CN114517168B - 一种抗肿瘤的乳酸菌发酵海参肽制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

一种抗肿瘤的乳酸菌发酵海参肽制剂及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有抗肿瘤功效的益生菌发酵的海参肽制剂及其制备方法和用途，属于海洋生物制品技术领域。本发明通过特定的益生菌鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌24‑7，对海参肽进行发酵，获得分子量更小、生物活性更好的小分子多肽制剂，所述的多肽制剂能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，且能够抑制肿瘤的发生和发展，具有良好的应用前景。

Description

一种抗肿瘤的乳酸菌发酵海参肽制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及海洋生物制品技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤功效的益生菌发酵的海参肽制剂及其制备方法和用途。
背景技术
海参属于无脊椎动物、棘皮动物门、海参纲，其含有海参皂苷、海参多糖、海参胶原蛋白和海参肽等多种成分，并且具有多种生物活性。海参肽是从海参中提取出的具有多种生物功能的活性物质，具有抗氧化性、提高免疫力、降血压、抗菌、抗疲劳以及降血糖等功能。但是已有报道的海参肽多采用海参多肽，而针对分子量小于1000Da甚至更小的海参活性低聚肽的研究还较少。
生物活性肽是具有复杂线性关系和环形结构的二肽到多肽的总称，二十种氨基酸可以组成蛋白质，其以不同的结构和排列也可以组成生物活性肽。其分子量一般情况下小于5000Da，从蛋白质中得到，在生物机体内具有特殊的生物活性功能，如调节机体内生理功能，影响部分蛋白质的核查，还可以作为运输工具，运输各种对机体有益的营养物质、微生物以及微量元素等的神经、激素、生殖和细胞生长等领域的生理代谢功能。
海参肽是生物活性肽中的一种，目前主要的制备方法是通过蛋白酶水解海参，再经过进一步的分离或者更进一步的纯化精制措施后得到的小分子肽，也会含有许多其它的蛋白质水解产物，而且具有不同的活性功能，一般由十个以下的氨基酸构成，分子量在2000Da左右。活性微生物菌体的生化代谢可以修饰某些功能基团；活性微生物菌体可以合成、分泌小肽物质；微生物发酵法不同于酶法，酶法只是简单的切割肽键；通过微生物的代谢、发酵可以合成许多复杂的初级代谢产物和次级代谢产物，但酶法不能。例如，专利CN201810961331.X公开了一种海参肽的制备方法，其采用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶组成的复合中性蛋白酶保温酶解得到酶解产物，可有效清除海参原料中的有害重金属，得到小分子海参肽。专利CN202111090296.7则公开了一种海参肽，来源于刺参，其氨基酸序列为WDGVGSGR，其活性高、生物相容性好、安全无毒副作用，对于酪氨酸酶活性和黑色素合成具有抑制作用，能够用于制备美白产品中。
通过特定的益生菌对海参原料，尤其是酶法获得的海参肽进行后续的发酵处理，获得分子量更小、种类更多、生物活性更好的小分子活性肽（小于1000Da），拓宽海参肽的适应症及促健康效果，是未来发展的趋势。因此，亟需提供一种益生菌，用于海参肽制剂的制备及生产。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种具有抗肿瘤功效的益生菌发酵的海参肽制剂及其制备方法和用途。本发明通过特定的益生菌鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌24-7，对海参肽进行发酵，获得分子量更小、生物活性更好的小分子多肽制剂，所述的多肽制剂能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，且能够抑制肿瘤的发生和发展，具有良好的应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌，所述的鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）L12，所述的鼠李糖乳杆菌L12于2021年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21570。
另一方面，本发明提供了上述鼠李糖乳杆菌L12在制备海参肽中的应用。
又一方面，本发明提供了上述鼠李糖乳杆菌L12的发酵产物，所述的发酵产物为海参肽。
作为非限制被申请保护范围的说明，发酵产物可以直接使用，也可以保存后备用，一种推荐的保存方法为：将发酵液灭菌后，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥为在-60℃下预冷2-4h后，在真空度为4Pa下冷冻干燥20-26h。
作为一个示例性的实施方式，可利用鼠李糖乳杆菌L12发酵制备海参肽。
作为一个示例性的实施方式，发酵方法的具体步骤如下：
发酵体系中，海参肽冻干粉质量占10%，作为唯一氮源；碳源的添加选自：乳糖、蔗糖和果葡糖浆中的一种或多种，所述添加物质的添加量为所述海参肽发酵体系总质量的0.5-5.0%。所述的鼠李糖乳杆菌L12的初始浓度为2.0-5.0×106CFU/L，发酵时间为8-12小时，发酵温度为37±1℃。
又一方面，本发明提供了上述鼠李糖乳杆菌L12和/或鼠李糖乳杆菌L12发酵产物在制备预防、治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
又一方面，本发明提供了一种预防、治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物，所述的药物包含上述鼠李糖乳杆菌L12和/或利用鼠李糖乳杆菌L12制备得到的海参肽发酵产物。
具体地，所述的药物可口服给药。
具体地，所述的口服给药剂型包括但不限于：胶囊剂、片剂、粉剂、冲剂、颗粒剂、乳剂、混悬剂、丸剂、散剂。
又一方面，本发明提供了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）24-7在制备海参肽中的应用。
具体地，所述的植物乳杆菌24-7保藏编号为CGMCC No.15780，于2018年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所（具体详见专利CN201810941395.3，该专利于2020.01.31申请人由甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司变更为哈尔滨美华生物技术股份有限公司）。
又一方面，本发明提供了植物乳杆菌24-7的发酵产物，所述的发酵产物为海参肽。
作为非限制被申请保护范围的说明，发酵产物可以直接使用，也可以保存后备用，一种推荐的保存方法为：将发酵液灭菌后，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥为在-60℃下预冷2-4h后，在真空度为4Pa下冷冻干燥20-26h。
作为一个示例性的实施方式，可利用植物乳杆菌24-7发酵制备海参肽。
作为一个示例性的实施方式，发酵方法的具体步骤如下：
发酵体系中，海参肽冻干粉质量占10%，作为唯一氮源；碳源的添加选自：乳糖、蔗糖和果葡糖浆中的一种或多种，所述添加物质的添加量为所述海参肽发酵体系总质量的0.5-5.0%。所述的植物乳杆菌24-7的初始浓度为2.0-5.0×106CFU/L，发酵时间为8-12小时，发酵温度为37±1℃。
又一方面，本发明提供了植物乳杆菌24-7和/或植物乳杆菌24-7发酵产物在制备预防、治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
又一方面，本发明提供了一种预防、治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物，所述的药物包含植物乳杆菌24-7和/或利用植物乳杆菌24-7制备得到的海参肽发酵产物。
具体地，所述的药物可口服给药。
具体地，所述的口服给药剂型包括但不限于：胶囊剂、片剂、粉剂、冲剂、颗粒剂、乳剂、混悬剂、丸剂、散剂。
又一方面，本发明提供了一种益生菌组合物，所述的益生菌组合物包括上述鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌24-7。
又一方面，本发明提供了上述益生菌组合物在制备海参肽中的应用。
又一方面，本发明提供了上述益生菌组合物的发酵产物，所述的发酵产物为海参肽。
作为非限制被申请保护范围的说明，发酵产物可以直接使用，也可以保存后备用，一种推荐的保存方法为：将发酵液灭菌后，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥为在-60℃下预冷2-4h后，在真空度为4Pa下冷冻干燥20-26h。
作为一个示例性的实施方式，可利用上述益生菌组合物即鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌24-7发酵制备海参肽。
作为一个示例性的实施方式，发酵方法的具体步骤如下：
发酵体系中，海参肽冻干粉质量占10%，作为唯一氮源；碳源的添加选自：乳糖、蔗糖和果葡糖浆中的一种或多种，所述添加物质的添加量为所述海参肽发酵体系总质量的0.5-5.0%。
具体地，所述的鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌24-7的菌数比例为1:0.1-3，优选为1:0.5-2，进一步优选为1:1。
具体地，所述的鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌24-7的初始浓度均为2.0-5.0×106CFU/L，发酵时间为8-12小时，发酵温度为37±1℃。
又一方面，本发明提供了上述益生菌组合物和/或上述益生菌组合物的发酵产物在制备预防、治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
又一方面，本发明提供了一种预防、治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物，所述的药物包含上述益生菌组合物和/或利用上述益生菌组合物制备得到的海参肽发酵产物。
具体地，所述的药物可口服给药。
具体地，所述的口服给药剂型包括但不限于：胶囊剂、片剂、粉剂、冲剂、颗粒剂、乳剂、混悬剂、丸剂、散剂、滴丸。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
（1）本发明从婴儿肠道分离筛选得到一株鼠李糖乳杆菌L12，所述的鼠李糖乳杆菌L12于2021年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.21570。
（2）本发明所述鼠李糖乳杆菌L12来源于婴儿肠道，植物乳杆菌24-7分离自青藏高原牦牛酸奶，其在我国都被列为食品可用菌，可直接用于食品，安全且无任何毒副作用。本发明所述的益生菌组合物安全性好、针对性强、无毒副作用、价格低廉且能够实现工业化生产，具有良好的应用前景。
（3）利用本发明披露的鼠李糖乳杆菌L12制备得到的海参肽产物具备如下性能：明显抑制肿瘤细胞的增殖、生长及转移，且明显优于各对照组。
利用本发明披露的植物乳杆菌24-7制备得到的海参肽产物具备如下性能：明显抑制肿瘤细胞的增殖、生长及转移，且明显优于各对照组。
利用本发明披露的鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌24-7制备得到的海参肽产物具备如下性能：明显抑制肿瘤细胞的增殖、生长及转移，且明显优于各对照组。
通过特定菌株的发酵后，此发酵液具备更多生物活性小肽，能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，并能够抑制小鼠肝癌的发生发展。
保藏说明
分类命名：鼠李糖乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus rhamnosus
参椐的生物材料：L12
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2021年12月31日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21570。
分类命名：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus plantarum
参椐的生物材料：24-7
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2018年5月21日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15780。
附图说明
图1为不同乳酸杆菌发酵海参肽所得小肽（2-4个氨基酸）所占百分比示意图。
图2为不同乳酸杆菌发酵海参肽所得发酵液对肝癌细胞（HepG2）的抑制作用示意图。
图3为不同乳酸杆菌发酵海参肽所得发酵液对结肠癌细胞（HCT116）的抑制作用示意图。
图4为不同乳酸杆菌发酵海参肽所得发酵液对肺癌细胞（A549）的抑制作用示意图。
图5为不同乳酸杆菌发酵海参肽所得发酵液对胃癌细胞（SGC-7901）的抑制作用示意图。
图6为鼠李糖乳杆菌L12联合植物乳杆菌24-7的海参肽发酵液抑制肿瘤细胞的迁移示意图。
图7为鼠李糖乳杆菌L12联合植物乳杆菌24-7的海参肽发酵液诱导肿瘤细胞的调亡示意图。
图8为鼠李糖乳杆菌L12联合植物乳杆菌24-7的海参肽发酵液抑制小鼠肿瘤的生长和转移示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请中，用于进行微生物发酵海参肽的海参原料可以为任意自行制备或通过合法商业途径购买获得的海参、海参提取物、海参肽产品。
实施例1 鼠李糖乳杆菌L12及植物乳杆菌24-7的培养
MRS培养基成分如下：蛋白胨10.0g；牛肉膏10.0g；酵母膏5.0g；柠檬酸氢二铵2.0g；葡萄糖20.0g；吐温80，1.0mL；乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0g；磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0g；硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.58g；硫酸锰（MnSO4·H2O） 0.25g；蒸馏水1000mL；调至pH6.2-6.6。
将鼠李糖乳杆菌L12或植物乳杆菌24-7在上述培养基中培养18-24小时后，离心收取菌沉淀，弃上清，再用PBS缓冲液重悬菌体，备用。
实施例2 海参肽初步提取
选用新鲜优质海参，除去内脏得到鲜参体；（2）鲜参体加入纯净水，加热煮沸，并保持沸腾10分钟，使蛋白变性；冷却破碎成小块，并重新加热至40-50℃后，加入中性蛋白酶，温度40-70℃，酶解时间10-12h，然后加热煮沸使酶失活；粗过滤并醇沉，用30-50目的丝绢进行粗过滤，加95%（V/V）酒精，使体系中酒精含量达到60-70%（V/V），静置10小时，用100目的滤布过滤，分离沉淀，收集滤液；真空浓缩滤液，浓缩条件为：温度30-50℃，绝对压力1000-5000Pa，当浓缩液体积达到滤液体积的1/10左右，即可；静置沉淀，浓缩液中加入浓度为18-20%的单宁溶液，加入量为浓缩液体积的3-6%，静置沉淀3-5小时，100目滤布过滤，除去沉淀，收集滤液；过滤，滤液中加入粉末状活性炭，加入量为滤液体积的1-3%（w/V），将体系加热到50-80℃，维持1-2小时；用100目滤布过滤，并收集滤液，将滤液真空浓缩至原体积的1/3-1/5；冷冻干燥，浓缩液真空冷冻干燥，得淡黄色粉末，即为分子量不超过2000Da的海参肽产品。
实施例3 应用乳酸菌发酵海参肽
发酵体系中，实施例2制备的海参肽冻干粉质量占10%，作为唯一氮源；碳源的添加选自：乳糖、蔗糖和果葡糖浆中的一种或多种，以乳糖为例，其添加量为所述海参肽发酵体系总质量的1%。鼠李糖乳杆菌L12与植物乳杆菌24-7的菌数比例为1:1，发酵体系中，两种乳酸菌的初始浓度均为4.0×106 CFU/L，发酵时间为12小时，发酵温度为37℃。
同时以单独鼠李糖乳杆菌L12（初始接种浓度8.0×106 CFU/L）、单独植物乳杆菌24-7（初始接种浓度8.0×106 CFU/L）、其他鼠李糖乳杆菌（鼠李糖乳杆菌CGMCC1.8882）联合其他植物乳杆菌（植物乳杆菌CGMCC1.573）（两种乳酸菌的初始浓度均为4.0×106 CFU/L）、嗜酸乳杆菌CGMCC1.2686（初始接种浓度8.0×106 CFU/L）、长双歧杆菌CGMCC1.5082（初始接种浓度8.0×106 CFU/L）、副干酪乳杆菌CGMCC1.570（初始接种浓度8.0×106 CFU/L）做对照，按照同样的发酵体系进行海参肽发酵，分析不同乳杆菌发酵海参肽生成小肽的区别。
检测结果如图1所示，发酵液经过质谱分析发现，在鼠李糖乳杆菌L12与植物乳杆菌24-7联合发酵海参肽组，发酵液中小肽（2-4个氨基酸）的比例明显多于其他乳酸菌发酵组。
实施例4 应用乳酸菌发酵海参肽
发酵体系中，实施例2制备的海参肽冻干粉质量占10%，作为唯一氮源；碳源的添加选为蔗糖，所述蔗糖的添加量为所述海参肽发酵体系总质量的0.5%。鼠李糖乳杆菌L12与植物乳杆菌24-7的菌数比例为1:1，发酵体系中，两种乳酸菌的初始浓度均为2.0×106 CFU/L，发酵时间为12小时，发酵温度为37℃。
实施例5 应用乳酸菌发酵海参肽
发酵体系中，实施例2制备的海参肽冻干粉质量占10%，作为唯一氮源；碳源的添加选为果葡糖浆，所述添加物质的添加量为所述海参肽发酵体系总质量的5.0%。鼠李糖乳杆菌L12与植物乳杆菌24-7的菌数比例为1:1，发酵体系中，两种乳酸菌的初始浓度均为5.0×106 CFU/L，发酵时间为8小时，发酵温度为37℃。
实验例1 乳酸菌发酵液对肿瘤细胞的抑制作用
为了进一步研究鼠李糖乳杆菌L12及植物乳杆菌24-7联合发酵海参肽的发酵产物抑制肿瘤细胞增殖的能力，选取了肝癌细胞（HepG2）、结肠癌细胞（HCT116）、肺癌细胞（A549）、胃癌细胞（SGC-7901），设置鼠李糖乳杆菌L12及植物乳杆菌24-7联合发酵液（制备方法如上述实施例3）组，同时设置单独鼠李糖乳杆菌L12、单独植物乳杆菌24-7、其他鼠李糖乳杆菌（鼠李糖乳杆菌CGMCC1.8882）联合其他植物乳杆菌（植物乳杆菌CGMCC1.573）、嗜酸乳杆菌CGMCC1.2686、长双歧杆菌CGMCC1.5082、副干酪乳杆菌CGMCC1.570的海参肽发酵液作为对照。
各肿瘤细胞培养均为常规方法，具体检测步骤如下：
（1）将长满培养瓶的HepG2、HCT116、A549以及SGC-7901细胞消化完全，加入DMEM培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并制成细胞悬液，800r/min离心5min。
（2）弃上清，加入适量的培养基重悬，吸取20μL细胞至计数区域，在细胞计数仪下计数。将细胞密度调整至1×104个/mL。
（3）每孔加入100μL调整过密度的细胞悬液至96孔板中，令细胞在孔板中分布均匀，将96孔板放入37℃含5% CO2的细胞培养箱中培养。
（4）细胞贴壁后，吸弃96孔板孔内的细胞培养基。向实验孔中分别加入浓度为200μg/mL的发酵液，并向对照孔中重新加入新鲜培养基。将96孔板继续放入细胞培养箱中培养48h。
（5）发酵液作用结束后，每孔加入10μL WST-1溶液，在细胞培养箱中孵育1-2h。使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
检测结果如图2-5所示，结果发现鼠李糖乳杆菌L12及植物乳杆菌24-7联合发酵液（200μg/mL）与HepG2、HCT116、A549以及SGC-7901四种癌细胞作用48小时后可以明显抑制细胞增殖，癌细胞的活力显著降低。其他不同发酵液以相同浓度（200μg/mL）对这四种肿瘤细胞的抑制效果明显低于鼠李糖乳杆菌L12及植物乳杆菌24-7联合发酵液。
实验例2 鼠李糖乳杆菌L12联合植物乳杆菌24-7的海参肽发酵液抑制肿瘤细胞的迁徙
以肝癌细胞（HepG2）为例，检测鼠李糖乳杆菌L12联合植物乳杆菌24-7的海参肽发酵液抑制细胞的迁徙。
划痕实验：检测细胞迁徙能力。0.1% Gelatin预包被培养板，铺细胞12小时后，设空白对照组及发酵液组。分别记录0、24小时细胞增殖情况，发现发酵液组的细胞迁徙能力下降，与空白组相比较差异显著（P<0.05）。检测结果详见附图6。
实验例3 鼠李糖乳杆菌L12联合植物乳杆菌24-7的海参肽发酵液诱导肝癌细胞的调亡
Western-blot方法检测细胞调亡，0.1% Gelatin预包被培养板，铺细胞12小时后，设空白对照组及发酵液组。检测24小时后cleaved capase-3表达，评价细胞凋亡水平。检测结果如图7所示。
由图7可知，发酵液处理的HepG2细胞的凋亡水平相比对照组细胞，cleavedcapase-3表达量有明显差异，说明发酵液能够促进凋亡。由此结合细胞增殖活性及迁徙能力结果分析，也进一步验证了发酵液通过促进了细胞凋亡，抑制了肿瘤细胞的生长增殖。
实验例4 鼠李糖乳杆菌L12联合植物乳杆菌24-7的海参肽发酵液抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长
（1）动物选择与分组及处理：
1）实验动物：BACB/c nu/nu雄性裸鼠，分为正常组、发酵液治疗组，每组10只。
2）处理方法：将1×106个对数期生长的HepG2细胞通过开腹手术的方法注射裸鼠肝脏，制作肝癌模型。
3）治疗组每日灌胃发酵液1mL，空白对照组用等量生理盐水灌胃。
4）根据以往经验4周后，通过B超观察后取肝脏组织。
（2）肝癌组织形态学观察：
成瘤后取肝脏，观察肝脏瘤体及转移情况，检测结果如附图8所示。
由图8可知，发酵液组的肝脏瘤体更小，并且与空白组相比，肝内转移更少，说明鼠李糖乳杆菌L12联合植物乳杆菌24-7的海参肽发酵液对肿瘤能起到一定的治疗作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）L12，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.21570。
2.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌L12在发酵海参肽中的应用。
3.一种益生菌组合物，其特征在于：所述的益生菌组合物包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）24-7，所述的植物乳杆菌24-7的保藏号为CGMCC No.15780。
4.权利要求3所述的益生菌组合物在发酵海参肽中的应用。
5.一种权利要求3所述的益生菌组合物的发酵产物，其特征在于：所述的发酵产物制备方法如下：
（1）在除去内脏的鲜参体中加入纯净水，加热煮沸，并保持沸腾10分钟，使蛋白变性；
（2）冷却破碎成小块，并重新加热至40-50℃后，加入中性蛋白酶，温度40-70℃，酶解时间10-12h，然后加热煮沸使酶失活；
（3）粗过滤并醇沉，用30-50目的丝绢进行粗过滤，加95%V/V酒精，使体系中酒精含量达到60-70%V/V，静置10小时，用100目的滤布过滤，分离沉淀，收集滤液；（4）真空浓缩滤液，浓缩条件为：温度30-50℃，绝对压力1000-5000Pa，当浓缩液体积达到滤液体积的1/10左右，即可；
（5）静置沉淀，浓缩液中加入浓度为18-20%的单宁溶液，加入量为浓缩液体积的3-6%V/V，静置沉淀3-5小时，100目滤布过滤，除去沉淀，收集滤液；
（6）过滤，滤液中加入粉末状活性炭，加入量为滤液体积的1-3%w/V，将体系加热到50-80℃，维持1-2小时；
（7）用100目滤布过滤，并收集滤液，将滤液真空浓缩至原体积的1/3-1/5；
（8）冷冻干燥，浓缩液真空冷冻干燥，得淡黄色粉末，即为分子量不超过2000Da的海参肽冻干粉；
（9）发酵：发酵体系中，海参肽冻干粉质量占10%，作为唯一氮源；碳源的添加选自：乳糖、蔗糖和果葡糖浆中的一种或多种，所述添加物质的添加量为所述海参肽发酵体系总质量的0.5-5.0%；采用鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌24-7进行发酵，所述的鼠李糖乳杆菌L12和植物乳杆菌24-7的菌数比例为1：1；所述鼠李糖乳杆菌L12的初始浓度为2.0×106-5.0×106CFU/L，所述植物乳杆菌24-7的初始浓度为2.0×106-5.0×106CFU/L，发酵时间为8-12小时，发酵温度为37±1℃。
6.权利要求5所述的发酵产物在制备预防、治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
7.一种预防、治疗和/或辅助治疗肿瘤的药物，其特征在于：所述的药物包含权利要求5所述的发酵产物。
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