CN100484963C - 干酪乳杆菌胞外多糖及其粗品、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干酪乳杆菌Lactobacillus casei胞外多糖，其主要由鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，其摩尔比为0.35～0.50∶1.00∶0.30～0.40∶0.90～1.00，该胞外多糖的平均重量分子量在5.0×10³～9.0×10⁶道尔顿之间。本发明还公开了一种含有上述干酪乳杆菌胞外多糖的粗品，该胞外多糖及其粗品的制备方法和在预防或抗高血压的饮食品、药品或保健品中的应用，以及含有干酪乳杆菌胞外多糖或其粗品的组合物。

Description

干酪乳杆菌胞外多糖及其粗品、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多糖，尤其涉及一种由干酪乳杆菌发酵产生的胞外多糖，该多糖的制备方法和在抗高血压方面的应用。

背景技术

众所周知，某些特定的微生物(如乳酸菌)在生长过程中，可以产生多种类型的多糖，根据这些多糖所处的位置，可以分为荚膜多糖和分泌到生长环境中的多糖，又称为胞外多糖。这些多糖对产生菌在自然环境中具有保护作用，可以使产生菌避免受到干燥、紫外辐射、渗透压变化、抗生素、噬菌体浸染所引起的伤害以及在体内抗吞噬作用。最近的研究发现，部分乳酸菌所产生的胞外多糖对人体健康具有重要的改善和促进作用，如抗肿瘤、抗消化道溃疡、免疫调节和降胆固醇作用，如Lactococcus lactis subsp.cremorisKVS20所产生的胞外多糖在体内通过免疫调节的方式抑制S-180(肉瘤-180)。因此，这些多糖成为具有特定生理活性物质的重要来源，开发和利用这些具有特定生理功能的乳酸菌胞外多糖成为药物研究和保健品生产的前沿。

申请号为03129450.2的专利申请公开了一种干酪乳杆菌LC2W，该干酪乳杆菌LC2W已于2002年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏(中国北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100080)，保藏登记号为CGMCC No.0828。该专利申请详细公开了干酪乳杆菌的筛选、分离和纯化及其在降血压方面的应用。

发明内容

本发明的目的之一是为了提供一种具有生物活性的多糖，该多糖为干酪乳杆菌Lactobacillus casei胞外多糖，其主要由鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，其摩尔比为0.35～0.50：1.00：0.30～0.40：0.90～1.00，该胞外多糖的平均重量分子量在5.0×10³～9.0×10⁶道尔顿之间。

本发明的干酪乳杆菌胞外多糖较佳地是由保藏号为CGMCC NO.0828的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC2W菌株产生。本发明的干酪乳杆菌胞外多糖除可以由保藏号为CGMCC NO.0828的干酪乳杆菌Lactobacillus caseiLC2W菌株产生外，还可以由其它的可以降低血压的干酪乳杆菌菌株产生，如由申请号为03129450.2的专利申请中筛选分离得到的干酪乳杆菌菌株产生，如Lactobacillus casei 01、Lactobacillus casei CG11等菌株。

其中，本发明的干酪乳杆菌胞外多糖较佳地是平均重量分子量在1.0×10⁶道尔顿以上的胞外多糖占35～50％，平均重量分子量在2.0×10⁵～1.0×10⁶道尔顿之间的胞外多糖占40～55％，平均重量分子量在2.0×10⁵道尔顿以下的胞外多糖占5.0～25％，以上百分比均指占总的胞外多糖的质量百分比。

在本发明的一较佳实施例中，本发明的干酪乳杆菌胞外多糖中的鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为0.50：1.00：0.40：0.98；平均重量分子量为8,727,196道尔顿的多糖占45.05％，平均重量分子量为485,651道尔顿的多糖占48.27％，平均重量分子量为46,029道尔顿的多糖占6.71％，以上均指占总的多糖的重量百分比，经离子交换和凝胶排阻层析分析得到。

在本发明的另一较佳实施例中，本发明的干酪乳杆菌胞外多糖中的鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为0.44：1.00：0.34：0.93；平均重量分子量为1,586,000道尔顿的胞外多糖占39.5％，平均重量分子量为383,933道尔顿的胞外多糖占48.27％，平均重量分子量为5,124道尔顿的胞外多糖占12.21％，经高效液相色谱分析得到。

本发明的干酪乳杆菌胞外多糖为一种纯白色的丝状物或粉末，在λ＝205nm处有强烈的吸收，在λ＝355nm处有微弱的吸收；10.0mg/mL的干酪乳杆菌胞外多糖水溶液澄清透明、无色、无味，pH值为4.90～5.10。

本发明的目的之二是提供一种干酪乳杆菌胞外多糖粗品，该干酪乳杆菌胞外多糖粗品包括55～95重量％本发明的干酪乳杆菌胞外多糖和5～45重量％的游离蛋白。

本发明的目的之三是提供一种干酪乳杆菌胞外多糖粗品的制备方法。该制备方法可以是本发明的干酪乳杆菌Lactobacillus casei按照现有技术内常规的培养方法培养得到发酵液，然后将发酵液采用常规的多糖分离方法分离得到的多糖粗品。

本发明较佳地采用下列制备方法：

1)将干酪乳杆菌Lactobacillus casei于20～40℃下，在无菌培养基中发酵16～72小时得发酵液；

其中，所述的无菌培养基含有0.0～10.0g/L酵母浸出物，0.0～60.0g/L的单糖、双糖和/或寡聚糖，0.0～10.0g/L蛋白胨和60.0～160.0g/L的脱脂奶粉，该无菌培养基在85～135℃下灭菌制成；

2)将上述发酵液在95～100℃加热10～30分钟，以灭活发酵液中使多糖发生降解的酶，然后离心或过滤获得发酵上清液；

3)加入2～4倍体积的80～100体积％乙醇于上述发酵上清液中，离心或过滤收集沉淀物，在温度不超过115℃下干燥得多糖粗品。

在本发明的一较佳实施例中，本发明的制备方法包括如下步骤：

1)将保藏号为CGMCC NO.0828的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC2W菌株于28～40℃下，在无菌培养基中发酵20～48小时得发酵液；

其中，所述的无菌培养基含有1.0～5.0g/L酵母浸出物，0.0～60.0g/L单糖、双糖和/或寡聚糖，0.0～10.0g/L蛋白胨和80.0～160.0g/L的脱脂奶粉；所述的单糖为葡萄糖和/或果糖，所述的双糖为蔗糖、乳糖和/或麦芽糖，所述的寡聚糖为玉米糖浆和/或麦芽糖浆，所述的蛋白胨为胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨和/或牛肉浸出物；

本发明的发酵温度优选28～37℃，更优选33℃；发酵时间优选22～40小时，更优选24小时；所述的无菌培养基中酵母浸出物的含量优选1.0～3.0g/L，更优选2.0g/L；脱脂奶粉的含量优选100.0～140.0g/L，更优选120.0g/L；

2)将上述发酵液在95～100℃加热10～15分钟，然后离心或过滤获得发酵上清液；

3)加入2～3倍体积的95体积％乙醇于上述发酵上清液中，离心或过滤收集沉淀物，在温度不超过105℃下干燥得多糖粗品。

在本发明的另一较佳实施例中，在本发明的制备方法的步骤1)之前，可以是将保存的干酪乳杆菌接种于上述培养基中，用同样的培养条件发酵得到含有多糖的发酵液；较佳地是将用平板培养活化后的干酪乳杆菌接种于上述培养基中，用同样的培养条件培养得到含有多糖的发酵液；更佳地是将保藏号为CGMCC NO.0828的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC2W菌株于20～40℃下，在上述无菌培养基中发酵6～48小时，获得发酵种子液，再按0.5～8体积％的接种量接种于上述无菌培养基中。在本发明的一较佳技术方案中，干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC2W菌株于30～37℃下，在上述无菌培养基中发酵20～26小时，获得发酵种子液，再按1～5体积％的接种量接种于上述无菌培养基中。在本发明的一更佳技术方案中，干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC2W菌株于33～35℃下，在上述无菌培养基中发酵24小时，获得发酵种子液，再按3体积％的接种量接种于上述无菌培养基中。

所获得的多糖粗品可以直接碾碎进行包装或作为胶囊、片剂生产的原料或多糖粉原料使用。

本发明的目的之四是提供一种干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其包括本发明的干酪乳杆菌胞外多糖粗品的制备方法，并将制得的干酪乳杆菌胞外多糖粗品进一步纯化的步骤，以去除蛋白和其它杂质。

该纯化步骤可以是现有技术中的任何分离纯化的步骤，较佳地是采用三氯乙酸法去除蛋白和透析法去除其它杂质。所述的三氯乙酸法为将胞外多糖粗品用80℃蒸馏水溶解，使其浓度为5～8％(w/w)，待溶液冷却至20℃时加入三氯乙酸，使三氯乙酸的最终质量浓度为10％，在0～8℃放置过夜，离心或过滤去除沉淀物。所述的透析法为将去除沉淀后的胞外多糖溶液用分子截留极限为6,000道尔顿的膜在0～8℃透析72小时，较佳地是中间多次换水。

透析后的多糖溶液还可以进一步采用凝胶排阻层析的方法进行纯化。

纯化后的多糖溶液可进行干燥获得以粉末状的多糖，干燥方法有热风干燥、低温干燥、冷风干燥、冷冻干燥、真空干燥、真空冷冻干燥等，较佳的干燥方法为冷风干燥、冷冻干燥、真空干燥或真空冷冻干燥。

本发明的目的之五是提供本发明的干酪乳杆菌胞外多糖或本发明的干酪乳杆菌胞外多糖粗品在制备预防或抗高血压的饮食品、药品或保健品中的应用。

本发明采用干酪乳杆菌菌株，通过发酵乳所获得的胞外多糖具有抗高血压作用，可用于生产具有抗高血压功能的产品，例如生产具有抗高血压功能的各种乳制品；该多糖既可以混合的形式存在于特定的产品中(乳品、饮料等)，也可以以多糖粉末的形式生产粉剂、胶囊或片剂等。

因此，本发明的目的之六是提供一种抗高血压的组合物，其包括有效量的本发明干酪乳杆菌胞外多糖或其粗品，以及生理学上可接受的载体。

其中，该生理学上可接受的载体是食品或保健品载体，比如酸乳、酸牛奶、乳酪、乳饮料或奶粉中的任何一种；该载体还可为各种药学上可接受的载体。

附图说明

图1为干酪乳杆菌LC2W胞外多糖在DEAE-Sepharose FF离子交换柱上的洗脱曲线图；其中，纵坐标为洗脱液经过硫酸-苯酚比色法在n＝490nm处的光吸收值OD，横坐标为洗脱时间。

图2为干酪乳杆菌LC2W胞外多糖对自发性高血压大鼠血压的影响图。

具体实施方式

实施例1

将保存的干酪乳杆菌LC2W接种到含有3.0g/L酵母浸出物和100.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于35℃培养24小时得到种子液。然后按3％(v/v)接种量转接到含有3.0g/L酵母浸出物、10.0g/L葡萄糖和120.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于35℃发酵24小时得到发酵液。然后通过加热将发酵液的温度提升至95℃以上，并保温10分钟，压滤获得发酵上清液。在经过预冷的上清液中加入3倍体积的95％(v/v)酒精，在6℃放置12小时，过滤收集沉淀物，经过冷冻干燥即可获得胞外多糖粗品。

将胞外多糖粗品(预留其1/3供实施例7之用)用80℃的蒸馏水充分溶解，使其浓度为8g/L。待冷却至20℃时，然后加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的最终浓度为10wt％，在4℃放置12小时后，于4℃、9,000rpm下离心20分钟去除沉淀物，收集上清液。收集的上清液采用分子截留极限为6,000Dalton的膜，在4℃透析72小时，中间换蒸馏水四次。经过透析后的多糖溶液(预留其1/3供实施例8之用)进行真空冷冻干燥，获得白色丝状的胞外多糖纯品(EPS-FM)。

实施例2

将保存的干酪乳杆菌LC2W接种到含有1.0g/L酵母浸出物、10.0g/L葡萄糖和100.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于35℃培养24小时得到种子液。然后按3％(v/v)接种量转接到含有3.0g/L酵母浸出物、10.0g/L葡萄糖和120.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于35℃发酵24小时得到发酵液。然后通过加热将发酵液的温度提升至95℃以上，并保温10分钟，待冷却到30℃以下后，4℃、8,000rpm离心15分钟，获得发酵上清液。在发酵上清液中加入3倍体积经过预冷的95％(v/v)酒精，在6℃放置12小时，4℃、8,000rpm离心15分钟收集沉淀物，经过冷冻干燥即可获得胞外多糖粗品。

将胞外多糖粗品(预留1/3供实施例7之用)用80℃的蒸馏水充分溶解，使其浓度为8g/L。待冷却至20℃时，然后加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的最终浓度为10wt％，在4℃放置12小时后，于4℃、9,000rpm下离心20分钟去除沉淀物，收集上清液。收集的上清液采用分子截留极限为6,000Dalton的膜，在4℃透析72小时，中间换蒸馏水四次。经过透析后的多糖溶液(预留其1/3供实施例8之用)进行真空冷冻干燥，获得白色丝状的胞外多糖纯品(EPS-FM)。

实施例3

从36℃、厌氧培养24小时的MRS琼脂上(MRS培养基，乳杆菌选择性培养基，Merck，Darmstadt，Germany)挑取新鲜培养的干酪乳杆菌LC2W菌落，转接到含有10.0g/L葡萄糖、3.0g/L酵母浸出物和100.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于37℃培养24小时，获得种子液。然后将上述种子液按3％体积比的接种量接种于含有10.0g/L葡萄糖、3.0g/L酵母浸出物和120.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于37℃培养24小时，获得LC2W多糖发酵液。将发酵液加热到95℃，保温15分钟，采用压滤的方式去除沉淀，收集发酵上清液。发酵上清液通过减压浓缩的方法(80℃，真空度700千帕)浓缩至原体积的1/3。待冷却至25℃以后，加入3倍体积95％(v/v)的酒精，在6℃静置12小时，用多层尼龙布过滤收集沉淀。沉淀后的酒精溶液通过蒸馏回收，可以反复使用。采用乙醇沉淀所得到的胞外多糖经过低温烘干(温度不超过105℃)，即获得胞外多糖粗品。

将胞外多糖粗品(预留1/3供实施例7之用)用80℃的蒸馏水充分溶解，使其浓度为8g/L。待冷却至20℃时，然后加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的最终浓度为10wt％，在4℃放置12小时后，于4℃、9,000rpm下离心20分钟去除沉淀物，收集上清液。收集的上清液采用分子截留极限为6,000Dalton的膜，在4℃透析72小时，中间换蒸馏水四次。经过透析后的多糖溶液(预留其1/3供实施例8之用)进行真空冷冻干燥，获得白色丝状的胞外多糖纯品(EPS-FM)。

实施例4

将保存的干酪乳杆菌LC2W接种到含有10.0g/L酵母浸出物、10.0g/L蔗糖和80.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于28℃培养24小时得到种子液。然后按0.5％(v/v)接种量转接到含有5.0g/L酵母浸出物、1.0g/L蛋白胨(大豆蛋白胨)、10.0g/L玉米糖浆和120.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于35℃发酵48小时得到发酵液。然后通过加热将发酵液的温度提升至100℃以上，并保温20分钟，待冷却到30℃以下后，4℃、8,000rpm离心15分钟，获得发酵上清液。在上清液中加入3倍体积经过预冷的95％(v/v)酒精，在6℃放置12小时，4℃、8,000rpm离心15分钟收集沉淀物，经过冷冻干燥即可获得胞外多糖粗品。

胞外多糖粗品(预留1/3供实施例7之用)用80℃的蒸馏水充分溶解，使其浓度为8g/L。待冷却至20℃时，然后加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的最终浓度为10％(w/w)。在4℃放置12小时后，于4℃、9,000rpm下离心20分钟去除沉淀物，收集上清液。收集的上清液采用分子截留极限为6,000Dalton的膜，在4℃透析72小时，中间换蒸馏水四次。经过透析后的多糖溶液(预留其1/3供实施例8之用)进行真空冷冻干燥，获得白色丝状的胞外多糖纯品。

实施例5

将保存的干酪乳杆菌LC2W接种到含有1.0g/L酵母浸出物、10.0g/L麦芽糖和160.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于20℃发酵72小时得发酵液。然后通过加热将发酵液的温度提升至95℃以上，并保温30分钟，压滤获得发酵上清液。在经过预冷的发酵上清液中加入2倍体积的100％(v/v)酒精，在6℃放置12小时，过滤收集沉淀物，经过冷风干燥即可获得胞外多糖粗品。

胞外多糖粗品用80℃的蒸馏水充分溶解，使其浓度为8g/L。待冷却至20℃时，然后加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的最终浓度为10wt％，在4℃放置12小时后，于4℃、9,000rpm下离心20分钟去除沉淀物，收集上清液。收集的上清液采用分子截留极限为6,000Dalton的膜，在4℃透析72小时，中间换蒸馏水四次。经过透析后的多糖溶液进行真空冷冻干燥，获得白色丝状的胞外多糖纯品。

实施例6

将保存的干酪乳杆菌LC2W接种到含有10g/L蛋白胨(牛肉浸出物)和60.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于35℃培养24小时得到种子液。然后按8％(v/v)接种量转接到含有1.0g/L酵母浸出物、5.0g/L蛋白胨(胰蛋白胨)、60.0g/L果糖和100.0g/L脱脂奶粉的无菌培养基中，于40℃发酵16小时得发酵液。然后通过加热将发酵液的温度提升至100℃，并保温10分钟，4℃、8,000rpm离心15分钟获得发酵上清液。在经过预冷的发酵上清液中加入4倍体积的80％(v/v)酒精，在6℃放置12小时，过滤收集沉淀物，经过真空干燥即可获得胞外多糖粗品。

胞外多糖粗品用80℃的蒸馏水充分溶解，使其浓度为8g/L。待冷却至20℃时，然后加入三氯乙酸(TCA)，使TCA的最终浓度为10wt％，在4℃放置12小时后，于4℃、9,000rpm下离心20分钟去除沉淀物，收集上清液。收集的上清液采用分子截留极限为6,000Dalton的膜，在4℃透析72小时，中间换蒸馏水四次。经过透析后的多糖溶液进行真空冷冻干燥，获得白色丝状的胞外多糖纯品。

实施例7

将实施例1～4预留的多糖粗品用80℃蒸馏水配制而成10mg/mL的混悬液，经过4℃、10,000rpm离心20分钟后，分别收集沉淀和上清液。然后采用凯氏定氮法和苯酚-硫酸法分别测定沉淀部分游离蛋白质含量和上清液中胞外纯多糖的含量，结果见表1。

表1

结论：本发明的胞外多糖粗品中，纯多糖的含量在55～95wt％之间，游离蛋白的含量在5～45wt％之间。

实施例8

将实施例1～4预留的经过透析后的纯多糖溶液采用苯酚-硫酸法(Dubois，M.，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，P.A.Rebers，and F.Smith，1956.Colorimeteric method for determination of sugars and related substances.Anal.Chem.28：350-356)测定其碳水化合物的含量，以葡萄糖为基准，结果以mg/L来表示，干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的产量见表2。

表2

 

胞外多糖	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					产量mg/L	960	1,090	875	780

结论：采用本发明的制备方法从每升发酵液中得到的多糖的产量在780～1,090mg之间。

实施例9

分别取上述实施例1～4胞外多糖纯品样品溶于蒸馏水中，配制成10.0mg/mL的溶液。

结果显示：各溶液澄清透明、无色、无味；在λ＝205nm处有强烈的吸收，在λ＝355nm处有微弱的吸收；它们的pH值见表3。

表3

 

多糖纯品	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					pH值	5.10	5.05	4.90	4.99

结论：10.0mg/mL的多糖溶液的pH值在4.90～5.10之间。

实施例10

取实施例1～4的胞外多糖纯品样品10mg于试管中，加入2M三氟乙酸(TFA)，充氮后封管，于120℃水解2小时；减压浓缩去TFA；溶于水，室温下加入硼氢化钠25mg还原4小时；加入1mL冰醋酸中和；再用1:9(v/v)冰醋酸-甲醇混合液5mL反复中和3次，蒸去生成的硼酸；所得粉末经过充分干燥后，用1mL醋酐于110℃乙酰化2小时。然后采用气相色谱(ShimadzuQP-5050A型气相仪，5％OV225/AW-DMC-Chromosorb W填充柱)进行分析(条件为：150℃保温5分钟，按15℃/分钟的方式线性升温至190℃并保温20分钟，然后按15℃/分钟的方式线性升温至230℃并保温20分钟，进样器和离子火焰检测器的温度分别为225℃和250℃)。

结果显示：各胞外多糖样品都是分别由鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡糖糖等糖基组成，各糖基的摩尔比见表4。

表4

结论：在本发明的胞外多糖中，鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖的摩尔比为0.35～0.50：1.00：0.30～0.40：0.90～1.00。

实施例11

对实施例1的胞外多糖纯品用重蒸水配制成50mg/mL的溶液，进行高效液相(HPLC)分析(柱：Ultrahydrogel2000/500，泵：515HPLC，检测器：Waters 2410 Refractive Index Detector(均为美国Waters公司产品)；进样体积20μL，流动相：3mM乙酸钠，洗脱速度：0.5mL/min，测试过程：50min)。

结果表明：在保留时间32min、34min和43min处出现3个吸收峰，经过与标准分子量的多糖色谱对比，该多糖由大小不同的三部分多糖组成，该三部分多糖及其占据总多糖的比例见表5。

表5

 

吸收峰出现的时刻	平均重量分子量(道尔顿)	占有比例wt％
			32min	1,586,000	39.5
34min	383,933	48.27
			43min	5,124	12.21

结论：实施例1的胞外多糖的平均重量分子量在5,124～1,586,000之间。

实施例12

将实施例2的胞外多糖纯品溶液进行离子交换[柱填料：DEAE-Sepharose FF，柱子：2.6×30cm洗脱液：Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH7.60)，流速：3mL/min]和凝胶排阻层析[柱填料：Sepharose CL-6B，柱子：1.6×100cm，洗脱液：重蒸馏水，上样浓度：10mg/mL，流速：0.25mL/min]后，可以得到3个单独的多糖组份，分别为图1中的离子交换的吸收峰1、2、3，3个单独的多糖组份的平均重量分子量及其占据总多糖的重量比例见表6。

表6

 

吸收峰	平均重量分子量(道尔顿)	比例wt％
			1	8,727,196	45.05
2	485,651	48.27
			3	46,029	6.71

结论：实施例2的胞外多糖的平均重量分子量在46,029～8,727,196之间。

注：在图1中，随着洗脱时间先后顺序依次出现的峰分别为吸收峰1、2和3。

实施例13

在原料乳(脱脂奶)中加入干酪乳杆菌胞外多糖，使其最终浓度为250mg/L，经95℃、20分钟高强度热处理后冷却至5℃，在0～6℃冷藏保存，即得到具有降血压作用的乳饮料。

实施例14

将原料乳(鲜奶)经140℃、2秒钟的高强度热处理后冷却至35℃，按3体积％的量接种预先培养好的干酪乳杆菌LC2W，并在35℃培养至最终酸度为0.9～1.0％(以乳酸计，采用0.1mol/L NaOH滴定)，冷却至5℃并冷藏保存，即得到含有干酪乳杆菌胞外多糖的具有降血压作用的乳饮料。

应用实施例1

测定实施例1中获得的干酪乳杆菌LC2W胞外多糖(EPS-FM)对清醒自发性高血压大鼠血压的影响。采用灌胃给药的方式，LC2W胞外多糖5mg/kg/d和25mg/kg/d，大鼠每天给药一次，连续七天，尾动脉间接测定血压。

1 材料与方法

1.1 受试药物

名称：LC2W胞外多糖(EPS-FM)，由上海光明乳业有限公司提供。

配制方法：临用时，加蒸馏水新鲜配制成5mg/mL的溶液。对照组给予蒸馏水体积为0.8mL/100g。

1.2 实验动物

自发性高血压大鼠(SHR)，21周龄，(雄性)，体重387±17g，由中国科学院上海试验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(沪)2003-0003，饲养合格证号：SYXK(沪)2003-0029。

1.3 实验方法

清醒大鼠血压测定采用SHR大鼠电子血压仪(北京中日友好医院生产，RBP-1B)进行尾动脉间接测压，将大鼠置于38℃温箱内加热15min，然后测定收缩压。

自发性高血压大鼠24只，随机分为3组：对照组给予蒸馏水，试验组分别给予LC2W胞外多糖5mg/kg/d和25mg/kg/d，每组8只。大鼠在给药前一周开始测压，待血压稳定后开始实验。大鼠每天给药一次，连续七天，并分别在给药的第1、3、5和7天测定大鼠血压。在第一天实验中，先测定大鼠给药前血压，然后灌胃给药，并分别测定1，2，4，6小时大鼠血压，观察药物对大鼠血压的作用。结果显示药物的降压作用在2～4小时达到峰值。在第三、第五和第七天的实验中，测压的时间分别定在给药前和给药后2小时、4小时进行。

1.4 数据处理

实验数据用x±SD表示，Student t test进行显著性检验。

2、实验结果

在首次给药时，LC2W胞外多糖5mg/kg/d和25mg/kg/d给药组，给药前大鼠的收缩压分别为184±3和185±2mmHg，给药后2小时和4小时分别下降至169±12和170±8mmHg，较给药前均明显下降(P<0.01)，见表7。

表7 LC2W胞外多糖灌胃给药后2小时对自发性高血压大鼠血压的影响(x±SD，n＝8)

结果表明：首次给药后，LC2W胞外多糖5mg/kg/d和25mg/kg/d给药组，大鼠的收缩压明显降低。在连续给药过程中，观察第三天、第五天和第七天的大鼠血压，显示本品5mg/kg/d和25mg/kg/d有明显的降压作用，见图2。

LC2W胞外多糖5mg/kg/d和25mg/kg/d组大鼠，比较实验过程中第一、第三、第五和第七天的大鼠给药前的血压(相当于前一天给药后24小时)，对照组大鼠血压无明显差别，见表8。

表8 LC2W胞外多糖连续多次灌胃给药对自发性高血压大鼠血压的影响(x±SD，n＝8)

对照组大鼠在实验期间血压无明显变化，见表8和图2。

结论：LC2W胞外多糖对自发性高血压大鼠具有明显的降压作用。

以上所有原料和试剂国内均有销售。

Claims (13)

1、一种干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)胞外多糖，其主要由鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，其摩尔比为0.35～0.50：1.00：0.30～0.40：0.90～1.00，该胞外多糖的平均重量分子量在5.0×10³～9.0×10⁶道尔顿之间。

2、如权利要求1所述的干酪乳杆菌胞外多糖，其特征在于该干酪乳杆菌胞外多糖由保藏号为CGMCC NO.0828的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2W菌株产生。

3、如权利要求1所述的干酪乳杆菌胞外多糖，其特征在于所述的鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为0.50：1.00：0.40：0.98；平均重量分子量为8,727,196道尔顿的多糖占45.05％，平均重量分子量为485,651道尔顿的多糖占48.27％，平均重量分子量为46,029道尔顿的多糖占6.71％，以上均指占总的多糖的重量百分比。

4、如权利要求1所述的干酪乳杆菌胞外多糖，其特征在于所述的鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为0.44：1.00：0.34：0.93；平均重量分子量为1,586,000道尔顿的胞外多糖占39.5％，平均重量分子量为383,933道尔顿的胞外多糖占48.27％，平均重量分子量为5,124道尔顿的胞外多糖占12.21％，以上均指占总的多糖的重量百分比。

5、一种干酪乳杆菌胞外多糖粗品，其特征在于其包括55～95重量％权利要求1～4任一项所述的干酪乳杆菌胞外多糖和5～45重量％的游离蛋白。

6、如权利要求5所述的干酪乳杆菌胞外多糖粗品的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)于20～40℃下，在无菌培养基中发酵16～72小时得发酵液；其中，所述的无菌培养基含有0.0～10.0g/L酵母浸出物，0.0～60.0g/L的单糖和/或寡聚糖，0.0～10.0g/L蛋白胨和60.0～160.0g/L的脱脂奶粉；

2)将上述发酵液在95～100℃加热10～30分钟，然后离心或过滤获得发酵上清液；

3)加入2～4倍体积的80～100体积％乙醇于上述发酵上清液中，离心或过滤收集沉淀物，在温度不超过115℃下干燥得多糖粗品。

7、如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的寡聚糖为双糖。

8、如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：

1)将保藏号为CGMCC NO.0828的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)LC2W菌株于28～40℃下，在无菌培养基中发酵20～48小时得发酵液；其中，所述的无菌培养基含有1.0～5.0g/L酵母浸出物，0.0～60.0g/L单糖和/或寡聚糖，0.0～10.0g/L蛋白胨和80.0～160.0g/L的脱脂奶粉；所述的单糖为葡萄糖和/或果糖，所述的寡聚糖为蔗糖、乳糖、麦芽糖、玉米糖浆和/或麦芽糖浆，所述的蛋白胨为胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨和/或牛肉浸出物；

2)将上述发酵液在95～100℃加热10～15分钟，然后离心或过滤获得发酵上清液；

3)加入2～3倍体积的95体积％乙醇于上述发酵上清液中，离心或过滤收集沉淀物，在温度不超过105℃下干燥得多糖粗品。

9、如权利要求6所述的制备方法，其特征在于在步骤1)之前将干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)于20～40℃下，在权利要求6所述的无菌培养基中发酵6～48小时，获得发酵种子液，再按0.5～8体积％的接种量接种于权利要求6所述的无菌培养基中。

10、如权利要求1～4任一项所述的干酪乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于包括下列步骤：1)采用权利要求6～9任一项所述的制备方法，制得干酪乳杆菌胞外多糖粗品；2)将所制得的粗品进行进一步纯化，以去除蛋白和其它杂质。

11、如权利要求10所述的制备方法，其特征在于该纯化步骤采用三氯乙酸法去除蛋白和透析法去除其它杂质。

12、如权利要求1～4任一项所述的干酪乳杆菌胞外多糖或如权利要求5所述的干酪乳杆菌胞外多糖粗品在制备预防或抗高血压的饮食品、药品或保健品中的应用。

13、一种抗高血压的组合物，其包括有效量的权利要求1～4任一项所述的干酪乳杆菌胞外多糖或权利要求5所述的干酪乳杆菌胞外多糖粗品，以及生理学上可接受的载体。

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