CN113604509B

CN113604509B - 二裂酵母发酵产物及其制备方法和用途

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Publication number: CN113604509B
Application number: CN202110985291.4A
Authority: CN
Inventors: 李海珍; 李海燕
Original assignee: Shandong Dorado Shang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Dorado Shang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-08-26
Filing date: 2021-08-26
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2041-08-26
Also published as: CN113604509A

Abstract

本发明公开了二裂酵母发酵产物及其制备方法和用途，该制备方法包括以下步骤：将长双歧杆菌接种于种子培养基中，厌氧培养活化，得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中，调节发酵液初始pH值为6.5～7.0，厌氧发酵培养；所得发酵液离心，取上清液，为二裂酵母发酵产物；所述的种子培养基和发酵培养基，是取豆渣5～10g、甘蔗渣1～5g，补水至1kg。本发明采用豆渣和甘蔗渣作为双歧杆菌培养基，利用豆渣和甘蔗渣丰富多样的营养成分进一步强化提升双歧杆菌的有益代谢产物。本发明的二裂酵母发酵产物滤液在化妆品中具有较好的应用效果：具有优异的促进屏障修复相关基因表达、促进胶原蛋白合成的功效性能。

Description

二裂酵母发酵产物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及二裂酵母发酵产物及其制备方法和用途。

背景技术

二裂酵母发酵产物(BIFIDA FERMENT FILTRATE)，是双歧杆菌发酵后得到的代谢产物，主要成分为有机酸(乳酸、柠檬酸和琥珀酸等)、维生素(B1、B2、B6、B12、泛酸、叶酸等)、细菌素(大多属于水溶性多肽)、多糖、蛋白质与氨基酸等。

二裂酵母发酵产物中的乳酸是天然保湿因子，存在于人体肌肤中，可有效去除细纹、皱纹，加快角质更新等功效；叶酸可以活化皮肤表皮细胞，促进水分的保养和营养成分的吸收，可减轻皮肤的角化速度，从而达到美容养肤和嫩化皮肤的目的；另外，氨基酸，脂质，多糖，腺苷，维生素，微量矿物质、维生素B群等活性成分，能滋润、营养肌肤，帮助肌肤抵御外界环境和压力对皮肤造成的伤害，同时能促迚多种与表皮分化和皮肤屏障功能相关的蛋白基因表达，収挥祛皱、修复、保湿、增强皮肤弹性的功效。因此，二裂酵母发酵产物具有极大的市场应用前景。但目前用于化妆品原料的二裂酵母发酵产物滤液制备工艺复杂，且常需要不断补充外源性营养成分促进双歧杆菌的发酵生长，使得代谢产物中残留一些外源添加物成分，且同时提高了发酵的生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供二裂酵母发酵产物的制备方法，通过采用豆渣和甘蔗渣作为培养基，从而有效提高所得发酵产物的抗衰老能力，具体体现在促进屏障修复相关基因的表达，提高成纤维细胞活性和COL-I蛋白表达量。这些效果是现有技术方法未能达到的。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

二裂酵母发酵产物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将长双歧杆菌接种于种子培养基中，厌氧培养活化，得到种子液；

(2)将种子液接种至发酵培养基中，调节发酵液初始pH值为6.5～7.0，厌氧发酵培养；

(3)将步骤(2)所得发酵液离心，取上清液，为二裂酵母发酵产物；

优选地，所得二裂酵母发酵产物经过低温巴氏灭菌、过滤、添加防腐剂后，得到可产业化使用的二裂酵母发酵产物。

步骤(1)所述的长双歧杆菌，优选长双歧杆菌ATCC 15697；

所述的种子培养基和发酵培养基，是取豆渣5～10g、甘蔗渣1～5g，补水至1kg；其中的豆渣、甘蔗渣粉碎后过40～80目筛网；豆渣中含有大量的蛋白质、膳食纤维、氨基酸、维生素、矿物质等各类营养元素，为双歧杆菌生长提供天然的N源；另外，利用甘蔗渣中丰富的多糖成分，为双歧杆菌生长提供天然的C源。

优选地，步骤(1)中，长双歧杆菌的接种量占种子培养基质量的1％～3％；所述厌氧培养的温度为35～40℃(特别优选36～38℃)，培养时间20～30h；所得种子液中长双歧杆菌的浓度为1×10⁶～1×10⁸CFU/mL。

优选地，步骤(2)中，种子液占发酵培养基体积的3％～5％；厌氧发酵培养的培养温度为36～38℃，培养时间为40～60h；调节发酵液pH值是指利用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液进行调节；

步骤(3)中，所述的离心，是3000～6000r/min离心15～30min；

所述的低温巴氏灭菌，灭活处理的温度为60～80℃，灭活处理的时间为20～50min，完成对微生物的灭活处理；

所述的过滤，利用陶瓷膜滤机过滤，将滤液依次经过1.5μm、0.6μm的陶瓷膜滤柱除去细小杂质。

所述的防腐剂为多元醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油、对羟基苯乙酮、苯甲酸铵或山梨酸钾中的一种以上；

所述的多元醇为丁二醇、戊二醇或己二醇中的一种以上。

上述方法制得的二裂酵母发酵产物可以应用在化妆品中。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用豆渣和甘蔗渣作为双歧杆菌培养基，利用豆渣和甘蔗渣丰富多样的营养成分进一步强化提升双歧杆菌的有益代谢产物。

(2)本发明发酵产物离心处理后，分别收集下层长双歧杆菌和培养基余料，和上层长双歧杆菌代谢产物；将上层长双歧杆菌代谢产物经过处理获得二裂酵母发酵产物滤液，下层长双歧杆菌和培养基余料可回收循环利用，进一步降低产品成本。

(3)本发明的二裂酵母发酵产物滤液在化妆品中具有较好的应用效果：具有优异的促进屏障修复相关基因表达、促进胶原蛋白合成的功效性能。

附图说明

图1是屏障修复相关基因扩增倍数柱状图。

图2是成纤维细胞活性柱状图。

图3是COL-I蛋白表达量柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种二裂酵母发酵产物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将长双歧杆菌(ATCC 15697)接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基体积的3％，培养温度为38℃，时间为30h，种子液的浓度为1×10⁸CFU/mL；所述种子培养液是取豆渣10g、甘蔗渣3g，补水至1kg；其中的豆渣、甘蔗渣粉碎后过60目筛网。

(2)将培养好的种子液按培养基体积的5％接种于已灭菌处理的发酵培养基中，利用0.01mol/L浓度柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为7.0，厌氧发酵培养,培养温度为38℃，时间为60h；所述发酵培养基是取豆渣10g、甘蔗渣3g，补水至1kg。

(3)利用卧式离心机转速6000r/min，离心时间15min，分别收集下层长双歧杆菌和培养基余料，和上层长双歧杆菌代谢产物；将上层产物巴氏灭菌，灭活温度为68℃，灭活处理的时间为30min；利用陶瓷膜滤机过滤，将上层滤液依次经过1.5μm、0.6μm的陶瓷膜滤柱除去细小杂质；添加的防腐剂为0.96％(以步骤(2)所得发酵液的体积为计算基准；下同)丁二醇、0.5％戊二醇、0.5％己二醇、0.3％对羟基苯乙酮复配，获得二裂酵母发酵产物。

实施例2

一种二裂酵母发酵产物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将长双歧杆菌(ATCC 15697)接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基体积的2％，培养温度为37℃，时间为24h，菌种的浓度为3.0×10⁷CFU/mL；所述种子培养液是取豆渣5g、甘蔗渣1g，补水至1kg；其中的豆渣、甘蔗渣粉碎后过60目筛网。

(2)将培养好的种子液按培养基体积的4％接种于已灭菌处理的发酵培养基中，利用0.01mol/L浓度柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.6，厌氧发酵培养，培养温度为37℃，时间为48h；所述发酵培养基是取豆渣7g、甘蔗渣2g，补水至1kg。

(3)利用卧式离心机转速5000r/min，离心时间20min，分别收集下层长双歧杆菌和培养基余料，和上层长双歧杆菌代谢产物；将上层产物巴氏灭菌，灭活温度为65℃，灭活处理的时间为30min；利用陶瓷膜滤机过滤，将上层滤液依次经过1.5μm、0.6μm的陶瓷膜滤柱除去细小杂质；添加的防腐剂为0.96％丁二醇、0.5％戊二醇、0.5％己二醇、0.3％对羟基苯乙酮复配，获得二裂酵母发酵产物。

实施例3

一种二裂酵母发酵产物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将长双歧杆菌(ATCC 15697)接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基体积的1％，培养温度为36℃，时间为20h，菌种的浓度为1.0×10⁶CFU/mL；所述种子培养液是取豆渣5g、甘蔗渣1g，补水至1kg；其中的豆渣、甘蔗渣粉碎后过60目筛网。

(2)将培养好的种子液按培养基质量的2％接种于已灭菌处理的发酵培养基中，利用0.01mol/L浓度柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.5，厌氧发酵培养，培养温度为36℃，时间为40h；所述发酵培养基是取豆渣5g、甘蔗渣1g，补水至1kg。

(3)利用卧式离心机转速4000r/min，离心时间25min，分别收集下层长双歧杆菌和培养基余料，和上层长双歧杆菌代谢产物；将上层产物巴氏灭菌，灭活温度为65℃，灭活处理的时间为30min；利用陶瓷膜滤机过滤，将上层滤液依次经过1.5μm、0.6μm的陶瓷膜滤柱除去细小杂质；添加的防腐剂为0.96％丁二醇、0.5％戊二醇、0.5％己二醇、0.3％对羟基苯乙酮复配，获得二裂酵母发酵产物。

对比例1

一种二裂酵母发酵产物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将长型双歧杆菌(ATCC 15697)接种于种子培养基中厌氧发酵培养，得到种子液；其中，双歧杆菌的接种量是种子培养基体积的3％，培养温度为38℃，时间为24h，所述种子培养液是由脱脂奶粉5g、葡萄糖1.5g、异乳糖1.5g,补水至1kg；

(2)将培养好的种子液接种于已灭菌处理的发酵培养基中厌氧发酵培养，利用0.01mol/L浓度柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液调节发酵罐内料液pH为6.5，厌氧发酵培养，培养温度为38℃，时间为48h；所述发酵培养基是由葡萄糖3g、酪蛋白胨1.5g、牛肉蛋白胨3.0g、水解乳蛋白2.0g、补水至1kg；

(3)利用卧式离心机转速4000r/min，离心时间25min，取上层滤液进行巴氏灭菌，灭活温度为65℃，灭活处理的时间为30min；利用陶瓷膜滤机过滤，将上层滤液依次经过1.5μm、0.6μm的陶瓷膜滤柱除去细小杂质；添加的防腐剂为0.96％丁二醇、0.5％戊二醇、0.5％己二醇、0.3％对羟基苯乙酮复配，获得二裂酵母发酵产物。

功效测试

对实施例1-3与对比例1得到的发酵产物在促进屏障修复相关基因表达、促进胶原蛋白合成等方面的效果进行检验对比：

一、促进屏障修复相关基因表达

使用人角质形成细胞(HaCat细胞)为模型，测定屏障修复相关基因(TGM1、FLG、LOR、IVL和ABCA12)表达。

转谷氨酰胺酶1基因TGM1：编码与膜相连的钙依赖性硫醇酶，可以抵抗蛋白酶的水解作用，是角质形成细胞终末分化组成角质包膜的关键步骤，是皮肤屏障功能的物质基础。

丝聚合蛋白FLG：是皮肤屏障的关键，可减少抗原的入侵和TEWL，并可释放酸性物质致皮肤pH值下降，抑制细菌的生长。

兜甲蛋白LOR：是表皮颗粒细胞角质透明蛋白颗粒的主要成分，FLG基因突变影响角质形成细胞的终末分化及其表达异常使皮肤屏障功能受损。

内披蛋白IVL：在转谷酰胺酶TGK的催化作用下交叉连接并沉积在细胞膜内侧而形成不溶于水的角质化包膜。

ABCA12基因：作为一种ABC家族脂质体运体，位于板层小体界膜，参与板层小体形成，对维持正常的皮肤屏障功能起着重要作用。

试验步骤具体如下：

(1)细胞接种：按2.5×10⁵个/孔的密度接种细胞至6孔板中，于培养箱(37℃、5％CO₂、95％RH)中培养过夜。

(2)配液：利用完全培养基(MEM+10％FBS)为溶剂，将实施例、对比例发酵产物配制成体积分数为5％的溶液，作为荧光定量PCR测试的受试物工作液。

(3)给药：每组设置3个重复孔，待6孔板中细胞的铺板率达到40％～50％时，进行分组给药，于培养箱(37℃、5％CO₂、95％RH)中培养24h。

(4)收集细胞：样品孵育培养24h后，进行PBS清洗操作，1mL/孔，清洗两次。清洗结束后，每孔加入1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收集至1.5mL无酶EP管中，并保存至-80℃冰箱。

(5)荧光定量PCR测试：根据RNAiso Plus说明书进行RNA提取操作，根据反转录试剂盒进行反转录操作，根据SYBR Premix Ex TaqTM II荧光染料(TaKaRa DRR081A)产品说明书进行荧光定量PCR反应体系配制及上机检测。

(6)结果计算：采用2^-△△CT方法进行结果计算。

实施例1-3及对比例1发酵产物对屏障相关基因荧光定量PCR检测结果如图1所示，根据图1所示，实施例1-3在浓度为5％时，对屏障修复相关基因TGM1、FLG、LOR、IVL和ABCA12的表达有显著的促进作用，均高于对比例1的效果。

二、胶原蛋白的合成

当皮肤受到紫外线辐射后，细胞内会产生过量的活性氧，引起衰老相关基因表达，诱发炎症级联反应并降低弹力蛋白和胶原蛋白的表达量，导致皮肤出现松弛、皱纹等老化现象。UVA刺激人皮肤成纤维细胞，会导致胶原特别是I型胶原(COL-I)的降解。

本试验拟通过检测UVA刺激后成纤维细胞中的COL-I含量，与溶剂对照组比较其含量变化，评价实施例1-3及对比例1发酵产物是否对COL-I的分泌有促进作用。

成纤维细胞毒性测试，具体测试步骤如下：

(1)细胞培养：试验前24h制备细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每孔细胞数为8000个，37℃，5％CO₂培养24h。

(2)暴露：弃去孔中原培养液，每孔加入100μL不同浓度的测试样品(测试样品为实施例1的发酵产物加入适量完全培养基(DMEM+10％FBS)，配制成体积百分数为0.5％、1.0％、5.0％、10％、15％、20％、30％、40％的测试样品溶液)空白样品组加入100μL完全培养基(DMEM+10％FBS)。37℃，5％CO₂培养箱孵育24h。相差倒置显微镜下观察细胞形态和特性。

(3)MTT测试：每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，培养箱孵育3±0.5h。去除孔中液体，每孔加入100μL DMSO，置于振荡器振荡10～15min后，在酶标仪570nm波长处测定吸收值。

(4)数据处理：各组数据以均值±标准差表示，以对照组细胞活性为100％，计算各组相对细胞活性(Viability)。

本次测试所用细胞为人皮肤成纤维细胞(HFF-1)，购自中国科学院上海生命科学研究院上海细胞库。不同浓度的实施例1试样下人皮肤成纤维细胞的相对细胞活性情况如图2所示，对比空白样品组，在试样为20％实施例1时，人皮肤成纤维细胞的相对细胞活性为73.98％(行业认为相对细胞活性高于70％为安全浓度)。因此，本发明组合物添加量1～20％均为细胞安全给药浓度。

三、COL-I含量的检测

(1)接种：将人皮肤成纤维细胞以5.0×10⁴的密度接种至6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱孵育过夜；

(2)给药：待6孔板中细胞铺板率达到50％～60％时，分四组(阴性对照组、空白对照组、受试样品组1、受试样品组2)给药，每组设3个复孔。阴性对照组和空白对照组中分别加入完全培养基(DMEM+10％FBS)，受试样品组1和2中分别加入含有5％(v/v)和10％(v/v)浓度受试物的完全培养基(DMEM+10％FBS)。37℃，5％CO₂培养箱继续培养24h。

(3)照射：对受试样品组1、受试样品组2、阴性对照组进行40mJ·cm^-2的UVA照射，紫外线照射剂量(mJ·cm^-2)＝辐射强度(mW/cm²)×照射时间(min)，空白组无需照射。照射后将各组培养基更换为完全培养基(DMEM+10％FBS)，37℃，5％CO₂培养箱培养24h。

(4)COL-I含量检测：收集上清液，-80℃保存，细胞因子采用ELISA试剂盒进行测定。

(5)数据分析：数据以均值±标准差表示，数据采用SPSS进行分析，如果p<0.05考虑差异具有统计学意义。

实验结果见图3所示，本发明实施例1-3及对比例1产物在10％的给药剂量下，与阴性对照(UVA+)(接受UVA照射)相比，试样对COL-I蛋白的表达量有显著提升作用(p<0.05)。

根据促进屏障修复基因表达以及促进胶原蛋白的形成测试，证明了本发明的这种二裂酵母发酵产物滤液具有抗衰老的功效。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将长双歧杆菌接种于种子培养基中，厌氧培养活化，得到种子液；

（2）将种子液接种至发酵培养基中，调节发酵液初始pH值为6.5～7.0，厌氧发酵培养；

（3）将步骤（2）所得发酵液离心，取上清液，为二裂酵母发酵产物；

所述的种子培养基和发酵培养基，是取豆渣5～10g、甘蔗渣1～5g，补水至1kg。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所得二裂酵母发酵产物经过低温巴氏灭菌、过滤、添加防腐剂后，得到可产业化使用的二裂酵母发酵产物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的长双歧杆菌为长双歧杆菌ATCC 15697。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的豆渣、甘蔗渣粉碎后过40～80目筛网。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，长双歧杆菌的接种量占种子培养基质量的1%～3%；所述厌氧培养的温度为35～40℃，培养时间20～30h；所得种子液中长双歧杆菌的浓度为1×10⁶～1×10⁸CFU/mL。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，种子液占发酵培养基体积的3%～5%；厌氧发酵培养的培养温度为36～38℃，培养时间为40～60h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的离心，是3000～6000r/min离心15～30min。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：

所述的低温巴氏灭菌，灭活处理的温度为60～80℃，灭活处理的时间为20～50 min；

所述的过滤，利用陶瓷膜滤机过滤，将滤液依次经过1.5μm、0.6μm的陶瓷膜滤柱；

所述的多元醇为丁二醇、戊二醇或己二醇中的一种以上。