CN111544371A - 含有益生菌活性提取液和烟酰胺的美白修复面膜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液作为主要功效成分的美白修复面膜。枯草芽孢杆菌nk1培养基中加入牛樟芝提取物，可以进一步增强美白作用，并且大幅度增加其修复活性，和烟酰胺具有协同提高枯草芽孢杆菌nk1发酵上清液功效的作用。

Description

含有益生菌活性提取液和烟酰胺的美白修复面膜

技术领域

本发明涉及化妆品配方技术领域，特别涉及一种含有益生菌活性提取液和烟酰胺的美白修复面膜。

背景技术

面膜是集清洁、护理、营养于一体的面部皮肤用化妆品，深受女性消费者所喜爱。其通过阻断皮肤和空气的接触，抑制皮脂分泌和汗液蒸发使肌肤温度上升，从而促进面部皮肤血液循环；并可软化角质、扩张毛孔，起到清洁与保养皮肤的作用。同时，面膜中含有的营养物质、功效成分能渗入皮肤，更可增强皮肤机能、有效改善肤质。

烟酰胺是一种水溶性维生素，为维生素B族成员之一。烟酰胺在临床皮肤科治疗中作为一种基础性维生素类补充剂，具有很高的安全性，较广泛应用于治疗光敏性皮炎、痤疮等。研究显示，烟酰胺在抑制黑色素沉着、阻隔其向表层细胞的转移、抗炎、保湿、抗老化等方面也有很好的功效；基于这一特征，烟酰胺在化妆品领域的应用得到了进一步延伸。烟酰胺在强酸或碱性条件下不稳定，可水解成烟酸。极低剂量的烟酸即可导致皮肤出现潮红等症状，而潮红症状容易导致消费者产生烫伤、刺激、过敏等负面联想。现有技术的烟酰胺产品都只能通过避光，pH控制，低温来达到抑制烟酰胺水解。此外，烟酰胺本身的酪氨酸酶抑制率也很低，美白效果并不出众。

本领域技术人员知道，益生菌的代谢受多方面调控，其代谢产物包括许多具有生物活性的物质，如小肽，胞外多糖，皂苷，氨基酸，矿物质，酚类等。而如胞外多糖的具体结构，都会大大影响其生理活性。对此，本发明团队对菌株进行了大量的筛选，以及培养工艺的改进，以期获得美容效果突出的发酵工艺，本发明团队尝试在菌株发酵阶段加入烟酰胺和牛樟芝，结果取得了很好的美白修复效果。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种含有益生菌活性提取液和烟酰胺的美白修复面膜。

中国专利2019107127773公开了一株具有抗血栓功能的枯草芽孢杆菌(B.subtilis sp)nk1，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC18057。该菌株是具有凝乳活性的芽孢杆菌，并且能产生纳豆激酶，已知用途为制备具有抗血栓效果的酸奶。本发明用到的枯草芽孢杆菌nk1为江南大学食品学院研究人员赠送得到。

本研发团队在菌株筛选过程中，发现枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液具有一定的美白活性和修复活性。本研发团队进一步深入研究发现，在其培养基中加入烟酰胺，可以提高其美白活性，但是检测其发酵上清液并无烟酰胺成分，应该是已经在细胞中被代谢转化了，转化后的发酵上清液具有非常显著的美白效果。此外，进一步发现，培养基中加入牛樟芝提取物，可以进一步增强美白作用，并且大幅度增加其修复活性，和烟酰胺具有协同提高枯草芽孢杆菌nk1发酵上清液功效的作用。

牛樟芝，又名樟菇，属于非褶菌目、多孔科、多年生蕈菌类。其生长区域为台湾山区海拔450-2000公尺山林间，只生长在台湾特有百年以上的牛樟树树干腐朽之心材内壁，或枯死倒伏之牛樟树木材潮湿表面，因其采集不易，加上野生牛樟木近年已被台湾列为国宝级生物之一。牛樟芝提取物在现有技术中公开的是提升黑色素细胞和黑色素形成，有用于治疗白癜风的潜力。然而，本研发团队惊奇的发现，在发酵过程中加入牛樟芝提取物，反而经过枯草芽孢杆菌nk1代谢后，其发酵上清液具有更为优秀的美白效果，并且牛樟芝提取物和烟酰胺具有协同促进发酵上清液的美容性能的作用。

本发明还进一步提供了一种利用枯草芽孢杆菌nk1上清液作为主要功效成分的美白修复面膜。

本发明所用到的牛樟芝提取物为市售产品，为申请人购买获得。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现：

一种含有益生菌活性提取液和烟酰胺的美白修复面膜，其特征在于：

含有枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液。

作为优选，所述枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液的制备方法为：

(1)菌株活化：

活化所使用的培养基为牛奶培养基，配方参考现有技术，配方如下：500g鲜牛奶，50g蔗糖，配置成1L，高温灭菌；

活化条件为：37℃摇床培养12h，活化后成为菌量为2.2×10⁸CFU/mL的种子液。

(2)发酵培养：

发酵所用专用液体培养基配方如下：将20g的葡萄糖、10g的蛋白胨、10g的酵母膏、8g的大豆粉、3g的烟酰胺、3g的牛樟芝提取物，3mL的吐温-80，0.6g的MgSO₄·7H₂O、0.3g的MnSO₄·4H₂O、2g的K₂HPO₄和1000mL的蒸馏水混合，调节pH值为7.0并且经高压蒸汽灭菌后得到的无菌培养基；

按照5％v/v的接种量将步骤(1)获得的种子液接种至专用液体发酵培养基，38℃发酵12小时；

(3)将步骤(2)所得的发酵液离心，离心转速8000r/min，时间30min，收集上清液，得到发酵滤液，并过0.22um除菌过滤器，得到无菌的枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液。

作为优选，所述面膜的具体配方为：

枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液5份，玻尿酸0.5份、海藻糖1份、蚕丝蛋白1份、羧甲基纤维素钠2份、海藻酸钠1份、D-泛醇1份、鲸蜡硬脂醇10份、玫瑰提取液10份，去离子水200份。

所述面膜的制备方法为：

S1.将羧甲基纤维素钠、鲸蜡硬脂醇按重量份数分别称量，随后将其混合均，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热至85℃～95℃，加热过程中不断搅拌至其完全溶解，静置在烧杯中待用匀(A组分)；

S2.将玻尿酸、蚕丝蛋白、海藻酸钠、海藻糖、玫瑰提取液按重量份数分别称量，并将其混合均匀，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热到70℃～85℃，至其完全溶解，静置在烧杯中待用(B组分)；

S3.将枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液、D-泛醇按重量份数分别称量，并将其混合均匀，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热到55℃～75℃，至其完全溶解，静置在烧杯中待用(C组分)；

S4.并用高速剪切机在3000～4500r/min条件下分别对A组分、B组分和C组分搅拌8～20min，促进其溶解，随后将A组分、B组分和C组分进行混合均质，均质时间7～15min；均质1～3次；

S5.均质完成后，待其自然冷却，至温度低于25℃以下时，并在室温条件下冷却静置2～3h，即得护肤品。

作为优选，所述枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液还可以做成精华液，面霜，眼霜等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的化妆品活性成分是用食品级益生菌枯草芽孢杆菌nk1发酵制备而成，培养基中加入了烟酰胺，牛樟芝提取物，成分天然，安全性极高，无细胞毒作用，含有丰富的营养物质，具有非常显著的美白，修复功能，具有广阔的市场潜力。

(2)本发明的活性成分做成面膜后，肤感好，补水保湿效果好。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液的制备方法为：

(1)菌株活化：

活化所使用的培养基为牛奶培养基，配方参考现有技术，配方如下：500g鲜牛奶，50g蔗糖，配置成1L，高温灭菌；

活化条件为：37℃摇床培养12h，活化后成为菌量为2.2×10⁸CFU/mL的种子液。

(2)发酵培养：

发酵所用专用液体培养基配方如下：将20g的葡萄糖、10g的蛋白胨、10g的酵母膏、8g的大豆粉、3g的烟酰胺、3g的牛樟芝提取物，3mL的吐温-80，0.6g的MgSO₄·7H₂O、0.3g的MnSO₄·4H₂O、2g的K₂HPO₄和1000mL的蒸馏水混合，调节pH值为7.0并且经高压蒸汽灭菌后得到的无菌培养基；

按照5％v/v的接种量将步骤(1)获得的种子液接种至专用液体发酵培养基，38℃发酵12小时；

(3)将步骤(2)所得的发酵液离心，离心转速8000r/min，时间30min，收集上清液，得到发酵滤液，并过0.22um除菌过滤器，得到无菌的枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液。

实施例2对比例

对比例1：发酵上清液制备实验方法同实施例1，但是发酵培养基不含有烟酰胺和牛樟芝提取物。

对比例2：发酵上清液制备实验方法同实施例1，但是发酵培养基不含有烟酰胺。

对比例3：发酵上清液制备实验方法同实施例1，但是发酵培养基不含有牛樟芝提取物。

对比例4：发酵上清液制备实验方法同实施例1，但是使用枯草芽孢杆菌GIM 1.784替代枯草芽孢杆菌nk1作为发酵菌株。

实施例3

细胞毒理测试：

将实施例1得到的枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液溶于无血清DMEM培养液中，配制4个样品，质量分数分别为0.25％、0.5％、1％、2％，以无血清DMEM培养液为阴性对照样组进行MTT检测，评价枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液的细胞毒性。

按照100μL/孔接种L929细胞至96孔板，调整浓度为1×10⁵个/mL，在37℃、5％CO₂，无血清DMEM培养液培养24h进行贴壁后，吸弃培养液，每孔加入100μL不同质量分数的样品溶液，阴性对照样组继续无血清DMEM培养，常规培养48h。再加入5mg/mL MTT溶液20μL，置培养箱内避光孵育4h。弃上清液加入DMSO 100μL，摇床低速振荡20min，570nm波长处测定吸光度值。按下式计算其他各组细胞相对存活率(β)。结果如表1所示。

β＝An/A₀

式中，An为实验组吸光度，A₀为阴性对照组吸光度

表1细胞毒理测试

根据ISO 10993-5：2009所述的毒性分级评价方法，细胞存活率大于70％，可视为无毒性。由上表结果可见，本发明的枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液在所选取质量浓度下，细胞存活率较高均高于90％，考虑其无细胞毒性。

实施例4

体外抑制酪氨酸酶实验：

设计实施例1、对比例1-4做为处理组，维生素C乙基醚溶液为阳性对照组。

首先配用PBS溶液(pH＝6.8)配制1mg/ml的酪氨酸溶液和200U/ml的酪氨酸酶溶液。

将处理组的发酵液和维生素C乙基醚溶液使用PBS配制为质量分数分别为0.25％、0.5％、1％、2％的4个实验浓度。

酶活检测：使用微量移液器分别按照表3移取a、b、c、d四组样液置于1.5mlEP管(配制反应体系为1000ul)，35℃水浴10min；加入酪氨酸酶溶液200ul，35℃水浴30min，各反应管分别取150ul加入96孔板，酶标仪测定475nm吸光度A值。每组重复试验3次。

表3

相对抑制率	a	b	c	d
					酪氨酸溶液	0	200ul	0	200ul
酪氨酸酶溶液	200ul	200ul	200ul	200ul
					水溶液	200ul	200ul	0	0
PBS	800ul	600ul	800ul	600ul
					实验组	0	0	200ul	200ul

计算各实验组的酪氨酸酶抑制率(I)，I＝[1-(Ad-Ac)/(Ab-Aa)]*100％。试验结果如表4所示。

表4各实验组不同浓度下酪氨酸酶抑制率

从表4可见，各个实验组酪氨酸酶抑制率均随着浓度的增加逐渐升高。在相同浓度下，实施例1组和阳性对照组比较，实施例1组的酪氨酸酶抑制率更好。而不含有烟酰胺和牛樟芝提取物有一定的抑制能力，但是含有其中一种发酵滤液的酪氨酸酶抑制率会稍高一点(对比例2组和对比例3组清除率大于对比例1组)；从结果来看，说明烟酰胺比牛樟芝提取物对滤液提升酪氨酸酶抑制率能力更高；当烟酰胺和牛樟芝提取物协同发酵枯草芽孢杆菌nk1的时候，酪氨酸酶抑制率最高，甚至高于维生素C乙基醚溶液，说明其相互之间有很好的协同作用，能够大大抑制络氨酸酶从而具有更佳的美白活性。枯草芽孢杆菌GIM 1.784作为发酵菌株抑制率很低，说明该抑制作用是枯草芽孢杆菌nk1所特有的。

实施例5光老化皮肤TEWL值测定

使用的主要仪器：

SS-04AB型紫外线光疗仪(上海希格玛高技术有公限司)；

UVA和UVB型UV辐照计(上海希格玛高技术有公限司)；

Tewameter^TM210cC无创性皮肤测试仪(德国Courage+Khazaka公司)；

经表皮水分丢失量(TEWL)是皮肤屏障功能中最重要的参数之一，通过测定皮肤表面的水蒸气压梯度表明水分散失的情况，从而反应皮肤的水通透屏障。UV长期反复照射后，皮肤屏障功能会受到损伤，TEWL值将增加，皮肤会出现干燥、脱屑等现象，同时对外界的抵抗力也会减弱，致使皮肤光老化等相关皮肤病的产生。研究发现UV照射诱导的光老化皮肤中TEWL值会升商。研究发现UVB照射组小鼠皮肤测定的TEWL值较空白组小鼠皮肤上升，破坏了皮肤屏障功能，使皮肤产生红斑、皱纹等光老化特征。TEWL是判断皮肤屏障功能的主要方法之一，其增高提示皮肤屏障功能受损，其降低提示屏障功能修复修复。

35只健康雌性昆明小鼠造模制备光老化皮肤，将小鼠随机分为7组，每组5只小鼠，设为空白对照组、阳性对照组、实施例1组、对比例1-4组。

小鼠光老化皮肤制备方：小鼠常规饲养，无不良影响因素1周后，于第2周开始UV照射建模。各组小鼠均剪除2x 2cm的背部毛发，空白对照组不进行照射。阳性对照组涂抹PBS溶液，实施例1组和对比例1-4组均涂抹各组制备的发酵上清液水溶液(2％浓度)，干燥后开始照射，将初始照射剂量达到最小红斑量，逐步增加，每周照射5次，第10周终止照射，共计照射9周(UVA辐射剂量累计102.58J/cm²，UVB照射剂量累计9.6J/cm²)，空白对照组小鼠皮肤出现红斑、脱屑、皱纹等光老化特征，说明皮肤光老化造模成功。

照射终止后，对各组小鼠受试区皮肤进行TEWL值测定，在室温25度，空气相对湿度50％条件下进行检测，检测所用仪器是Tewameter的无创性皮肤测试仪，每组每只小鼠重复检测3次，取平均值。结果如表5所示。

表5各实验组受试区皮肤TEWL值测定

从表4可见，各个实验组受试区皮肤TEWL值相比较，实施例1组最小，接近于空白对照组，说明其皮肤屏障功能相对最好。而单纯的枯草芽孢杆菌nk1发酵上清液也有一定的保护作用；从结果来看，含有烟酰胺比牛樟芝提取物的上清滤液效果更好，能够增加皮肤的屏障功能，但是仍远远小于实施例1，说明烟酰胺和牛樟芝提取物相互之间有很好的协同作用，能够大大提高枯草芽孢杆菌nk1发酵效果。枯草芽孢杆菌GIM 1.784作为发酵菌株屏障保护作用最差，说明该保护作用是枯草芽孢杆菌nk1所特有的。

实施例6做成面膜的示范例

按照实施例1的枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液再添加以下原料制备相对应的面膜：

所述面膜的具体配方为，按照重量份：

枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液5份，玻尿酸0.5份、海藻糖1份、蚕丝蛋白1份、羧甲基纤维素钠2份、海藻酸钠1份、D-泛醇1份、鲸蜡硬脂醇10份、玫瑰提取液10份，去离子水200份。

所述面膜的制备方法为：

S1.将羧甲基纤维素钠、鲸蜡硬脂醇按重量份数分别称量，随后将其混合均，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热至85℃℃，加热过程中不断搅拌至其完全溶解，静置在烧杯中待用匀(A组分)；

S2.将玻尿酸、蚕丝蛋白、海藻酸钠、海藻糖、玫瑰提取液按重量份数分别称量，并将其混合均匀，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热到70℃℃，至其完全溶解，静置在烧杯中待用(B组分)；

S3.将枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液、D-泛醇按重量份数分别称量，并将其混合均匀，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热到40℃至其完全溶解，静置在烧杯中待用(C组分)；

S4.并用高速剪切机在3000～4500r/min条件下分别对A组分、B组分和C组分搅拌20min，促进其溶解，随后将A组分、B组分和C组分进行混合均质，均质时间15min；均质3次；

S5.均质完成后，待其自然冷却，并在室温条件下冷却静置2h，即得面膜液。

做成的面膜液补水效果的，各项指标符合国家相关规定。

实施例7皮肤斑贴安全性试验

对本发明的枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液进行人体安全性研究，选用2％浓度的本发明实施例1的美枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液纯净水溶液作为测试组1以及蒸馏水作为对照组进行测试，每组30人，两组之间无统计学差异。根据《化妆品卫生规范》(2007年版)中的规定，30位受试者中出现“++”级皮肤不良反应的人数多于2位或出现任何1位“+++”级或“+++”级以上皮肤不良反应时，判定受试物对人体有不良反应。相关测试结果如下表所示。

表6皮肤斑贴安全性试验

如上表所示，在去除斑试器0.5，24和48h后，30名受试者中蒸馏水对照区均未观察到皮肤不良反应，受试区无1例出现“++”反应，该结果表明本发明的枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液的安全性很高，对人体皮肤未引起不良反应。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种含有益生菌活性提取液和烟酰胺的美白修复面膜，其特征在于：

含有枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 18057；

所述枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液为枯草芽孢杆菌nk1发酵后高速离心获得的上清液。

2.权利要求1所述的美白修复面膜，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液的制备方法为：

(1)菌株活化：

活化所使用的培养基为牛奶培养基，配方如下：500g鲜牛奶，50g蔗糖，配置成1L，高温灭菌；

(2)发酵培养：

发酵所用专用液体培养基配方如下：将20g的葡萄糖、10g的蛋白胨、10g的酵母膏、8g的大豆粉、3g的烟酰胺、3g的牛樟芝提取物，3mL的吐温-80，0.6g的MgSO₄·7H₂O、0.3g的MnSO₄·4H₂O、2g的K₂HPO₄和1000mL的蒸馏水混合，调节pH值为7.0并且经高压蒸汽灭菌后得到的无菌培养基；

按照5％v/v的接种量将步骤(1)获得的种子液接种至专用液体发酵培养基，38℃发酵12小时；

(3)将步骤(2)所得的发酵液离心，高速离心收集上清液，得到发酵滤液，并过滤，得到无菌的枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液。

3.权利要求2所述的美白修复面膜，其特征在于，所述(3)：

将步骤(2)所得的发酵液离心，离心转速8000r/min，时间30min，收集上清液，得到发酵滤液，并过0.22um除菌过滤器，得到无菌的枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液。

4.权利要求1-3任一项所述的美白修复面膜，其特征在于，所述面膜的具体配方为，按照重量份：

枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液5份，玻尿酸0.5份、海藻糖1份、蚕丝蛋白1份、羧甲基纤维素钠2份、海藻酸钠1份、D-泛醇1份、鲸蜡硬脂醇10份、玫瑰提取液10份，去离子水200份。

5.权利要求4所述面膜的制备方法。

6.权利要求5所述的制备方法，其步骤为：

S1.将羧甲基纤维素钠、鲸蜡硬脂醇按重量份数分别称量，随后将其混合均，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热至85℃～95℃，加热过程中不断搅拌至其完全溶解，静置在烧杯中待用匀(A组分)；

S2.将玻尿酸、蚕丝蛋白、海藻酸钠、海藻糖、玫瑰提取液按重量份数分别称量，并将其混合均匀，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热到70℃～85℃，至其完全溶解，静置在烧杯中待用(B组分)；

S3.将枯草芽孢杆菌nk1发酵活性提取液、D-泛醇按重量份数分别称量，并将其混合均匀，同时往里加入适量的去离子水，并将其加热到55℃～75℃，至其完全溶解，静置在烧杯中待用(C组分)；

S4.并用高速剪切机在3000～4500r/min条件下分别对A组分、B组分和C组分搅拌8～20min，促进其溶解，随后将A组分、B组分和C组分进行混合均质，均质时间7～15min；均质1～3次；

S5.均质完成后，待其自然冷却，至温度低于25℃以下时，并在室温条件下冷却静置2～3h，即得护肤品。