CN114917160B

CN114917160B - 一种具有抗氧化、抗炎、修护功效的香水莲花发酵物及其制备与应用

Info

Publication number: CN114917160B
Application number: CN202210631263.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋旭峰; 杜林婧; 秦锋
Original assignee: Frog Prince Fujian Baby Care Products Co ltd
Current assignee: Frog Prince Fujian Baby Care Products Co ltd
Priority date: 2022-06-06
Filing date: 2022-06-06
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2042-06-06
Also published as: CN114917160A

Abstract

本发明公开了一种具有抗氧化、抗炎、修护功效的香水莲花发酵物及其制备方法与应用。本发明利用微生物发酵方法，采用保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌与香水莲花进行共生发酵，可以在低温的条件下制备了一种富含香水莲花多糖、多酚及氨基酸活性成分的发酵物。香水莲花多糖为低分子量多糖(分子量为10kDA‑15kDA)，低分子量多糖更容易透过皮肤直到皮肤的真皮层，有利于将香水莲花的发酵物应用。本发明的香水莲花发酵物具有优异的抗氧化、抗炎、修护的生物活性，适合应用在化妆品领域。

Description

一种具有抗氧化、抗炎、修护功效的香水莲花发酵物及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物发酵领域，特别涉及一种具有抗氧化、抗炎、修护功效的香水莲花发酵物及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，由于各种因素如环境污染、生活压力以及化妆品的使用等造成的皮肤炎症疾病不断出现，皮肤刺激性、过敏性现象的发生率逐渐增加，针对敏感性肌肤的特殊护理品成为了化妆品细分产品领域中的销售黑马。因此针对过敏性皮肤的护理问题，研发出具有抗炎、修护功效的化妆品原料具有重要意义及市场价值。敏感皮肤的产生往往与皮肤屏障功能异常有关，促进屏障基因的表达，能够有效地促进皮肤屏障的修复；抑制炎症因子的产生，减少皮肤免疫炎症反应。

香水莲花富含多酚、黄酮、多糖、蛋白质、微量元素等天然活性成分，具有显著的保湿、抗氧化、抗炎、修护等功效。目前市面上针对香水莲花的开发和应用，多是通过水提或乙醇提取其中多酚、黄酮、氨基酸等物质，作为美白、抗衰、保湿、舒敏等功效成分应用于化妆品开发。而小分子物质具有更好的透皮吸收效果，例如中国专利公开文本CN110251433A利用水热提取，经过高温80-100℃提取0.5-3h将大分子物质剪切为不同分子量的小分子物质，并利用活性炭脱色、离心、膜过滤法去除色素及大分子物质，制得含小分子物质的香水莲花提取物。但该公开文本利用热降解处理，将使得多酚、黄酮等活性成分变性失活，且利用脱色膜过滤方法后去掉大分子物质的同时也损失了其它活性成分。专利公开文本CN109303734A利用碱性蛋白酶酶解大分子物质、过滤、乙醇热回流提取脂溶性成分、过滤、真空浓缩除乙醇、合并滤液真空冻干的方法获得香水莲花提取物。该工艺复杂，且碱性蛋白酶对蛋白质成分有效，但对于大分子多糖类成分效果有限，难以高效获得小分子活性成分。因此，上述方法中制备得到含小分子物质的香水莲花提取物中活性物含量较低，不利于香水莲花提取物中活性物的充分提取与应用。

现在对香水莲花的提取方式的研究还不充分，因此找到一种低温、温和且高效的提取香水莲花活性成分的方法及其应用效果的研究具有重要意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物的制备方法。

本发明另一目的在于提供上述方法制备的具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物。本发明利用保加利亚乳杆菌及青春双歧杆菌对香水莲花进行发酵萃取，获得富含小分子活性物多糖、多酚和氨基酸的香水莲花发酵物。并且本发明制备的香水莲花发酵物具有强抗氧化、抗炎、修护活性。

本发明再一目的在于提供上述具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将活化后的保加利亚乳杆菌及青春双歧杆菌菌种分别接入液体种子培养基中进行培养，获得保加利亚乳杆菌种子液和青春双歧杆菌种子液；

(2)取所述保加利亚乳杆菌种子液和所述青春双歧杆菌种子液，均接种至发酵罐的发酵培养基中，调节发酵罐内料液pH为6.0～7.0，在25～37℃下发酵24～72h，获得发酵液；所述发酵培养基包含有香水莲花干(含花房结构)；

(3)将所述发酵液进行灭活和过滤处理，即得到香水莲花发酵物。

步骤(1)中所述活化是指将保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌分别配成菌悬液，将所述菌悬液接种于固体培养基，活化培养，得到活化的保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌菌种；所述固体培养基为PDA固体培养基(马铃薯培养基)或DRBC琼脂固体培养基；

所述PDA固体培养基的制备步骤为：将新鲜马铃薯洗净去皮，称取200～300g马铃薯切块，加水煮烂(煮沸30min)，利用100～500目滤布过滤残渣。在滤液中添加琼脂20～40g，葡萄糖20～40g，再补足水分至1L，120～130℃灭菌20～30min后贮存备用。

所述DRBC琼脂固体培养基的制备步骤为：3号月示胨5.0～10.0g、葡萄糖10.0～30.0g、KH₂PO₄1.0～3.0g、氯硝胺0.002～0.01g、MgSO₄·7H₂O 0.5～3.0g、虎红0.01～0.1g、琼脂15～30g，再补足水分至1L，120～130℃灭菌20～30min后贮存备用。

所述活化培养的条件为：活化培养的温度为25～35℃，活化培养的时间为36～72h。

步骤(1)中在活化保加利亚乳杆菌及青春双歧杆菌菌种后，通过接种环分别将固体培养基中的保加利亚乳杆菌及青春双歧杆菌接入至液体种子培养基中进行培养，获得保加利亚乳杆菌种子液和青春双歧杆菌种子液。

步骤(1)中所述液体种子培养基为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基(DG18)、孟加拉红培养基(RB)或YES培养基中的一种或多种的组合。

所述沙氏液体培养基的配置方法是：将40.0～50.0g葡萄糖，10.0～30.0g蛋白胨溶解在人工海水中，并定容至1L，然后灭菌，备用。人工海水的配方为：NaCl 20～30g、MgSO₄·7H₂O 1.0～8.0g、CaCl₂·2H₂O 1.0～3.0g、KCl 0.5～1.0g、NaHCO₃ 0.2～1.0g、KBr0.1～0.5g、H₃BO₃ 0.01～0.05mg，蒸馏水加至1L。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。

所述高盐察氏培养基的配置方法是：NaCl 50～80g、NaNO₃ 1.0～5.0g、KH₂PO₄1.0～3.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5～3.0g、KCl 0.5～1.0g、FeSO₄ 0.01～0.5g、蔗糖30～50g，蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。

所述氯硝胺18％甘油培养基的配置方法是：蛋白胨5.0～10.0g、无水葡萄糖10.0～30.0g、KH₂PO41.0～3.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5～3.0g、氯硝胺0.002～0.01g、氯霉素0.1～0.5g、甘油200～250g、蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。

所述孟加拉红培养基的配置方法是：蛋白胨5.0～10.0g、葡萄糖10.0～20.0g、KH₂PO₄1.0～3.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5～3.0g、氯霉素0.1～0.5g、1/3000孟加拉红溶液100～200ml，蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。

所述YES培养基的配置方法是：酵母提取物1.0～5.0g、葡萄糖10～30g、NaCl 50～80g、CuSO₄·5H₂O 0.001～0.01g、ZnSO₄ 0.01～0.05g、氯硝胺0.002～0.02g、氯霉素0.1～0.5g，蒸馏水加至1L，灭菌，备用。所述灭菌是在120～130℃灭菌20～30min。

步骤(1)中所述培养的条件为培养温度为25～37℃，发酵罐内搅拌桨的转速为100～300r/min，培养时间为24～72h。

步骤(1)中所述种子液中，保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌的菌种浓度均为1×10⁷～1×10¹⁰CFU/mL。

步骤(2)中所述调节发酵罐内料液pH是指利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液进行调节；步骤(2)中发酵时发酵罐搅拌桨的转速为100～300r/min。

步骤(2)中所述发酵培养基包含有香水莲花干(含花房结构)和液体培养基；香水莲花干经过粉碎机打碎，过40-80目筛网；香水莲花为发酵培养基质量的1％～5％；所述液体培养基为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基(DG18)、孟加拉红培养基(RB)或YES培养基，这些培养基的配置方法同上。

步骤(2)中保加利亚乳杆菌种子液的接种量为发酵培养基质量的1％～3％；青春双歧杆菌种子液的接种量为发酵培养基质量的1％～3％。

步骤(3)中所述灭活处理是指巴氏灭菌法，灭活处理的温度为90～110℃，灭活处理的时间为30～120s；完成对微生物的灭活处理。

步骤(3)中所述过滤是指利用板框压滤机过滤去渣，得到的滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质。

步骤(3)中过滤后还包括向所述香水莲花发酵物中添加防腐剂，所述添加的防腐剂为丁二醇、戊二醇、己二醇等多元醇中一种以上；或者，苯氧乙醇、乙基己基甘油、对羟基苯乙酮、苯甲酸铵、山梨酸钾等常规防腐剂中一种以上；或者花椒果提取物、连翘提取物等植物防腐剂中的一种以上；或者抗菌肽等成分，防腐剂的添加量为0.1％～5％。

本发明还提供一种具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物，所述香水莲花发酵物包括通过上述的制备方法制备得到的香水莲花发酵物。本发明提供的香水莲花发酵产物包括香水莲花多糖、香水莲花多酚及氨基酸活性成分。本发明提供的香水莲花发酵物具有抗氧化、抗炎、修护功效。

本发明还提供一种具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物的应用，所述香水莲花发酵物在食品、药品、保健品和/或化妆品的应用。所述香水莲花发酵物用于制备食品、药品、保健品和/或化妆品，尤其是用于制备化妆品。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明利用微生物发酵方法，采用保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌与香水莲花进行共生发酵，可以在低温的条件下制备了一种富含香水莲花多糖、多酚及氨基酸活性成分的发酵物。与此同时，本发明提供的香水莲花发酵物中香水莲花多糖为低分子量多糖(分子量为10kDA-15kDA)，低分子量多糖更容易透过皮肤直到皮肤的真皮层，有利于将香水莲花的发酵物应用。

(2)本发明的香水莲花发酵物在化妆品中具有较好的应用效果：具有优异的抗氧化、抗炎、修护的生物活性。

附图说明

图1为不同浓度的实施例1、对比例1-4对DPPH清除率效果的示意图；

图2为不同浓度的实施例1试样下人角质形成细胞的相对细胞活性的示意图；

图3为不同浓度的对比例1试样下人角质形成细胞的相对细胞活性的示意图；

图4为不同浓度的对比例2试样下人角质形成细胞的相对细胞活性的示意图；

图5为不同浓度的对比例3试样下人角质形成细胞的相对细胞活性的示意图；

图6为不同浓度的对比例4试样下人角质形成细胞的相对细胞活性的示意图；

图7为不同浓度的实施例1、对比例1-4对人角质形成细胞内炎症因子IL-6的抑制效果的示意图；

图8为不同浓度的实施例1、对比例1-4对人角质形成细胞内炎症因子IL-8的抑制效果的示意图；

图9为实施例1、对比例1-4在3％浓度下对屏障修复相关基因TGM1、FLG、LOR、IVL和ABCA12的表达作用的示意图；

图10为实施例1、对比例1-4在5％浓度下对屏障修复相关基因TGM1、FLG、LOR、IVL和ABCA12的表达作用的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

当以范围、优选范围、或者优选的数值上限以及下限的形式表述某个量、浓度或其它值或参数的时候，应当理解相当于具体揭示了通过将任意一对范围上限或优选数值与任意范围下限或优选数值结合起来的任何范围，而不考虑该范围是否具体揭示。除非另外指出，本文所列出的数值范围值在包括范围的端点，和该范围之内的所有整数和分数。

除非另外说明，本文中所有的百分比、份数、比值等均是按质量计。

本文的材料、方法和实施例均是示例性的，并且除非特别说明，不应理解对本发明的限制。

本发明采用的微生物为保加利亚乳杆菌(BNCC187941)、青春双歧杆菌(BNCC341109)，菌种均为已公开的菌株，可通过各种途径获得。

本发明在菌株活化时，在固体培养基上接种的步骤为：移取1～10μL保加利亚乳杆菌、1～10μL青春双歧杆菌菌悬液在PDA固体培养基或DRBC琼脂固体培养基表面划线，然后活化培养。

实施例中PDA固体培养基的制备步骤为：将新鲜马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切块，加水煮烂(煮沸30min)，利用300目滤布过滤残渣，在滤液中添加琼脂20g，葡萄糖20g，再补足水分至1L，120℃灭菌20min冷却后贮存备用。

实施例中DRBC琼脂固体培养基的制备步骤为：3号月示胨5.0g、葡萄糖10.0、KH₂PO₄1.0g、氯硝胺0.002g、硫酸镁0.5g、虎红0.025g、琼脂15g，再补足水分至1L，120℃灭菌20min后贮存备用。

在活化保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌后，通过接种环将固体培养基中的保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌接入至液体种子培养基中进行培养，获得种子液。

其中所述液体种子培养基和液体培养基均为沙氏液体培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18％甘油培养基、孟加拉红培养基或YES培养基中的一种或多种的组合。

沙氏液体培养基的配置方法是(以制备1L培养基为例)：将40.0g葡萄糖，10.0g蛋白胨溶解在人工海水(人工海水配方：NaCl 20g、MgSO₄·7H₂O 1g、CaCl₂·2H₂O 1g、KCl0.5g、NaHCO₃ 0.2g、KBr 0.1g、H₃BO₃ 0.01mg，蒸馏水加至1L)中，并定容至1L，然后在120℃灭菌20min后贮存备用。

氯硝胺18％甘油培养基的配置方法是(以制备1L培养基为例)：蛋白胨5.0g、无水葡萄糖10.0g、KH₂PO₄1.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、氯硝胺0.002g、氯霉素0.1g、甘油200g、蒸馏水加至1L，然后在120℃灭菌20min后贮存备用。

高盐察氏培养基的配置方法是(以制备1L培养基为例)：NaCl 60g、NaNO₃ 2.0g、KH₂PO₄ 1.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、FeSO₄ 0.01g、蔗糖30g，蒸馏水加至1L，然后在120℃灭菌20min后贮存备用。

孟加拉红培养基的配置方法是(以制备1L培养基为例)：蛋白胨5.0g、葡萄糖10.0g、KH₂PO₄1.0 g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、氯霉素0.1g、孟加拉红溶液100mL，蒸馏水加至1L，，然后在120℃灭菌20min后贮存备用。

YES培养基的配置方法是(以制备1L培养基为例)：酵母提取物5.0g、葡萄糖30g、NaCl 50g、CuSO₄·5H₂O 0.01g、ZnSO₄ 0.01g、氯硝胺0.002g、氯霉素0.1g，蒸馏水加至1L，然后在120℃灭菌20min后贮存备用。

实施例1

(1)菌株活化与扩培：将保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌菌种分别溶于无菌水制成菌悬液，分别移取3μL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，活化培养，培养温度30℃，培养时间24h，获得活化后的保加利亚乳杆菌菌、青春双歧杆菌。通过接种环分别将固体培养基中的保加利亚乳杆菌及青春双歧杆菌接入至含有沙氏液体培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为30℃，发酵摇瓶的转速200r/min，培养48h后，得到保加利亚乳杆菌种子液及青春双歧杆菌种子液。在种子液中，保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌的菌种浓度均为1×10⁸CFU/mL。

(2)香水莲花原料处理：称取3kg香水莲花干(含花房结构)，粉碎机打碎，过60目筛网，注入97kg沙氏液体培养基，使香水莲花的质量分数为3.0％，将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温，从而得到3.0％(质量分数)香水莲花的沙氏液体培养基。

(3)发酵培养：将3％(质量分数)保加利亚乳杆种子液、3％(质量分数)青春双歧杆菌加入含有3％(质量分数)香水莲花的沙氏液体培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.2，随后将发酵罐内料液置于在30℃的条件下发酵48h。其中，在发酵过程中，发酵罐搅拌桨发生转动以使保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌与发酵罐内料液混合更加均匀，搅拌桨的转速为200r/min，发酵完成得到发酵液。

(4)发酵物灭活处理：将上述发酵物利用巴氏灭菌法，灭活处理的温度为90℃，灭活处理的时间为60s；完成对微生物的灭活处理；

(5)纯化：待发酵液完成降温至25℃后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除杂质，得到滤液88.9kg。

在过滤后得到的滤液中加入滤液质量为3％的戊二醇作为防腐剂，得到香水莲花发酵物。

实施例2

(1)菌株活化与扩培：将保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌菌种分别溶于无菌水制成菌悬液，分别移取3μL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，活化培养，培养温度30℃，培养时间24h，获得活化后的保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌菌；通过接种环分别将活化后的保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌菌接种至含有高盐察氏培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为28℃，发酵摇瓶的转速150r/min，培养48h后，得到保加利亚乳杆菌种子液及青春双歧杆菌种子液。在种子液中，保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌的菌种浓度均为1×10⁷CFU/mL。

(2)香水莲花原料处理：称取1kg香水莲花干(含花房结构)，粉碎机打碎，过70目筛网，注入99kg高盐察氏培养基，使香水莲花的质量分数为1.0％，将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温。

(3)发酵培养：将2％(质量分数)保加利亚乳杆菌种子液、2％(质量分数)青春双歧杆菌加入含有1％香水莲花的高盐察氏培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.0，在28℃，在搅拌桨的转速为100r/min的条件下发酵72h，得到发酵液。

(4)发酵物灭活处理：将上述发酵物利用巴氏灭菌法，灭活处理的温度为110℃，灭活处理的时间为40s；完成对微生物的灭活处理。

(5)纯化：待发酵液完成降温至25℃后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除杂质，得到滤液88.6kg。

在过滤后得到的滤液中加入滤液质量为3％的己二醇作为防腐剂，得到香水莲花发酵物。

实施例3

(1)菌株活化与扩培：将保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌菌种分别溶于无菌水制成菌悬液，分别移取3μL菌悬液在PDA固体培养基表面划线，活化培养，培养温度30℃，培养时间36h，获得活化后的保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌菌。通过接种环分别将活化后的保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌接种至含有氯硝胺18％甘油培养基的发酵摇瓶中进行扩培，培养温度为30℃，发酵摇瓶转速200r/min，培养12h后，得到保加利亚乳杆菌种子液和青春双歧杆菌种子液。在种子液中，保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌的菌种浓度均为1×10¹⁰CFU/mL。

(2)香水莲花原料处理：称取5kg香水莲花干(含花房结构)，粉碎机打碎，过60目筛网，注入95kg氯硝胺18％甘油培养基，使香水莲花的质量分数为5.0％，将发酵罐密闭，升温至120℃，保持30min进行灭菌处理，然后降温至室温。

(3)发酵培养：将1％(质量分数)保加利亚乳杆菌种子液、1％(质量分数)青春双歧杆菌加入含有5％香水莲花的氯硝胺18％甘油培养基中，利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.2，在30℃，在搅拌桨的转速为300r/min的条件下发酵24h，得到发酵液。

(4)发酵物灭活处理：将上述发酵物利用巴氏灭菌法，灭活处理的温度为100℃，灭活处理的时间为60s；完成对微生物的灭活处理。

(5)纯化：待发酵液完成降温至25℃后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除杂质，得到滤液90.1kg。

在过滤后得到的滤液中加入滤液质量为0.1％的对羟基苯乙酮作为防腐剂，得到香水莲花发酵物。

对比例1

利用粉碎机将3kg香水莲花干(含花房结构)粉碎处理，过60目筛网，按照料液质量分数，加入97kg的纯水，70℃温度、匀速200r/min搅拌条件下提取6h；待提取液降温至25℃后，利用板框压滤机过滤，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液88.0kg。在过滤后得到的滤液中加入滤液质量为3％的戊二醇作为防腐剂，得到香水莲花提取物。

对比例2

利用粉碎机将3kg香水莲花干(含花房结构)粉碎处理，过60目筛网，按照料液质量比1：5，加入15kg纯水，将水pH调制成5.0，然后加入0.015kg植物水解酶(酶活性100FBG/g)和0.015kg果胶酶(酶活性10000FBG/g)，40℃酶解1h后；再加入81.97kg纯水70℃提取5h，得到香水莲花提取物；待提取液降温至25℃后，将滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质，得到滤液88.7kg。在过滤后得到的滤液中加入滤液质量为3％的戊二醇作为防腐剂，得到香水莲花提取物。

对比例3

对比例3仅用6％(质量分数)保加利亚乳杆菌进行发酵，其余步骤与实施例1相同，得到香水莲花发酵物。

对比例4

对比例4仅用6％(质量分数)青春双歧杆菌进行发酵，其余步骤与实施例1相同，得到香水莲花发酵物。

效果实施例

香水莲花多糖分子量的测定方法：采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定香水莲花多糖分子量。GPC色谱条件：Waters色谱仪，Waters公司色谱柱Ultrahydrogel120、Ultrahydrogel 250、Ultrahydrogel 500串联，柱温：35℃，流动相为0.02mol/L KH2PO4溶液，pH为6.0，流速0.80mL/min。取分子量为5kDA-25kDA葡聚糖标准品和香水莲花多糖用流动相配置成2mg/mL的溶液，过0.22μm滤膜，进样量为20μL。根据标准曲线，得香水莲花多糖分子量。

香水莲花多酚含量测定方法：制备没食子酸标准液，量取梯度标准液，制备得到梯度质量浓度的(5、10、20、30、40μg/mL)，依次加入2.0mL 10％(体积比)的福林酚溶液，充分摇匀后再静置5min，然后再依次加入2mL 7.5％的碳酸钠稀释液，室温下放置2h。以纯水代替实际作为对照，测定波长为765nm处的吸光值，以没食子酸与吸光度的值回执标准曲线，以标准曲线法测定香水莲花发酵物中的香水莲花多酚含量。

总氨基酸含量测定：参照GB/T 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》方法对香水莲花发酵物中的水解氨基酸进行提取和测定，利用全自动氨基酸分析仪进行分析。

表1为实施例1～3和对比例1～4制备的香水莲花提取物的活性成分含量表。

实施例1、实施例2和实施例3使用本发明提供的香水莲花发酵物的制备方法得到的发酵液中香水莲花多糖、香水莲花多酚、总氨基酸的含量明显高于对比例1水提法、对比例2酶解提取法以及对比例3、4单独使用保加利亚乳杆菌或青春双歧杆菌制备的香水莲花提取物中活性物含量。本发明制备的香水莲花发酵物中香水莲花多糖含量为18.00-20.00mg/mL且多糖峰值分子量为10-15kDa，多酚含量为21.00-23.00μg/mL，总氨基酸含量为0.07-0.08mg/mL。对比例1中香水莲花多糖含量为4.96mg/mL，且多糖峰值分子量为1204kDa，多酚含量为10.65mg/mL，总氨基酸含量为0.045mg/mL。对比例2中香水莲花多糖含量为9.38mg/mL，且多糖峰值分子量为127kDa，多酚含量为13.14μg/mL，总氨基酸含量为0.050mg/mL。对比例3中香水莲花多糖含量为10.46mg/mL，且多糖峰值分子量为49kDa，多酚含量为15.54μg/mL，总氨基酸含量为0.052mg/mL。对比例4中香水莲花多糖含量为11.03mg/mL，且多糖峰值分子量为63kDa，多酚含量为14.33μg/mL，总氨基酸含量为0.057mg/mL。因此，利用本发明提供的保加利亚乳杆菌及青春双歧杆菌双微生物发酵法可以制备高含量的香水莲花多糖、多酚、总氨基酸，且多糖分子量为10-15kDa低分子量(远低于对比例1-4中多糖的分子量)。

本发明提供的香水莲花发酵物的制备方法制备得到的发酵液中，香水莲花多糖、香水莲花多酚、总氨基酸的含量明显高于使用水提法和酶解提取法制备香水莲花提取物中的香水莲花多糖、香水莲花多酚、总氨基酸的含量。与此同时，本申请提供的香水莲花发酵物的制备方法更有利于得到低分子量的香水莲花多糖。

表1实施例1～3和对比例1～4中活性成分的含量情况表

功效测试

对实施例1与对比例1-4的香水莲花样品进行抗氧化、抗炎、修护效果检验对比，结果如下所述：

一、抗氧化性能测试

利用DPPH法测试本发明中具有抗氧化、抗糖化、抗衰老作用的护肤组合物对自由基的清除效果。DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，具有单电子，在517nm处有一强吸收，其无水乙醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。

测试方法：

按以下表2依次加样，其中，DPPH-乙醇溶液由以下步骤制备得到：称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(Macklin，纯度>96％)12mg溶解于无水乙醇中，加入乙醇定容至250mL棕色容量瓶。DPPH-乙醇溶液临用时现配。样品溶液由以下步骤制备得到：分别移取实施例1及对比例1-2的组合物0.0001mL、0.001mL、0.01mL、0.1mL、1mL、10mL、30mL，加入去离子水定容至1000mL棕色容量瓶，得到0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、3％浓度样品溶液。

表2样品加液要求

扫描C-DPPH组的最大吸收波长，在最大吸收波长处检测吸光度值。测量结果显示，溶液在517nm处有最大吸收峰。将各支试管反应溶液混匀后，移入3cm比色皿中，测量每组溶液在517nm的吸光度。

清除率计算公式为：

式中：

T—样品管吸光值，即样品与DPPH反应后溶液吸光值；

T₀—样品本底吸光值；

C—DPPH管吸光值，即未加样品时DPPH溶液吸光值；

C₀—溶剂本底吸光值。

取三次测量平均值，测试结果如下图1所示。在系列浓度梯度下，实施例1对自由基的清除率均大于比例1-4对自由基的清除率，说明本申请的香水莲花发酵物对自由基具有较强的清除能力。其中，本发明实施例1浓度1％稀释液对自由基的清除率>90％；要显著高于对比例1-4对自由基的清除率。实验证明，本发明得到的香水莲花发酵液的抗氧化效果明显高于对比例1水提法、对比例2酶解提取法和对比例3、4保加利亚乳杆菌发酵或青春双歧杆菌发酵制备的香水莲花提取物的抗氧化效果。保加利亚乳杆菌和青春双歧杆菌在香水莲花的发酵过程中起到协同作用，两者共生发酵得到的香水莲花提取物的抗氧化效果优于采用单微生物的发酵香水莲花提取物。

二、抗炎性能测试

1.细胞毒理性测试

使用人角质形成细胞(HaCat细胞，购买至北京协和细胞资源中心)为模型，考察不同浓度的实施例1、对比例1和对比例2样品对人角质形成细胞的相对细胞活性情况，表征试样的细胞毒性，并筛选出试样的最大安全给药浓度。试验步骤如下：

(1)细胞培养：试验前24h制备细胞悬液，调整HaCat细胞浓度为0.8～

1.0×10⁵个/mL，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，在37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养24h。

(2)暴露：弃去孔中原培养液，每孔加入100μL不同浓度的测试样品(测试样品是指将实施例1的组合物加入适量完全培养基(MEM+10％FBS)，配置成体积百分数为0.15％、0.3％、0.6％、1.0％、3.0％、5.0％、10％、20％、25％、30％的测试样品溶液(图2至图6中以0.0015、0.003、0.006、0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.25、0.3示意)，以及阴性对照(完全培养基组)。培养箱孵育24h±0.5h。相差倒置显微镜下观察细胞形态和特性。

(3)MTT(噻唑蓝)测试：每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，培养箱孵育3±0.5h。去除孔中液体，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，置于振荡器振荡10～15min后，在酶标仪570nm波长处测定吸收值。

(4)数据处理：各组数据以均值±标准差表示，以对照组细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性(Viability)。

因化妆品中本发明组合物的建议添加量为1～40％，研究该浓度范围内，不同浓度的实施例1试样下人角质形成细胞的相对细胞活性情况如图2所示。观察加入测试样品乳液后人角质形成细胞的相对细胞活性，如果相对细胞活性高于70％，则对应该浓度为安全添加量，如果相对细胞活性低于70％，则认为为非安全添加量。在试样为20％本实施例1时，人角质形成细胞的相对细胞活性为75.29％；在试样为25％本实施例1时，人角质形成细胞的相对细胞活性为68.17；对比阴性对照组，人角质形成细胞的相对细胞活性为100％。因此，本发明实施例1添加量1～20％为安全添加量。不同浓度的对比例1-4试样下人角质形成细胞的相对细胞活性情况如图3-6所示，对比例1的添加量1-25％为安全添加量，对比例2的添加量1-20％为安全添加量，对比例3的添加量1-20％为安全添加量，对比例4的添加量1-20％为安全添加量。

2.抗炎功效测试

人角质形成细胞是一种存在于表皮中的免疫活性细胞，可分泌至少9种白细胞介素(IL)，这些因子对淋巴细胞增殖、活化炎症细胞等有重要作用。已有研究发现，紫外线辐射后角质形成细胞分泌的IL-6可促进成纤维细胞产生细胞外基质金属蛋白酶(MMP)，MMP可导致胶原蛋白降解，导致细胞外基质的损伤而引起皮肤的老化。此外，UVB的紫外线(波长为280～320nm)可促使角质形成细胞分泌更多的IL-8，促使中性粒细胞在皮肤局部的聚集，诱导后续的炎症反应，从而进一步影响皮肤的免疫功能。

因此，本发明使用人角质形成细胞(HaCat细胞)为模型，将实施例1的组合物用完全培养基(MEM+10％FBS)配置成体积百分数为1.0％、3.0％、5.0％的测试样品溶液，利用脂多糖LPS(10ug/mL，终浓度)刺激，角质形成细胞孵育24h后，研究对炎症因子(IL-6、IL-8)的释放情况，进而评价浓度为1.0％、3.0％、5.0％的本实施例1组合物的抗炎效果。以LPS(10ug/mL)作为刺激物，1％+LPS、3％+LPS、5％+LPS三个浓度的实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的组合物溶液与LPS的混合物为受试样品，以正常培养的角质形成细胞为空白对照。

试验步骤具体如下所示:

(1)细胞培养：将HaCat细胞以密度为2.0～3.0×10⁵个/mL/孔接种于12孔板，返回培养箱培养18～24h，培养基为在2～8℃下保存2周的含10％FBS的MEM培养基。

(2)暴露：取出上述培养板，弃去孔中原培养液，每孔加入1mL测试样品溶液(实施例1的组合物用完全培养基(MEM+10％FBS)配置成体积百分数为1.0％、3.0％、5.0％的测试样品溶液)，并利用脂多糖(LPS)(10ug/mL，终浓度)刺激；同时设置模型组和空白对照组，模型组为仅利用LPS(10μg/mL，终浓度)刺激，空白对照组为加入1mL完全培养基，不加LPS刺激。培养24±1h。

(3)加样：去除原培养液，加入1mL新鲜培养液，继续培养24±1h。

(4)检测：收集上清液，-80℃保存，细胞因子采用ELISA试剂盒进行测定，测试条件为：温度37±0.5℃，湿度>90％和5％CO₂浓度。

(5)数据分析：数据以均值±标准差表示，数据采用SPSS进行分析，如果p<0.05考虑差异具有统计学意义。

实施例1、对比例1-4不同浓度对IL-6炎症因子的抑制效果见图7所示：空白为正常细胞内的IL-6炎症因子相对含量为100％，经LPS刺激角质形成细胞后，模型组的IL-6水平较对照组(正常细胞)显著升高至263.20％，约为对照组的2.63倍。经统计学分析，与模型组对比，1％、3％和5％含量的实施例1组合物对LPS诱导的巨噬细胞分泌的炎性细胞因子IL-6有显著下调作用,实施例1组合物对巨噬细胞分泌的炎性细胞因子IL-6的下调作用明显强于对比例1-4组合物。与此同时，添加3％的实施例1使IL-6的含量接近至对照组的水平，表明较高浓度(≥3％)的实施例1可显著抑制抗炎反应。

实施例1、对比例1-4不同浓度对IL-8炎症因子的抑制效果见图8所示：空白为正常细胞内的IL-8炎症因子相对含量为100％，经LPS刺激角质形成细胞后，模型组的IL-8水平较对照组(正常细胞)显著升高至451.30％，约为对照组的3倍。经统计学分析，与模型组对比，1％低浓度的实施例1组合物对IL-8的抑制作用不具有显著性差异；而3％和5％含量的实施例1组合物对LPS诱导的巨噬细胞分泌的炎性细胞因子IL-8有显著下调作用，且差异具有统计学意义，实施例1组合物对巨噬细胞分泌的炎性细胞因子IL-6的下调作用明显强于对比例1-4组合物。与此同时，添加3％的实施例1组合物，使IL-8的含量接近至对照组的水平，表明较高浓度(≥3％)的实施例1可显著抑制抗炎反应。

上述试验结果表明，实施例1组合物与对比例1-4的组合物相比，具有显著的消炎效果。

三、促进屏障修复相关基因表达

使用人角质形成细胞(HaCat细胞)为模型，以屏障修复相关基因(转谷氨酰胺酶1基因TGM1、丝聚合蛋白FLG、兜甲蛋白LOR、内披蛋白IVL和ABCA12基因)进行测试。TGM1：编码与膜相连的钙依赖性硫醇酶，可以抵抗蛋白酶的水解作用，是角质形成细胞终末分化组成角质包膜的关键步骤，是皮肤屏障功能的物质基础。FLG：是皮肤屏障的关键，可减少抗原的入侵和经皮水分散失(TEWL)，并可释放酸性物质致皮肤pH值下降，抑制细菌的生长。LOR：是表皮颗粒细胞角质透明蛋白颗粒的主要成分，FLG的基因突变影响角质形成细胞的终末分化及FLG的表达异常使皮肤屏障功能受损。IVL：在转谷酰胺酶TGK的催化作用下交叉连接并沉积在细胞膜内侧而形成不溶于水的角质化包膜。ABCA12基因：作为一种ABC家族脂质体运体，位于板层小体界膜，参与板层小体形成，对维持正常的皮肤屏障功能起着重要作用。试验步骤具体如下所示:

(1)细胞接种：按2.5×10⁵个/孔的密度接种细胞至6孔板中，于培养箱(37℃、5％CO₂、95％RH)中培养过夜。

(2)配液：利用完全培养基(MEM+10％FBS)为溶剂，将实施例1组合物配制成质量分数为5％的溶液作为荧光定量PCR测试的受试物工作液。

(3)给药：每组设置3个重复孔，待6孔板中细胞的铺板率达到40％～50％时，进行分组给药，于培养箱(37℃、5％CO₂、95％RH)中培养24h。

(4)收集细胞：样品孵育培养24h后，进行PBS清洗操作，1mL/孔，清洗两次。清洗结束后，每孔加入1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收集至1.5mL无酶EP管中，并保存至-80℃冰箱。

(5)荧光定量PCR测试：根据RNAiso Plus说明书进行RNA提取操作，根据反转录试剂盒进行反转录操作，根据SYBR Premix Ex TaqTM II荧光染料(TaKaRa DRR081A)产品说明书进行荧光定量PCR反应体系配置及上机检测。

(6)结果计算：采用2-△C△T方法进行结果计算。

实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4不同浓度样品对屏障相关基因荧光定量PCR检测结果如图9和图10所示，实施例1在浓度为3％、5％时，对屏障修复相关基因TGM1、FLG、LOR、IVL和ABCA12的表达有显著的促进作用，均高于对比例1-4的效果。

实施例4和实施例5

重复实施例1，不同的是将液体种子培养基和液体培养基分别选用高盐察氏培养基、孟加拉红培养基。

可以理解的是，液体种子培养基和液体培养基所选的培养基的种类可以相同，也可以不相同，本发明中将液体种子培养基和液体培养基所选的培养基的种类相同为例，但不作为对本申请的限制。

本发明提供一种香水莲花发酵物的制备方法。本发明提供的香水莲花发酵物的制备方法制备得到的香水莲花发酵物中的香水莲花提取物的活性物含量明显高于现有技术中的水提法和酶解提取法制备的香水莲花提取物中活性物含量。香水莲花发酵物中香水莲花多糖为低分子量多糖(分子量为10kDA-15kDA)，低分子量多糖更容易透过皮肤直到皮肤的真皮层，有利于将香水莲花的发酵物应用。与此同时，本发明提供的香水莲花发酵物的制备方法制备得到的香水莲花发酵物表现出优异的抗氧化性能、抗炎性能以及促进屏障修复的功效。

本发明还提供一种香水莲花发酵物。香水莲花发酵物采用如前所述的香水莲花发酵物的制备方法制备得到。

本发明提供的香水莲花发酵物中香水莲花提取物的活性物含量明显高于现有技术中的水提法和酶解提取法制备的香水莲花提取物中活性物含量。与此同时，香水莲花发酵物表现出优异的抗氧化性能、抗炎性能以及促进屏障修复的功效。

本发明还提供一种香水莲花发酵物的应用。香水莲花发酵物在食品、药品、保健品和/或化妆品的应用。香水莲花发酵物用于制备食品、药品、保健品和/或化妆品。

虽然已经参照特定实施例示出并描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解：在不脱离由权利要求及其等同物限定的本发明的精神和范围的情况下，可在此进行形式和细节上的各种变化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将活化后的保加利亚乳杆菌及青春双歧杆菌菌种分别接入液体种子培养基中进行培养，获得保加利亚乳杆菌种子液和青春双歧杆菌种子液；

（2）取所述保加利亚乳杆菌种子液和所述青春双歧杆菌种子液，均接种至发酵罐的发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；

（3）将所述发酵液进行灭活处理和过滤处理，得到香水莲花发酵物；

所述保加利亚乳杆菌种子液的菌种浓度为1×10⁷～1×10¹⁰ CFU/mL；

所述青春双歧杆菌种子液的菌种浓度为1×10⁷～1×10¹⁰ CFU/mL；

步骤（2）中所述发酵培养基包括香水莲花干和液体培养基，所述香水莲花干包含花房结构；所述香水莲花干经过粉碎机打碎，过40-80目筛网；所述香水莲花干为所述发酵培养基质量的1%～5%；

步骤（2）中保加利亚乳杆菌种子液的接种量为所述发酵培养基质量的1%～3%；青春双歧杆菌种子液的接种量为所述发酵培养基质量的1%～3%。

2.根据权利要求1所述的具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述活化是指将保加利亚乳杆菌、青春双歧杆菌分别配成菌悬液，将所述菌悬液接种于固体培养基，活化培养，得到活化的保加利亚乳杆菌、活化的青春双歧杆菌；所述活化培养的条件为：活化培养的温度为25～35℃，活化培养的时间为36～72h。

3.根据权利要求1所述的具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述培养的条件为培养温度为25～37℃，培养时间为24～72 h。

4.根据权利要求1所述的具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物的制备方法，其特征在于：

步骤（3）中所述灭活处理的方式为巴氏灭菌法，灭活处理的温度为90～110℃，灭活处理的时间为30～120 s；

步骤（3）中所述过滤是指利用板框压滤机过滤去渣，得到的滤液再依次经过10μm、5.0μm及2.5μm的聚丙烯微滤膜滤柱除去杂质。

5.根据权利要求1所述的具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物的制备方法，其特征在于：

步骤（3）中过滤后还包括向所述香水莲花发酵物中添加防腐剂，所述添加的防腐剂为多元醇防腐剂、常规防腐剂、植物防腐剂、抗菌肽中至少一种，其中，

所述常规防腐剂为苯氧乙醇、对羟基苯乙酮、苯甲酸铵、山梨酸钾中的至少一种；

所述植物防腐剂为花椒果提取物、连翘提取物中的至少一种；

所述防腐剂的添加量为0.1%~5%。

6.一种具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的方法制备得到。

7.权利要求6所述的具有抗氧化、抗炎、修护活性的香水莲花发酵物在制备食品、药品、保健品和/或化妆品的应用。