코팅한 경우에 40% 이상의 생존율을 보였다. 상기 사실로부터, 탈지유, 폴리에틸렌글리콜 및 젤라틴만을 사용한 비교군 또는 아무것도 사용하지 않은 대조군과 비교하였을 때 본 발명의 유산균 분말이 월등한 생존율을 가지는 것을 확인하였다.
<실험예 3> 유산균의 내담즙성 측정
본 발명의 유산균 분말의 내담즙성을 측정하기 위하여, 먼저 멸균된 담즙산이 300 ㎍/㎖의 농도로 첨가된 용액에 배양세포(대조군)와 유산균 함유 비드 0.5 g을 넣은 후 30℃ 항온수조에 침지시켜 2시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 멸균수에 일정비율로 희석하여 엠알에스 평판배지에 도말한 후 나타난 콜로니 수를 비교하여 유산균의 생존율을 표시하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균 분말은 담즙산을 포함하는 용액에서도 락토코커스 라피노락티스의 경우에는 최소 30 내지 50% 이상의 생존율을 보였으며, 락토바실러스 플란타룸의 경우에는 30% 이상의 생존율을 보였다. 상기 사실로부터, 탈지유, 폴리에틸렌글리콜 및 젤라틴만을 사용한 비교군 또는 아무것도 사용하지 않은 대조군과 비교하였을 때 본 발명의 유산균 분말이 월등한 생존율을 가지는 것을 확인하였다.
<실험예 4> 유산균의 내열성 측정
본 발명의 유산균 분말의 내열성을 측정하기 위하여, 먼저 멸균수에 배양세포(대조군)와 유산균 함유 비드 0.5 g을 첨가한 후 55℃의 항온수조에 침지시켜 2시간 동안 방치하였다. 그 후, 배양액을 멸균수에 일정비율로 희석하여 엠알에스 평판배지에 도말한 후 나타난 콜로니 수를 비교하여 유산균의 생존율을 표시하였다.
그 결과, 도 12 및 도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균 분말은 높은 온도에서도 락토코커스 라피노락티스의 경우에는 최소 10% 이상의 생존율을 보였으며, 락토바실러스 플란타룸의 경우에는 젤라틴으로 코팅한 경우에도 약 10% 정도의 생존율을 보였다. 반면에, 비교군 및 대조군의 경우에는 두 가지 유산균 분말을 사용한 경우 모두 0.1%의 이하의 생존율을 보였다. 상기 사실로부터, 유산균 분말이 높은 온도에서 상대적으로 생존율이 떨어지는 것을 알 수 있으며, 탈지유, 폴리에틸렌글리콜 및 젤라틴만을 사용한 비교군 또는 아무것도 사용하지 않은 대조군과 비교하였을 때 본 발명의 유산균 분말이 월등한 생존율을 가지는 것을 확인하였다.
<실험예 5> 유산균의 항생물질 내성 측정
본 발명의 유산균 분말의 항생물질 내성을 측정하기 위하여, 먼저 비기니아마이신(viginiamycin), 술파티아졸(sulfathiazole), 오레오마이신(aureomycin) 및 네오마이신(neomycin)이 각각 300 ㎍/㎖의 농도로 함유된 용액에 배양세포(대조군)와 유산균 함유 비드를 일정 양 첨가한 후 30℃ 항온수조에 침지시켜 2시간 동안 방치하였다. 그 후 배양액을 멸균수에 일정비율로 희석하여 엠알에스 평판배지에 도말한 후 나타난 콜로니 수를 비교하여 유산균의 생존율을 표시하였다.
락토코커스 라피노락티스의 생존율(%)
항생제 락토코커스 라피노락티스의 생존율(%)
A B C D E F G
비기니아마이신 11.8 15.2 21.6 28.9 27.1 31.5 35.6
술파티아졸 15.0 11.6 28.6 47.5 55.9 85.4 59.7
오레오마이신 7.5 4.9 22.5 47.6 49.8 62.5 70.2
네오마이신 28.1 13.3 18.9 36.5 16.8 52.4 66.6
A ; 대조군, B ; 탈지유 안정제, C ; 폴리에틸렌글리콜,
D ; 젤라틴, E ; 알기네이트 비드,
F ; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트 비드,
G ; 젤라틴 + 알기네이트 비드
락토바실러스 플란타룸의 생존율(%)
항생제 락토바실러스 플란타룸의 생존율(%)
A B C D E F G
비기니아마이신 21.6 23.2 38.6 40.0 42.1 69.8 72.8
술파티아졸 18.5 21.5 24.5 38.8 35.7 28.4 39.7
오레오마이신 4.4 3.4 8.7 13.3 15.4 16.8 15.9
네오마이신 2.7 4.9 5.7 11.9 8.9 7.8 18.8
그 결과, 상기 표 2 및 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유산균 분말은 다양한 종류의 항생물질에 대하여 비교군 및 대조군과 비교하였을 때 월등한 생존율을 가지는 것을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 유산균을 폴리머로 코팅한 후, 알기네이트 비드로 포집하고 동결건조하여 분말제제화한 본 발명의 유산균 분말은 유산균의 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항생물질에 대한 내성을 증진되어 식품, 의약품 및 동물약품 등의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 폴리머가 첨가된 유산균 알기네이트 비드의 제조 공정을 나타낸 개략도이고,
도 2는 본 발명의 동결보호제의 종류에 따른 락토코커스 라피노락티스(Lactococcus raffinolactis, 수탁번호 : KCTC 3509, ATCC 43920)의 생존율을 저온(4 ℃)에서 저장 기간에 따라 보여주는 그래프이고,
●; 탈지유, ■; 탈지유 안정제,
▲; 글리세롤(glycerol), ▼; 솔비톨(sorbitol)
도 3은 본 발명의 동결보호제의 종류에 따른 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum, 수탁번호 : KCTC 3099, ATCC 8014)의 생존율을 저온(4℃)에서 저장 기간에 따라 보여주는 그래프이고,
●; 탈지유, ■; 탈지유 안정제,
▲; 글리세롤(glycerol), ▼; 솔비톨(sorbitol)
도 4는 본 발명의 알기네이트 비드에 포집 또는 코팅 폴리머의 종류에 따른 락토코커스 라피노락티스의 생존율을 저온(4℃)에서 저장 기간에 따라 보여주는 그래프이고,
●; 탈지유 안정제, ■; 탈지유 안정제 + 전분,
▲; 탈지유 안정제 + 폴리에틸렌글리콜,
▼; 탈지유 안정제 + 젤라틴, ◆ ; 탈지유 안정제 + 덱스트란,
○; 탈지유 안정제 + 알기네이트 비드에 포집
도 5는 알기네이트 비드에 포집 또는 코팅 폴리머의 종류에 따른 락토바실러스 플란타룸의 생존율을 저온(4℃)에서 저장 기간에 따라 보여주는 그래프이고,
●; 탈지유 안정제, ■; 탈지유 안정제 + 전분,
▲; 탈지유 안정제 + 폴리에틸렌글리콜,
▼; 탈지유 안정제 + 젤라틴, ◆ ; 탈지유 안정제 + 덱스트란,
○; 탈지유 안정제 + 알기네이트 비드에 포집
도 6은 폴리머 코팅 및 알기네이트 비드로 포집된 락토코커스 라피노락티스의 저장 온도에 따른 생존율을 보여주는 그래프이고,
●; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드(4℃ 보관),
■; 젤라틴 + 알기네이트비드(4℃ 보관),
○; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드(30℃ 보관),
□; 젤라틴 + 알기네이트비드(30℃ 보관)
도 7은 폴리머 코팅 및 알기네이트 비드로 포집된 락토바실러스 플란타룸의 저장 온도에 따른 생존율을 보여주는 그래프이고,
●; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드(4℃ 보관),
■; 젤라틴 + 알기네이트비드(4℃ 보관),
○; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드(30℃ 보관),
□; 젤라틴 + 알기네이트비드(30℃ 보관)
도 8은 본 발명의 동결보호제의 종류에 따른 락토코커스 라피노락티스의 내산성을 보여주는 그래프이고,
□ ; 대조군 ▨ ; 탈지유 안정제,
▧ ; 폴리에틸렌글리콜 ▥ ; 젤라틴,
▤ ; 알기네이트 비드 ▩ ; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드,
▦ ; 젤라틴 + 알기네이트비드 포집
도 9는 본 발명의 동결보호제의 종류에 따른 락토바실러스 플란타룸의 내산성을 보여주는 그래프이고,
□ ; 대조군 ▨ ; 탈지유 안정제,
▧ ; 폴리에틸렌글리콜 ▥ ; 젤라틴,
▤ ; 알기네이트 비드 ▩ ; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드,
▦ ; 젤라틴 + 알기네이트비드 포집
도 10은 본 발명의 동결보호제의 종류에 따른 락토코커스 라피노락티스의 내담즙성을 보여주는 그래프이고,
□ ; 대조군 ▨ ; 탈지유 안정제,
▧ ; 폴리에틸렌글리콜 ▥ ; 젤라틴,
▤ ; 알기네이트 비드 ▩ ; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드,
▦ ; 젤라틴 + 알기네이트비드 포집
도 11은 본 발명의 동결보호제의 종류에 따른 락토바실러스 플란타룸의 내담즙성을 보여주는 그래프이고,
□ ; 대조군 ▨ ; 탈지유 안정제,
▧ ; 폴리에틸렌글리콜 ▥ ; 젤라틴,
▤ ; 알기네이트 비드 ▩ ; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드,
▦ ; 젤라틴 + 알기네이트비드 포집
도 12는 본 발명의 동결보호제의 종류에 따른 락토코커스 라피노락티스의 내열성을 보여주는 그래프이고,
□ ; 대조군 ▨ ; 탈지유 안정제,
▧ ; 폴리에틸렌글리콜 ▥ ; 젤라틴,
▤ ; 알기네이트 비드 ▩ ; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드,
▦ ; 젤라틴 + 알기네이트비드 포집
도 13은 본 발명의 동결보호제의 종류에 따른 락토바실러스 플란타룸의 내열성을 보여주는 그래프이다.
□ ; 대조군 ▨ ; 탈지유 안정제,
▧ ; 폴리에틸렌글리콜 ▥ ; 젤라틴,
▤ ; 알기네이트 비드 ▩ ; 폴리에틸렌글리콜 + 알기네이트비드.
▦ ; 젤라틴 + 알기네이트비드 포집

Claims (15)

  1. 유산균과 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜, 전분 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리머 및 금속 알기네이트 염으로 구성되며, 상기 유산균이 폴리머로 코팅된 후 금속 알기네이트 비드에 포집된 것을 특징으로 하는 경구투여용 유산균 분말.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유산균이 스트렙토코커스 속, 락토코커스 속, 엔테로코커스 속, 락토바실러스 속, 페디오코커스 속, 류코노스톡 속, 비셀라속 및 비피도박테리움 속의 균주로 이루어진 그룹 중 선택된 1 종 또는 2종 혹은 그 이상으로 이루어진 것을 특징으로 하는 유산균 분말.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 금속염이 칼슘염, 나트륨염 및 스트론튬염으로 이루어진 그룹 중 1 종 이상의 선택된 것을 특징으로 하는 유산균 분말.
  5. 유산균, 폴리머, 금속알기네이트 염 및 동결보호제로 구성되며, 상기 유산균이 폴리머로 코팅된 후 금속 알기네이트 비드에 포집된 것을 특징으로 하는 유산균 분말.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 동결보호제가 탈지유 안정제, 솔비톨 및 글리세롤로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유산균 분말.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 탈지유 안정제가 탈지유 8∼12 중량%, 수크로스 1∼4 중량%, 아스코스빈산 0.3∼0.7 중량% 및 글루탐산 0.3∼0.7 중량%으로 이루어진 것을 특징으로 하는 유산균 분말.
  8. 배양 농축된 유산균에 동결보호제를 혼합하는 단계(단계 1),
    상기 혼합된 유산균에 폴리머 수용액을 첨가하여 유산균을 코팅하는 단계(단계 2),
    상기 코팅된 유산균에 알긴산 수용액 첨가하는 단계(단계 3),
    상기 첨가된 유산균에 금속염을 적하하여 금속 알기네이트 비드를 제조하는 단계(단계 4), 및
    상기 알기네이트 비드를 건조하는 단계(단계 5)지는 것을 특징으로 하는 제 1항의 유산균 분말의 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 폴리머 수용액의 농도가 0.1∼10 중량%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 알긴산 수용액의 농도가 0.5∼2 중량%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 8항에 있어서, 상기 금속염의 농도가 0.01∼1 M인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제 8항에 있어서, 상기 건조가 동결 건조 또는 분사 건조에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제 1항의 유산균 분말을 유효성분으로 함유하는 인체용 정장제 및 생균활성제.
  14. 제 1항 유산균 분말을 유효성분으로 함유하는 가축용 또는 어류용 생균활성제.
  15. 삭제
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