KR20170137963A

KR20170137963A - 씀바귀, 선복화 및 민들레를 유산균으로 발효한 항염활성, 피부개선에 유용한 발효 추출물 및 이를 이용한 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20170137963A
Application number: KR1020160069159A
Authority: KR
Inventors: 신동주; 최용복; 남상인
Original assignee: 인코스(주)
Priority date: 2016-06-03
Filing date: 2016-06-03
Publication date: 2017-12-14
Also published as: KR102174260B1

Abstract

본 발명은 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 제조 방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 씀바귀, 선복화 및 민들레로 이루어진 혼합물을 추출하여 발효한 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항염 효과 및 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

씀바귀, 선복화 및 민들레를 유산균으로 발효한 항염활성, 피부개선에 유용한 발효 추출물 및 이를 이용한 화장료 조성물 {A Useful Ferment Extract For Anti-inflammatory Activity And Skin Improvement That Fermented Lettuce, Inula flower And Dandelion With Lactic Acid Bacteria And Cosmetic Composition Including The Same}

본 발명은 씀바귀, 선복화, 민들레를 발효한 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 발효를 통해 생리활성 증진 효과를 가질 뿐 아니라 항염, 피부개선 효과가 우수한 발효 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 현대인들의 경제수준이 향상되고 사회생활의 참여도가 높아지면서 피부 미용 건강에 대한 관심이 다양한 연령층에서 높은 수준으로 증가하고 있다. 피부노화를 방지하고 피부 노화 과정을 지연시켜 건강한 피부를 유지하고자 하는 목적에 따라 많은 미용 관련 화장품 및 식품이 개발되고 있고 특히 발효 추출물을 이용한 염증 억제와 피부개선을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

화장품은 피부를 보호하고 피부의 미화 및 청결을 위해 사용되는 제품이지만, 그 조성으로는 피부 보호 목적과는 상이한 성분들이 제품 형성을 위해 불가피하게 포함된다. 이러한 성분들로는 계면활성제, 방부제, 향료, 자외선 차단제, 색소뿐 아니라, 그 밖의 효능 및 효과를 부여하기 위한 여러 가지 성분들이 여기에 포함되며, 이들 성분은 일반적으로 피부에 염증이나 뾰루지, 부종 등 각종 트러블을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 체내로부터 배출되는 피지 및 땀, 화장품 성분 중의 지방산, 고급 알코올, 단백질 성분 등이 피부상에 존재하는 피부 상재균에 의해 독성이 강한 물질로 분해되어 이들에 의해 피부 염증이 유발될 수도 있으며, 태양으로부터 나오는 자외선에 의해서도 피부 염증이 유발된다는 것은 잘 알려진 사실이다. 이러한 외부 환경에 의해 노출된 피부는 활성 산소 종에 쉽게 노출되고, 발생된 활성 산소 종은 정상적인 세포 조직이나 세포막 뿐만 아니라 인접해 있는 조직 세포와 비세포 성분들까지 공격하게 되어 피부는 결국 염증을 일으키게 된다.

염증 반응은 붉어짐(feeling of redness), 따끔거림(pricking feeling), 화끈거림(burning hotness), 팽윤(swelling), 조직의 변화와 같은 5가지 현상으로 나타나는데, 이는 해로운 주위 환경, 즉 세균과 같은 외부 물질의 침입과 기계적 손상으로부터 생체를 보호하려는 생리적인 반응이다

염증반응은 면역세포가 생체의 이물질 등을 인식하여 활성화되고, 활성화된 면역세포에서 염증을 매개하는 많은 인자를 분비함으로써 시작된다. 이러한 염증현상은 여러 종류의 다핵형 백혈구(PMNs)와 면역 물질의 많은 증가를 초래하며, 이처럼 증가된 세포들은 염증성 세포 산물인 다양한 종류의 단백질 분해 효소와 사이토카인 등을 분비함으로써 치료 및 방어를 할 수 있게 해준다. 하나의 강력한 염증 매개물인 Nitric oxide (NO)는 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는 높은 반응성을 가진 생체 분자로서, NO synthase에 의해 L-argine으로부터 생성되고 특히 lipopolysaccharide (LPS)로 자극하면 inducible NOS가 발현되어 NO를 생성하게 된다. 이렇게 생성된 NO는 대신세포를 활성화시킴으로써 interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8, tumor necrosis factor (TNF)-α와 같은 pro-inflammatory cytokine을 생성하게 된다. 적절한 조건 하에서는 염증 초기 상태가 지난 후 정상 기능을 되찾게 되지만, 염증을 자극하는 자극제가 없어지지 않거나 계속해서 만들어질 경우에는 결과적으로 만성 염증이 일어나게 되어 더욱더 심각한 조직의 손상을 가져온다. 이처럼 과다 염증은 단백질 분해 효소들에 의해 세포 및 결합조직의 손상을 입히고, 결합 조직의 손상은 피부의 탄력을 감소시켜 주름의 원인이 될 뿐 아니라, 세포의 재생 및 증식에도 나쁜 영향을 미치게 되어 빠른 피부노화를 초래하게 되고, 피부에 국소적인 홍반과 부어 오름이 나타나게 된다. 만일, 결합조직이 심각하게 손상되고 염증반응이 지속된다면 정상적인 조직구조와 기능을 회복시키는 일은 훨씬 어렵게 된다.

발효(fermentation)란 미생물이 분비하는 효소에 의해 유기물을 분해하는 과정을 말한다. 또한 미생물이 에너지를 얻는 과정에서 유용한 물질을 내는 것도 발효이다. 한국인은 이러한 발효와 친숙한데 예로부터 김치를 비롯하여 된장, 청국장 등의 전통 발효식품이 대표적이다. 이러한 발효과정은 무산소호흡을 하는 미생물들로 유기물을 완전히 분해 시키고 다른 종류의 유기물을 만들어 내기도 하여 적은 양의 에너지를 생성시킨다. 이러한 발효의 종류는 미생물에 따라 젖산발효, 알콜 발효, 프로피온산 발효, 메탄 발효 등이 있다.

이러한 발효에 관계되는 미생물의 대표적인 유산균은 포도당 또는 유당과 같은 당을 분해하여 젖산이나 초산과 같은 유기산을 생성하며 부산물로 아밀라아제, 셀룰라아제, 리파아제, 프로테아제와 같은 효소를 생성하여 천연물 내의 거대분자의 저분자화를 통하여 피부침투를 용이하게 해준다.

씀바귀는 국화과에 속하는 여러해살이풀로 주로 한국, 일본, 중국에 분포하며 고채(苦菜) 씸배 나물이라고도 한다. 주로 산과 들에 자생하고 높이는 25～50 cm 정도로 자라고, 줄기나 잎을 자르면 유백색의 액체가 있다. 황색의 꽃은 5～7월에 약 1.5 cm 정도로 개화하고, 그 종류로는 흰씀바귀(Ixeris dentata var. albiflora Nakai), 벋은씀바귀(Ixeris japonica Nakai), 냇씀바귀(Ixeris tamagawaensis), 갯씀바귀(Ixeris repens), 좀씀바귀(Ixeris stolonifera), 선씀바귀(Ixeris chnensis var.strigosa), 산씀바귀(Lactuca raddeana), 왕씀배 (Prenanthes tanakae) 등이 있다.

선복화는 국화과의 금불초(Inula britannica var. japonica(Thunb.) Franch. & Sav)의 꽃을 말린 약재(한국). 중국에서는 금불초를 비롯하여 가는금불초(Inula britannica var. linariifolia(Turcz.) Regel), 구아선복화(Inula britannica L.:歐亞旋覆花)를 사용한다. 금불초는 꽃과 잎이 무성하고 둥근 것이 아래로 기울어져 있으므로 선복(旋覆)이라고 불렀다. 꽃 모양과 색깔 때문에 도경(盜庚)이라고 하였는데, 대개 경(庚)은 금(金)에 속하고 그것은 여름에 노란 꽃을 피우기 때문에 금기(金氣)를 훔쳤다고 여겨 붙여진 이름이다. 이 약은 특이한 냄새가 있고 맛은 쓰고 맵고 짜며 성질은 약간 따듯하다.

민들레(Taraxacum officinale: Dandelion)는 국화과에 속하는 다년초로 포공영, 금잠로 및 지정으로 불리어진다. 뿌리가 땅속 깊이 들어가고 줄기는 없다. 잎은 뿌리에서 뭉쳐나고 사방으로 퍼지며 타원 모양이고 끝이 예리하게 뾰족하며 깃 모양으로 깊게 갈라지고 가장자리가 밋밋하다. 꽃은 3~9월에 황색으로 피고 잎이 없는 꽃대 끝에 두상화(頭狀花, 꽃대 끝에 꽃자루가 없는 작은 꽃이 많이 모여 피어 머리 모양을 이룬 꽃) 1개가 달린다. 두상화는 지름이 2~5 cm이고, 총포 조각은 줄모양이며 녹색 또는 검은색이 돌고 털이 없으며, 바깥쪽 포 조각은 뒤로 젖혀지고 안쪽 포조각은 곧게 선다. 열매는 수과이고 갈색이며 편평하고 양 끝이 뾰족한 원기둥 모양이며 길이가 2~4mm이고 짧은 돌기가 있으며 끝이 부리처럼 길다. 관모는 흰색이고 부리 끝에서 우산 모양으로 퍼진다. 예부터 민간과 한방에서는 강장, 해열, 이뇨, 건위, 거담, 해독 등에 이용되어 왔다.

이에 본 발명자들은 염증 억제, 피부개선을 갖는 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 산물에 대하여 연구 노력한 결과, 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물이 세포 독성 없이 염증 억제, 피부개선 효과를 동시에 가짐을 확인하였고, 특히 발효 미생물에 따라 그 기능이 더욱 강화됨을 발견하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 과제는 염증억제, 피부개선 효과를 갖는 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 기능성 원료로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이를 위해 본 발명은 유산균에 의해 발효된 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 포함하는 염증억제, 피부개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물에 관한 것으로, 기존의 씀바귀, 선복화 및 민들레 추출물 보다 발효 추출물이 효과가 뛰어나고 염증 억제, 피부 개선 효과 증가를 나타낸다. 따라서 염증유발 물질인 NO, IL-6, IL-8, PGE2 생성저해를 통한 항염 활성 효과를 가지며 항산화 활성, 피부콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 저해를 통한 피부 개선 및 예방효과가 우수하여, 피부개선 기능이 현저하게 우수하면서도 피부 자극이 없는 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 효과를 갖는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확히 표현하기 위한 목적으로 기재될 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<비교예1> 씀바귀, 선복화 및 민들레 추출물 제조

환류냉각관을 부착시킨 둥근 플라스크에 씀바귀, 선복화 및 민들레 100 g의 시료에 증류수 1 L를 넣고 80℃의 수욕조 상에서 3 시간씩, 3회 반복 추출하여 얻은 추출물을 여과지로 여과하여 제조 하였고, 하기 발효 원료 및 실험예의 시료로 사용하였다.

<실시예1> 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물 제조

Lactobacillus paracasei 균을 MRS 고체 배지에서 25℃ 내지 50℃ 온도 에서 24시간 활성화시킨 후, 한 콜로니를 따서 멸균된 MRS 액체 배지에 접종한 후 25℃ 내지 50℃ 온도 배양기에서 24시간 진탕배양시켜 종균으로 사용한다.

씀바귀, 선복화 및 민들레 추출물이 1 내지 90 중량%가 함유된 액체 배지에 미리 배양된 Lactobacillus paracasei 균을 10⁷~10⁸ CFU/ml 농도가 되도록 첨가한 후 25℃ 내지 50℃온도에서 18시간 내지 120시간 배양하여 발효를 시켜 발효물을 제조하였다.

발효를 종료하기 위해 100℃에서 40분간 열을 가하여 균의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<실험예 1> 항염 효과

<실험예1-1> NO 생성 억제

RAW264.7 대식세포는 한국세포주은행에서 구입하여 37℃, 5% CO₂조건하에서 10% FBS와 1% Antibiotic-Antimycotic (10 units/mL penicillin, 100μg/mL sterptomycin, 0.25 μg/mL amphotericin)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다.

항염효과를 측정하기 위하여 NO 생성을 측정하였다. NO 생성량은 Griess 시약을 이용한 Nitrite/Nitrate Assay Kit (Invitrogen, USA)을 통해 세포 배양액 내 존재하는 NO의 안정된 산화물인 NO₂ ^-를 측정하여 분석하였다. RAW264.7 세포를 96-well plate에 2 × 10⁶ cells/ml의 농도로 접종하여 24 h 배양한 뒤 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음 FBS를 포함하지 않는 새로운 배지로 교환하였다. 추출물과 LPS (100ng/mL)를 처리하여 다시 24 h 배양하였다. 세포 배양 상층액 100 μL와 Griess 시약 100 μL를 혼합하여 96-well plate에서 10 min 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 NaNO₂를 이용하여 표준곡선을 구하여 정량하였다.

실험결과, 표 1 에 나타난 바와 같이, 비교예 1에 비해 실시예 1의 발효 추출물의 항염 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 항염활성

농도(%)	NO conc(ug/ml).
농도(%)	LPS(-)	LPS(+)	비교예1	실시예1
0.05	0.2	13.4	11.8	7.5
0.5			10.1	3.5
5			3.9	1.5

<실험예1-2> IL-6, IL-8, PGE₂ 생성 억제 효과

RAW264.7 대식세포는 한국세포주은행에서 구입하여 37 ℃, 5% CO₂조건하에서 10% FBS와 1% Antibiotic-Antimycotic (10 units/mL penicillin, 100μg/mL sterptomycin, 0.25 μg/mL amphotericin)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다.

염증 매개 물질인 PGE2, IL-6 및 IL-8의 생성 억제 효과를 측정함으로써 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 염증 억제 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다. RAW264.7 대식세포를 6 well plate에 1 x 10⁵ 세포의 밀도로 접종하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 다음, 과산화수소(H₂O₂) 500uM을 well plate에 처리하여 24시간 동안 자극을 준 후, 추출물을 처리하여 48시간 동안 반응시키고 배양액을 수거하여 ELISA 에세이를 실시한 다음, PGE2는 에세이 디자인(Assay Design)사의 키트를, IL-6 및 IL-8은 엔도젠(Endogen)사의 키트를 사용하여, 각 회사의 메뉴얼대로 실험하였고(P. Tijssen, in Practise and Theory of Enz. Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, 1985), 하기 수학식 1을 이용하여 PGE2, IL-6 및 IL-8의 생성 억제 효과를 구하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

실험결과, 표 2 에 나타난 바와 같이, 비교예 1, 실시예 1 모두 농도의존적으로 PGE2, IL-6 및 IL-8의 생성을 저해시켰고, 비교예 1에 비해 실시예 1의 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 항염 활성이 탁월함을 알 수 있었다.

[수학식 1]

억제 효과 ={1 - (A-B)/ (C-B)} X 100

A: 과산화수소(H2O2)를 처리한 비교예 1, 실시예 1의 PGE₂, IL-6 또는 IL-8의 생성량(pg/ml)

B: 배지만 처리한 대조군에서 PGE2, IL-6 또는 IL-8의 생성량(pg/ml)

C: 과산화수소(H2O2) 처리군에서 PGE2, IL-6 또는 IL-8의 생성량(pg/ml)

씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 항염활성

시료	PGE₂ (pg/ml)	PGE₂ 생성 억제율 (%)	IL-6 (pg/ml)	IL-6 생성 억제율 (%)	IL-8 (pg/ml)	IL-8 생성 억제율 (%)
대조군	151.1	-	22.8	-	22.8	-
H2O2(500uM)	487.8	-	191.1	-	322.4	-
H2O2+비교예1의 0.5%	387.5	29.8	165.8	15.0	288.7	11.2
H2O2+비교예1의 5%	365.7	36.3	157.9	19.7	278.8	14.6
H2O2+실시예1의 0.5%	200.5	85.3	100.6	53.8	178.4	48.1
H2O2+실시예1의 5%	156.0	98.5	51.8	82.8	107.7	71.7

<실험예 2> 자극완화 평가

RAW264.7 대식세포는 한국세포주은행에서 구입하여 37℃, 5% CO₂조건하에서 10% FBS와 1% Antibiotic-Antimycotic (10 units/mL penicillin, 100μg/mL sterptomycin, 0.25 μg/mL amphotericin)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 자극완화 효과를 측정하기 위하여 RAW264.7 대식세포에 LPS (100 ng/mL)로 자극시킨 후 추출물을 처리하여 LPS의 독성에 의한 세포독성 억제 효과를 MTT assay로 측정하였다. 세포 생존율은 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 보라색 formazan으로 환원되는 MTT의 원리를 이용하여 분석하였다. RAW264.7 세포를 96-well plate에 2 × 10⁴ cells/mL의 농도로 접종하여 24h 배양한 뒤 배지를 버리고 Phosphate Buffered Saline(PBS)로 세척한 다음 FBS를 포함하지 않는 새로운 배지로 교환하였다. 세포는 LPS (100 ng/mL)로 자극시키거나 혹은 자극시키지 않은 상태에서 각 추출물을 처리하고 세포를 다시 24 h 배양 후, 0.5% MTT 용액을 각 well에 100μL씩 첨가하여, 4 h 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO를 200 μL씩을 넣고 10 min간 흔들어준 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 대조군에 대한 흡광도 값을 나누어 백분율로 나타내었다.

실험결과, 표 3 에 나타난 바와 같이, 비교예 1 도 LPS에 의한 세포독성 완화 효과가 있었으나, 실시예 1인 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물에서 LPS에 의한 세포독성 완화 효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.

씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 자극완화 활성

농도(%)	세포생존율(%).
농도(%)	LPS(-)	LPS(+)	비교예1	실시예1
0.1	100	78	85	104

<실험예 3> 자극완화 임상 평가

본 발명의 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 자극 완화 임상 평가를 위하여 하기 표 4에 기재된 조성으로 화장료 조성물을 제조하였다. 실시예1의 방법으로 제조된 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물(제형예 1)과 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 포함하지 않은 영양로션 (비교제형예 1)을 제조하여 자극 완화 임상 평가를 실시하였다.

	원료명	제형예1	비교제형예2
1	씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물 (실시예1)	5.0	-
2	스테아린산	4.0	4.0
3	세틸알콜	1.0	1.0
4	글리세릴모노스테아레이트	2.0	2.0
5	폴리옥시에틸렌소르비탄모노스테아레이트	0.5	0.5
6	솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
7	글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트	1.0	1.0
8	왁스	1.0	1.0
9	유동파라핀	4.0	4.0
10	스쿠알렌	4.0	4.0
11	카르릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0	4.0
12	카르복시비닐폴리머	0.3	0.3
13	부틸렌글리콜	5.0	5.0
14	글리세린	3.0	3.0
15	트리에탄올아민	0.5	0.5
16	소듐-이디티에이	0.02	0.02
17	정제수	to100	to100

<제조방법〉

제형예 1 : 12, 13, 14 및 17번을 혼합 교반하면서 80~85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후, 유화기를 작용시키고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 16번을 80∼85℃ 사이로 가열하여 용해한 후 15를 투입 교반하여 제조부에 투입하고 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각하고 1번을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

비교제형예 1 : 12, 13, 14 및 17번을 혼합 교반하면서 80~85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후, 유화기를 작용시키고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 16번을 80∼85℃ 사이로 가열하여 용해한 후 15를 투입 교반하여 제조부에 투입하고 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시킨다.

상기에서 제조된 화장료의 자극완화 효과를 간이 임상평가를 통해 확인하였다.

제형예 화장료의 피부 자극개선 효과를 평가하기 위해, 20~30대 여성 지원자 10명을 대상으로 다음과 같은 실험을 실시하였다. 지원자의 피부자극 측정 조건을 동일하게 하기 위하여 실험부위를 깨끗하고 마른 상태로 유지하였으며, 최소 30분간 항온 항습 (20℃, 상대습도 40~60%)이 유지되는 곳에서 피부 안정을 취한 후 진행하였다. 피부의 자극측정은 인중을 중심으로 좌측에는 제형예1을 우측에는 비교제형예1을 도포하여 20분 경과 후 설문 평가를 통하여 피부 자극 정도를 평가하였다. 자극측정은 하기 표 5 및 표 6의 기재된 내용을 바탕으로 지원자의 자가 설문 평가를 통해 시행하였으며 제형예1과 비교제형예1을 가지고 피부 자극의 차이를 비교하였다.

피부자극 평가기준

0	1	2	3
자극없음	약간있음	보통	자극있음

피부자극 평가항목 및 설문지

홍반 (Erythema)	부종 (Edema)	가려움(Itching)	따끔거림(Prickling)

설문 조사 결과를 표 7에 나타내었다.

피부자극 설문조사 결과

분류	홍반 (Erythema)	부종 (Edema)	가려움(Itching)	따끔거림(Prickling)
제형예1	0	0	0.5	0.3
비교제형예1	0	0	2.0	1.8

표 7에 나타낸 바와 같이, 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물(실시예1)을 함유하는 제형예1의 화장료가 추출물 대신 물을 사용하여 제조한 비교제형예1의 화장료에 비해 자극완화효과가 매우 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 4> 피부 개선 효과

<4-1> 항산화 활성 측정

씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 항산화 활성을 측정하기 위하여, DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 라디칼 소거능을 사용하였다.

0.4 mM DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 용액을 에칠 알콜에 녹여 여과한 후 즉시 사용하였다. 제조된 DPPH 용액과 시료 용액을 1:1로 혼합하여 격렬하게 섞은 후, 상온 암소에 10 분간 방치하였다. Microplate reader (BioTek, USA)를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 2을 통해 DPPH 라디칼 제거율(%)을 산출하였다. 이때 라디칼을 제거하는 양성 대조군(positive control)으로 1 mg/ml의 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.

실험 결과, 표 8 에 나타난 바와 같이, 비교예 1에 비해 실시예 1의 발효 추출물의 항산화능이 높음을 알 수 있었다

[수학식 2]

DPPH 라디칼 제거율(scavenging, %) = (A - B) / A x 100

상기 식에서, A는 공시험액에서 얻은 흡광도이고, B는 검액에서 얻은 흡광도임

씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 항산화 활성

농도(%)	항산화력 (%)
농도(%)	As 1mg/ml	비교예1	실시예1
0.1	91.2	47.6	76.6
1	91.2	88.4	95.2

<4-2> 콜라겐 생합성 평가

시료에 대한 Fibroblast 세포 내에서 새로 생성되는 collagen 양을 측정하기 위해 procollagen assay를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 젠타마이신 (50ug/mL)과 10% Fetal bovine serum(FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM Welgene, Korea)에 37℃, 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2 x 10⁵농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, DMEM배지에 시료를 농도 별로 처리하여 48 - 72시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 200uM을 positive control로, UV(+)군을 Negative control로, 배지만 처리한 그룹을 control로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 시료 처리 후 48 - 72시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였고, 수거한 배지는 Procollagen Type-I C-Peptide(PIP) EIA kit(Takara Bio Inc. MK101)를 이용하여 새로 생성된 콜라겐 양을 측정하였다. Antibody-POD conjugate solution 100ul를 각 well에 첨가하고, sample 이나 standard를 20ul씩 넣은 뒤 잘 섞어서 37℃에서 3시간 방치하였다. 반응이 끝나면 내용물을 제거한 뒤 PBS 400ul로 4번 세척하였다. 제거 후 기질용액 100ul를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 stop solution 100ul 첨가하여 부드럽게 섞어주었다, microplate reader(BioTek, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한 후 표준 농도곡선을 작성하여 콜라겐 양을 산정하였다(표 9).

실험 결과, 표 9 에 나타난 바와 같이 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴보기 위해서, 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 처리하였을 경우와 이를 비교하기 위한 씀바귀, 선복화 및 민들레 추출물을 함께 비교하였다. 실시예 1의 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물 경우 비교예 1 보다 강한 콜라겐 합성능을 보임으로써 자외선에 의한 항노화 및 주름 개선의 효과를 확인할 수 있었다

씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 콜라겐 생합성

농도(%)	콜라겐 합성 (%)
	UV (-)	UV (+)	As 200uM	비교예1	실시예1
0.5	100	48	58	47	65
5				53	84

<4-3> MMP-1 저해 평가

Collagen을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 collagen type I을 분해하는 MMP-1(Matrix metalloproteinase I, collagenase)으로 이를 측정하기 위해 MMP-1 assay를 실시하였다. 시료에 대한 Fibroblast 세포 내에서 새로 생성되는 collagen 양을 측정하기 위해 procollagen assay를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 젠타마이신 (50ug/mL)과 10% Fetal bovine serum(FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM Welgene, Korea)에, 37℃ , 5 % CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, DMEM배지에 시료를 농도 별로 처리하여 48시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 200uM을 positive control로, UV(+)군을 Negative control로, 배지만 처리한 그룹을 control로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 시료 처리 후 48시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 MMP-1 측정 키트(RPN 2610, Amersham Bioscience, UK)를 이용하여 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Anti-MMP1 antibody로 코팅된 96 well plate에 buffer를 well 하나에 첨가하여 blank로 삼고, 배지 중에 유리된 샘플과 표준액 100ul를 각각의 well에 넣는다, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 3회 반복해서 세척 한 후 물기를 완전히 제거한다. 100ul peroxide conjugate를 첨가하고, 실온에서 shaking 없이 2시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 30분간 shaking 하면서 반응시킨다. 100ul 1M H₂SO₄로 반응을 중지시킨 후 microplate reader(BioTek, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 비교 하였다(표 10).

실험결과, 표 10 에 나타난 바와 같이, 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴보기 위해서, 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 처리하였을 경우와 이를 비교하기 위한 씀바귀, 선복화 및 민들레 추출물을 함께 비교하였다. 실시예 1의 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 경우 비교예 1 보다 강하게 MMP-1 활성이 저해되었고, 이는 콜라겐 생합성 결과(표 9)와 일치하는 양상을 보인다.

씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 MMP-1 활성 저해도

농도(%)	MMP-1 (% of control)
농도(%)	UV (+)	As 200uM	비교예1	실시예1
0.5	100	71.6	91	66
5	100	71.6	80	50

<실시예3> 유연화장수(스킨토너)

하기의 표 11과 같이 상기 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 함유하는 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량%
씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물 (실시예1)	5
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트80	0.4
에탄올	10
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

<실시예4> 에센스

하기의 표 12과 같이 상기 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 함유하는 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료명	중량%
씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물 (실시예1)	10
히아루론산	3.0
부틸렌글리콜	5.0
글리세린	5.0
위치하젤 추출물	0.5
레시친	0.2
알란토인	0.1
변성알콜	5.0
피이지60 하이드로제네이티드 캐스터 오일	0.5
내추럴베테인	1.5
잔탄검	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

<실시예5> 영양크림

하기의 표 13과 같이 상기 씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 함유하는 영양크림은 수상과 유상은 각각 75℃에 가열 후 5분간 유화시켜 냉각 탈포하여 제조하였다.

원료명	중량%
씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물 (실시예1)	10
밀납	10.0
폴리솔베이트60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

Claims

씀바귀, 선복화 및 민들레 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염 효과 및 피부개선용 화장료 조성물
1항에 있어서, 상기 발효는 유산균을 이용하여 발효 하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
2항에 있어서, 상기 유산균은 Bifidobacterium longum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus confusus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc citreum, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc sp, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaseus 중 1종인 것으로 한다
1항 내지 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효 추출물은 상기 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.01~95%(w/w)로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
제 4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨류, 로션류, 에센스류, 크림류, 팩류, 파운데이션류 및 메이크업베이스류 중 선택된 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 항염효과, 피부개선 효과를 갖는 화장료 조성물