CN114058510A - 一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法及由其得到的乳酸菌溶胞活性物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法及由其得到的乳酸菌溶胞活性物。所述乳酸菌溶胞活性物的提取方法包括以下步骤：将乳酸菌菌泥稀释得到菌液后，以高压脉冲电场进行破碎处理，得到乳酸菌溶胞活性物。本发明采用高压脉冲电场对发酵得到的乳酸菌菌泥进行破碎处理，通过增加细胞膜通透性，减弱细胞膜强度，最终导致细胞膜破裂，胞内细胞质流出，具有耗能少，处理时间短、效率高等特点。利用高压脉冲电场技术可以使胞内多糖分解酶变性失活，不再具有分解多糖的能力，从而使提取的多糖含量更高、抗氧化活性更好。

Description

一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法及由其得到的乳酸菌溶胞 活性物

技术领域

本发明属于微生物发酵提取技术领域，具体涉及一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法及由其得到的乳酸菌溶胞活性物。

背景技术

酸杆菌是一类存活于肠道中的有益于人类健康的微生物，其能够改善宿主的微生态平衡，形成抗菌生物屏障，抑制病源微生物和腐败菌的生长繁殖，起到抑菌消炎的作用。乳酸杆菌溶胞活性产物对改善皮肤有重大作用，这些活性代谢产物包括有机酸、氨基酸、维生素、多糖、小分子肽类、生物酶等。有机酸可平衡肌肤表面的pH，使皮肤的pH呈弱酸性，而氨基酸、维生素和生物酶类可以修复表皮细胞，去除色素沉淀，改善皮肤粗糙使皮肤光亮且富有弹性；微生物多糖还具有抗氧化活性、延缓皮肤衰老的功效。

不过现有的乳酸菌破壁技术：超声破碎、高压均质、酶解法等，很难将乳酸菌细胞溶胞物完全提取出来，即使提取出来，其抗氧化活性也大大降低。乳酸菌细胞中的多糖分解酶活性直接影响胞内多糖提取率，乳酸菌细胞中含有多糖分解酶，其活性高低是影响胞内多糖积累的主要因素。

CN111334450A公开了一种乳酸菌溶胞复合物制备工艺，涉及微生物复合物提取技术，具体涉及一种乳酸菌溶胞复合物制备工艺。提供了一种乳酸菌溶胞复合物的提取的完整简化工艺。种子液制备：将植物乳杆菌，长双歧杆菌，副干酪乳杆菌分别接种于MRS试管培养基中，37-38℃下培养22-26h，然后将试管菌种接入三角瓶液体MRS培养基中发酵培养，37-38℃培养35-38h；发酵：将各个种子液分别按接种量接种于发酵罐中，厌氧发酵；均质破壁：将发酵好的乳酸菌发酵液通过高压均质机，均质破壁，得到破壁液；离心：将均质好的破壁液，通过管式离心机，得到离心后的破壁上清液；过滤：将离心后的破壁上清液，经过食品级液体过滤器，得到乳酸菌溶胞复合物。该方法采用高压均质机进行破壁处理，很难将乳酸菌细胞溶胞物完全提取出来，即使提取出来，其抗氧化活性也大大降低。

CN111057710A公开了一种将重组质粒导入宿主乳酸菌的具体步骤方法，包括：先乳酸菌活化后进行扩大培养，当生长OD600值在0.4-1.2时收集经扩大培养所得的菌体，用电击缓冲液A洗涤菌体3次后，使用终浓度为1000-3000％的溶菌酶处理菌体，最后再用电击缓冲液B使菌体重悬，得感受态细胞；再向制备得到的感受态细胞中加入验证正确的重组质粒，吹吸混匀，然后转移到冰预冷的电转杯中，使用高压脉冲电转仪电击细胞混合液。该方法采用溶菌酶处理菌体并高压脉冲电转仪电极的方式获得重组乳酸菌，但由于未对发酵完全的乳酸菌菌体处理，导致无法达到将乳酸菌细胞溶胞物完全提取出来的目的。

因此，开发一种乳酸菌溶胞活性物提取技术，提高各活性物质的提取率，并使溶胞提取物具有较强的抗氧化活性是本领域研究的重点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法及由其得到的乳酸菌溶胞活性物。所述提取方法采用高压脉冲电场提取技术，提取效率高、提取物含量更高，且具有更好的抗氧化活性功效。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：将乳酸菌菌泥稀释得到菌液后，以高压脉冲电场进行破碎处理，得到乳酸菌溶胞活性物。

在本发明中，采用高压脉冲电场对发酵得到的乳酸菌菌泥进行破碎处理，，通过增加细胞膜通透性，减弱细胞膜强度，最终导致细胞膜破裂，胞内细胞质流出，具有耗能少，处理时间短、效率高等特点。利用高压脉冲电场技术可以使胞内多糖分解酶变性失活，不再具有分解多糖的能力，从而使提取的多糖含量更高、抗氧化活性更好。

优选地，所述高压脉冲电场的强度为0～3kv/cm，例如可以是0kv/cm、0.2kv/cm、0.4kv/cm、0.6kv/cm、0.8kv/cm、1kv/cm、1.2kv/cm、1.4kv/cm、1.6kv/cm、1.8kv/cm、2kv/cm、2.2kv/cm、2.4kv/cm、2.6kv/cm、2.8kv/cm、3kv/cm等。

优选地，所述高压脉冲电场的次数为50～70次，例如可以是50次、52次、54次、56次、58次、60次、62次、64次、66次、68次、70次等。

优选地，所述高压脉冲电场的有效时间为2～4min，例如可以是2min、2.2min、2.3min、2.4min、2.6min、2.8min、3min、3.2min、3.4min、3.6min、3.8min、4min等。

优选地，所述菌液的浓度为8-12g/100mL，例如可以是8g/100mL、8.5g/100mL、9g/100mL、9.5g/100mL、10g/100mL、10.5g/100mL、11g/100mL、11.5g/100mL、12g/100mL等。

优选地，所述菌液的溶剂为水，优选为超纯水。

优选地，所述乳酸菌菌泥由以下制备方法制备得到：

(a)将乳酸菌接种于MRS液体培养基中，培养活化，得到种子液；

(b)将步骤(a)得到的种子液接种于发酵培养基中，培养，得到发酵液；

(c)将步骤步骤(b)得到的发酵液离心，收集得到乳酸菌菌泥。

优选地，步骤(a)中，所述乳酸菌的保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2020年5月，保藏编号为ATCC8014，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

优选地，步骤(a)中，所述乳酸菌的接种量为2-4wt％，例如可以是2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％等。

优选地，步骤(a)中，所述培养活化的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，培养活化的时间为22-26h，例如可以是22h、23h、24h、25h、26h等。

优选地，步骤(a)中，所述培养活化的转速为100-150r/min，例如可以是100r/min、110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min等。

优选地，所述发酵培养基按重量份数计包括：蛋白胨8-12份、酵母浸粉4-6份、葡萄糖18-22份、乙酸钠4-6份、柠檬酸氢二铵1-3份、Tween-80 0.5-2份、K₂HPO₄ 1-3份、MgSO₄·7H₂O 0.1-1份、MnSO₄·H₂O 0.1-0.5份和水800-1000份。

在所述发酵培养基中，蛋白胨含量为8-12份，例如可以是8份、8.5份、9份、9.5份、10份、10.5份、11份、11.5份、12份等。

在所述发酵培养基中，酵母浸粉含量为4-6份，例如可以是4份、4.5份、5份、5.5份、6份等。

在所述发酵培养基中，葡萄糖含量为18-22份，例如可以是18份、19份、20份、21份、22份等。

在所述发酵培养基中，乙酸钠含量为4-6份，例如可以是4份、4.5份、5份、5.5份、6份等。

在所述发酵培养基中，柠檬酸氢二铵含量为1-3份，例如可以是1份、1.5份、2份、2.5份、3份等。

在所述发酵培养基中，Tween-80含量为0.5-2份，例如可以是0.5份、0.7份、1份、1.3份、1.5份、1.8份、2份等。

在所述发酵培养基中，K₂HPO₄含量为1-3份，例如可以是1份、1.5份、2份、2.5份、3份等。

在所述发酵培养基中，MgSO₄·7H₂O含量为0.1-1份，例如可以是0.1份、0.2份、0.4份、0.6份、0.8份、1份等。

在所述发酵培养基中，MnSO₄·H₂O含量为0.1-0.5份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份等。

在所述发酵培养基中，水含量为800-1000份，例如可以是800份、850份、900份、950份、10000份等。

优选地，步骤(b)中，所述接种的接种量为2-4wt％，例如可以是2wt％、2.2wt％、2.4wt％、2.6wt％、2.8wt％、3wt％、3.2wt％、3.4wt％、3.6wt％、3.8wt％、4wt％等。

优选地，步骤(b)中，所述培养的温度为35-40℃，例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，培养的时间为22-26h，例如可以是22h、23h、24h、25h、26h等。

优选地，步骤(c)中，所述离心的转速为7000-9000r/min，例如可以是7000r/min、7500r/min、8000r/min、8500r/min、9000r/min等，离心的时间为8-12min，例如可以是8min、9min、10min、11min、12min等。

优选地，步骤(c)中，所述乳酸菌菌泥还需采用水清洗2次以上，例如可以是2次、3次、4次、5次、6次等。

优选地，所述破碎处理后还需进行离心。

优选地，所述离心的转速为7000-9000r/min，例如可以是7000r/min、7500r/min、8000r/min、8500r/min、90000r/min等，离心的时间为8-12min，例如可以是8min、9min、10min、11min、12min等。

优选地，所述乳酸菌溶胞活性物的提取方法包括以下步骤：

(1)将乳酸菌接种于MRS液体培养基中，在100-150r/min、35-40℃下培养活化22-26h，得到种子液；

(2)将步骤(1)得到的种子液接种于发酵培养基中，35-40℃下培养22-26h，得到发酵液；

其中，所述发酵培养基按重量份数计包括：蛋白胨8-12份、酵母浸粉4-6份、葡萄糖18-22份、乙酸钠4-6份、柠檬酸氢二铵1-3份、Tween-80 0.5-2份、K₂HPO₄ 1-3份、MgSO₄·7H₂O 0.1-1份、MnSO₄·H₂O 0.1-0.5份和水800-1000份；

(3)将步骤步骤(2)得到的发酵液离心，用水清洗2次以上，再次离心收集，得到乳酸菌菌泥；

(4)将(3)得到乳酸菌菌泥稀释得到菌液后，以高压脉冲电场进行破碎处理，以7000-9000r/min离心8-12min收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物；

其中，所述高压脉冲电场的强度为0～3kv/cm所述高压脉冲电场的次数为50～70次，所述高压脉冲电场的有效时间为2～4min。

第二方面，本发明提供一种乳酸菌溶胞活性物，所述乳酸菌溶胞活性物由如第一方面所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法得到。

优选地，所述乳酸菌溶胞活性物中多糖含量为300mg/L以上，例如可以是302mg/L、304mg/L、306mg/L、308mg/L、310mg/L、312mg/L、314mg/L、316mg/L、318mg/L、320mg/L、330mg/L、340mg/L、350mg/L、360mg/L、380mg/L、400mg/L等。

优选地，所述乳酸菌溶胞活性物中多肽含量为1.6mg/L以上，例如可以是1.6mg/L、1.62mg/L、1.64mg/L、1.68mg/L、1.7mg/L、1.75mg/L、1.8mg/L、2.0mg/L等。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过使用高压脉冲电场提取技术，使乳酸菌溶胞产物有机酸、氨基酸、维生素、多糖、小分子肽类、生物酶等充分溶解出来，提取率更高；

(2)相较传统细胞破壁提取方法，使用高压脉冲电场提取技术，提取效率、经济效益好，提取物含量更高，且具有更好的抗氧化活性功效；

(3)由本发明制备得到的乳酸菌溶胞活性物中多糖含量高达300mg/L以上，多肽含量高达1.6mg/L以上，对ABTS清除率达高达98％以上，对DPPH清除率高达97％以上。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下制备例和实施例各组分来源如下所示：

实施例1

本实施例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，所述乳酸菌溶胞活性物的提取方法包括以下步骤：

(1)将乳酸菌接种于150mL的MRS液体培养基中，在120r/min、37℃下培养活化24h，得到种子液；其中，乳酸菌的接种量为3wt％；

(2)按3wt％的接种量将步骤(1)得到的种子液接种于发酵培养基中，在150r/min、37℃下培养24h，得到发酵液；

其中，所述发酵培养基包括：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、Tween-80 1.0g、K₂HPO₄ 2.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·H₂O0.25g和蒸馏水1L；

(3)将步骤步骤(2)得到的发酵液以8000r/min离心10min，用水清洗2次，再次以8000r/min离心10min收集，得到乳酸菌菌泥；

(4)将(3)得到乳酸菌菌泥稀释得到菌液后，以高压脉冲电场进行破碎处理，以8000r/min离心10min收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物；其中，所述高压脉冲电场的强度为2kv/cm所述高压脉冲电场的次数为60次，所述高压脉冲电场的有效时间为3min。

实施例2

本实施例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，所述乳酸菌溶胞活性物的提取方法包括以下步骤：

(1)将乳酸菌接种于150mL的MRS液体培养基中，在120r/min、37℃下培养活化24h，得到种子液；其中，乳酸菌的接种量为3wt％；

(2)按3wt％的接种量将步骤(1)得到的种子液接种于发酵培养基中，在150r/min、37℃下培养24h，得到发酵液；

其中，所述发酵培养基包括：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、Tween-80 1.0g、K₂HPO₄ 2.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·H₂O0.25g和蒸馏水1L；

(3)将步骤步骤(2)得到的发酵液以7000r/min离心10min，用水清洗2次，再次以7000r/min离心10min收集，得到乳酸菌菌泥；

(4)将(3)得到乳酸菌菌泥稀释得到菌液后，以高压脉冲电场进行破碎处理，以8000r/min离心10min收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物；其中，所述高压脉冲电场的强度为1.5kv/cm所述高压脉冲电场的次数为62次，所述高压脉冲电场的有效时间为4min。

实施例3

本实施例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，所述乳酸菌溶胞活性物的提取方法包括以下步骤：

(1)将乳酸菌接种于150mL的MRS液体培养基中，在120r/min、37℃下培养活化24h，得到种子液；其中，乳酸菌的接种量为3wt％；

(2)按3wt％的接种量将步骤(1)得到的种子液接种于发酵培养基中，在150r/min、37℃下培养24h，得到发酵液；

其中，所述发酵培养基包括：蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、Tween-80 1.0g、K₂HPO₄ 2.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·H₂O0.25g和蒸馏水1L；

(3)将步骤步骤(2)得到的发酵液以8000r/min离心10min，用水清洗2次，再次以8000r/min离心10min收集，得到乳酸菌菌泥；

(4)将(3)得到乳酸菌菌泥稀释得到菌液后，以高压脉冲电场进行破碎处理，以8000r/min离心10min收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物；其中，所述高压脉冲电场的强度为2.5kv/cm所述高压脉冲电场的次数为58次，所述高压脉冲电场的有效时间为2min。

实施例4

本实施例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(4)中，所述高压脉冲电场的强度为0.5kv/cm，高压脉冲电场的有效时间为10min。

实施例5

本实施例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，，步骤(4)中，所述高压脉冲电场的强度为3.5kv/cm，高压脉冲电场的有效时间为1min。

实施例6

本实施例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，，步骤(4)中，所述高压脉冲电场的强度为2kv/cm，所述高压脉冲电场的次数为45次，所述高压脉冲电场的有效时间为10min。

实施例7

本实施例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(4)中，所述离心的转速为6500r/min，所述离心的时间为20min。

实施例8

本实施例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(4)中，所述离心的转速为9500r/min，所述离心的时间为5min。

实施例9

本实施例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，所述发酵培养基包括：葡萄糖35g、牛肉蛋白胨35g、牛肉膏9.5g、酵母浸粉4.0g、乙酸钠5.0g、K₂HPO₄ 2.0 g、柠檬酸氢二铵2.0g、ZnSO₄·7H₂O 0.4g，MnSO₄·H₂O 0.2g，Tween-801.0g和蒸馏水1L。

对比例1

本对比例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，与实施例1的区别仅在于，利用超声破碎仪对菌体进行破碎处理，在800W冰浴条件下超声处理30min。处理完成后，菌液8000r/min离心10min，收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物。

对比例2

本对比例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，与实施例1的区别仅在于，利用超声破碎仪对菌体进行破碎处理，在1000W冰浴条件下超声处理30min。处理完成后，菌液8000r/min离心10min，收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物。

对比例3

本对比例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，与实施例1的区别仅在于，利用高压均质机对菌体进行破碎处理，在600MPa条件下处理3次。处理完成后，菌液8000r/min离心10min，收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物。

对比例4

本对比例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，利用高压均质机对菌体进行破碎处理，在800Mpa条件下处理3次。处理完成后，菌液8000r/min离心10min，收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物。

对比例5

本对比例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，利用溶菌酶对菌体进行破碎处理，在40℃条件下酶解处理处理4h。90℃加热处理，处理完成后，菌液8000r/min离心10min，收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物。

对比例6

本对比例提供一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，与实施例1的区别仅在于，利用溶菌酶对菌体进行破碎处理，在50℃条件下酶解处理处理4h。90℃加热处理，处理完成后，菌液8000r/min离心10min，收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物。

性能测试

分别测试上述实施例1-9和对比例1-6最终得到的上清液中多糖含量和多肽含量，以及ABTS抗氧化活性、DPPH抗氧化活性，具体测试方法如下所示：

I、多糖含量的测试方法：

1、试剂配制

(1)80％苯酚溶液：称取80g苯酚于100mL烧杯中，加水溶解，定容至100mL后转至棕色瓶中，置于4℃冰箱中避光贮存；

(2)5％苯酚溶液：选取5mL 80％苯酚溶液，溶于75mL水中，混匀，现用现配；

(3)100mg/L标准葡萄糖溶液：称取0.1000g葡萄糖于100mL烧杯中，加水溶解，定容至1000mL，置于4℃冰箱中贮存。

2、标准曲线制作

分别吸取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL标准葡萄糖溶液于20mL具塞玻璃试管，用蒸馏水补至1mL，加入1mL苯酚(5％)，然后迅速加入5mL浓硫酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合)，静置10min。使用涡旋振荡器时反应液充分混合，然后将试管置于30℃水浴中反应20min，在490nm处测定吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标，以490nm处吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

3、样品中总糖含量测定

对样品进行适当稀释，准确吸取1mL样品，后续操作同标准曲线的操作步骤，使最终吸光值在0.2～0.8之间，每个样品测定三个平行样，平行样结果误差不超过10％。

II、多肽含量

1、取1.2mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

2、取适量25mg/mL蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/mL。例如取20μL的25mg/mL蛋白标准，加入980μL稀释液即可配制成0.5mg/mL蛋白标准品。

3、将0.5mg/mL标准品按0、5、7、14、28、42、56、70μL加到1.5mL离心管中，加标准品稀释液补足到70μL，相当于标准品浓度分别为0mg/mL、0.025mg/mL(补足到100μL)、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL。

4、根据标准品稀释个数和待测样品数准备好酶标板，重复三次。

5、AB混合工作液为试剂A：试剂B按50:1制得。【注：AB混合工作液总体积＝(标准品个数+样品个数)×3×200μL，可根据实验适量多配一点。试剂B加人试剂A时，会产生浑浊，轻微混匀后既得绿色澄清液体。】

6、每孔预先加AB混合液200μL，然后再加标准品稀释液20μL、待测样品20μL，轻轻震荡混匀，不用移液枪混匀。

7、封板孵育，37℃下30分钟，冷却至室温后，酶标仪562nm检测吸光值。根据标品做标曲，计算样品蛋白含量；

III、ABTS抗氧化活性：

分别配置以下试剂：①2.45mmol/L过硫酸钾溶液；②10mmol/L的PBS磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)；③7mmol/L的ABTS储备液(用已制备的溶剂①配制)

取ABTS储备液，用无水乙醇获10mmol/L的PBS(pH＝7.4)稀释60～70倍，使其在734nm处的吸光值为0.7±0.02，得到ABTS工作液；吸取6mLABTS工作液加入60μL样品溶液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm下的吸光值A1；吸取6mL无水乙醇或PBS缓冲液加入60μL样品溶液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm下的吸光值A2；吸取6mLABTS工作液加入60μL无水乙醇或PBS缓冲液，振荡10s，30℃条件下静置6min，测定734nm下的吸光值A0。以VC作为样品的阳性对照，每个样品做三次平行；

其中，ABTS清除率的计算公式：

IV、DPPH抗氧化活性：

DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。

配制0.2mmol/L的DPPH·甲醇(或无水乙醇)溶液；配制不同浓度的待测样品溶液；

分别吸取2mL样品溶液和2mL的DPPH·溶液于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A₁；分别吸取2mL样品溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A₂；分别吸取2mL的DPPH·溶液和2mL甲醇于具塞试管中，混匀，避光反应30min，测定517nm波长下的吸光值A₀；每个样品做3个平行样；

其中，DPPH清除率的计算公式：

具体测试结果如下表1所示：

表1

由表1测试数据可知，所述乳酸菌溶胞活性物中多糖含量为300mg/L以上，所述乳酸菌溶胞活性物中多肽含量为1.6mg/L以上；乳酸菌溶胞活性物对ABTS清除率达到98％以上，对ABTS清除率达到97％以上。由此充分说明，本发明利用高压脉冲电场技术可以使胞内多糖分解酶变性失活，不再具有分解多糖的能力，从而使提取的多糖含量更高、抗氧化活性更好。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的乳酸菌溶胞活性物的提取方法及由其得到的乳酸菌溶胞活性物，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种乳酸菌溶胞活性物的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：将乳酸菌菌泥稀释得到菌液后，以高压脉冲电场进行破碎处理，得到乳酸菌溶胞活性物。

2.根据权利要求1所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法，其特征在于，所述高压脉冲电场的强度为0～3kv/cm，优选为1.5～3kv/cm；

优选地，所述高压脉冲电场的次数为50～70次；

优选地，所述高压脉冲电场的有效时间为2～4min。

3.根据权利要求1或2所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法，其特征在于，所述菌液的浓度为8-12g/100mL；

优选地，所述菌液的溶剂为水，优选为超纯水。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法，其特征在于，所述乳酸菌菌泥由以下制备方法制备得到：

(a)将乳酸菌接种于MRS液体培养基中，培养活化，得到种子液；

(b)将步骤(a)得到的种子液接种于发酵培养基中，培养，得到发酵液；

(c)将步骤步骤(b)得到的发酵液离心，收集得到乳酸菌菌泥。

5.根据权利要求4所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法，其特征在于，步骤(a)中，所述乳酸菌的保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2020年5月，保藏编号为ATCC8014，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼；

优选地，步骤(a)中，所述乳酸菌的接种量为2-4wt％；

优选地，步骤(a)中，所述培养活化的温度为35-40℃，培养活化的时间为22-26h；

优选地，步骤(a)中，所述培养活化的转速为100-150r/min。

6.根据权利要求4或5所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法，其特征在于，步骤(b)中，所述发酵培养基按重量份数计包括：蛋白胨8-12份、酵母浸粉4-6份、葡萄糖18-22份、乙酸钠4-6份、柠檬酸氢二铵1-3份、Tween-800.5-2份、K₂HPO₄1-3份、MgSO₄·7H₂O 0.1-1份、MnSO₄·H₂O 0.1-0.5份和水800-1000份；

优选地，步骤(b)中，所述接种的接种量为2-4wt％；

优选地，步骤(b)中，所述培养的温度为35-40℃，培养的时间为22-26h。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法，其特征在于，步骤(c)中，所述离心的转速为7000-9000r/min，离心的时间为8-12min；

优选地，步骤(c)中，所述乳酸菌菌泥还需采用水清洗2次以上。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法，其特征在于，所述破碎处理后还需进行离心；

优选地，所述离心的转速为7000-9000r/min，离心的时间为8-12min。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法，其特征在于，所述乳酸菌溶胞活性物的提取方法包括以下步骤：

(1)将乳酸菌接种于MRS液体培养基中，在100-150r/min、35-40℃下培养活化22-26h，得到种子液；

(2)将步骤(1)得到的种子液接种于发酵培养基中，35-40℃下培养22-26h，得到发酵液；

其中，所述发酵培养基按重量份数计包括：蛋白胨8-12份、酵母浸粉4-6份、葡萄糖18-22份、乙酸钠4-6份、柠檬酸氢二铵1-3份、Tween-800.5-2份、K₂HPO₄1-3份、MgSO₄·7H₂O0.1-1份、MnSO₄·H₂O 0.1-0.5份和水800-1000份；

(3)将步骤步骤(2)得到的发酵液离心，用水清洗2次以上，再次离心收集，得到乳酸菌菌泥；

(4)将(3)得到乳酸菌菌泥稀释得到菌液后，以高压脉冲电场进行破碎处理，以7000-9000r/min离心8-12min收集上清液，得到乳酸菌溶胞活性物；

其中，所述高压脉冲电场的强度为0～3kv/cm所述高压脉冲电场的次数为50～70次，所述高压脉冲电场的有效时间为2～4min。

10.一种乳酸菌溶胞活性物，其特征在于，所述乳酸菌溶胞活性物由如权利要求1-9中任一项所述的乳酸菌溶胞活性物的提取方法得到；

优选地，所述乳酸菌溶胞活性物中多糖含量为300mg/L以上；

优选地，所述乳酸菌溶胞活性物中多肽含量为1.6mg/L以上。