CN110714038B - 植物乳杆菌胞外多糖及其在制备ace抑制剂组合物中的用途 - Google Patents

植物乳杆菌胞外多糖及其在制备ace抑制剂组合物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供植物乳杆菌胞外多糖及其在制备ACE抑制剂组合物中的用途，属于微生物技术领域，植物乳杆菌胞外多糖，具有如下1)和/或2)的特征：1)胞外多糖重均分子量为1.15×106Da；2)胞外多糖由摩尔比为5.6:7.3:1的甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。本发明还提供一种植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物。本发明植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物均显示出显著的ACE抑制活性且无细胞毒性。本发明还提供一种用于预防或治疗心血管疾病的组合物，包含上述胞外多糖和/或其磷酸化衍生物，该心血管疾病是选自于以下疾病所组成的组的一种或多种疾病：高血压、心脏病、中风、血栓、动脉硬化、心绞痛、心力衰竭以及心肌梗塞。

Description

植物乳杆菌胞外多糖及其在制备ACE抑制剂组合物中的用途
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌胞外多糖及其在制备ACE抑制剂组合物中的用途。
背景技术
多糖是自然界中广泛存在的生物聚合物。他们存在于所有的生物体，即动物、植物和微生物。所有多糖都是由相同或不同单糖组成的同多糖或异多糖。它们也可被非糖单元取代，从而形成线性或具分支的结构。近年来，多糖活性研究取得了巨大的进展，大量多糖如香茹多糖、灵芝多糖被证明具有抗肿瘤活性，人参多糖被证明具有增强免疫的功能。微生物多糖山于产量稳定、受气候和地理影响较小也出现了较大的研究热潮。多糖的生物活性与其结构有关，四个主要因素可影响修饰多糖的生物活性：水溶性、分子量(Mw)、取代度和取代基团很多研究发现化学修饰多糖的生物活性会明显增强或产生新的活性，一些化学修饰多糖如硫酸化、磷酸化、甲基化或羧甲基化多糖具有很强的生物活性，可开发为新型药品。因此多糖的分子修饰和结构改造具有重要意义。
微生物多糖的免疫调节活性主要体现在其能激活巨噬细胞，而巨噬细胞会攻击死细胞和细胞内的病原体；能激活中性白细胞，从而有效抑制化脓细胞；能激活在血液中循环的自然杀伤性细胞，从而裂解癌细胞和受病毒感染的细胞。我国有着优质的郭酸菌资源，许多传统发酵食品中都含有乳酸菌，对这些资源进行研究和开发可W为改善国民的生活做出贡献。一些学者认为产胞外多糖乳酸菌的益生功能主要取决于它们的胞外多糖。乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)通常两种形式存在：一种紧密结合在菌体的表面为细胞结合多糖(Cell-bound exopolysaccharides,C-EPS)；另一种释放到周围的液体环境中为释放多糖(Released exopolysaccharides,r-EPS)。大多数报道的乳酸菌只产生r-EPS，然而也有一些乳酸菌可同时产生C-EPS和r-EPS。目前己报道的产胞外多糖乳酸菌主要有30种左右。其中，我们熟悉的有干酪杆菌(L.casei)、保加利亚乳杆菌(L.delbrueckiibulgaricus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)和约氏乳杆菌(L.johnsonil)。乳酸菌胞外多糖具有增强免疫调节作用的功能，如淋巴细胞的增殖、巨噬细胞的激活、细胞内溶酶体含量的增加以及诱导细胞因子(干扰素和白细胞介素1α)的产生等。而乳酸菌胞外多糖的提取则相对简单，只需通过离必将菌体和液体分开，然后将液体浓缩后直接添加乙醇即可沉淀出r-EPS，部分产荚膜菌体还可用来提取C-EPS；同时，与其他微生物多糖相比，乳酸菌胞外多糖具有更好的安全性，可广泛应用于各种食品和药品。因此，对乳酸菌胞外多糖进行研究是十分必要的。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种显示出显著的ACE抑制活性且无细胞毒性的植物乳杆菌胞外多糖。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
植物乳杆菌胞外多糖，具有如下1)和/或2)的特征：
1)胞外多糖重均分子量为1.35×106Da；
2)胞外多糖由摩尔比为5.6:7.3:1的甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。
上述的胞外多糖抑制血管紧张素转换酶(ACE)。本发明胞外多糖显示出血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性，具有调节血压以及预防高血压的作用，从而使得可将本发明胞外多糖有效地用作预防或治疗心血管疾病组合物的活性成分。且本发明胞外多糖无细胞毒性。
本发明的第二个目的是提供一种植物乳杆菌胞外多糖在制备ACE抑制剂组合物中的用途。本发明胞外多糖显示出显著的ACE抑制活性且无细胞毒性，可有效地用作ACE活性抑制剂组合物。
本发明的第三个目的是提供一种植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物。本发明植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物同样显示出血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性，具有调节血压以及预防高血压的作用，本发明无细胞毒性。
上述的植物乳杆菌胞外多糖的取代度为0.24。
本发明的第四个目的是提供一种用于预防或治疗心血管疾病的组合物，包含上述的胞外多糖和/或其磷酸化衍生物。该组合物为食品组合物或药物组合物，相对于组合物总重量，包含0.1-80wt％的胞外多糖和/或磷酸化衍生物。
上述的心血管疾病是选自于以下疾病所组成的组的一种或多种疾病：高血压、心脏病、中风、血栓、动脉硬化、心绞痛、心力衰竭以及心肌梗塞。
上述的组合物为经口组合物。
上述的组合物以成人每一天摄取0.1-500mg植物乳杆菌胞外多糖和/或磷酸化衍生物的方式使用。优选每天50-100mg/kg，给药频率优选为每天1-3次。
上述的组合物以摄取9-12周或更久的方式使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明胞外多糖及其磷酸化衍生物均其显示出血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性，具有调节血压以及预防高血压的作用，从而使得可将本发明胞外多糖及其磷酸化衍生物有效地用作预防或治疗心血管疾病组合物的活性成分。且本发明胞外多糖及其磷酸化衍生物无细胞毒性，具有广阔的应用前景。
本发明采用了上述技术方案提供植物乳杆菌胞外多糖及其在制备ACE抑制剂组合物中的用途，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
附图说明
图1是本发明试验例1中植物乳杆菌ATCC 8014的生长曲线；
图2是本发明试验例2中高效液相色谱法测植物乳杆菌胞外多糖分子量的标准曲线；
图3是本发明试验例2中植物乳杆菌胞外多糖的高效液相色谱图；
图4是本发明试验例2中植物乳杆菌胞外多糖和标准单糖的气相色谱图；
图5是本发明试验例4中植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物对ACE的抑制作用；
图6是本发明试验例4中植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物的细胞毒性；
图7是本发明试验例4中植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物对自发性高血压大鼠收缩压的影响；
图8是本发明试验例4中植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物对自发性高血压大鼠舒张压的影响。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
本实施方式提供一种植物乳杆菌胞外多糖，具有如下1)和/或2)的特征：
1)胞外多糖重均分子量为1.35×106Da；
2)胞外多糖由摩尔比为5.6:7.3:1的甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。
作为一个优选的具体例子，胞外多糖抑制血管紧张素转换酶(ACE)。本发明胞外多糖显示出血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性，具有调节血压以及预防高血压的作用，从而使得可将本发明胞外多糖有效地用作预防或治疗心血管疾病组合物的活性成分。且本发明胞外多糖无细胞毒性。
本实施方式的胞外多糖通过如下方法制备：
S1：发酵植物乳杆菌，收集发酵液；
S2：用三氯乙酸水溶液与发酵液混匀，反应，收集反应液中的上清液；
S3：将上清液与无水乙醇混匀，静置，收集沉淀；
S4：将沉淀溶于水中，透析，纯化，得到胞外多糖。
作为一个优选的具体例子，胞外多糖的制备方法包括如下步骤：
S1：将植物乳杆菌ATCC 8014连续活化两代，然后转接至含有浓度为0.02-0.1μM二硫化四乙基秋兰姆和0.1-0.5mM乳糖的MRS培养基中，30-40℃静置发酵12-24h，收集发酵液；该步骤用含有二硫化四乙基秋兰姆和乳糖的MRS培养基不仅能够改变胞外多糖的化学结构，获得本发明的胞外多糖，而且有利于植物乳杆菌的延长对数期和稳定期，大量合成胞外多糖，提高植物乳杆菌产胞外多糖的能力，最终提高提高胞外多糖的产量；
S2：用70-80％三氯乙酸水溶液与所述发酵液混匀，常温下搅拌反应1-2h，收集反应液中的上清液；去除发酵液中的细胞和蛋白；
S3：将上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀，4℃静置10-15h，再于4℃、8000-15000r/min离心20-30min，收集沉淀；
S4：将沉淀溶于水中，并移入透析袋，每5-10h换一次去离子水，透析12-24h后收集产物，冷冻干燥，得到粗胞外多糖；
S5：将粗胞外多糖经离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖。
本实施方式还提供一种植物乳杆菌胞外多糖在制备ACE抑制剂组合物中的用途。多糖分子经磷酸化修饰后，支链上的羟基被磷酸基团取代，从而增强多糖水溶性，改变链构象，本发明胞外多糖显示出显著的ACE抑制活性且无细胞毒性，可有效地用作ACE活性抑制剂组合物。
本实施方式还提供一种植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物。
作为一个优选的具体例子，植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物通过如下方法制备：
按固液比为1:10-30g/mL将植物乳杆菌胞外多糖溶于二甲亚砜中，在50-70℃下加热20-40min使其充分溶解，然后加入尿素和磷酸，在50-70℃下反应2-5h后加入去离子水终止反应，并用1M NaOH中和反应液，经透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物。上述胞外多糖和尿素的重量比为1:15-20，胞外多糖和磷酸的固液比为1:5-10g/mL，胞外多糖和去离子的固液比为1:8-12g/mL。
作为一个优选的具体例子，植物乳杆菌胞外多糖的取代度为0.24。
本实施方式还提供一种用于预防或治疗心血管疾病的组合物，包含上述胞外多糖和/或其磷酸化衍生物。该组合物为食品组合物或药物组合物，相对于组合物总重量，包含0.1-80wt％的胞外多糖和/或磷酸化衍生物。本发明的食品组合物可将本发明的胞外多糖和/或其磷酸化衍生物添加至饮料、肉、香肠、面包、饼干、年糕、巧克力、糖果、点心、曲奇饼、比萨饼、拉面、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、特殊营养食品(如配方奶粉或幼儿饮食)、加工肉制品、鱼制品、豆腐、淀粉凝胶产品、健康辅助食品、调味食品(如酱油、豆瓣酱、辣椒酱或什锦酱)、酱汁、其它加工食品、咸菜(如泡菜或酱菜)、汤、饮料、酒精饮料和维生素复合物，并在广泛的意义上说，几乎可包括适于生产保健食品的每一种食品。本发明的药物组合物还可包含各种营养素、维生素、矿物质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于添加至苏打水的碳酸化剂等。所述载体、赋形剂或稀释剂可以选自于以下物质所组成的组：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐/酯、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、糊精、碳酸钙、丙二醇、液体石蜡和盐水，但并非总是受限于此。所有提及的成分可单独添加或共同添加。
作为一个优选的具体例子，心血管疾病是选自于以下疾病所组成的组的一种或多种疾病：高血压、心脏病、中风、血栓、动脉硬化、心绞痛、心力衰竭以及心肌梗塞。
作为一个优选的具体例子，组合物为经口组合物。
作为一个优选的具体例子，组合物以成人每一天摄取0.1-500mg植物乳杆菌胞外多糖和/或磷酸化衍生物的方式使用。优选每天50-100mg/kg，给药频率优选为每天1-3次。
作为一个优选的具体例子，组合物以摄取9-12周或更久的方式使用。
以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
实施例1：
植物乳杆菌胞外多糖的制备方法为：
S1：将购自上海北诺生物科技有限公司的植物乳杆菌ATCC 8014连续活化两代，然后转接至含有浓度为0.05μM二硫化四乙基秋兰姆和0.2mM乳糖的MRS培养基中，37℃静置发酵15h，收集发酵液；
S2：用75％三氯乙酸水溶液与所述发酵液混匀，常温下搅拌反应2h，收集反应液中的上清液；
S3：将上清液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，4℃静置12h，再于4℃、12000r/min离心30min，收集沉淀；
S4：将沉淀溶于水中，并移入透析袋，每8h换一次去离子水，透析15h后收集产物，冷冻干燥，得到粗胞外多糖；
S5：将粗胞外多糖用蒸馏水溶解后(10mg/mL)，上样至DEAE-Cellulose 52离子交换柱，上样量100mg，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min，每管收集5mL，逐管检测多糖含量(多糖含量采用硫酸苯酚法进行检测并绘制洗脱曲线)，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥；
将经0.3mol/L NaCl洗脱出峰得到的多糖组分用蒸馏水溶解(5mg/mL)后，上样至Sephadex G-100凝胶柱，采用去离子水进行洗脱，洗脱速率为0.2mL/min，洗脱溶液采用自动部份收集装置进行收集，每管收集体积为2mL，逐管检测多糖含量，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖。
植物乳杆菌胞外多糖得率采用如下公式进行计算：
得率(％)＝(纯组分质量/粗多糖质量)×100。
植物乳杆菌胞外多糖的得率为53.72％。
实施例2：
植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物通过如下方法制备：
将2g实施例1得植物乳杆菌胞外多糖溶于100mL二甲亚砜中，在60℃下加热30min使其充分溶解，然后加入36g尿素和15mL磷酸，在60℃下反应3h后加入去离子水终止反应，并用1M NaOH中和反应液，经透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物。
对比例1：
植物乳杆菌胞外多糖的制备方法为：
S1：将购自上海北诺生物科技有限公司的植物乳杆菌ATCC 8014连续活化两代，然后转接至含有浓度为0.05μM二硫化四乙基秋兰姆的MRS培养基中，37℃静置发酵15h，收集发酵液；
S2：用75％三氯乙酸水溶液与所述发酵液混匀，常温下搅拌反应2h，收集反应液中的上清液；
S3：将上清液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，4℃静置12h，再于4℃、12000r/min离心30min，收集沉淀；
S4：将沉淀溶于水中，并移入透析袋，每8h换一次去离子水，透析15h后收集产物，冷冻干燥，得到粗胞外多糖；
S5：将粗胞外多糖用蒸馏水溶解后(10mg/mL)，上样至DEAE-Cellulose 52离子交换柱，上样量100mg，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min，每管收集5mL，逐管检测多糖含量(多糖含量采用硫酸苯酚法进行检测并绘制洗脱曲线)，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥；
将经0.3mol/L NaCl洗脱出峰得到的多糖组分用蒸馏水溶解(5mg/mL)后，上样至Sephadex G-100凝胶柱，采用去离子水进行洗脱，洗脱速率为0.2mL/min，洗脱溶液采用自动部份收集装置进行收集，每管收集体积为2mL，逐管检测多糖含量，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖，得率为36.74％。
对比例2：
植物乳杆菌胞外多糖的制备方法为：
S1：将购自上海北诺生物科技有限公司的植物乳杆菌ATCC 8014连续活化两代，然后转接至含有浓度为0.2mM乳糖的MRS培养基中，37℃静置发酵15h，收集发酵液；
S2：用75％三氯乙酸水溶液与所述发酵液混匀，常温下搅拌反应2h，收集反应液中的上清液；
S3：将上清液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，4℃静置12h，再于4℃、12000r/min离心30min，收集沉淀；
S4：将沉淀溶于水中，并移入透析袋，每8h换一次去离子水，透析15h后收集产物，冷冻干燥，得到粗胞外多糖；
S5：将粗胞外多糖用蒸馏水溶解后(10mg/mL)，上样至DEAE-Cellulose 52离子交换柱，上样量100mg，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min，每管收集5mL，逐管检测多糖含量(多糖含量采用硫酸苯酚法进行检测并绘制洗脱曲线)，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥；
将经0.3mol/L NaCl洗脱出峰得到的多糖组分用蒸馏水溶解(5mg/mL)后，上样至Sephadex G-100凝胶柱，采用去离子水进行洗脱，洗脱速率为0.2mL/min，洗脱溶液采用自动部份收集装置进行收集，每管收集体积为2mL，逐管检测多糖含量，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖，得率为43.68％。
对比例3：
植物乳杆菌胞外多糖的制备方法为：
S1：将购自上海北诺生物科技有限公司的植物乳杆菌ATCC 8014连续活化两代，然后转接至MRS培养基中，37℃静置发酵15h，收集发酵液；
S2：用75％三氯乙酸水溶液与所述发酵液混匀，常温下搅拌反应2h，收集反应液中的上清液；
S3：将上清液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，4℃静置12h，再于4℃、12000r/min离心30min，收集沉淀；
S4：将沉淀溶于水中，并移入透析袋，每8h换一次去离子水，透析15h后收集产物，冷冻干燥，得到粗胞外多糖；
S5：将粗胞外多糖用蒸馏水溶解后(10mg/mL)，上样至DEAE-Cellulose 52离子交换柱，上样量100mg，依次用蒸馏水、0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl、0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min，每管收集5mL，逐管检测多糖含量(多糖含量采用硫酸苯酚法进行检测并绘制洗脱曲线)，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥；
将经0.3mol/L NaCl洗脱出峰得到的多糖组分用蒸馏水溶解(5mg/mL)后，上样至Sephadex G-100凝胶柱，采用去离子水进行洗脱，洗脱速率为0.2mL/min，洗脱溶液采用自动部份收集装置进行收集，每管收集体积为2mL，逐管检测多糖含量，按多糖含量检测值分别合并收集单一峰组分，去离子水透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖，得率为35.01％。
对比例4：
植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物通过如下方法制备：
将2g对比例1得植物乳杆菌胞外多糖溶于100mL二甲亚砜中，在60℃下加热30min使其充分溶解，然后加入36g尿素和15mL磷酸，在60℃下反应3h后加入去离子水终止反应，并用1M NaOH中和反应液，经透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物。
对比例5：
植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物通过如下方法制备：
将2g对比例2得植物乳杆菌胞外多糖溶于100mL二甲亚砜中，在60℃下加热30min使其充分溶解，然后加入36g尿素和15mL磷酸，在60℃下反应3h后加入去离子水终止反应，并用1M NaOH中和反应液，经透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物。
对比例6：
植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物通过如下方法制备：
将2g对比例3得植物乳杆菌胞外多糖溶于100mL二甲亚砜中，在60℃下加热30min使其充分溶解，然后加入36g尿素和15mL磷酸，在60℃下反应3h后加入去离子水终止反应，并用1M NaOH中和反应液，经透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物。
试验例1：
植物乳杆菌ATCC 8014的生长曲线的测定
将菌株以的接种量分别接种于实施例1、对比例1-3用培养基中，振荡摇匀后于37℃静置发酵，每间隔2h取出，以培养基做空白调零，在600nm的波长处检测吸光值。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，得到该菌株的生长曲线，如图1所示。从ATCC 8014的生长曲线图中可以看出，实施例1植物乳杆菌ATCC 8014大概从2h以后开始进入对数生长期，6h以后开始进入稳定期，稳定期较长；对比例1和对比例3植物乳杆菌ATCC 8014大概从3h以后开始进入对数生长期，14h以后开始进入稳定期；对比例2植物乳杆菌ATCC 8014大概从3h以后开始进入对数生长期，14h以后开始进入稳定期；这说明用实施例1培养基培养植物乳杆菌ATCC8014，植物乳杆菌的对数期和稳定期长于对比例1-3，且植物乳杆菌的密度也明显高于对比例1-3。
由植物乳杆菌ATCC 8014的生长曲线和实施例1、对比例1-3得胞外多糖的得率可知，用含有二硫化四乙基秋兰姆和乳糖的MRS培养基培养植物乳杆菌ATCC 8014，有利于植物乳杆菌的延长对数期和稳定期，大量合成胞外多糖，提高植物乳杆菌产胞外多糖的能力，最终提高提高胞外多糖的产量。
试验例2：
植物乳杆菌胞外多糖的性能测定
1.植物乳杆菌胞外多糖的分子量测定
将不同分子量的标准Dextran相继进样，记录保留时间(TR)，以各标准品的保留时间(TR)为横坐标，以各多糖标准品峰值分子量的对数(log Mol Wt)为纵坐标，绘制标准曲线(如图2)，得出分子量与保留时间(TR)的回归方程，y＝11.9972-0.40662x，R2＝0.99824。待测样品按上述步骤进样，根据所得保留时间(TR)，通过标准分子量曲线自动计算样品的平均相对分子量，同时可根据多糖样品在色谱图上的峰的数目和形状来鉴定多糖的纯度。实施例1、对比例1-3得胞外多糖的高效液相色谱图如图3所示，从图中可看出，实施例1、对比例1-3得胞外多糖均为单一峰形，说明4种多糖均为均一多糖。实施例1、对比例1-3得胞外多糖的保留时间依次为14.428min、15.660min、15.660min和15.660min，将相应的保留时间代入标准分子量与保留时间的回归方程得出实施例1、对比例1-3得胞外多糖的分子量依次为1.35×106Da、4.26×105Da、4.26×105Da和4.26×105Da。
2.植物乳杆菌胞外多糖的单糖组成分析
2.1多糖的水解
称取5mg胞外多糖样品至安培瓶中，再加入2mL的2mol/L三氟乙酸，用酒精喷灯封口，于烘箱中120℃水解2h，水解液减压蒸干后，再加入少量甲醇减压蒸干(重复5次)以除去残留的三氟乙酸，然后加少量水溶解，冷冻干燥，即得完全酸水解单糖样品。
2.2糖腈乙酸酯衍生物的制备
称取各单糖标准品5mg、NaBH4 30mg和5mg肌醇至安培瓶中，慢慢滴入2mL蒸馏水，边加边震荡，室温下使还原反应成糖醇(反应2h)，慢慢滴入几滴冰乙酸以中和过量的NaBH4，边加边震荡，直至不再产生气泡。将旋转蒸发仪调至60℃真空旋蒸至样品完全干燥，之后每次用0.1％(v/v)盐酸甲醇溶液2mL复溶后再次蒸干，重复4～5次以除去硼酸根。处理完毕将产物置于105℃烘箱脱水15min，拿出加入吡啶和乙酸酐各0.5mL，用酒精喷灯封口，沸水浴反应1h，所得产物经微孔膜(0.22μm)除去杂质，进行气相色谱分析。完全酸水解后胞外多糖样品衍生物的制备同样按照此方法制备。
2.3气相色谱条件色谱仪
Agilent7890A气相色谱仪；色谱柱：DB225毛细管柱(30m×0.25mm)；检测器：氧火焰离子检测器；流速：1mL/min；分流比：1:50；进样量：1μL。升温程序：80℃保持3min，5℃/min升至195℃保持1min，5℃/min升至215℃保持1min，10℃/min升至230℃保持3min。
实施例1、对比例1-3得胞外多糖经三氟乙酸水解后的气相色谱分析及与单糖标准品的对比结果如图4所示。单糖标准品的保留时间(图4标准品)从左到右依次为鼠李糖(26.215min)、岩藻糖(26.427min)、阿拉伯糖(26.531min)、木糖(26.951min)、甘露糖(30.553min)、果糖(31.553min)、葡萄糖(31.714min)、半乳糖(31.921min)。实施例1、对比例1-3得胞外多糖均在保留时间为30.553min、31.714min和31.921min时出峰(图4实施例1、对比例1-3)，表明实施例1、对比例1-3得胞外多糖均主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖三种单糖构成。通过面积归一化法定量分析可得，实施例1得胞外多糖中甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为5.6:7.3:1，对比例1-3得胞外多糖中甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为1:2.6:4.2。
由胞外多糖的分子量和单糖组成可知，用含有二硫化四乙基秋兰姆和乳糖的MRS培养基培养植物乳杆菌ATCC 8014，能够改变胞外多糖的化学结构，获得本发明的胞外多糖。
试验例3：
植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物取代度测定
磷元素含量采用电感耦合-原子发射光谱仪测定，测得实施例1、对比例1-3得磷酸化衍生物的磷元素含量(P％)分别为4.11％、2.34％、2.34％和2.34％，取代度(磷酸化程度)依据如下公式计算：
取代度＝(5.22×P％)/(1-2.61×P％)。
计算得实施例1、对比例1-3得磷酸化衍生物的磷元素含量(P％)分别为0.24、0.13、0.13和0.13。
试验例4：
1.植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物抑制血管紧张素转换酶(ACE)的性能测定
ACE是一种能使人血管收缩，引起血压上升的羧二肽多功能酶。处于激活状态的ACE是导致高血压病主要原因之一。因此，通过抑制剂使ACE失活或活性受抑制，成为是潜在的降血压手段之一。对于植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物抑制ACE的性能，采用如下方法测定：
取质量浓度为100mg/mL的植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物样品溶液，对其ACE抑制活性进行测定，依次于试管中加入6.5mmol/L底物HHL溶液100mL，样品溶液200mL，100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝8.3)200mL，在37℃恒温水浴预热3～5min，然后加入ACE酶液500mL启动反应，37℃水浴30min后，加入1mol/L HCl 100mL终止反应。然后加入1.5mL乙酸乙酯，混合均匀后进行离心(5200r/min，10min)，吸取上层乙酸乙酯1mL移于另一试管中，放入120℃的烘箱中挥发溶剂30min，冷却后加入蒸馏水6mL，混匀后在228nm下测定其吸光度值，计算公式如下：
ACE抑制率(％)＝(Ab－Aa)/(Ab－Ac)×100，
其中：
Aa-ACE与底物HHL加入抑制剂反应的样品的吸光度值；
Ab-反应中不加抑制剂，只有ACE与底物HHL完全反应的对照组的吸光度值；
Ac-反应前预先失活ACE，再加抑制剂，ACE与HHL反应的空白组吸光度值。
植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物对ACE的抑制作用如图5所示，可以看出，实施例1得植物乳杆菌胞外多糖及实施例2得植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物对于ACE活力有较显著的抑制作用，而对比例1-6得样品对于ACE活力的抑制作用不明显。
2.植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物的细胞毒性测定
采用MTT法，培养结束前4h，每孔加入20μL MTT(5g/L)，继续培养4h。培养结束后加二甲亚砜150μl。酶联免疫检测仪于570nm测定A570值。结果如图6，可以看出，添加不同浓度的植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生的物体外培养的细胞培养液与对照组相比，OD值之间没有显著差异，这说明实施例1-2、对比例1-6得植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生均未显示细胞毒性。
2.植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物的体内抗高血压活性
动物实验符合伦理标准(批准号：20140405)。自发性高血压大鼠在恒温条件下(22±2℃)饲养，给予12h的明暗循环，自由摄水摄食。实施例1胞外多糖及实施例2胞外多糖的磷酸化衍生物用生理盐水配制成0.05g/kg的剂量，每次灌胃给予1mL，对照组给予等量的生理盐水。在第0、2、4、6、8、12、24h时分别测量大鼠的收缩压和舒张压，观察收缩压(SBP)和舒张压(DBP)的变化情况来评价植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物的降压效果(图7和图8)。阴性对照组(生理盐水)的大鼠的SBP和DBP在24h内没有显著变化。实施例1胞外多糖组的大鼠血压变化明显，灌胃给予实施例1胞外多糖8h后，收缩压降低了53.8mmHg，舒张压降低了68.1mmHg；在给药24h后，收缩压相对初始水平的压差为2.1mmHg，收缩压相对初始水平的压差为2.1mmHg；实施例2胞外多糖的磷酸化衍生物组的大鼠血压变化明显，灌胃给予实施例1胞外多糖6h后，收缩压降低了61.6mmHg，舒张压降低了68.7mmHg；在给药24h后，收缩压相对初始水平的压差为6.4mmHg，收缩压相对初始水平的压差为2.5mmHg。体内降压结果与体外对ACE酶的抑制作用结果相一致。体内、体外实验结果表明，植物乳杆菌胞外多糖及其磷酸化衍生物具有较好的降压作用。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (7)

1.植物乳杆菌胞外多糖，其特征在于：具有如下1）和2）的特征：
1）所述胞外多糖重均分子量为1.35×106Da；
2）所述胞外多糖由摩尔比为5.6:7.3:1的甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌胞外多糖在制备ACE抑制剂组合物中的用途。
3. 权利要求1所述的植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物，其通过如下方法制备：按固液比为1:10-30g/mL将权利要求1所述的植物乳杆菌胞外多糖溶于二甲亚砜中，在50-70℃下加热20-40min使其充分溶解，然后加入尿素和磷酸，在50-70℃下反应2-5h后加入去离子水终止反应，并用1M NaOH中和反应液，经透析，冷冻干燥，即得植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物；所述胞外多糖和尿素的重量比为1:15-20，胞外多糖和磷酸的固液比为1:5-10g/mL，胞外多糖和去离子水的固液比为1:8-12g/mL。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌胞外多糖的磷酸化衍生物，其特征在于：所述植物乳杆菌胞外多糖的取代度为0.24。
5.一种用于预防或治疗心血管疾病的组合物，其特征在于：包含权利要求1所述胞外多糖和/或权利要求3或4所述磷酸化衍生物。
6.根据权利要求5所述的用于预防或治疗心血管疾病的组合物，其特征在于：所述心血管疾病是选自于以下疾病所组成的组的一种或多种疾病：高血压、心脏病、中风、血栓、动脉硬化、心绞痛、心力衰竭以及心肌梗塞。
7.根据权利要求5所述的用于预防或治疗心血管疾病的组合物，其特征在于：所述组合物为经口组合物。
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