KR102289556B1

KR102289556B1 - 이산화 타이타늄 다공성 비드에 유산균이 함침된 유산균-비드 복합체 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR102289556B1
Application number: KR1020200081610A
Authority: KR
Inventors: 최종일; 고창현; 변주연; 박다솜
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2021-08-13

Abstract

본 발명은 유산균이 함침된 다공성 비드 (porous bead)에 관한 것으로서, 구체적으로 유산균이 이산화 타이타늄 (titanium dioxide, TiO₂)으로 이루어진 다공성 비드에 함침되어, 유산균의 환경 스트레스에 대한 안정성을 제공하여, 적은 양의 유산균을 섭취하더라도 보다 높아진 장에서의 생균 활성을 기대할 수 있으며, 위장관을 통과하며 감소하는 유산균의 생존율을 현저히 상승시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

이산화 타이타늄 다공성 비드에 유산균이 함침된 유산균-비드 복합체 및 이의 제조 방법{Lactic acid bacteria-bead complex in which titanium dioxide porous beads are impregnated with lactic acid bacteria and a method for manufacturing the same}

본 발명은 이산화 타이타늄 (titanium dioxide, TiO₂) 비드 (bead)에 유산균이 함침된 유산균-비드 복합체에 관한 것으로서, 구체적으로 이산화 타이타늄 다공성 비드에 유산균이 함침되어 유산균에게 환경 스트레스에 대한 안정성을 제공하여, 위장관을 통과하는 유산균의 생존율을 현저히 상승시킬 수 있는 이산화 타이타늄 다공성 비드에 함침된 유산균-비드 복합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

물질대사에 의해 탄수화물을 젖산으로 분해시키는 후벽균류 세균을 총칭하여 유산균이라고 한다. 유산균의 정의에 적합한 것으로는 락토바실러스 (lactobacillus), 락토코커스 (lactococcus), 류코노스톡 (leuconostoc), 페디오코커스 (pediococcus) 또는 비피도박테리움 (bifidobacterium) 등이 있다.

대부분의 유산균은 산소가 적은 환경에서 잘 발육하여 각종 당으로부터 락트산 (lactic acid)을 생성하는 것일 수 있다. 다만, 영양요구성이 매우 복잡하여 당류 이외에 많은 종류의 아미노산이나 비타민을 요구하거나, 균종이나 균주에 따라 미량 영양소를 요구할 경우에는, 혐기성 환경에서 잘 발육할 수 없을 수 있다.

일부 유산균은 숙주의 창자 등의 소화기관이나 질 안에 있어 병원체의 성장을 억제하고, 콜레스테롤 수치를 감소시키며, 암의 위험 인자를 억제하고 또는 비타민의 합성을 촉진하는 등 다양한 효과를 가지기 때문에, 적절한 양을 섭취하는 경우 숙주에게 유익한 효과를 가져온다. 이러한 장점으로 인하여 유산균은 식품 및 제약 산업을 비롯한 여러 분야에서 널리 사용되고 있다.

일반적으로 유산균을 생균제로 사용하여 경구투여한 경우 위장의 낮은 pH와 담즙산 등으로 인하여 장과 소장 상부에서 사멸될 수 있으므로, 위에서의 낮은 산성도를 극복하고, 각종 소화 효소가 포함된 환경에서 활성이 저하되지 않고 장에 도달하는 것이 큰 과제이다. 즉, 유산균은 장에서 증식하고 정착할 수 있도록 위산과 담즙산에서 살아남아 소장까지 도달하기 위해서 낮은 pH에서 생존할 수 있거나 낮은 pH에 노출되는 것을 방지하는 방법이 필요하다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위한 방법으로 유산균을 담체, 미세캡슐 또는 지지체 등에 물리적으로 고정하는 방법이 고안되었다. 현재 식품업계에서 주로 사용하는 방법 중 하나로는 '캡슐화'가 있으며, 이를 적용한 '닥터캡슐 유산균 요구르트'가 시중에 판매되고 있다. 그러나, 캡슐제 요구르트는 제조 공정이 복잡하고 캡슐이 위에서 쉽게 녹아, 장에 도달할 때까지 유산균의 생균 활성이 유지되지 못한다는 단점이 있다.

따라서, 유산균 관련 기술분야에서는 이러한 장내 환경적 스트레스에 의한 유산균의 생존율 감소를 극복하기 위하여, 보다 안정적인 방안이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 이산화 타이타늄 (titanium dioxide, TiO₂) 다공성 비드 (porous bead)에 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) 유산균이 함침된 유산균-비드 복합체를 제조하여 위장관 모사 환경하에서의 생균 활성을 측정하였다. 그 결과, 이산화 타이타늄 다공성 비드에 함침된 유산균-비드 복합체는 비드에 함침되지 않은 유산균에 비하여, 위장관의 산성 또는 효소적 환경 스트레스에 대한 안정성이 증가하고, 생균 활성을 유지한 채로 장에 도달할 수 있는 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 다음의 단계를 포함하는 유산균-비드 복합체의 제조 방법을 제공하는 것이다:

다공성 비드를 제조하는 제조 단계; 및

유산균을 다공성 비드에 함침시키는 함침 단계.

본 발명의 다른 목적은 이산화 타이타늄 다공성 비드에 유산균이 함침된 유산균-비드 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유산균-비드 복합체를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유산균-비드 복합체를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 다음의 단계를 포함하는 유산균-비드 복합체의 제조 방법에 관한 것이다:

이산화 타이타늄 다공성 비드를 준비하는 준비 단계; 및

유산균을 이산화 타이타늄 다공성 비드에 함침시키는 함침 단계.

본 발명에 있어서 용어 '유산균'은 통상적인 개념으로서 그람 (gram) 양성의 구균 또는 간균을 의미한다. 유산균은 혐기성 발효인 카탈라제 (catalase) 음성이고, 스포어 (spore)를 형성하지 않으며, 대체로 운동성이 없다. 유산균은 유산균 제제로서 장내 미생물의 증가로 발생할 수 있는 소화 불량이나 복부 팽만 등의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서 유산균은 락토바실러스 (Lactobacillus) 속인 락토바실러스 액시도필러스 (L. acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스 (L. bulgaricus), 락토바실러스 델부룩키 (L, delbrueckii), 락토바실러스 락티스 (L. lactis), 락토바실러스 살리바리우스 (L. salivarius), 락토바실러스 카제이 (L. casei), 락토바실러스 호모히오치 (L. homohiochii), 락토바실러스 플랜타룸 (L. plantarum), 락토바실러스 레익카마니 (L. leichmannii), 락토바실러스 자일로수스 (L.xylosus), 락토바실러스 헬베티쿠스 (L. helveticus), 락토바실러스 브레비스 (L. brevis), 락토바실러스 퍼맨툼 (L. fermentum), 락토바실러스 헤테로히오치 (L. heterohiochii), 락토바실러스 부크네리 (L. buchneri) 및 락토바실러스 람노저 (L. lamnosers)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 락토바실러스 카제이일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 유산균은 스트렙토코커스 이스트 (Sterptococcus east), 락토보버스 이스트 (Lactobobbus east), 락토코커스 이스트 (L. east), 스트렙토코커스 살리바리어스 (S. salivarius), 스트렙토코커스 써모필러스 (S. thermophilus), 스트렙토코커스 다이아세타리스 (S. diacetalis) 및 스트렙토코커스 크레모리스 (S. cremoris)로 이루어진 군으로 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 이산화 타이타늄 다공성 비드를 준비하는 준비 단계는 이산화 타이타늄 전구체를 증류수에 적가하여 이산화 타이타늄 침전물을 형성시키는 적가 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 이산화 타이타늄 전구체는 증류수와 반응하여 이산화 타이타늄 (titanium dioxide, TiO₂)이 합성되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 이산화 타이타늄 전구체로는 사염화티타늄 (Titanium(IV) chloride, TiCl₄), 타이타늄 에톡사이드 [Titanium ethoxide, Ti(OCH₂CH₃)₄], 타이타늄 이소프로폭사이드 [Titanium(IV) isopropoxide, Ti(OCH(CH₃)₂)₄], 타이타늄 다이이소프로폭사이드 비스(아세틸아세톤) [Titanium diisopropoxide bis(acetylacetonate), ((CH₃)₂CHO)₂Ti(C₅H₇O₂)₂], 타이타늄(IV) 메톡사이드 [Titanium(IV) methoxide, Ti(OCH₃)₄] 및 타이타늄(IV) 옥시아세틸아세톤 [Titanium(IV) oxyacetylacetonate, Ti(C₅H₇O₂)₂]으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 타이타늄 이소프로폭사이드 [Ti(OCH(CH₃)₂)₄]일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 적가 단계는 점적 (droplets) 또는 분무 방법으로 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 점적 방법으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 점적 방법은 다양한 직경의 주사기, 스포이트 또는 점적 피펫을 사용하여 수행되는 것일 수 있고, 분무 방법은 에어 제트 스프레이 (airjet spray) 또는 공기-분무기 (air-atomizer) 등을 사용하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서 적가 단계는 점적 (droplets) 방식으로 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 적가 단계는 타이타늄 이소프로폭사이드를 2.0 내지 4.0 ml/min, 2.0 내지 3.8 ml/min, 2.0 내지 3.6 ml/min, 2.0 내지 3.4 ml/min, 2.0 내지 3.2 ml/min, 2.0 내지 3.0 ml/min 2.5 내지 4.0 ml/min, 2.5 내지 3.8 ml/min, 2.5 내지 3.6 ml/min, 2.5 내지 3.4 ml/min, 2.5 내지 3.2 ml/min 또는 2.5 내지 3.0 ml/min의 적가 속도로 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 3.0 ml/min의 적가 속도로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 이산화 타이타늄 다공성 비드를 준비하는 준비 단계는 이산화 타이타늄 전구체를 증류수에 적가하여 얻어진 이산화 타이타늄 침전물을 가열 소성하는 소성 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

가열 소성 과정을 하지 않는다면 침전물은 비결정질 구조이므로, 공극 (pore) 구조가 단단하지 못하여 유산균 함침과 같은 물리적 과정에서 쉽게 무너질 수 있다. 특히, 가열 소성 전 침전물의 표면에는 이산화 타이타늄 (TiO₂) 보다 수산기 (-OH)가 많이 존재하기 때문에, 가열 소성 전 침전물을 지지체로 사용하면 실험의 재현성 (reproducibility)이 낮을 수 있다. 따라서 재현성을 높여 신뢰성을 확보하기 위해서는 이산화 타이타늄 다공성 비드의 가열 소성 과정이 필요하다.

본 발명에 있어서 소성 단계는 300 내지 500 ℃, 300 내지 480 ℃, 300 내지 450 ℃, 320 내지 500 ℃, 320 내지 480 ℃, 320 내지 450 ℃, 350 내지 500 ℃, 350 내지 480 ℃ 또는 350 내지 450 ℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 400 ℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 소성 단계는 180 내지 300분, 180 내지 270분, 180 내지 240분, 210 내지 300분, 210 내지 270분, 210 내지 240분 동안 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 210분 동안 수행되는 것일 수 있다.

소성 단계가 500 ℃ 이상의 온도 조건 하에서 장시간 수행되면 이산화 타이타늄 다공성 비드의 결정 구조가 루타일 (rutile) 상으로 전이되어 기공이 붕괴될 수 있으므로, 소성 온도 및 시간의 설정에 주의해야 한다.

본 발명에 있어서 이산화 타이타늄 다공성 비드의 직경은 0.1 내지 250 um, 0.1 내지 230 um, 0.1 내지 200 um, 0.1 내지 180 um, 0.1 내지 150 um, 1.0 내지 250 um, 1.0 내지 230 um, 1.0 내지 200 um, 1.0 내지 180 um, 1.0 내지 150 um, 3.0 내지 250 um, 3.0 내지 230 um, 3.0 내지 200 um, 3.0 내지 180 um, 3.0 내지 150 um, 5.0 내지 250 um, 5.0 내지 230 um, 5.0 내지 200 um, 5.0 내지 180 um 또는 5.0 내지 150 um 일 수 있으며, 예를 들어, 5.0 내지 150 um일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 이산화 타이타늄 다공성 비드의 공극 직경은 0.001 내지 20 um, 0.001 내지 18 um, 0.001 내지 16 um, 0.001 내지 14 um, 0.001 내지 12 um, 0.001 내지 10 um, 0.0025 내지 20 um, 0.0025 내지 18 um, 0.0025 내지 16 um, 0.0025 내지 14 um, 0.0025 내지 12 um, 0.0025 내지 10 um, 0.004 내지 20 um, 0.004 내지 18 um, 0.004 내지 16 um, 0.004 내지 14 um, 0.004 내지 12 um 또는 0.004 내지 10 um일 수 있으며, 예를 들어, 0.004 내지 10 um일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 함침 단계는 이산화 타이타늄 다공성 비드에 유산균 현탁액을 분주하는 것을 의미하고, 분주 과정은 적어도 1회 이상 수행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 2회 또는 3회, 더욱 바람직하게는 4회 또는 5회 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 분주는 지지체에 공극의 부피 (pore volume) 만큼의 용액을 분주하는 초기 습윤 함침 (Incipient Wetness Impregnation, IWI) 방법을 사용하여, 촉매 지지체인 다공성 비드의 공극 부피와 동일한 부피의 유산균 현탁액을 혼합하여 함침시키는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 이산화 타이타늄 다공성 비드에 분주 또는 함침시키는 유산균 현탁액의 농도 (cell forming unit, CFU/ml)는 10⁵ 내지 10¹¹ CFU/ml, 10⁵ 내지 10¹⁰ CFU/ml, 10⁵ 내지 10⁹ CFU/ml, 10⁵ 내지 10⁸ CFU/ml, 10⁶ 내지 10¹¹ CFU/ml, 10⁶ 내지 10¹⁰ CFU/ml, 10⁶ 내지 10⁹ CFU/ml, 10⁶ 내지 10⁸ CFU/ml, 10⁷ 내지 10¹¹ CFU/ml, 10⁷ 내지 10¹⁰ CFU/ml, 10⁷ 내지 10⁹ CFU/ml 또는 10⁷ 내지 10⁸ CFU/ml 일 수 있으며, 예를 들어, 10⁷ 내지 10⁸ CFU/ml 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 예는 유산균이 함침된 이산화 타이타늄 다공성 비드를 포함하는, 유산균-비드 복합체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 이산화 타이타늄 다공성 비드에 함침된 유산균의 농도는 10⁵ 내지 10¹¹ CFU/ml, 10⁵ 내지 10¹⁰ CFU/ml, 10⁵ 내지 10⁹ CFU/ml, 10⁵ 내지 10⁸ CFU/ml, 10⁶ 내지 10¹¹ CFU/ml, 10⁶ 내지 10¹⁰ CFU/ml, 10⁶ 내지 10⁹ CFU/ml, 10⁶ 내지 10⁸ CFU/ml, 10⁷ 내지 10¹¹ CFU/ml, 10⁷ 내지 10¹⁰ CFU/ml, 10⁷ 내지 10⁹ CFU/ml 또는 10⁷ 내지 10⁸ CFU/ml 일 수 있으며, 예를 들어, 10⁷ 내지 10⁸ CFU/ml 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 예는 유산균-비드 복합체를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에서 식품 조성물은 각종 식품, 음료, 식품 첨가제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 포함될 수 있는 탄수화물로는 모노사카라이드 (monosaccharide), 디사카라이드 (disaccharide), 폴리사카라이드 (polysaccharide) 및 당알콜 (sugar alcohol)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 모노사카라이드는 포도당 (glucose), 과당 (fructose), 마노스 (mannose), 갈락토스 (galactose) 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 디사카라이드는 말토스 (maltose), 슈크로스 (sucrose), 올리고당 (oligosaccharide), 락토오스 (lactose) 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 폴리사카라이드는 덱스트린 (dextrin), 사이클로덱스트린 (cyclodextrin) 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 당알콜은 자일리톨 (xylitol), 소르비톨 (sorbitol), 에리트리톨 (erythritol) 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 식품 조성물에 포함될 수 있는 향미제는 천연 향미제 및 합성 향미제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 천연 향미제는 타우마틴 (thaumatin), 스테비아 (stevia) 추출물 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 합성 향미제는 사카린 (saccharin), 아스파탐 (aspartame) 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 유산균이 함침된 다공성 비드를 음료 첨가제 또는 식품 첨가제로 사용할 경우, 상기 유산균이 함침된 다공성 비드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

유효성분의 혼합량은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명에 따른 유산균-비드 복합체가 식품 또는 음료의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 10 중량 % 포함되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 예는 유산균-비드 복합체를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 유산균이 함침된 이산화 타이타늄 다공성 비드는 정장, 다이어트, 불포화지방산 보충, 면역개선, 피로회복, 영양공급을 위한 건강보조식품 또는 의약품에 유효성분으로 포함될 수 있다.

본 발명은 유산균이 이산화 타이타늄 (titanium dioxide, TiO₂)으로 이루어진 다공성 비드에 함침되어, 유산균의 환경 스트레스에 대한 안정성을 제공하여, 적은 양의 유산균을 섭취하더라도 보다 높아진 장에서의 생균 활성을 기대할 수 있으며, 위장관을 통과하며 감소하는 유산균의 생존율을 현저히 상승시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 제조예에 따라 이산화 타이타늄 다공성 비드의 자체 직경을 주사전자현미경 (Scanning Electron Microscope, SEM)으로 촬영한 SEM 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 제조예에 따라 이산화 타이타늄 다공성 비드의 공극 직경을 머큐리 포러스메트리 (Mercury porosimetry) 방법으로 측정하여 얻은 분포도 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 위장관 모사 환경에서 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei)의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 위 모사 환경에서 락토바실러스 카제이의 생존율을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1. 이산화 타이타늄으로 구성된 다공성 비드의 제조

타이타늄 이소프로폭사이드 [titanium isopropoxide, Ti(OCH(CH₃)₂)₄,Sigma Aldrich] 25 ml를 3 ml/min의 속도로 점적 방식 (droplets)을 이용하여 증류수 100 ml에 적가하였다. 동시에, 타이타늄 이소프로폭사이드 침전물이 서로 뭉치지 않도록 증류수가 들어있는 용기를 흔들어주었다. 타이타늄 이소프로폭사이드가 증류수에 첨가되면서 이산화 타이타늄 (titanium dioxide, TiO₂) 침전물이 형성되었다.

침전물을 흡입기 (aspiration)로 흡입하여 여과하고, 3회 세척하였다. 세척이 끝난 침전물을 400 ℃의 온도 조건에서 가열 소성하였다.

소성 과정은 1시간 30분 동안 400 ℃의 온도 조건까지 가열하는 승온 과정 및 2시간 동안 유지하는 과정을 진행하여, 이산화 타이타늄다공성 비드를 제조하였다. 제조된 이산화 타이타늄 다공성 비드는 오염을 방지하기 위하여 밀봉한 후 냉각시켰다.

제조된 다공성 비드의 자체 직경을 주사전자현미경로 촬영하여 얻은 SEM 이미지 (SEM image)를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인할 수 있듯이, 비드 자체의 직경은 5 내지 250 um을 가졌다.

다공성 비드의 공극 직경은 머큐리 포러스메트리 (Mercury porosimetry) 방법으로 측정하여 얻은 분포도 그래프를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, 다공성 비드의 공극은 10 nm 이하의 크기를 갖는 중형 공극이 주로 발달하였으나, 1 um (=1,000 nm) 이상의 크기를 갖는 매크로 (macro) 공극도 발달하였다.

제조예 2. 락토바실러스 카제이 유산균이 함침된 다공성 비드의 제조

2-1. 락토바실러스 카제이 ( Lactobacillus casei ) 농축 현탁액의 준비

락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) 유산균을 MRS 배지 (Man, Rogosa & Sharpe, MRS; BD, Franklin Lakes, 뉴저지, 미국)로 37 ℃의 온도 조건에서 50 rpm으로 OD₅₅₀값이 1이 될 때까지 배양하였다. 그 후, 배지를 교체하여 최종적으로 OD₅₅₀값이 5가 될 때까지 배양하여, 락토바실러스 카제이를 5×10¹⁰ CFU/ml의 농도로 농축한 유산균 현탁액을 준비하였다.

2-2. 다공성 비드에 락토바실러스 카제이 유산균의 함침

이산화 타이타늄 다공성 비드의 공극 부피 (pore volume) 만큼의 용액을 분주하는 초기 습윤 함침 (Incipient Wetness Impregnation, IWI) 방법을 사용하였다. 제조예 1에서 냉각시킨 이산화 타이타늄 다공성 비드의 공극 부피는 약 0.2 cm³/g이므로, 이산화 타이타늄 다공성 비드 0.5 g에 5Х10¹⁰ CFU/ml 농도의 유산균 현탁액 100 ul를 한 방울씩 분주하고, 충분히 흔들어 함침시킴으로써, 락토바실러스 카제이 유산균이 함침된 이산화 타이타늄 다공성 비드를 제조하였다.

제조예 3. 위장관 환경을 모사한 용액의 제조

입, 위 및 장의 환경을 모사한 용액 (위장관 모사 용액)은 표 1 내지 표 3에 나타낸 무기 용질 및 유기 용질을 혼합한 혼합 용액의 부피가 500 ml가 될 때까지 증류수를 첨가한 다음, 첨가물을 더 첨가하였고 37 ℃의 온도 조건에서 55 rpm으로 5분 동안 반응시켰다. 필요한 경우, 1 M 수산화나트륨 (NaOH) 또는 염산 (HCl)으로 pH를 조절하여 위장관 모사 용액을 제조하였다.

3-1. 입 환경 모사 용액의 제조

표 1의 무기 용질인 10.0 ml 염화칼륨 (KCl) 89.6 g/L, 10.0 ml 티오시안산칼륨 (KSCN) 2.0 g/L, 10.0 ml 인산이수소나트륨 (NaH₂PO₄) 88.8 g/L, 10.0 ml 인산이나트륨 (Na₂HPO₄) 57.0 g/L, 1.7 ml 염화나트륨 (NaCl) 175.3 g/L 및 7.8 ml 수산화나트륨 (NaOH) 25.0 g/L를 혼합하여 혼합물을 제조하였다.

상기 혼합물에 유기 용질인 8.0 ml 요소 (urea) 25 g/L를 첨가하고, 마지막으로 혼합물의 총 부피가 500 ml가 되도록 증류수를 첨가한 다음, 1 M 염산 (HCl)을 추가적으로 첨가하여 pH 6.5로 조절하였다. 0.2 um 필터지로 여과하여 입 모사 환경 용액 (simulated saliva fluids, SSF)을 제조하여, 멸균된 용기에 담아 보관하였다.

첨가물인 α-아밀라아제 (α-amylase) 145 mg, 요산 (uric acid) 15 mg 및 뮤신 (mucin) 50 mg은, 생균 활성 측정을 하기 직전 상기 입 모사 환경 용액 (SSF)에 첨가하는 것이 바람직하나, 이미 첨가물을 첨가하였더라도 24시간 이내라면 측정을 하기에 무방하다.

SSF (Simulated saliva fluids) pH 6.5
구분	조성	농도 (g/L)	부피 (ml)	질량 (mg)
무기 용질	KCl	89.6	10.0	-
	KSCN	20.0	10.0	-
	NaH₂PO₄	88.8	10.0	-
	Na₂HPO₄	57.0	10.0	-
	NaCl	175.3	1.7	-
	NaOH	40.0	1.8	-
유기 용질	urea	25.0	8.0	-
첨가물	α-amylase	-	-	145.0
	uric acid	-	-	15.0
	mucin	-	-	50.0
합계	-	-	44.3	210.0

3-2. 위 환경 모사 용액의 제조

표 2의 무기 용질인 15.7 ml 염화나트륨 (NaCl) 175.3 g/L, 3.0 ml 인산이수소나트륨 (NaH₂PO₄) 88.8 g/L, 9.2 ml 염화칼륨 (KCl) 89.6 g/L, 18.0 ml 염화칼슘 수화물 (CaCl₂ㆍ2H₂O) 22.2 g/L 및 10.0 ml Na₄Cl 30.6 g/L를 혼합하여 혼합물을 제조하였다.

상기 혼합물에 유기 용질인 3.4 ml 요소 (urea) 25 g/L, 10.0 포도당 (glucose) 65.0 g/L, 10.0 ml 글루쿠론산 (glucuronic acid) 2.0 g/L 및 글루코사민 하이드로클로라이드 (glucosamine hydrochloride) 33.0 g/L를 첨가하고, 1 M 염산 (HCl)을 추가적으로 첨가하여 pH 2.0로 조절하였다. 마지막으로 혼합물의 총 부피가 500 ml가 되도록 증류수를 첨가하고, 0.2 um 필터지로 여과하여 위 모사 환경 용액 (simulated gastric fluids, SGF)을 제조하여, 멸균된 용기에 담아 보관하였다.

첨가물인 소혈청알부민 (BSA) 1.0 g, 펩신 (pepsin) 1.0 g 및 뮤신 (mucin) 3.0 g은, 생균 활성 측정을 하기 직전 상기 위 모사 환경 용액 (SGF)에 첨가하는 것이 바람직하나, 이미 첨가물을 첨가하였더라도 24시간 이내라면 측정을 하기에 무방하다.

SGF (Simulated gastric fluids) pH 2
구분	조성	농도 (g/L)	부피 (ml)	무게 (g)
무기 용질	NaCl	175.3	15.7	-
	NaH₂PO₄	88.8	3.0	-
	KCl	89.6	9.2	-
	CaCl₂ㆍ2H₂O	22.2	18.0	-
	Na₄Cl	30.6	10.0	-
유기 용질	urea	25.0	3.4	-
	glucose	65.0	10.0
	glucuronic acid	2.0	10.0
	glucosamine hydrochloride	33.0	10.0
첨가물	BSA	-	-	1.0
	pepsin	-	-	1.0
	mucin	-	-	3.0
합계	-	-	89.3	5.0

3-3. 장 환경 모사 용액의 제조

표 3의 무기 용질인 5.78 ml 염화칼륨 (KCl) 89.6 g/L, 37.50 ml 염화나트륨 (NaCl) 175.3 g/L, 47.00 ml 탄산수소나트륨 (NaHCO₃) 84.7 g/L, 7.50 ml 제1인산칼륨 (KH₂PO₄) 8.0 g/L 및 7.50 ml 염화마그네슘 (MgCl₂) 5.0 g/L를 혼합하여 혼합물을 제조하였다.

상기 혼합물에 유기 용질인 5.50 ml 요소 (urea) 25 g/L를 첨가하고, 1 M 염산 (HCl)을 추가적으로 첨가하여 pH 7.8로 조절하였고, pH가 7.8로 조절된 후, 9.25 ml 염화칼슘 수화물 (CaCl₂ㆍ2H₂O) 22.2 g/L를 첨가하였다. 마지막으로 혼합물의 총 부피가 500 ml가 되도록 증류수를 첨가하고, 0.2 um 필터지로 여과하여 장 모사 환경 용액 (simulated intestinal fluids, SIF)을 제조하여, 멸균된 용기에 담아 보관하였다.

첨가물인 소혈청알부민 (BSA) 1.2 g, 판크레아틴 3.0 g, 리파아제 (lipase) 0.5 g 및 담즙 (chicken bile) 1.5 g은, 생균 활성 측정을 하기 직전 상기 장 모사 환경 용액 (SIF)에 첨가하는 것이 바람직하나, 첨가물을 첨가하였더라도 24시간 이내라면 측정을 하기에 무방하다.

제조된 모든 용액은 4 ℃의 온도 조건에서 보관되며, 생균 활성 측정시 체온과 같은 조건을 위하여 37 ℃의 온도 조건에서 미리 보관한 다음, 생균 활성 측정에 사용하였다.

SIF (Simulated intestinal fluids) pH 7.8
구분	조성	농도 (g/L)	부피 (ml)	무게 (g)
무기 용질	KCl	89.6	5.78	-
	NaCl	175.3	37.50	-
	CaCl2ㆍ2H₂O	22.2	9.25	-
	NaHCO₃	84.7	47.00	-
	KH₂PO₄	8.0	7.50	-
	MgCl₂	5.0	7.50	-
유기 용질	urea	25	5.50	-
첨가물	BSA	-	-	1.2
	pancreatin	-	-	3.0
	lipase	-	-	0.5
	bile (chicken)	-	-	1.5
합계	-	-	120.03	6.2

실험예. 이산화 타이타늄 다공성 비드에 함침한 락토바실러스 카제이의 생균 활성 측정

(1) 입-위-장 환경을 모사한 생균 활성 측정

입-위-장으로 이어지는 체내의 환경을 모사하여, 생균 활성을 측정하였다. 입 환경 반응은 락토바실러스 카제이 유산균이 함침된 다공성 비드와 입 모사 환경 용액 (SSF)을 1:9 (v/v)의 비율로 혼합하여 37 ℃의 온도 조건에서 55 rpm으로 5분 동안 반응시켰다.

다음으로, 위 환경 반응은 입 환경 반응이 끝난 용액을 채취하여 위 모사 환경 용액 (SGF)을 1:9 (v/v)의 비율로 혼합하고 37 ℃의 온도 조건에서 55 rpm으로 1시간 동안 반응시켰다.

마지막으로, 장 환경 반응은 위 환경 반응이 끝난 용액을 채취하여 장 모사 환경 용액 (SIF)을 1:1.5 (v/v)의 비율로 혼합하고 2시간 또는 4시간 동안 반응시켰다.

장 환경 반응을 완료한 용액을 1 ml 채취하여 PBS 버퍼 (buffer)로 2번 세척한 뒤, 희석시켜 MRS 아가 플레이트 (MRS agar plate)에 도말 (spreading)하여 37 ℃의 온도 조건에서 인큐베이터 (incubator)로 배양하고, 플레이트 도말을 이용한 CFU값인 생균 활성을 측정하였다. 상대 생존율 값은 동일한 조건에서 0시간의 유산균 CFU에 대한 특정 처리 이후 얻어진 유산균의 CFU값에 대한 비율로 계산하여, 그 결과값을 도 3 및 표 4에 나타내었다.

	상대 생존율 (log)
시간	다공성 비드에 함침된 유산균	다공성 비드에 함침되지 않은 유산균
0 h	0	0
1.1 h	- 0.036150871	- 0.23068761
3.1 h	- 0.097615609	- 0.628627619
5.1 h	- 0.06694679	- 0.634758937

도 3 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 이산화 타이타늄에 함침된 락토바실러스 카제이는 대조군인 함침되지 않은 락토바실러스 카제이에 비하여 위장관 환경에 장시간 노출되더라도 높은 생균 활성을 나타내었다.

(2) 위 환경을 모사한 생균 활성 측정

입 환경을 배제하고, 위 환경 반응에서의 생균 활성을 확인하기 위하여 락토바실러스 카제이 유산균이 함침된 다공성 비드와 PBS를 1:9의 비율로 혼합하고, 혼합 용액을 채취하여 위 모사 환경 용액 (SGF)을 1:9 (v/v%)의 비율로 혼합하고 2시간 및 4시간 동안 반응시켰다.

위 환경 반응을 완료한 용액을 1 ml 채취하여 PBS 버퍼 (buffer)로 2번 세척한 뒤, 희석시켜 MRS 아가 플레이트 (MRS agar plate)에 도말 (spreading)하여 37 ℃의 온도 조건에서 인큐베이터 (incubator)로 배양하고, 생균 활성을 측정하였다. 상대 생존율 값은 동일한 조건에서 0시간의 유산균 CFU에 대한 특정 처리 이 후 얻어진 유산균의 CFU값에 대한 비율로 계산하여, 그 결과값을 도 4 및 표 5에 나타내었다.

	상대 생존율 (log)
시간	비드에 함침된 유산균	비드에 함침되지 않은 유산균
0 h	0	0
2 h	0.56695503	- 0.037477796
4 h	0.67669361	0.13799171

도 4 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, 이산화 타이타늄에 함침된 락토바실러스 카제이는 대조군인 함침되지 않은 락토바실러스 카제이에 비하여 위 환경에 장시간 노출되더라도 높은 생균 활성을 나타내었다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 유산균-비드 복합체의 제조 방법:
이산화 타이타늄 다공성 비드를 준비하는 준비 단계; 및
유산균을 이산화 타이타늄 다공성 비드에 함침시키는 함침 단계.
제1항에 있어서, 상기 준비 단계는 이산화 타이타늄 전구체를 증류수에 적가하여 이산화 타이타늄 침전물을 형성시키는 적가 단계를 포함하는 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 이산화 타이타늄 전구체는 염화티타늄 (TiCl₄), 타이타늄 에톡사이드 [Ti(OCH₂CH₃)₄], 타이타늄 이소프로폭사이드 [Ti(OCH(CH₃)₂)₄], 타이타늄 다이이소프로폭사이드 비스(아세틸아세톤) [((CH₃)₂CHO)₂Ti(C₅H₇O₂)₂], 타이타늄(IV) 메톡사이드 [Ti(OCH₃)₄] 및 타이타늄(IV) 옥시아세틸아세톤 [Ti(C₅H₇O₂)₂]으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 적가 단계는 타이타늄 이소프로폭사이드를 증류수에 점적(droplets) 방식으로 적가하는 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 적가 단계는 타이타늄 이소프로폭사이드를 증류수에 2.0 내지 4.0 ml/min의 속도로 적가하는 것인, 제조 방법.
제2항에 있어서, 상기 준비 단계는 이산화 타이타늄 침전물을 가열 소성하는 소성 단계를 더 포함하는 것인, 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 소성 단계는 300 내지 500 ℃의 온도 조건 하에서 수행되는 것인, 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 소성 단계는 180 내지 300분 동안 수행되는 것인, 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 함침 단계는 유산균 현탁액을 이산화 타이타늄 다공성 비드에 적어도 1회 이상 분주하는 것인, 제조 방법.
제9항에 있어서, 상기 유산균 현탁액의 농도는 10⁵ 내지 10¹¹ CFU/ml인 것인, 제조 방법.
유산균이 함침된 이산화 타이타늄 다공성 비드를 포함하는, 유산균-비드 복합체.
제11항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 액시도필러스 (L. acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스 (L. bulgaricus), 락토바실러스 델부룩키 (L, delbrueckii), 락토바실러스 락티스 (L. lactis), 락토바실러스 살리바리우스 (L. salivarius), 락토바실러스 카제이 (L. casei), 락토바실러스 호모히오치 (L. homohiochii), 락토바실러스 플랜타룸 (L. plantarum), 락토바실러스 레익카마니 (L. leichmannii), 락토바실러스 자일로수스 (L.xylosus), 락토바실러스 헬베티쿠스 (L. helveticus), 락토바실러스 브레비스 (L. brevis), 락토바실러스 퍼맨툼 (L. fermentum), 락토바실러스 헤테로히오치 (L. heterohiochii), 락토바실러스 부크네리 (L. buchneri) 및 락토바실러스 람노저 (L. lamnosers)와 같은 락토바실러스 속 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 유산균-비드 복합체.
제11항에 있어서, 상기 이산화 타이타늄 다공성 비드의 직경은 0.1 내지 250 um인 것인, 유산균-비드 복합체.
제11항에 있어서, 상기 이산화 타이타늄 다공성 비드의 공극 직경은 0.001 내지 20 um인 것인, 유산균-비드 복합체.
제11항에 있어서, 상기 이산화 타이타늄 다공성 비드에 함침된 유산균의 농도는 10⁵ 내지 10¹¹ CFU/ml인 것인, 유산균-비드 복합체.
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