CN110809411A - 包含通过涂敷丝素蛋白来使肠道内定殖性得以提高的乳酸菌的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过将丝素蛋白涂敷于乳酸菌的表面来提高乳酸菌的存活率、储藏稳定性、耐酸性或耐胆汁性及肠道上皮细胞附着能力的方法以及由此制备的乳酸菌组合物。现有技术通过多步骤涂敷来仅在乳酸菌菌体外部建立物理屏障，因此存在不能确认摄入时乳酸菌对肠道上皮细胞附着能力的效果的局限性，但是，本发明是通过利用从蚕茧提取的丝素蛋白来涂敷乳酸菌，从而不仅提高保管、流通条件下的稳定性，尤其显著增加肠道环境内稳定性及定殖能力的方法。

Description

包含通过涂敷丝素蛋白来使肠道内定殖性得以提高的乳酸菌 的组合物

技术领域

本发明在农村振兴厅的支持下通过课题编号PJ01128701完成的，上述课题的研究管理专门机构是农村振兴厅，研究项目名称为“新一代生物绿色21事业”，研究课题名称为“降胆固醇保健功能食品材料的产业生产工艺的开发”，主管机构为(株)钟根堂生物，研究时间为2015年1月15日至2017年12月31日。

本专利申请要求于2017年4月7日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2017-0045326号的优先权，上述专利申请的公开内容通过引用并入本文。

本发明涉及通过将丝素蛋白涂敷于乳酸菌的表面来提高乳酸菌的存活率、储藏稳定性、耐酸性或耐胆汁性及肠道上皮细胞附着能力的方法以及由此制备的乳酸菌组合物。

背景技术

乳酸菌(lactic acid bacteria)是利用糖类作为能源而产生乳酸的细菌。乳酸菌发现于人或哺乳动物的消化道、口腔及阴道等中，并且广泛分布于自然界中，例如各种发酵产品。乳酸菌为人类长期以来使用最广泛的微生物之一，是一种不会生成对人或动物的肠道有害的物质且具有防止肠道腐烂的纯功能的微生物。

目前，乳酸菌被分为12个属(乳杆菌(Lactobacillus)、肉杆菌(Carnobacterium)、奇异菌(Atopobium)、乳酸乳球菌(Lactococcus)、片球菌(Pediococcus)、四联球菌(Tetragenococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、魏斯氏菌(Weisella)、酒球菌(Oenococcus)、肠球菌(Enterococcus)、链球菌(Streptococcus)、漫游球菌(Vagococcus))。通常，我们所使用的乳酸菌有作为杆菌的乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、作为球菌的乳球菌属(Lactococcus sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、明串珠菌属(Leuconostoc sp.)及片球菌属(Pedicoccus sp.)均等(BioWave，2009，Vol.11，No.7，pp.1-20)。

另一方面，益生菌(Probiotics)是指当摄入适当量时有益于宿主的活的微生物或含活的微生物的食品(FAO/WHO 2001)，其有助于保持和调节人体的肠道内微生物处于正常水平。代表性的益生菌具有乳酸菌和双歧杆菌(Bifidobacterium)，除此之外，酵母菌(酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii))和丝状菌(米曲霉(Aspergillus oryzae))等也包括在益生菌中。

众所周知，益生菌的代表性功效包括抗菌活性、改善与抗生素有关的腹泻、减轻乳糖不耐症、抗癌效果、降低血液中的胆固醇、抑制胃中的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、过敏性结肠炎、克罗恩病、减轻溃疡性结肠炎、调节免疫功能等(InternationalDairy Journal，2007，Vol.17，pp.1262-1277)。益生菌可分为作为人体医药品的理肠剂或乳酸菌制剂、作为饲料添加剂的益生菌以及作为保健食品之一的乳酸菌食品。乳酸菌食品是指将乳酸杆菌、乳酸球菌、双歧杆菌等益生菌混入食品中并制成粉末、颗粒、片剂、胶囊等以使稳定且易于摄取。

制备这种乳酸菌食品的工序分为乳酸菌培养、菌体回收、冷冻干燥、粉碎机产品化等步骤。乳酸菌食品的制备过程中的乳酸菌暴露于多种物理及化学应激。具体地，乳酸菌受回收菌体时基于浓度的渗透压的影响，在冷冻干燥过程中，因冰晶及脱水(dehydration)现象同时受温度和渗透压的影响。并且，在粉碎及产品化过程中，可暴露于高温、高压，由于暴露于空气中而导致构成细胞膜的脂质氧化，从而乳酸菌的存活率下降(ComprehensiveReviews in Food Science and Food Safety，2004，Vol.3，pp.117-124；Curr.IssuesIntest.Microbiol.，2004，Vol.5，pp.1-8；Letters in Applied Microbiology，1996，Vol.22，No.1，pp.3438)。

并且，当乳酸菌益生菌在保管或流通过程中暴露于高温、潮湿及有氧条件时，对益生菌的生存和生长产生巨大影响(Journal of Functional Foods，2014，Vol.9，pp.225-241)。

另一方面，与其他产业用微生物发酵产物不同，由于益生菌产品使用益生菌，因此在摄取后到达肠道之前，内在人体会暴露于各种应激之下。例如，在胃肠中暴露于pH 2左右的强酸环境和各种消化酶中，当到达小肠时受到从小肠分泌的消化酶和胆汁酸等的影响。进一步地，即使所摄取的益生菌乳酸菌菌体到达肠道，但也会因各种肠道内有害成分和活性氧等而生长受到抑制，同时必须与定殖在肠道内的现有的多种微生物进行竞争并附着在肠道上皮细胞上(Immunology and Cell Biology，2000，Vol.78，pp.8088；AmericanJournal of Clinical Nutrition(AJCN)，2001，Vol.73，pp.393S398S(suppl)；ProbioticBacteria and Enteric Infections，2011，Chap.2，pp.41-63)。

因此，迫切需要在制备、保管和流通乳酸菌的条件下，由于诸如渗透压、温度、压力、湿度或暴露于空气等环境而造成的益生菌的稳定性下降以及使摄取后暴露于肠道环境所引起的应激所杀死的菌体最小化，并解决肠道内生长抑制问题的方法。

为了解决如上所述的问题点，开发了涂敷乳酸菌的多种方法。最初开发了利用胶囊剂的肠溶衣、利用明胶、多糖类、胶类等的微囊化方法。但是，上述方法具有使用昂贵的涂敷剂或需要增加工序的问题。为了改善这些问题，引入了制备具有高浓度的乳酸菌存活的双重结构的果冻的方法或者利用蛋白质和多糖类进行双涂层的方法(韩国专利申请第10-2003-0020375、韩国专利申请第10-2001-0010397)，或引入了在蛋白质和多糖类涂层添加纳米粒子的三涂层方法(韩国专利申请第10-2008-0008267)。但是，如上所述的乳酸菌涂敷技术没有完全涂敷乳酸菌的表面，因此仍存在乳酸菌的耐热性、耐酸性及耐胆汁性不足以优秀的问题点。并且，还竞争性地开发了通过在三涂层中添加食用油脂来进行多涂层(韩国专利申请第10-2011-0093074)，或者通过添加具有水溶性聚合物、透明质酸、具有多孔性粒子的涂敷剂及蛋白质来进行四涂层的方法(韩国专利申请第10-2011-0134486)等，但是上述的乳酸菌涂敷技术需要执行回收通过常规方法培养的乳酸菌菌体后混合涂敷剂组合物来进行搅拌的多步骤工序，因此存在难以用益生菌进行无菌操作的问题，尤其，在产业大量生产中，存在竞争性下降的缺点。为此，韩国专利申请第10-1605516号提出了一种可通过在制备工序中添加脯氨酸来增加产品的储藏稳定性、耐酸性及耐胆汁性的有效的方法，但是存在不能确认摄取后乳酸菌到达小肠及大肠后可发挥功效的与肠道上皮细胞附着能力有关的效果的问题点。为了解决这些问题，本发明人致力于开发一种提高乳酸菌的肠道上皮细胞附着能力的方法，该方法不仅可提高在制备的乳酸菌益生菌的加工及流通条件下的稳定性，而且还可使摄取后肠道环境下的益生菌乳酸菌的生理活性最大化。

在整个说明书中，引用了多个论文及专利文献并指出了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容通过引用整体并入本文，并且更清楚地解释了本发明所属的技术领域的水平和本发明的内容。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于，提供包含利用丝素蛋白(silk fibroin)涂敷的乳酸菌的组合物。

本发明的再一目的在于，提供包含涂敷有丝素蛋白及纤维素的乳酸菌的组合物。

本发明的另一目的在于，提供一种促进乳酸菌的培养的方法，包括在添加丝素蛋白的培养基(medium)中培养乳酸菌的步骤。

本发明的还有一目的在于，提供增加乳酸菌的存活率、储藏稳定性、耐酸性或耐胆汁性及肠道上皮细胞附着能力的方法。

通过下述的发明的详细描述和发明要求保护范围来使本发明内的其他目的及优秀更加明确。

解决问题的方案

本发明提供如下的组合物或方法。

1.一种组合物，包含涂敷有丝素蛋白的乳酸菌。

2.根据上述1.所述的组合物，其特征在于，利用丝素蛋白及纤维素涂敷上述乳酸菌。

3.根据上述1.及2.所述的组合物，其特征在于，上述丝素蛋白为利用乙醇预处理的丝素蛋白。

4.根据上述3.所述的组合物，其特征在于，上述乙醇的浓度为85％(v/v)以上。

5.根据上述1.至4.所述的组合物，其特征在于，上述乳酸菌为选自由乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属及双歧杆菌属组成的组中的乳酸菌。

6.根据上述1.至5.所述的组合物，其特征在于，上述乳酸菌为选自由嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus fecalis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)及乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)组成的组中的乳酸菌。

7.根据1.至6.所述的组合物，其特征在于，上述乳酸菌为选自由嗜酸乳杆菌CKDB007(保藏编号：KCTC13117BP)、屎肠球菌CKDB003(保藏编号：KCTC13115BP)、嗜热链球菌CKDB021(保藏编号：KCTC13118BP)、两歧双歧杆菌CKDB001(保藏编号：KCTC13114BP)及乳双歧杆菌CKDB005(保藏编号：KCTC13116BP)组成的组中的乳酸菌。

8.根据上述1.至7.所述的组合物，其特征在于，上述组合物选自由食品组合物、益生菌组合物、药剂学组合物及饲料用组合物组成的组中。

9.一种促进乳酸菌的培养的方法，包括在添加丝素蛋白的培养基中培养乳酸菌的步骤。

10.一种涂敷有丝素蛋白的乳酸菌益生菌的制备方法，包括在包含丝素蛋白的乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌的步骤。

11.根据上述10.所述的方法，其特征在于，上述乳酸菌培养用培养基还包含水溶性钙。

12.根据上述11.所述的方法，其特征在于，相对于乳酸菌培养用培养基的体积，添加0.01％(w/v)至5％(w/v)浓度的上述水溶性钙。

13.根据上述10.至12.所述的方法，其特征在于，上述乳酸菌培养用培养基还包含纤维素。

14.一种增加乳酸菌的存活率、储藏稳定性、耐酸性或耐胆汁性以及肠道上皮细胞附着能力的方法，包括在包含丝素蛋白的乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌的步骤。

15.根据上述9.、10.或14.所述的方法，其特征在于，添加上述丝素蛋白的培养基或包含丝素蛋白的乳酸菌培养用培养基还包含水溶性钙。

16.根据上述15.所述的方法，其特征在于，相对于乳酸菌培养用培养基的体积，添加0.01重量百分比至5重量百分比浓度的上述水溶性钙。

17.根据上述14.所述的方法，其特征在于，上述乳酸菌培养用培养基还包含纤维素。

18.根据上述10.至17.所述的方法，其特征在于，上述乳酸菌为选自由乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属及双歧杆菌属组成的组中的乳酸菌。

19.根据上述10.至18.所述的方法，其特征在于，上述乳酸菌为选自由嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌及乳双歧杆菌组成的组中的乳酸菌。

20.根据上述10.至19.所述的方法，其特征在于，上述乳酸菌为选自由嗜酸乳杆菌CKDB007(保藏编号：KCTC13117BP)、屎肠球菌CKDB003(保藏编号：KCTC13115BP)、嗜热链球菌CKDB021(保藏编号：KCTC13118BP)、两歧双歧杆菌CKDB001(保藏编号：KCTC13114BP)及乳双歧杆菌CKDB005(保藏编号：KCTC13116BP)组成的组中的乳酸菌。

21.一种增加乳酸菌的存活率、储藏稳定性、耐酸性或耐胆汁性及肠道上皮细胞附着能力的方法，包括在包含丝素蛋白的乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌的步骤。

在本发明的一实施方式中，本发明提供包含利用丝素蛋白涂敷的乳酸菌的组合物。

在本发明的另一实施方式中，本发明提供包含涂敷有丝素蛋白及纤维素的乳酸菌的组合物。

本发明人确认，若在乳酸菌培养工序中添加丝素蛋白，则具有促进乳酸菌的培并缩短培养时间的效果，进一步确认，若在乳酸菌培养过程中或培养之后添加素蛋白，则具有冷冻干燥存活率及在苛刻条件下的稳定性得以提高。

并且，本发明人确认，若在完成乳酸菌培养后回收培养菌体并使用针对各种处理条件优化的丝素蛋白来涂敷乳酸菌菌体，则针对应激的作为抵抗性指标的耐酸性、耐胆汁性大大增加，并且肠道上皮细胞附着能力大大提高。

在本说明书中，术语“丝素蛋白”活蚕通过挤压加工(extrusion)制备的氨基酸复合有机体。丝素蛋白的分子量为约84000g/mol，作为氨基酸的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸以3：2：1的比例分布，这些占所有氨基酸的70～80％。并且，酪氨酸、缬氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸及其他氨基酸占所有氨基酸的13％左右。这些丝素蛋白获得食品药品监督管理局(FDA)批准，其广泛用于各种领域，例如手术用缝合线、药物载体、组织学用途、烧伤治疗及固定化等。

在本发明的一实例中，上述丝素蛋白可以是通过蚕茧的酸水解或酶分解制备的，但是，以不受限制地使用在本领域中通常用于制备丝素蛋白的方法。

在本发明的再一实例中，上述丝素蛋白可以为用85％(v/v)以上的乙醇预处理的丝素蛋白。其中，上述85％以上的乙醇具体为发酵酒精。根据酒税法，发酵酒精是通过发酵含淀粉的物料或含糖分的物料来将酒精分蒸馏成85度以上，向淀粉质(谷类、番薯、木薯)或糖质(糖-)原料投入糖化酶来进行发酵后，通过连续性蒸馏方式进行蒸馏来制得，并用作稀释式烧酒的原料。

许多蛋白质在一条多肽链中同时具有α-螺旋(α-helix)和β-折叠(β-sheet)位点。丝素蛋白也由I型丝(silk I type)、II型丝(silk II type)两种类型构成，在I型丝的情况下，由α-螺结构旋构成，在II型丝的情况下，由β-折叠结构旋构成。另一方面，已知丝在以无定形状态重新排列为β-折叠结构时强度和蛋白质的弹性变高，基于此，研究了预处理丝蛋白的多种工法(Nature，2003，Vol.424，pp.1057-1061)。

在本发明中，通过使用发酵酒精来预处理丝蛋白，从而将丝蛋白的结构诱导为β-折叠后，增加了提高丝蛋白的稳定性和疏水性的工序，由此，通过提高乳酸菌益生菌的疏水性来制备了提高针对肠道粘膜细胞的定殖能力并且稳定性得以提高的乳酸菌益生菌。

在本发明中，为了涂敷乳酸菌益生菌，相对于乳酸菌浓缩液的体积，以1～10％(w/v)的比例添加丝素蛋白，但并不限定于此。

在本说明书中，术语“纤维素”是地球上最丰富的高分子，葡萄糖通过β-1，4键形成的高分子多糖类。纤维素目前用于包括造纸和纺丝在内的各种领域，也被用作止血带、皮肤置换剂和膳食纤维等。(Biowave，2007，Vol.9，No.7，pp.1-11)。

食品医药品安全厅许的食品添加剂有甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素，自1971年以来，广泛用作肠溶衣料的邻苯二甲酸羟甲基纤维素(HydroxyPropyl MethylCellulose Phthalate，以下称为HPMCP)被用作药物添加剂。

在国外，纤维素已被广泛用作片剂、颗粒剂、胶囊的的肠溶衣剂，并作为药物和保健食品的添加剂。尤其，邻苯二甲酸羟甲基纤维素是使用天然浆料作为原料通过化学合成方法制备的具有pH依赖性溶解度的高分子，被取代在纤维素环中的羧基的特征在于，在低pH值的胃液中不发生崩解和洗脱，而pH接近中性的肠液中迅速发生崩解和洗脱。

在本说明书中，在涂敷有丝素蛋白的乳酸菌菌体上复合涂敷纤维素，从而使其在人工胃液条件下不会发生崩解和洗脱，而在中性pH的肠液条件下迅速发生崩解和洗脱。

在本发明的一实施方式中，本发明提供在添加丝素蛋白的培养基中培养乳酸菌的步骤的促进乳酸菌的培养的方法。

在以往公知的常规的乳酸菌培养基及培养条件下实施本发明中的乳酸菌培养。

丝素蛋白被归类为存在于自然界的成分中纯度高的蛋白质(97％)，并且由作为人体蛋白质组分的多种氨基酸(amino acid)和其氨基酸的缀合体共存的肽(peptide)构成。尤其，丝素蛋白成分中占比重最多的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸成分占所有氨基酸的70～80％，此外，酪氨酸、缬氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸及其他氨基酸成分占其余比重，因此可用作乳酸菌培养重要的氮源成分。

在本发明的一实例中，以培养基的体积为基准，本发明的添加丝素蛋白的培养基的丝素蛋白可以为0.001％(w/v)至5％(w/v)、0.001％(w/v)至4％(w/v)、0.001％(w/v)至3％(w/v)、0.001％(w/v)至2％(w/v)、0.001％(w/v)至1％(w/v)、0.01％(w/v)至5％(w/v)、0.01％(w/v)至4％(w/v)、0.01％(w/v)至3％(w/v)、0.01％(w/v)至2％(w/v)、0.01％(w/v)至1％(w/v)、0.01％(w/v)至0.5％(w/v)、0.01％(w/v)至0.4％(w/v)、0.01％(w/v)至0.3％(w/v)、并且可包含0.01％(w/v)至0.2％(w/v)、0.1％(w/v)至5％(w/v)、0.1％(w/v)至4％(w/v)、0.1％(w/v)至3％(w/v)、0.1％(w/v)至2％(w/v)、0.1％(w/v)至1％(w/v)、1％(w/v)至5％(w/v)、1％(w/v)至4％(w/v)、1％(w/v)至3％(w/v)、1％(w/v)至2％(w/v)、2％(w/v)至5％(w/v)、2％(w/v)至4％(w/v)、2％(w/v)至3％(w/v)、3％(w/v)至5％(w/v)、3％(w/v)至4％(w/v)或4％(w/v)至5％(w/v)的浓度，但并不限定于此。

如下述示例所验证，可以看出通过本发明的方法培养的乳酸菌促进了生长并缩短了培养时间。

在本发明的一实例中，本发明的上述乳酸菌培养用培养基还可包含水溶性钙。上述水溶性钙可利用允许作为食品添加物的柠檬酸钙、氢氧化钙、氯化钙、乳酸钙、磷酸二钙、磷酸一钙。并且，上述水溶性钙的添加浓度可以为0.001％(w/v)至5％(w/v)、0.001％(w/v)至4％(w/v)、0.001％(w/v)至3％(w/v)、0.001％(w/v)至2％(w/v)、0.001％(w/v)至1％(w/v)、0.01％(w/v)至5％(w/v)、0.01％(w/v)至4％(w/v)、0.01％(w/v)至3％(w/v)、0.01％(w/v)至2％(w/v)、0.01％(w/v)至1％(w/v)、0.01％(w/v)至0.5％(w/v)、0.01％(w/v)至0.4％(w/v)、0.01％(w/v)至0.3％(w/v)，具体地为0.01％(w/v)至0.2％(w/v)，最具体地可以为0.1％(w/v)，但并不限定于此。

并且，在本发明的另一实例中，本发明的上述乳酸菌培养用培养基还可包含纤维素。上述纤维素可利用食品医药品安全厅允许作为食品添加物的甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素及邻苯二甲酸羟甲基纤维素(Hydroxypropyl methylcellulose phthalate，以下称为HPMCP)，但并不限定于此。

并且，在本发明的另一实施方式中，本发明提供一种增加乳酸菌的存活率、储藏稳定性、耐酸性或耐胆汁性及肠道上皮细胞附着能力的方法，包括在包含丝素蛋白的乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌的步骤。

在本发明中，在与作为用于培养乳酸菌的培养基成分的丝素蛋白一起添加上述水溶性钙的情况下，由乳酸菌产生的乳酸(lactic acid)与水溶性钙及丝素蛋白一起形成盐并凝结，从而在乳酸菌的培养及浓缩步骤中可以更稳定地涂敷丝素蛋白。

在本发明的具体的实例中，可确认利用本发明的丝素蛋白涂敷的乳酸菌的细胞疏水性及黏蛋白附着能力、肠道上皮细胞附着能力的增加效果，在摄取由这种方法制备的乳酸菌益生菌的情况下，乳酸菌稳定地附着在肠道上皮细胞，从而可增进乳酸菌的生理活性效果。

在本发明的再一具体的实例中，可确认利用丝素蛋白及纤维素复合涂敷的乳酸菌的细胞疏水性及黏蛋白附着能力、肠道上皮细胞附着能力优秀。

在本发明的另一具体的实例中，本发明的乳酸菌组合物在判断现有乳酸菌益生菌的肠道环境稳定性的耐酸性、耐胆汁性试验条件下以及判断储藏稳定性的冷冻干燥存活率及苛刻试验条件下具有优秀的稳定性(存活率)。

在本发明中，“耐酸性(resistance against acid)”是指本发明的乳酸菌可耐受pH为7以下的酸(acid)的性质。具体地，在本说明书中，耐酸性是指乳酸菌对pH为1～3的人工胃液的耐性，例如，pH为2.0或2.5的人工胃液，可通过比较与人工胃液接触前后的乳酸菌的益生菌数来测定存活率。在本发明的一实例中，上述人工胃液是通过将1N的浓度的盐酸(HCl)水溶液的pH调节至2.0或2.5来制备，必要时通过添加一定浓度(1～2％)的作为胃中分泌酶的胃蛋白酶(pepsin)来制备，但并不限定于此。

在本说明书中，“耐胆汁性”是指对本发明的乳酸菌的胆汁(胆液)的耐性。具体地，在本说明书中，耐胆汁性是指乳酸菌对人工肠液(人工胆汁液)的耐性，例如，包含0.1～1％的胆汁酸(oxigall)的人工肠液，可通过比较与人工肠液接触前后的乳酸菌的益生菌数来测定存活率。在本发明的一实例中，上述人工肠液是通过向液体培养基中添加0.5％的胆汁酸(oxigall)来制备，还通过添加胆汁提取物(bile extract)来制备，但并不限定于此。

在本说明书中，“冷冻干燥”是主要用于长期保存乳酸菌的冷冻干燥方法，一般在-20℃至-80℃的温度下进行。在上述冷冻干燥过程中，由于物理、生化应激，乳酸菌的细胞的活性和存活率降低。通过比较冷冻干燥前后的乳酸菌的益生菌数来测定“冷冻干燥存活率”。在本发明的一实例中，通过比较回收菌体并在0℃至-45℃，具体地在-20℃至-45℃的温度下进行冷冻后，通过粉碎及粉末化来再次在培养基中培养的乳酸菌试样的乳酸菌数(cfu)和冷冻干燥前试样的乳酸菌数来测定冷冻干燥存活率，但并不限定于此。

在本说明书中，“苛刻试验条件”是指用于测定针对乳酸菌的外部条件的耐性的条件，主要是针对高温及高湿的耐性。在本发明的一实例中，可在40℃的温度、70～75％的湿度的上述苛刻试验条件下测定，但并不限定于此。

上述乳酸菌的对肠道上皮细胞的附着能力受乳酸菌的存活率、宿主细胞的附着结能力以及与其他菌体的相关关系的影响，尤其，已知受乳酸菌菌体的细胞表面特征的影响很大。影响乳酸菌菌体的附着能力的细胞表面的特征很大程度上与菌体表面的静电平衡、范德华力(van der Waals force)及疏水性有关。尤其，细胞表面疏水性是与细菌细胞和肠道上皮细胞之间的附着能力有相关关系的指标，被用作确认包括乳酸杆菌和双歧杆菌等的乳酸菌株的附着能力的重要的指标(Letters in Applied Microbiology，1998，Vol.27，pp.307-310)。

在本发明中，通过在乳酸菌菌体涂敷丝素蛋白来对细胞表面赋予疏水性。尤其，利用发酵酒精预处理上述丝素蛋白，将丝素蛋白的结构诱导为β折叠结构，并通过提高涂敷有丝素蛋白的乳酸菌菌体表面的疏水性来提高对肠道粘膜细胞的附着能力。与α螺旋结构相比，β折叠结构具有对热量非常强的特征，因此当用作涂敷剂是时可提高稳定性并具有疏水性特征。

对本使用于本发明中的乳酸菌没有特别限制，例如，上述乳酸菌可以为选自由乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属及双歧杆菌属组成的组中的乳酸菌。

在本发明的再一实例中，具体地，上述乳酸菌可以为选自由嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌及乳双歧杆菌组成的组中的乳酸菌。

在本发明的另一实例中，最具体地，上述乳酸菌可以为选自由嗜酸乳杆菌CKDB007(保藏编号：KCTC13117BP)、屎肠球菌CKDB003(保藏编号：KCTC13115BP)、嗜热链球菌CKDB021(保藏编号：KCTC13118BP)、两歧双歧杆菌CKDB001(保藏编号：KCTC13114BP)及乳双歧杆菌CKDB005(保藏编号：KCTC13116BP)组成的组中的乳酸菌。

在本发明的还有一实例中，以本发明的上述乳酸菌为特征的组合物可选自由食品组合物、益生菌组合物及饲料用组合物组成的组中。

在将本发明的组合物制备成食品组合物的情况下，作为有效成分不仅可包含上述乳酸菌，而且还可包含制备食品时通常添加的成分。例如，上述添加成分可包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。作为上述碳水化合物有单糖(例如，葡萄糖、果糖等)、二糖(例如，麦芽糖、蔗糖、低聚糖等)及多糖(例如，普通糖，如糊精、环糊精等；以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等)。作为香味剂可使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪甙A、甘草甜素等))及合成甜味剂(糖精，阿斯巴甜等)。

例如，在将本发明的食品组合物制备成饮品的情况下，除了作为本发明的有效成分的上述菌株之外，还可包含柠檬酸，液相果糖、糖、葡萄糖、乙酸、苹果酸、果汁、枣提取液或甘草提取液等。

本发明的食品组合物包括食品、功能性食品(functional food)、营养补充剂(nutritional supplement)、保健食品(health food)及食品添加剂(food additives)等所有天然材料的加工形态。可以根据本领域已知的常规方法将上述类型的食品组合物制备成各种形态。

例如，作为保健食品，将上述乳酸菌本身制备成茶、果汁及饮品的形态来引用，或者可通过颗粒化、胶囊化及粉末化来摄取并且，作为食品，可通过添加饮料(包括酒精饮料)、果实及其加工品(例：水果罐头、食品罐头、果酱、柑橘酱等)、鱼类、肉类及其加工品食品(例：火腿、香肠玉米牛肉等)、面包类及面类(例：乌冬面、荞麦面、拉面、意大利面、通心面等)、果汁、各种饮品、饼干、饴糖、乳制品(例：黄油、奶酪等)、食用植物油脂、人造黄、植物蛋白、蒸煮食品、冷冻食品、各种调味料(例：大酱、酱油、酱汁等)等本发明的乳酸菌来制备。并且为了以食品添加剂的形态使用本发明的乳酸菌，可以将其制备成粉末或浓缩液形态来使用。

在将本发明的组合物制备成药剂学组合物的情况下，本发明的药剂学组合物包含要学上可接受的载体。包含在本发明的药剂学组合物的要学上可接受的载体制剂时通常所使用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。除了上述成分之外，本发明的药剂学组合物还可包含润滑剂，湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。

可口服或非口服给药本发明的药剂学组合物，优选地，适用口服给药方式。可将本发明的药剂学组合物剂型化成多种口服或非口服给药形态，但并不限定于此。

作为用于口服给药的剂型，例如有片剂、丸剂，硬/软胶囊剂、液剂、悬浮剂、乳化剂、糖浆剂、颗粒剂、酏剂等，除了上述有效成分之外，这些剂型可使用一种以上的通常所使用的填充剂、增量剂、湿润剂、崩解剂、助流剂、结合剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂。作为崩解剂可使用琼脂、淀粉、海藻酸或其钠盐、磷酸一氢钙酐等，作为助流剂可使用二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐或钙盐、聚乙二醇等，作为结合剂可使用硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷、低取代羟丙基纤维素等。此外，可使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、甘氨酸等作为稀释剂，根据情况可与通常已知的沸腾混合物、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等一起使用。

上述组合物可以无菌的，或包含防腐剂、稳定剂、水合剂或乳化促进剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂等助剂以及其他治疗上有用的物质，可根据作为常规方法的混合、颗粒化胡涂敷方法来进行制剂化。

本发明的药剂学组合物的适当的剂量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应敏感性等因素而不同。

可以按照本发明所属领域的普通技术人员可易于实施的方法，利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来对本发明的药剂学组合物进行制剂化，从而可制备成单位用量形态或者参入多用量容器中来制备。此时，剂型可以为油性或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳化液形态或提取剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包括分散剂或稳定剂。

可交叉应用在乳酸菌培养用培养基中添加利用本发明的上述丝素蛋白涂敷的乳酸菌、包含其的组合物与丝素蛋白来促进乳酸菌的培养的方法、涂敷有丝素蛋白的乳酸菌的制备方法、增加乳酸菌的存活率、储藏稳定性、耐酸性或耐胆汁性及肠道上皮细胞附着能力的方法。在由如上所述的技术制备的乳酸菌组合物的情况下，可应用为食品组合物、保健功能食品及药剂学组合物。为了避免说明书的复杂性，省略了重复范围的内容的说明。

发明的效果

本发明的特征及优点如下：

(i)本发明提供包含涂敷有丝素蛋白的乳酸菌或利用丝素蛋白及纤维素涂敷的乳酸菌的组合物。

并且，本发明提供包括在添加丝素蛋白的培养基中培养乳酸菌的步骤的促进乳酸菌的培养的方法。

并且，本发明提供增加乳酸菌的存活率、储藏稳定性、耐酸性或耐胆汁性及肠道上皮细胞附着能力的方法。

(ii)本发明利用通过多种处理方法制备的丝素蛋白涂敷乳酸菌菌体，从而提高乳酸菌菌体的存活率和储藏稳定性，并确认优秀的耐酸性或耐胆汁性及肠道上皮细胞附着能力增加效果。

附图说明

图1为示出利用丝素蛋白制备乳酸菌益生菌的工序图的图。

图2a及图2b为比较示出当使用丝素蛋白作为乳酸菌培养基时的碳源的消耗方式及培养性的图。

图3为示出利用电子背散射衍射/场发射扫描电子显微镜(EBSD/FE-SEM)(扫描电子检测仪)观察利用丝素蛋白及纤维素制备的乳酸菌益生菌的性状的照片。

图4为比较示出根据涂敷有丝素蛋白的乳酸菌益生菌的人工胃液及人工肠液条件的ζ电位的图。

图5为比较示出利用丝素蛋白和纤维素的在各个涂敷条件下与黏蛋白的结合能力的图。

图6为比较示出利用丝素蛋白和纤维素的在各个涂敷条件下与肠道上皮细胞(HT-29)的结合能力的图。

具体实施方式

以下，通过实施例进一步详细说明本发明。对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，根据本发明的精神、本发明的范围不受这些示例的限制。

在整个说明书中，除非另有说明，否则为了表示特定物质的浓度而使用的“％”中，固体/固体为(重量/重量)百分比，固体/液体为(重量/体积)百分比，以及液体/液体为(体积/体积)百分比。

实施例

本发明人为了确认本发明的丝素蛋白的添加及涂敷对乳酸菌的影响而进行了如下实验。图1为示出本发明人进行的实验的顺序和内容的工序图。

实施例1：本发明的丝素蛋白成分的分离及纯化

丝是可以从自然界中获得的巨大蛋白质，丝素蛋白的构成成分由构成人类蛋白质的20种氨基酸中18种氨基酸构成。18种天然氨基酸构成的蚕丝腺体生物合成的液相的丝在蚕丝土壤中形成高度结晶的纤维阵列，由约75％的蚕丝蛋白(fibroin)和约25％的丝胶蛋白(sericin)两种成分组合成。

丝素蛋白大致可分为通过(i)酸水解法和(ii)氯化钙溶液及酶进行的蛋白质水解法来获得的方法。在本发明中，通过饲养蚕(Bombyx Hori)并从中获得蚕茧(cocoon)，并经过分离去除上述丝胶蛋白成分的精炼过程蜡获得使用于乳酸菌菌体涂敷的丝素蛋白。

实施例1-1.酸水解法

为了分离丝素蛋白，加热(95℃)纯化水后，添加油酸钠(sodium oleate)，Na₂CO₃使其完全溶解后，通过添加蚕茧来煮沸约40分钟，然后进行脱水过程来精炼蚕茧。具体地，相对于纯化水，通过添加1.84％(w/v)浓度的上述蚕茧、0.0092％(w/v)浓度的油酸钠、0.0055％(w/v)浓度的Na₂CO₃来进行精炼。其中，当酸水解时添加通常使用的2N的HCl，并在110℃的温度条件下酸水解2小时后，过滤分解的溶解并用NaOH水溶液进行中和。利用透析膜(Dialysis tubing cellulose membrane)去除在中和过程中生成的盐，由此制备纯化的酸水解丝素蛋白。一般而言，通过酸水解获得的肽的平均分子量为约200～10000，已知可获得较小肽的丝素蛋白。

实施例1-2.酶分解法

为了分离丝素蛋白，以与上述实施例1-1相同的方法精炼蚕茧。接着，添加5％浓度的公知为地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或黑曲霉生产的蛋白分解酶的碱性蛋白酶(Alcalase)、Delvorase、风味蛋白酶(Flavourzyme)、复合蛋白酶(Protamax)((株)BISIONBio company)和从木瓜(Papapya)回收的木瓜蛋白酶(Papain)T100((株)BISION Biocompany)，在60～80℃的温度条件下处理6～10小时左右。将分解的丝素蛋白溶液利用于乳酸菌涂敷工序中之前，暴露于95℃的高温条件下2小时，以使蛋白水解酶失活。已知通过如上所述的酶分解法制备的丝素蛋白的特征在于溶解度高，体内吸收率高。

为了确认针对本发明的丝素蛋白的乳酸菌菌体的培养促进效果及菌体涂敷效果，分别回收通过上述的方法制备的丝素蛋白(酸水解及酶分解)，并适用于后述的屎肠球菌CKDB003(保藏编号：KCTC13115BP)、嗜酸乳杆菌CKDB007(保藏编号：KCTC13117BP)、嗜热链球菌CKDB021(保藏编号：KCTC13118BP)、乳双歧杆菌CKDB005(保藏编号：KCTC13116BP)及两歧双歧杆菌CKDB001(保藏编号：KCTC13114BP)菌体的培养基涂敷工序中。

实施例2.本发明的丝素蛋白成分的利用

作为从蚕茧回收的丝胶蛋白和蚕丝蛋白的主要成分的丝蛋白由75％的蚕丝蛋白和25％的丝胶蛋白约3％左右的无机碳水化合物构成。

丝素蛋白被归类为存在于自然界中的成分中纯度高的蛋白质(97％)，并且由作为人体蛋白质组分的多种氨基酸和其氨基酸的缀合体共存的肽构成。

尤其，丝素蛋白成分中占比重最多的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸成分占所有氨基酸的70～80％，已知丝素蛋白构成氨基酸的上述成分为构成胶原蛋白的氨基酸。因此这些丝素蛋白具有与胶原蛋白相同的坚固的特性，构成氨基酸在乳酸菌培养时可用作重要的氮源成分。

实施例2-1.丝素蛋白做诶乳酸菌培养成分的用途

当本发明的丝素蛋白用作乳酸菌培养成分时，为了确认对乳酸菌的培养性的影响效果，使用了已知对各个菌种优化的培养基和培养条件。将在上述最佳培养基组成中培养的乳酸菌作为对照组(control)，使用相同的培养条件并添加丝素蛋白来培养乳酸菌作为实验组，从而比较根据时间的碳源的消耗率(carbon source consumption rate，％)及活的菌体的数(viable cell count)。

结果如图2a及图2b所示。

如图2a及图2b所示，在通过添加本发明的丝素蛋白来培养时的情况下，与未添加丝素蛋白来培养的情况的乳酸菌相比，确认培养初期糖消耗速度非常快(图2a)。并且，在通过添加本发明的丝素蛋白来培养的情况下，确认在培养后期具有最大培养性的时间点也缩短了(图2b)。

因此，从上述结果可知，本发明的丝素蛋白成分起到乳酸菌生长的重要因子(growth factor)作用，从而具有促进乳酸菌的培养并可缩短培养时间的效果。上述图1的结果为示出针对乳双歧杆菌CKDB005(保藏编号：KCTC13116BP)菌种的培养性的结果，为示出针对其他菌种的结果，但是确认具有与上述乳双歧杆菌菌种类似的效果。

实施例2-2.水溶性钙和丝素蛋白作为乳酸菌培养成分的用途

本发明人确认，在与丝素蛋白一起提供水溶性钙作为用于培养乳酸菌的培养基成分的情况下，不仅提高乳酸菌的培养性，而且由乳酸菌产生的乳酸(lactic acid)与水溶性钙及丝素蛋白一起形成盐并凝固，从而在乳酸菌的培养及浓缩过程中可以更稳定地涂敷丝素蛋白。进一步地，建立将丝素蛋白涂敷在乳酸菌菌体的表面最佳条件，并且为了确认丝素蛋白的涂敷与否对乳酸菌的稳定性的影响，进行了如下实验。

首先，利用于培养的丝素蛋白使用了通过上述实施例1的方法制备的干燥粉末，添加浓度为培养液体积的0～3％(w/v)。并且，作为额外添加的水溶性钙使用了允许作为食品添加物的柠檬酸钙、氢氧化钙、氯化钙、乳酸钙、磷酸二钙、磷酸一钙，添加浓度分别为0％(w/v)、0.1％(w/v)及0.5％(w/v)，通过培养乳酸菌来制备了涂敷有丝素蛋白的乳酸菌益生菌。

然后，比较了制备的乳酸菌益生菌的冷冻干燥存活率及苛刻条件(温度为40℃、湿度为70～75％)下的存活率。菌体回收冷冻干燥工序部分应用了常规方法(通过离心回收菌体后，在-40℃的温度的冰箱中快速冷冻并在0℃至-45℃之间的冷冻干燥条件下进行冷冻干燥)，冷冻干燥存活率确定为冷冻干燥后益生菌数除以冷冻干燥前益生菌数的百分比。

另一方面，在苛刻条件下的存活率为在苛刻条件(温度为40℃、湿度为70～75％)下保管乳酸菌益生菌4周后确认益生菌。

表1

表2

如上述表1和表2所示，在于本发明的丝素蛋白一起添加水溶性钙的情况下，冷冻干燥存活率及苛刻条件下的存活率优秀，尤其，确认在钙浓度为0.1％(w/v)的情况下乳酸菌的存活率最优秀。

实施例2-3.利用于丝素蛋白的培养及涂敷

如上述实施例2-1、实施例2-2所确认，当将丝素蛋白和水溶性钙用作用于培养乳酸菌的培养基时，确认乳酸菌的培养性及稳定性得以提高的效果后，乳酸菌益生菌的制备如下。

为了制备对照组(未涂敷)，利用最佳培养基，在培养及浓缩菌体未后进行额外的涂敷工序，在实验组的情况下，培养乳酸菌时与丝素蛋白一起添加水溶性钙作为培养基成分并通过培养及浓缩后利用丝素蛋白进行涂敷。

乳酸菌涂敷工序适用常规的方法(实施例2-2)，利用粉碎机粉碎乳酸菌益生菌后分别适用于实施例4的实验例。

实施例3：利用发酵酒精预处理的丝素蛋白涂层-乳酸菌益生菌的制备

本发明人发现了用于涂敷在乳酸菌菌体的最佳丝素蛋白，并且为了确认根据所适用的丝素蛋白的条件对乳酸菌的涂敷质量的影响，利用发酵酒精预处理丝素蛋白。具体地，在通过本发明的上述实施例1～2的酶分解方法制备的丝素蛋白中，以30％的比例混合发酵酒精，在无菌条件及室温(25℃)条件下均质化并静置18～24小时。

在本实施例3中，除了使用如上所述利用发酵酒精预处理的丝素蛋白代替未经预处理的丝素蛋白之外，以与实施例2-2相同的方法培养并涂敷乳酸菌菌体。

实施例4：复合涂敷丝素蛋白及纤维素的乳酸菌益生菌的制备

本发明人为了改善利用上述丝素蛋白涂敷的乳酸菌益生菌的特性及对肠道内环境等的抵抗性，制备了与本发明的丝素蛋白一起复合涂敷用作现有肠溶衣料的纤维素的乳酸菌益生菌。

具体地，用于涂敷乳酸菌益生菌的丝素蛋白使用了通过上述实施例1的方法制备的干燥粉末，如实施例3所述，相对于乳酸菌额浓缩液体积，添加1～10％(w/v)的比例的预处理发酵酒精丝素蛋白。在纤维素的情况下，作为食品医药品安全厅允许的食品添加物，将甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素及邻苯二甲酸羟甲基纤维素(Hydroxypropyl methylcellulosephthalate，以下称为HPMCP)用作涂敷剂。其结果，如下述实验例所述，相对于乳酸菌浓缩液体积，在以1～10％的比例添加邻苯二甲酸羟甲基纤维素(药用品牌名称(Any Coast)，三星精细化工)和羧甲基纤维素钠(三星精细化工)来涂敷乳酸菌益生菌的情况下，确认乳酸菌的冷冻干燥存活率及苛刻条件(温度为40℃、湿度为70％)下的存活率得以提高。

实验例

本发明人为了确认根据在上述实施例2至实施例4中制备的丝素蛋白的涂敷与否及方法的乳酸菌益生菌的特性，进行了如下实验。

在以下实验例中所使用的各个对照组及实验组如下述表3所示。

表3

实验例1：确认根据丝素蛋白涂敷条件的乳酸菌益生菌的涂敷效率

如上述表3所示，利用碳带将对照组(实施例2-3，未涂敷对照组的乳酸菌益生菌)、实验组1(实施例2-3，丝素蛋白涂敷-乳酸菌益生菌)、实验组2(实施例3，利用发酵酒精预处理的丝素蛋白涂敷-乳酸菌益生菌)及实验组3(实施例4，利用发酵酒精预处理的丝素蛋白及纤维素复合涂敷-乳酸菌益生菌)的试样分别固定于金属板，用等离激元溅射镀铂后，利用电子背散射衍射/场发射扫描电子显微镜(扫描电子检测仪)在10kV的加速电压下观察。

结果如图3所示。

如图3所示，在仅利用丝素蛋白涂敷乳酸菌菌体来制备的益生菌(实验组1)的情况下，观察涂层覆盖形状比对照组(未涂敷)好，但是观察到未涂敷菌体的部分。并且，在利用通过添加发酵酒精预处理工序来制备的丝素蛋白涂敷的乳酸菌益生菌(实验组2)的情况下，确认整体上均匀地包围菌体的形状，在利用发酵酒精预处理的丝素蛋白及纤维素复合涂敷的乳酸菌益生菌(实验组3)的情况下，可确认与仅用丝素蛋白涂敷的乳酸菌益生菌(实验组2)相比，更均匀地涂敷菌体。因此可知，实验组1优于对照组，实验组2优于实验组1，且与实验组2相比，实验组3的益生菌的涂敷质量最优。

在实施例中，上述发酵酒精的预处理是为了诱导丝素蛋白再生成并处理成β-折叠结构，并使利用于酶分解工法的酶失活，以防止在涂敷工序中乳酸菌及丝素蛋白被酶分解。

实验例2：根据丝素蛋白涂敷方法的乳酸菌菌体的表面疏水性

细胞表面疏水性是可间接直到体外(in vitro)乳酸菌的肠道内附着能力的指标，用作确认包括乳杆菌双歧杆菌等的乳酸菌的附着能力的第一次选择方法之一。在本发明中，为了确认涂敷丝素蛋白的乳酸菌益生菌的疏水性，通过如下方法进行了实验。

具体地，利用1X的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS，pH 7.2)清洗未涂敷乳酸菌益生菌对照组和按各个涂敷条件制备的乳酸菌益生菌实验组2次后，利用1X的磷酸盐缓冲溶液悬浮菌体以使OD₆₀₀＝0.5。悬浮制备的乳酸菌试样添加甲苯来混合(mixing)后，在37℃的恒温水浴(water bath)中处理20分钟，然后去除甲苯，测定水溶液层的OD₆₀₀值。乳酸菌益生菌的疏水性通过下述式来计算。

结果如表4所示。

表4

如表4所示，当利用丝素蛋白涂敷乳酸菌时，与未涂敷对照组相比，确认具有菌体的疏水性得以提高的效果。并且，与利用酸水解法制备的丝素蛋白相比，当利用酶分解法制备的丝素蛋白涂敷乳酸菌菌体时，乳酸菌益生菌的疏水性整体上高，尤其，在利用用发酵酒精预处理的丝素蛋白涂敷乳酸菌菌体的情况下，确认菌体的疏水性进一步得以提高。

实验例3：根据丝素蛋白涂敷方法的乳酸菌菌体的表面ζ电位

被称为电动势(electrokinetic potential)的ζ电位(zeta potential)是指由电动现象引起的跨电双层的流动层的电位差。不能直接测量膜表面的点位，但可通过实验测量ζ电位以掌握表面的电化学性质(Chemistry of the solid-water interface，JohnWiley&Sons，Inc，1992)。这种ζ电位时判断分散状态的例子的稳定性或凝集的重要参数，当摄取乳酸菌益生菌时，在确认产品在体内的效果中可具有重要意义。在细颗粒或胶体的情况下，若ζ电位的绝对值增加，则粒子之间的排斥力增加，由此颗粒的稳定性增加，但ζ电位接近0，因此粒子易于凝集。本发明计算通过计算并使用通过使用ζ电位分析仪(zetapotential analyzer)测量5次的分析结果的平均值，上述ζ电位分析仪利用相分析光散射(phase analysis light scattering，PALS)技术。

具体地，以作为人工模仿肠道环境的实验条件的水溶液状态制备各个未涂敷(对照区)、涂敷丝素蛋白(实验区1)、涂敷发酵酒精预处理丝素蛋白(实验区2)及复合涂敷丝素蛋白及纤维素(实验区3)乳酸菌益生菌并确认ζ电位值。

结果如图4所示。

如图4所示，在人工胃液条件(2.0g的氯化钠、24.0ml/L的稀盐酸、pH 1.2条件下的水溶液)下，与对照组相比，确认涂敷丝素蛋白或发酵酒精预处理丝素蛋白的乳酸菌益生菌的ζ电位值减小(实验组1，实验组2)，在复合涂敷预处理丝素蛋白及纤维素的乳酸菌益生菌中更低(实验组3)。

而且，在人工肠液条件(含0.3％的胆汁酸的pH 7.0条件下的水溶液)下，所有实验组的ζ电位均显示为负值。与对照组相比，确认在涂敷丝素蛋白或发酵酒精预处理丝素蛋白的乳酸菌益生菌中ζ电位绝对值渐减小(实验组1，实验组2)，但在复合涂敷预处理丝素蛋白及纤维素的乳酸菌益生菌中ζ电位绝对值反而增加。这些结果间接表明，在人工肠液条件下，涂敷丝素蛋白的乳酸菌菌体的疏水增加，当复合涂敷纤维素时疏水性减少。

因此，通过测定ζ电位值，实验性地确认，利用本发明的丝素蛋白和纤维素复合涂敷的乳酸菌益生菌在人工胃液条件下，可通过强烈的凝集力来提高乳酸菌菌体的存活率，在到达小肠和大肠的时间点，因纤维素层被洗脱而ζ电位绝对值降低，因此丝素蛋白涂敷乳酸菌的肠道定殖性增加，并且在肠道环境中稳定生存的可能性高。

实验例4：根据丝素蛋白涂敷方法的乳酸菌菌体的黏蛋白结合能力

微生物的附着能力与细胞壁的静电平衡、范德华键及疏水性有关。已知疏水性是细胞附着在粘膜或上皮细胞的重要因素(Environ Microbiol，2000，Vol.66(6)，pp.2548-2554；International Dairy Journal，2005，Vol.15，pp.1289-1297)。

尤其，肠道上皮细胞通过产生一种称为黏蛋白白的凝胶状物质来形成保护肠壁的膜，作为肠道粘膜成分的黏蛋白可与乳酸菌疏水结合，因此，预期具有疏水性特征高的乳酸菌的肠道内附着能力也优秀。为此，在本发明中，通过评价对上述各乳酸菌的作为肠道粘膜成分的黏蛋白的附着能力来确认黏蛋白与乳酸菌菌体的结合能力。黏蛋白附着能力实验方法应用了Munoz-Provencio(Gastroenterology.1998，Vol.115，pp 874-882)。

首先，在已知作为酶联免疫吸附测定(ELISA)板的Maxisorb板中分别接种200μL的II型猪胃粘蛋白(porcine stomach mucin，typeⅡ)(西格玛(sigma))后在4℃的温度下附着24小时。然后，如表3所示，将涂敷丝素蛋白的乳酸菌益生菌和未涂敷的益生菌悬浮至OD₆₀₀＝0.5后，在涂有黏蛋白的Maxisorb板中分别接种200μL后在4℃的温度下反应过夜(12小时以上)。反应后，利用磷酸盐缓冲溶液清洗5次后去除未附着在黏蛋白的乳酸菌菌体，并用龙胆紫(crystal violet)染色后测定OD₆₂₀处的吸光度。

结果如图5所示。

如图5所示，黏蛋白结合能力按对照组、实验组1、实验组3及实验组2的顺序增加，预处理丝素蛋白，从而黏蛋白结合能力大幅增加，与利用通过预处理工序制备的丝素蛋白涂敷的乳酸菌益生菌的黏蛋白结合能力相比，当复合适用纤维素时小幅下降。

实验例5：根据丝素蛋白涂敷方法的乳酸菌菌体的肠道上皮细胞附着能力

为了确认通过丝素蛋白涂敷方法制备的乳酸菌益生菌的肠道上皮细胞附着能力，利用人结肠肉瘤细胞系HT-29确认与此有关的乳酸菌的附着能力。

向DMED培养基中添加10％的胎牛血清(fetal calf serum，FCS)及抗生素(100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素)来用作HT-29细胞系培养基，用磷酸盐缓冲溶液清洗在该培养基中形成单分子层(Monolayer)的HT-29细胞后，以5×10⁸个/ml的细胞数接种于6-孔板中。以1×10⁹/ml的浓度将各个乳酸菌益生菌悬浮于磷酸盐缓冲溶液后分别接种于孔板中，并在5％的CO₂、37℃的条件下与HT-29细胞一起培养2小时。完成培养后，用磷酸盐缓冲溶液清洗5次并去除未附着的乳酸菌后，通过处理0.05％的胰蛋白酶、0.02％的乙二胺四乙酸(EDTA)2分钟来分离未附着在孔板中的HT-29细胞和乳酸菌。利用稀释水通过十进制法稀释分离的细胞并培养于MRS或BL琼脂板后测定益生菌数(Trends.Food.Sci.Technol.，1999，Vol.10，pp 405-410；Korean Soc.Food.Sci.Nutr.，2016，Vol.45，pp 12-19)。

通过下述式计算上皮细胞附着率。

进一步地，为了从视觉上确认肠道上皮细胞和乳酸菌菌体的附着程度，利用LIVE/DEAD BacLight细菌细胞活性测定试剂盒(

BacLight^TMBacterialViability kit)荧光染色乳酸菌菌体后利用光学显微镜观察。

肠道上皮细胞附着率的结果如图6所示。

如图6所示，与对照组相比，确认涂敷丝素蛋白时HT-29细胞系附着能力增加，当涂敷经预处理工序的丝素蛋白时进一步增加。但是，与通过利用适用预处理工序的丝素蛋白来涂敷制备的乳酸菌益生菌相比，对与适用预处理工序的丝素蛋白一起复合涂敷纤维素的HT-29细胞的附着能力小幅减少。

实验例6：根据丝素蛋白涂敷方法的乳酸菌菌体的肠道环境稳定性

为了评价根据丝素蛋白涂敷方法的乳酸菌益生菌的肠道环境稳定性，对各个原料的耐酸性和耐胆汁性进行实验。

为了测定耐酸性，将益生菌暴露于pH 2.5和pH 2.0的人工胃液条件后，分析了益生菌数。具体地，人工胃液条件使用了食品食物崩解试验中的人工胃液条件(2.0g的氯化钠、24.0ml/L的稀盐酸、pH 1.2)并将人工胃液条件调节至最终pH 2.0、pH 2.5后，暴露于10％浓度的益生菌粉末中。考虑到胃收缩运动，使用跳舞机(Dancing machine)((株)BMS)每分钟执行100次往复运动以暴露于与胃肠道环境类似的条件下，考虑到通过胃的时间，暴露时间在2小时内进行。在将pH调节至7.0后，根据常规益生菌数测定方法分析暴露于人工胃液条件下的实验组。

另一方面，耐胆汁性使用无菌过滤的0.5％的胆汁酸培养基，添加10％的浓度的益生菌粉末来反应2小时后，根据常规的方法测定益生菌数。

结果如表5(根据乳酸菌涂敷方法的肠道环境存活率(％))所示。

表5

如表5所示，利用发酵酒精丝素蛋白涂敷乳酸菌，上乳酸菌益生菌的耐酸性和耐胆汁性整体上增加。在pH 2.0的条件下，与实验组3的未涂敷相比，确认嗜热链球菌CKDB021菌株和两歧双歧杆菌CKDB001、屎肠球菌CKDB003、乳双歧杆菌CKDB005、嗜酸乳杆菌CKDB007菌的耐酸性均增加最多2倍以上。在人工肠液条件下，耐胆汁性也倾向于根据丝素蛋白涂敷整体上增加，在乳双歧杆菌CKDB005、嗜酸乳杆菌CKDB007菌株的情况下，当以实验组2的条件涂敷时存活率最优秀。由此，涂敷丝素蛋白或发酵酒精预处理的丝素蛋白或者在此复合涂敷纤维素的情况下，乳酸菌益生菌的耐酸性或耐胆汁性大大增加。

实验例7：根据丝素蛋白涂敷方法的乳酸菌菌体的储藏稳定性

在乳酸菌益生菌的情况下，少则12个月、多则24个月的流通器件应保持并保存一定数量以上的益生菌。

通产，作为肠球菌类的屎肠球菌(E.faecium)、粪肠球菌(E.faecalis)等双球菌的乳酸菌菌体的情况下，当暴露于高温、高湿的条件下时，具有高稳定性，但是，在大多数乳酸菌菌体的情况下，当暴露于高温、高湿的条件下时，稳定性显著减少。

在本发明中，为了确认乳酸菌益生菌的储藏稳定性，以50g单位分别分为聚乙烯袋(Polyethylene bag)(里面(inner))&铝袋(aluminum bag)(外面(outer))，并保管在苛刻条件(温度为45℃、湿度为75％)，并按储藏时间段收集试样以确认益生菌数。

结果如表6(根据乳酸菌涂敷方法的储藏稳定性(％))所示。

表6

如表6所示，在乳双歧杆菌(B.lactis)、屎肠球菌(E.faecium)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)菌种的情况下，确认通过利用丝素蛋白的涂敷工序在苛刻条件下稳定性大幅增加，此外，两歧双歧杆菌(B.bifidum)、嗜热链球菌(S.thermophilus)菌种在苛刻条件下也略有增加。

[保藏编号]

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

保藏编号：KCTC13114BP

保藏日期：2016年9月23日

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

保藏编号：KCTC13115BP

保藏日期：2016年9月23日

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

保藏编号：KCTC13116BP

保藏日期：2016年9月23日

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

保藏编号：KCTC13117BP

保藏日期：2016年9月23日

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

保藏编号：KCTC13118BP

保藏日期：2016年9月23日

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根据实施细则第7.1款发行的

对于原始保藏的收条

保藏人：

钟根堂BIO(株)

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大韩民国，京畿道，安山市，檀园区，Shinwon路292(15604)

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PCT/RO/134表

Claims (14)

1.一种组合物，其特征在于，包含涂敷有丝素蛋白的乳酸菌。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，利用丝素蛋白及纤维素涂敷上述乳酸菌。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述丝素蛋白为利用乙醇预处理的丝素蛋白。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述乙醇的浓度为85％(v/v)以上。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述乳酸菌为选自由乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、链球菌属及双歧杆菌属组成的组中的乳酸菌。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，上述乳酸菌为选自由嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸乳球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌及乳双歧杆菌组成的组中的乳酸菌。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，上述乳酸菌为选自由保藏编号为KCTC13117BP的嗜酸乳杆菌CKDB007、保藏编号为KCTC13115BP的屎肠球菌CKDB003、保藏编号为KCTC13118BP的嗜热链球菌CKDB021、保藏编号为KCTC13114BP的两歧双歧杆菌CKDB001及保藏编号为KCTC13116BP的乳双歧杆菌CKDB005组成的组中的乳酸菌。

8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述组合物选自由食品组合物、益生菌组合物、药剂学组合物及饲料用组合物组成的组中。

9.一种促进乳酸菌的培养的方法，其特征在于，包括在添加丝素蛋白的培养基中培养乳酸菌的步骤。

10.一种涂敷有丝素蛋白的乳酸菌益生菌的制备方法，其特征在于，包括在包含丝素蛋白的乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌的步骤。

11.根据权利要求10所述的涂敷有丝素蛋白的乳酸菌益生菌的制备方法，其特征在于，上述乳酸菌培养用培养基还包含水溶性钙。

12.根据权利要求11所述的涂敷有丝素蛋白的乳酸菌益生菌的制备方法，其特征在于，相对于乳酸菌培养用培养基的体积，添加0.01％(w/v)至5％(w/v)浓度的上述水溶性钙。

13.根据权利要求10所述的涂敷有丝素蛋白的乳酸菌益生菌的制备方法，其特征在于，上述乳酸菌培养用培养基还包含纤维素。

14.一种增加乳酸菌的存活率、储藏稳定性、耐酸性或耐胆汁性以及肠道上皮细胞附着能力的方法，其特征在于，包括在包含丝素蛋白的乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌的步骤。

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