CN112980892A - 一种具有护肤功效的复合益生菌发酵产品及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，特别涉及一种具有护肤功能的发酵代谢物及其制备方法与应用。该产品由植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌为发酵菌株，以蔗糖、海藻粉、大豆粉和乳粉为发酵原料，混合发酵制备获得。该产品含有丙二酰染料木苷、染料木黄酮、透明质酸、鸢尾酮、Preaustinoid A和黄豆苷元等特有发酵代谢产物有助于护肤功效的提升；发酵产生的酒石酸、苹果酸、琥珀酸、水杨酸、香草酸和苯丙酸等有机酸能够控制病原菌及腐败微生物菌群，有利于维持皮肤菌群平衡，并起到天然防腐的作用。通过功效测试，表明其具有去皱，增加皮肤弹性，抗炎症和修护皮肤屏障等功效，且效果显著。

Description

一种具有护肤功效的复合益生菌发酵产品及其制备与应用
技术领域：
本发明涉及一种益生菌发酵产品，特别涉及一种具有护肤功能的发酵代谢物及其制备方法与应用，属于微生物发酵领域。
背景技术：
乳酸菌及其发酵制品在保障人类健康生活中发挥着重要作用，是承载人类营养和健康的民生产业。大量的研究表明，益生乳酸菌发挥益生功效与其活性有关，特别是益生菌的代谢产物、菌体裂解产物及菌体本身可能是发挥健康功效的直接推手，这些成分被国际益生菌组织命名为后生元。乳酸菌产生的有益代谢物，像胞外多糖、胞壁肽、短链脂肪酸、乳酸菌素、抗菌有机酸等，在调节机体免疫力、抗肿瘤、抗菌防腐、防治大肠癌、保护皮肤免受病原体侵袭、维持皮肤新陈代谢等方面的作用引起科研界和工业领域的广泛关注，在食品、化妆品、医药等领域中具有广阔的开发和应用前景。
研究表明益生菌代谢物含有丰富的活性物质，可解决当前人们关心的皮肤问题，包括炎症、减轻衰老、防止污染物，甚至促进皮肤微生物群平衡。益生菌代谢物主要含有五类活性物质：营养素如B族维生素、维生素K和一些氨基酸；短链脂肪酸帮助平衡肠道的pH值，抑制病原体；细菌素或天然抗菌肽，抑制不受欢迎的细菌生长；碳水化合物酶，帮助益生菌消化纤维；过氧化氢，帮助抑制酵母菌(如念珠菌)的生长。
近年来，国内外不少研究团队对乳酸菌代谢物进行了定性定量的描述和研究，也有团队利用宏基因组、代谢组等组学技术结合动物、人群临床实验对乳酸菌产生的代谢物进行功能性研究。
中国发明专利CN111544371B《含有益生菌活性提取液和烟酰胺的美白修复面膜》公开了一种利用枯草芽孢杆菌nk1发酵制备活性发酵液的方法及用发酵液和烟酰胺作为主要功效成分的美白修复面膜。发酵所用专用液体培养基配方如下：将20g的葡萄糖、10g的蛋白胨、10g的酵母膏、8g的大豆粉、3g的烟酰胺、3g的牛樟芝提取物、3mL的吐温-80、0.6g的MgSO4·7H2O、0.3g的MnSO4·4H2O、2g的K2HPO4和1000mL的蒸馏水混合,调节pH值为7.0并且经高压蒸汽灭菌后得到的无菌培养基。枯草芽孢杆菌nk1培养基中加入牛樟芝提取物，可以进一步增强美白作用，并且大幅度增加其修复活性，和烟酰胺具有协同提高枯草芽孢杆菌nk1发酵上清液功效的作用。
然而，现有技术缺乏对益生代谢物稳定发酵工艺、高活性代谢物富集工艺以及护肤功能的研究；具体表现在(1)缺乏针对护肤功能而优化的高产益生菌活性代谢物的发酵培养基、时间、温度等发酵技术，从而提高生产有益代谢物的产量和稳定性；(2)缺乏利用复合乳酸菌发酵技术，生产高活性且种类丰富的有益物质的发酵工艺；(3)缺乏对活性代谢物护肤功能的研究。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一种安全性高、天然无刺激的益生菌发酵产品及其制备方法，以及该益生菌发酵产品在化妆品中的应用。
本发明提供的技术方案之一，是一种益生菌发酵液，由植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌以蔗糖、海藻粉、大豆粉和乳粉等为原料，混合发酵制备获得，活性代谢物丰富且含量高，护肤效果好，制备方法如下：
(1)将植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌活化后按比例混合，按2-5％的接种量接种至发酵培养基中，在30-40℃条件下，100-200r/min发酵30-40h；
进一步地，各菌株活化后的活菌数为50-200亿cfu/ml；
进一步地，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌活菌数比例为：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)：(1-2)：(2-4)：(0.5-1)；
优选地，所述植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌活菌数比例为(1-1.5)：(1-1.5)：(1.5-2)：(2-3)：(0.5-1)：
优选地，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCCNo.11932；CGMCC No.14532；CGMCC No.14531；CGMCC No.6312；
优选地，所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CGMCC No.18638；CGMCC No.5469；CGMCC No.11132；CGMCC No.11131；
优选地，所述乳双歧杆菌为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)CGMCCNo.14536；CGMCC No.5470；
优选地，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalisssp.lactis)CGMCC No.16070；CGMCC No.18610；
优选地，所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCCNo.16002；CGMCC No.18639；
进一步地，所述发酵培养基组成为：蔗糖30-70g，海藻粉5-10g，脱脂大豆粉10-30g，脱脂乳粉5-10g，蒸馏水1L，初始pH＝7.0；100-130℃条件下，灭菌20-40min；
(2)发酵结束后对混合益生菌发酵液进行杀菌，在80-100℃条件下经过巴氏杀菌5-10min，得到后生元发酵液。
本发明提供的技术方案之二，是上述后生元发酵液的应用，特别是在化妆品、美容产品中的应用；
本发明提供的技术方案之三，是一种后生元Bilantera，是将上述后生元发酵液与增稠剂，防腐剂，保湿剂，乳化剂，稳定剂，去离子水混合制备所得；
进一步地，后生元Bilantera组成为：后生元发酵液1-10％，增稠剂0.1-2％，防腐剂0.1-1％，保湿剂1-5％，稳定剂1-5％，其余为去离子水(％为质量比)；
优选地，后生元Bilantera组成为：后生元发酵液3-8％，增稠剂0.5-1.5％，防腐剂0.5-1％，保湿剂3-5％，稳定剂2-4％，其余为去离子水；
更优选地，后生元Bilantera组成为：后生元发酵液4-6％，增稠剂0.5-1％，防腐剂0.5-1％，保湿剂4-5％，稳定剂3-4％，其余为去离子水；
进一步地，所用增稠剂为Aristoflex AVC；所述保湿剂为甜菜碱；所述防腐剂为PHL(1，2-己二醇；辛酰羟肟酸；1，3-丙二醇)；所述稳定剂为鲸蜡硬脂醇。
本发明提供的技术方案之四，是上述后生元Bilantera的应用，特别是在化妆品、美容产品中的应用。
有益效果：
本发明提供的益生菌发酵液是利用五种复合益生菌：植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌，按照一定菌株比例，发酵条件，在特制发酵培养基中培养而获得的，发酵所用的菌株均为食品级益生菌，更安全更温和。本发明所述方法制备的复合益生菌发酵液含有特有活性代谢物成分且含量高，丙二酰染料木苷、染料木黄酮、透明质酸、鸢尾酮、Preaustinoid A和黄豆苷元，这些特有发酵代谢产物有助于护肤功效的提升；另外，发酵产生的酒石酸、苹果酸、琥珀酸、水杨酸、香草酸和苯丙酸等有机酸属于抗菌物质，能够控制病原菌及腐败微生物菌群，有利于维持皮肤菌群平衡，并起到天然防腐的作用。通过对后生元Bilantera的临床功效测试，研究表明具有去皱，增加皮肤弹性，抗炎症和修护皮肤屏障等功效，且效果显著。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1：一种具有护肤功能的后生元Bilantera及其制备
(1)将植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002菌种分别接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代培养2次，使各菌株活化后的活菌数为50-200亿cfu/ml。
(2)将活化好的植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002菌种按照活菌数之比为1:1:2:2:0.5的比例混合成益生菌组合物。
(3)将上述益生菌组合物按照2％的接种量，接种于发酵培养基中。其中发酵培养基配方为：蔗糖50g，海藻粉8g，脱脂大豆粉20g，脱脂乳粉8g，蒸馏水1L，初始pH＝7.0。在接种发酵前，培养基需要高温灭菌，在105℃条件下经过30min灭菌处理。
(4)在37℃条件下发酵35h，转速为150rpm/min，发酵过程中控制pH为6，发酵结束后对混合益生菌发酵液进行杀菌，在95℃条件下经过巴氏杀菌5min，得到后生元发酵液。
(5)将后生元发酵液与增稠剂，防腐剂，保湿剂，乳化剂，稳定剂，去离子水混合，将上述成分混合制备后，得到后生元Bilantera；
组分含量为：后生元发酵液5％，增稠剂1％，防腐剂0.5％，保湿剂3％，稳定剂2％，其余为去离子水；
所用增稠剂为Aristoflex AVC，保湿剂为甜菜碱，防腐剂为PHL(1，2-己二醇：辛酰羟肟酸：1，3-丙二醇＝1:1:4)，稳定剂为鲸蜡硬脂醇。
实施例2：后生元Bilantera护肤功能研究
通过对后生元Bilantera的临床功效测试，研究涂抹前后皮肤各项指标的变化情况，以验证其去皱和修护皮肤屏障的效果。引用标准为：《化妆品保湿功效评价指南》QB/T4256-2011、《化妆品影响经表皮水分流失测试方法》T/ZHCA003-2018及机构内部测试标准。
测试方法具体如下：
(1)测试样品：实施例1制备的后生元Bilantera；
对照样品：增稠剂1％，防腐剂0.5％，保湿剂3％，稳定剂2％，其余为去离子水。
(2)测试仪器
面部影像分析VISIA图像分析软件；
皮肤弹性测试探头Cutometer MPA580(Courage&Khazaka,Germany)；
皮肤黑红色素测试探头MexameterMX18(Courage&Khazaka,Germany)；
皮肤水分含量探头CorneometerCM825(Courage&Khazaka,Germany)；
皮肤经皮水分散失量测试探头TewameterTM300(Courage&Khazaka,Germany)。
(3)测试人群：受试者排除条件符合《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》纳入、排除标准。符合测定人群21人；对照人群21人。
(4)测试过程
①睡前洁面后将5g后生元Bilantera均匀涂抹至面部或颈部静待15-20分钟后，正常入睡，或者将多余后生元Bilantera洗掉既可；对照组操作如上。
②开始使用样品前48h停用类似功效化妆品，测试当天，清水清洗受试部位，恒温恒湿环境中(温度21±1℃，相对湿度50％±10％RH)静坐30min之后进行数据采集。使用样品28天后，利用同样方法进行数据采集。
③使用样品前和使用样品后28天，两个时间点，采集面部皮肤水分含量、经皮水分散失量、皮肤弹性、皮肤血红素和面部VISIA图像拍摄及数据分析，填写消费者问卷。
④下发样品后，受试者按照产品内使用说明进行使用，使用周期为4周，根据回访周期进行皮肤测试。分别在第0天、第28天进行皮肤测试和回访。
(5)测试指标
①皮肤角质层含水量：使用Corneometer CM825测试3次，取平均值；
参数解释：皮肤水份含量会影响皮肤表面水和油脂混合膜的形成，能够直接影响皮肤屏障功能，测量值越大，说明皮肤含水量越高。
②经皮水分散失量：使用TewameterTM300测试3次，取平均值；
参数解释：经皮水分散失量一般与皮肤屏障相关，其值越大表明皮肤水分流失越大，锁水效果越低，皮肤屏障越差。
③面部VISIA图像分析软件：使用VISIA分别对面部左测、中测和右测进行拍照，进行图像分析；
参数解释：对指标数据分值进行分析，分值越小，改善越好。
④皮肤弹性：使用Cutometer MPA580测试皮肤弹性R2、Q1指标；
参数解释：测量值越小，说明皮肤弹性越差。
⑤皮肤血红素测试：使用MexameterMX18测试皮肤血红素，可评价护肤品对皮肤炎症的改善情况；
参数解释：测量值越大，说明皮肤红斑量越大，炎症越严重。
(6)结果与分析
①对皮肤修护作用测试结果
通过VISIA面部影像、MexameterMX18探头、Comeometer CM825和TewameterTM300对志愿者皮肤数据顺利采集，通过四个指标来分析测试样品修护、细嫩肌肤效果。
表1不同时间皮肤指标对比分析(X±s，n＝21)
Figure BDA0002957973000000061
皮肤水份含量会影响皮肤表面水和油脂混合膜的形成，能够直接影响皮肤屏障功能，参与老化皮肤、敏感性皮肤的发病机制。在整个测试期间，受试者面部水分含量呈现上升趋势(表1)，表明测试样品在增加皮肤水分含量方面效果明显。测试期内，面部经皮水分散失量随时间变化情况见表1，在28D时，受试者面部经皮水分散失量呈现明显下降趋势。通过VISIA测得红色区数据变化情况如表1，通常和皮肤炎症，角质层皮肤屏障受损相关，分值越小说明皮肤屏障越健康。血红素随时间变化情况如表1，血红素可以分析护肤品前后皮肤红斑的变化。血红素值越小，皮肤炎症红斑越少，皮肤屏障状态越好。在使用样品后，在实验周期28天时间范围内，皮肤血红素呈现明显下降趋势。相比之下，不加后生元发酵液对照组，实验周期28天后，变化率较不明显。
②面部皱纹分析和弹性测试结果
通过VISIA面部影像分析系统和MPA580弹性测试探头对志愿者皮肤数据顺利采集，对指标进行分析，来验证产品在提升皮肤弹性和淡化皱纹方面的功效。
表2不同时间皮肤弹性和皱纹对比分析(X±s，n＝21)
Figure BDA0002957973000000071
测试期内，面部皱纹测量结果见表2，与初始值相比，皱纹呈下降趋势，第28天时，面部皱纹平均值降低11.77％，这表明样品在改善皱纹尤其是细纹方面具有一定的作用。皮肤弹性测量结果见表2，与初始值相比，测试周期内R2值和Q1值有上升趋势。R2值和Q1值越高，表明皮肤弹性越好。使用至28D时，弹性R2指标平均值提升了16.07％。相比之下，不加后生元发酵液对照组，实验周期28天后，变化率较不明显。
③主观自我评价结果
表3使用28天后不同皮肤状态改善有效率的自我评价
Figure BDA0002957973000000072
Figure BDA0002957973000000081
由表3可以看出，实验组使用测试样品28天后，亮肤收细毛孔效果改善的有效率为95.2％；暗沉程度、光泽感、光滑感、滋润保湿度的改善有效率分别为85.7％，95.2％，90.5％，95.2％；认为水润改善的有效率95.2％，认为皱纹改善的有效率为95.2％，相比之下，不加后生元发酵液对照组，实验周期28天后，效果改善不明显。
实施例3：益生菌发酵液中活性物质的含量
以实施例1制备的后生元发酵液为测试样品，基于UPLC-Q-TRAP-MS靶向代谢分析方法分析活性物质及含量，具体如下：
(1)样品前处理
取0.1g样品于装有1.0mm氧化锆珠的2mL匀浆管中，加入1mL超纯水并混匀，使用OMNI Bead Ruptor 12(OMNI International，美国)将混合物在3m/s条件下匀浆均质30s，重复2次；全部转移至7mL离心管中，加入30μL 50μg/mL的胆汁酸混合IS溶液和2mL乙腈并混匀，13400×g离心10min。取上清过0.22μm滤膜，取50μL转移至装有450μL甲醇的2mL液质上样瓶中，混匀后上机检测。(2)UPLC-Q-TRAP-MS检测条件
液相条件：柱温设为40℃，进样量：2μL,色谱柱：Phenomenex(
Figure BDA0002957973000000082
2.6μm EVOC18 100A 2.1×100mm)，流动相：A相：水(含0.1％甲酸和0.5％氨水)；B相：乙腈。
质谱条件：采用电喷雾离子源(Electrospray Ionization，ESI)和多反应监测(Multiple Reaction Monitoring，MRM)模式进行质谱扫描。离子源参数：加热气(GS1)和辅助加热气(GS2)分别为55和45psi，脱溶剂气温度为600℃；气帘气(Curtain Gas)为30psi，碰撞气(Collision Gas)为6psi；喷雾针(Ionspray)电压为-3500V。
(3)UPLC-MS/MS检测方法和数据分析
通过绘制每种分析物与标准品的峰面积比与分析物浓度的关系，建立了分析物的校准曲线。用相关系数r测定线性度，用甲醇/水(50/50)溶液稀释校准品，确定定量限(LOQ)和检测限(LOD)。LOQ被定义为信噪比为10时的最低定量浓度，LOD的信噪比要求为3。数据结果通过SCEIX OS软件进行定量分析。利用GraphPad软件(7.0版)进行统计分析。
表4发酵液有机酸和短链脂肪酸
Figure BDA0002957973000000091
利用本发明所获得的益生菌发酵液含有丰富的抗菌物质(有机酸)和短链脂肪酸，见表4，其中抗菌物质包括乳酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、苯乳酸、琥珀酸、4-羟基苯乳酸、水杨酸、香草酸和苯丙酸等。这些益生菌发酵过程产生有机酸等抗菌物质能够控制病原菌及腐败微生物菌群，有利于维持皮肤菌群平衡，另外起到天然防腐的作用。短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸。将碳原子数量在2-6之间的有机酸称为短链脂肪酸，对于维持菌群平衡和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用。
表5后生元发酵液高浓度活性代谢物
Figure BDA0002957973000000092
Figure BDA0002957973000000101
利用本发明所获得的益生菌发酵液含有丰富的高浓度活性代谢物质，见表5，其中包括月桂基二乙醇胺、大豆皂苷、大豆异黄酮、丙二酰染料木苷、3-吲哚丙烯酸、染料木黄酮、透明质酸、胞外多糖、多肽、鸢尾酮、Preaustinoid A、异硬脂酸、三羟基黄酮、黄豆苷元和丁酸甘油酯。这些活性代谢物具有丰富的生物功能，像月桂基二乙醇胺在化妆品中有润滑作用，大豆皂苷具有抗肿瘤抗氧化作用，丙二酰染料木苷具有消除活性氧基，具有抗氧化作用，3-吲哚丙烯酸具有抗炎症的作用，染料木黄酮是大豆异黄酮中的一种主要活性因子，是大豆异黄酮产品中最有效的功能成分，具有多种生理功能，鸢尾酮是一种名贵的香料，在化妆品、食品、香烟、香皂等日用品中有广泛应用，Preaustinoid A是一类单萜类化合物，具有抗癌和抗菌活性，异硬脂酸主要用作化妆品原料，有润滑作用，黄豆苷元对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有显著的抑菌作用，丁酸甘油酯能快速补充肠黏膜营养，修复各种应激引起的肠黏膜损伤，进而改善肠道健康。
实施例4一种具有护肤功能的后生元Bilantera及其制备
(1)将植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002菌种分别接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代培养2次。
(2)将活化好的植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002菌种按照活菌数之比为1:1:2:2:1的比例混合成益生菌组合物。
(3)将上述益生菌组合物按照3％的接种量，接种于发酵培养基中。其中发酵培养基配方为：蔗糖55g，海藻粉6g，脱脂大豆粉25g，脱脂乳粉6g，蒸馏水1L，初始pH＝7.0。在接种发酵前，培养基需要高温灭菌，在105℃条件下经过30min灭菌处理。
(4)在37℃条件下发酵36h，转速为160rpm/min，发酵过程中控制pH为6，发酵结束后对混合益生菌发酵液进行杀菌，在100℃条件下经过巴氏杀菌3min，得到后生元发酵液。
(5)将后生元发酵液与增稠剂，防腐剂，保湿剂，乳化剂，稳定剂，去离子水混合，将上述成分混合制备后，得到后生元Bilantera；
组分含量为：后生元发酵液6％，增稠剂1％，防腐剂1％，保湿剂4％，稳定剂3％，其余为去离子水；
所用增稠剂为Aristoflex AVC，保湿剂为甜菜碱，防腐剂为PHL(1，2-己二醇：辛酰羟肟酸：1，3-丙二醇＝1:1:4)，稳定剂为鲸蜡硬脂醇。
实施例5一种具有护肤功能的后生元Bilantera及其制备
(1)将植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002菌种分别接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h，传代培养2次。
(2)将活化好的植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002菌种按照活菌数之比为1.5:1:2:2:0.5的比例混合成益生菌组合物。
(3)将上述益生菌组合物按照4％的接种量，接种于发酵培养基中。其中发酵培养基配方为：蔗糖60g，海藻粉7g，脱脂大豆粉28g，脱脂乳粉8g，蒸馏水1L，初始pH＝7.0。在接种发酵前，培养基需要高温灭菌，在105℃条件下经过30min灭菌处理。
(4)在32℃条件下发酵40h，转速为180rpm/min，发酵过程中控制pH为6，发酵结束后对混合益生菌发酵液进行杀菌，在95℃条件下经过巴氏杀菌5min，得到后生元发酵液。
(5)将后生元发酵液与增稠剂，防腐剂，保湿剂，乳化剂，稳定剂，去离子水混合，将上述成分混合制备后，得到后生元Bilantera；
组分含量为：后生元发酵液6％，增稠剂0.5％，防腐剂0.5％，保湿剂3％，稳定剂1％，其余为去离子水；
所用增稠剂为Aristoflex AVC，保湿剂为甜菜碱，防腐剂为PHL(1，2-己二醇：辛酰羟肟酸：1，3-丙二醇＝1:1:4)，稳定剂为鲸蜡硬脂醇。
对实施例4、5所获得的发酵液进行成分测定，结果如下表：
表6
Figure BDA0002957973000000121
Figure BDA0002957973000000131
对照试验
对照例1：发酵培养基替换为MRS培养基，其余条件同实施例1，进行发酵培养获得发酵液；(MRS为乳酸菌培养基，为乳酸菌提供生长因子，可使乳酸菌生长良好。而其他常用培养基，不能保证本发明的5种菌种均能生长良好，因此在此仅展示MRS培养基作为对照)；
对照例2：菌株替换为植物乳杆菌CGMCC No.14532，干酪乳杆菌CGMCC No.5469，乳双歧杆菌CGMCC No.5470，动物双歧杆菌CGMCC No.18610和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.18639，菌株配比等其余条件同实施例1，进行发酵培养获得发酵液；
对照例3：菌株替换为植物乳杆菌CGMCC No.14531，干酪乳杆菌CGMCC No.11132，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCCNo.16002，菌株配比等其余条件同实施例1，进行发酵培养获得发酵液；
对照例4：菌株替换为植物乳杆菌CGMCC No.6312，干酪乳杆菌CGMCC No.11131，乳双歧杆菌CGMCC No.5470，动物双歧杆菌CGMCC No.18610和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.18639，菌株配比等其余条件同实施例1，进行发酵培养获得发酵液；
对照例5：菌株分别替换为如下4组：①植物乳杆菌CGMCC No.11932和干酪乳杆菌CGMCC No.18638；②干酪乳杆菌CGMCC No.18638和乳双歧杆菌CGMCC No.14536；③乳双歧杆菌CGMCC No.14536和动物双歧杆菌CGMCC No.16070；④动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002，菌株配比等其余条件同实施例1，进行发酵培养获得发酵液；
对照例6：菌株分别替换为如下7组：①植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638和乳双歧杆菌CGMCC No.14536；②干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536和动物双歧杆菌CGMCC No.16070；③乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002；④植物乳杆菌CGMCCNo.11932，乳双歧杆菌CGMCC No.14536和动物双歧杆菌CGMCC No.16070；⑤植物乳杆菌CGMCC No.11932，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002；⑥植物乳杆菌CGMCC No.11932，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002；⑦干酪乳杆菌CGMCC No.18638，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCCNo.16002；菌株配比等其余条件同实施例1，进行发酵培养获得发酵液；
对照例7：菌株分别替换为如下4组：①植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536和动物双歧杆菌CGMCC No.16070；②植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002；③植物乳杆菌CGMCC No.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002；④干酪乳杆菌CGMCCNo.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCC No.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002；菌株配比等其余条件同实施例1，进行发酵培养获得发酵液；
对上述对照例所获得的发酵液进行成分测定，结果如下表7-10：
表7对照例1-4
Figure BDA0002957973000000141
Figure BDA0002957973000000151
表8对照例5
Figure BDA0002957973000000152
Figure BDA0002957973000000161
表9对照例6
Figure BDA0002957973000000162
Figure BDA0002957973000000171
表10对照例7
Figure BDA0002957973000000172
Figure BDA0002957973000000181
通过对照实验，以及本发明的实施方式，可知益生菌发酵过程中会发生生长和代谢互相作用，所以优选合适的菌种进行复配发酵尤为关键。经过大量的不同的复配菌种发酵，结果表明只有在植物乳杆菌,干酪乳杆菌,乳双歧杆菌,动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌五种菌种在本发明提供的培养基中同时复配发酵时，有助于护肤的活性代谢物含量才能最大化。只有两菌种，三菌种甚至四菌种复配发酵，或采用其他培养基的情况下，都会影响有护肤功效代谢物的产生。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (10)

1.一种益生菌发酵液，其特征在于，由植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌为发酵菌株，以蔗糖、海藻粉、大豆粉和乳粉为发酵原料，混合发酵制备获得。
2.如权利要求1所述的一种益生菌发酵液，其特征在于，制备方法如下：
(1)将植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌活化后按比例混合，按2-5％的接种量接种至发酵培养基中，在30-40℃条件下，100-200r/min发酵30-40h；
所述发酵培养基组成为：蔗糖30-70g，海藻粉5-10g，脱脂大豆粉10-30g，脱脂乳粉5-10g，蒸馏水1L；
(2)发酵结束后对混合益生菌发酵液进行杀菌得到益生菌发酵液，即后生元发酵液。
3.如权利要求2所述的一种益生菌发酵液，其特征在于，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、动物双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌按活菌数比例为：(0.5-1.5)：(0.5-1.5)：(1-2)：(2-4)：(0.5-1)进行混合。
4.如权利要求2所述的一种益生菌发酵液，其特征在于，
所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.11932、CGMCCNo.14532、CGMCC No.14531或CGMCC No.6312；
所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CGMCC No.18638、CGMCCNo.5469、CGMCC No.11132或CGMCC No.11131；
所述乳双歧杆菌为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)CGMCC No.14536或CGMCCNo.5470；
所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis ssp.lactis)CGMCCNo.16070或CGMCC No.18610；
所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No.16002或CGMCC No.18639。
5.如权利要求2所述的一种益生菌发酵液，其特征在于，发酵菌株为：植物乳杆菌CGMCCNo.11932，干酪乳杆菌CGMCC No.18638，乳双歧杆菌CGMCC No.14536，动物双歧杆菌CGMCCNo.16070和鼠李糖乳杆菌CGMCC No.16002。
6.如权利要求1-5任一所述的益生菌发酵液在化妆品、美容产品中的应用。
7.一种由权利要求1-5任意所述的益生菌发酵液制备的后生元Bilantera，其特征在于，是将上述益生菌发酵液与增稠剂，防腐剂，保湿剂，乳化剂，稳定剂，去离子水混合制备所得。
8.如权利要求7所述的后生元Bilantera，其特征在于，组成为：益生菌发酵液1-10％，增稠剂0.1-2％，防腐剂0.1-1％，保湿剂1-5％，稳定剂1-5％，其余为去离子水。
9.如权利要求8所述的后生元Bilantera，其特征在于，所用增稠剂为Aristoflex AVC；所述保湿剂为甜菜碱；所述防腐剂为PHL；所述稳定剂为鲸蜡硬脂醇。
10.权利要求7所述后生元Bilantera在化妆品、美容产品中的应用。
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