CN115554220B - 一种具有护肤作用的微生物发酵原液及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有护肤作用的微生物发酵原液及其制备方法与应用。该微生物发酵原液的制备方法包括如下步骤：(1)将蝇蛆、枸杞子、大枣和灵芝粉碎后与水混合均匀，灭菌，得到微生物菌剂培养基；其中，每升所述微生物菌剂培养基中含有：蝇蛆1～10克、枸杞子10～100克、大枣10～100克和灵芝10～100克；(2)将活化后的乳酸菌接种到微生物菌剂培养基中，于密封、35～40℃条件下进行发酵，收集发酵液，经过过滤得到所述具有护肤作用的微生物发酵原液。本发明制备的微生物发酵原液具有滋润、美白、抗皱及抗衰老的作用，可以改善皮肤的状态，可用于化妆产品中。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品护肤原料及制备领域，特别涉及一种具有护肤作用的微生物发酵原液及其制备方法与应用。
背景技术
原料创新，是推动化妆品行业产品创新的重要源泉。虽然原料所属的科学领域发展规律，决定了一款新原料往往研发周期很长、更新迭代频率低，但与此同时，原料的研发创新也具备相当广阔的空间，吸引科研人员不断探索前行。随着“功效护肤”时代的到来，消费者对于天然美容护肤品的需求不断攀升，中国化妆品行业形成了以“天然、绿色、安全、有效”为引导的原料趋势。这类原料主要从大自然中获取，而中国本土植物种类繁多，可挖掘的原料不胜枚举。整个化妆品行业对新原料成分、配方的研发也愈加重视，形成一股“侧重科研技术”的新趋势。
衰老是生物在生命过程中，整个机体的形态、结构和功能逐渐衰退的总现象。皮肤衰老是内源性生理衰老和外源性环境因素共同作用的结果。内源性衰老是根本，环境因素是在内源性衰老的基础上起加速或延缓作用。皮肤衰老表现为皱纹的出现和皮肤的松弛，皮肤暴露部位粗燥、皱纹加深加粗、结构异常、不规则性色素沉着、真皮弹性纤维变等。皮肤位于体表，在机体衰老过程中容易显露，是最早显现机体衰老的组织。皮肤衰老不仅影响美容，还与许多皮肤病有病因学联系，因此预防和延缓皮肤衰老已成为医学和美容的研究热点。
造成皮肤敏感的原因有很多，其中护肤意识不当是一个极其重要的因素，过度护肤导致皮肤屏障受损的例子数不胜数。当下，越来越多品牌对敏感性皮肤这一细分赛道十分关注，不断推出面向这一群体，主打皮肤屏障修护的产品。整体趋势如此，作为产业链中的上游，原料商们也在侧重修复型原料成分的研发，不断推出在该领域最新的技术成果。
21世纪以来，出于对健康和产品安全的考虑，人们的绿色产品意识和有害化学品威胁意识不但增强，有机绿色护理产品的需求不断增加，天然有机护理产品市场不断升温，拥有绿色天然成分的产品将会成为众多消费者的理想选择。这也促使天然化妆品成为各化妆品企业加强研发的重点领域。近年来，微生物发酵技术应用在化妆品中的突破，为天然护肤打开了一扇技术的大门。而生物自然发酵的护肤品，又称“七无”产品，即无香精、无色素、无防腐剂、无荧光剂、无化学油脂、无动物油脂、无化工添加剂。其是采用植物原料或天然酵母经过漫长自然发酵过程所释放出的生命能量和成分，因而效果更卓越，更加安全而环保。
对于传统的护肤品与微生物发酵产生的护肤品而言，其主要差异有：(1)从功效性来讲，微生物发酵护肤品基本为纯植物成分，通过微生物发酵产生植物天然护肤功效；而传统护肤品多通过添加各种化学成分实现功效，例如通过透明质酸和胶原来实现保湿，通过熊果苷、传明酸来美白，通过维生素E来抗氧化等。(2)从成分的安全性来讲，微生物发酵护肤品大多为植物加酵母，成分较少，无防腐体系，但传统护肤品多存在各种化学添加剂。(3)从生产工艺的安全性来讲，微生物发酵护肤品为一站式密闭无菌生产，具有新鲜保证，而传统护肤品多为开放式生产。(4)从稳定性来讲，微生物发酵护肤品pH为酸性，更加稳定。
虽然微生物发酵这一概念已经由来已久，但是随着大量科研人员的研究显示，发酵技术在化妆品植物功效原料的开发方面在还是具有良好的应用前景。这是因为绿色天然的植物本身含有丰富的生物成分，例如维生素、氨基酸、矿物质、多糖、黄酮、多酚等具有良好保湿、美白、舒敏及延缓衰老等功效。而利用微生物发酵技术可以富集这些有效成分，降低分子量，使之易于被皮肤吸收，同时通过改构大大降低毒副作用。不仅如此，采用微生物发酵技术，可以利用微生物细胞或细胞内的酶催化反应体系对植物原料中的活性物进行结构修饰和改造，从而获得有价值的新产物。此外，发酵之于人体皮肤也是通过像乳酸菌这类益生菌的代谢活动，将碳水化合物和糖分转化成皮肤喜好的酶和氨基酸的过程。比如说酵母菌发酵产物滤液，不添加一滴水，其成分接近皮肤细胞，敏感肌也能接受。因此，微生物发酵护肤品与在高温条件下将活性物质和其它成本进行混合的传统护肤品的制造过程不同，发酵制成的护肤品需在干净无氧的环境中经历长达数周的缓慢发酵过程。
总之，采用发酵方式生产的天然产品，既是行业的方向，更是消费者的选择，它将带给人们的是一种自然、绿色、健康以及返璞归真的生活方式。植物发酵护肤原料来源于植物。发酵过程中无添加外源物质，依靠微生物菌群的生命活动分解合成产物。具有低分子量，高营养成分，活性高，低毒低刺激性等优势。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有护肤作用的微生物发酵原液的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的具有护肤作用的微生物发酵原液。
本发明的再一目的在于提供所述具有护肤作用的微生物发酵原液的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有护肤作用的微生物发酵原液的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制微生物菌剂培养基
将蝇蛆、枸杞子、大枣和灵芝粉碎后与水混合均匀，灭菌，得到微生物菌剂培养基；其中，每升所述微生物菌剂培养基中含有：蝇蛆1～10克、枸杞子10～100克、大枣10～100克和灵芝10～100克；
(2)发酵培养
将活化后的乳酸菌接种到步骤(1)中得到的微生物菌剂培养基中，于密封、35～40℃条件下进行发酵，收集发酵液，经过过滤得到所述具有护肤作用的微生物发酵原液；其中，乳酸菌为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和凝结芽孢杆菌中的至少一种。
步骤(1)中的所述的每升微生物菌剂培养基中含有：蝇蛆1克，枸杞子10～30克、大枣20～30克、灵芝10克(即将蝇蛆、枸杞子、大枣和灵芝粉碎后加水溶解，再加水定容至1L)。
步骤(1)中的所述的灭菌的条件为：121℃灭菌20分钟。
步骤(2)中的所述的乳酸菌的活化均可采用常规的方式进行活化；优选为通过如下方法实现：将乳酸菌接种至种子液培养基中，于28～35℃培养24小时以上，得到活化后的乳酸菌。
所述的种子液培养基为MRS液体培养基，其配制方法如下：将蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物10g，柠檬酸二铵2g，K2HPO4 2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐温80lmL，MgSO4·7H2O 0.58g，加水至1000mL，调pH值至6.3～6.5，121℃灭菌15min。
所述的培养的温度优选为37℃。
步骤(2)中的乳酸菌的优选为干酪乳杆菌。
步骤(2)中的乳酸菌的接种密度(均)为107～109CFU/mL；优选为108CFU/mL。
步骤(2)中的所述的植物乳杆菌优选为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CMRC 19L，其保藏编号为CGMCC No.11347。
步骤(2)中的所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BLCC2-0003，保藏编号为CCTCC NO:M2015125。
步骤(2)中的所述的嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)BLCC2-0024，保藏编号为CCTCC NO:M2015129。
步骤(2)中的所述的凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulansGIM1.645)，购自广东省微生物菌种保存中心。
步骤(2)中的所述的发酵的温度优选为37℃。
步骤(2)中的所述的发酵的时间为48～96h；优选为72h。
一种具有护肤作用的微生物发酵原液，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的具有护肤作用的微生物发酵原液呈液态，含有抗菌肽、蛋白质、壳聚糖、多糖以及多种游离氨基酸；其中，所述的游离氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸和色氨酸；该游离氨基酸中含有8种必需氨基酸：苏氨酸、组氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸。
进一步的，本领域技术人员也可以根据本发明中测定得到的微生物发酵原液的组分及其含量，直接加入相应的抗菌肽(多肽)、壳聚糖、多糖以及氨基酸，配制得到与本发明功效相同或相近的化妆品原液(应当说明的是，下述氨基酸和多糖的含量可以根据实际需要进行调整)；其中，
所述的微生物发酵原液中的游离氨基酸的含量如下(mg/100g)：天冬氨酸(Asp)1.03，谷氨酸(Glu)1.46，丝氨酸(Ser)0.46，甘氨酸(Gly)0.70，苏氨酸(Thr)0.45，组氨酸(His)<0.2，丙氨酸(Ala)1.53，精氨酸(Arg)<0.2，酪氨酸(Tyr)<0.2，缬氨酸(Val)0.33，蛋氨酸(Met)<0.2，苯丙氨酸(Phe)<0.2，异亮氨酸(Ile)<0.2，亮氨酸(Leu)0.38，赖氨酸(Lys)<0.2，脯氨酸(Pro)4.75，以上游离氨基酸的总和为11.1。
所述的微生物发酵原液经水解后获得的水解氨基酸具体包括如下组分(mg/100g)：天冬氨酸(Asp)2.50，苏氨酸(Thr)<0.5，丝氨酸(Ser)1.22，谷氨酸(Glu)3.33，甘氨酸(Gly)1.45，丙氨酸(Ala)3.90，缬氨酸(Val)0.78，蛋氨酸(Met)<0.5，异亮氨酸(Ile)<0.5，亮氨酸(Leu)<0.5，酪氨酸TYR(Tyr)<0.5，苯丙氨酸(Phe)<0.5，赖氨酸(Lys)0.95，组氨酸(His)<0.5，精氨酸(Arg)1.72，脯氨酸(Pro)7.93，以上水解氨基酸的总和为23.8。
所述的微生物发酵原液中的蛋白质、壳聚糖、多糖的含量如下：甘露糖137.99μg/g、氨基葡萄糖32.81μg/g、核糖11.60μg/g)、鼠李糖30.16μg/g、葡萄糖醛酸4.04μg/g、半乳糖醛酸77.27μg/g、氨基半乳糖2.70μg/g、葡萄糖1754.81μg/g、半乳糖123.21μg/g、木糖20.67μg/g、阿拉伯糖263.16μg/g、多肽0.318％μg/g、蛋白质0.6％μg/g、壳聚糖32.81mg/kg。
所述的具有护肤作用的微生物发酵原液中微生物含菌量数量级为1×105～8CFU/g，符合国家化妆美容品卫生标准要求。
所述的具有护肤作用的微生物发酵原液在制备化妆品和/或护肤品中的应用。
所述的具有护肤作用的微生物发酵原液可以进一步制成清洗剂、乳剂、霜剂、水剂、或面膜等化妆产品。
所述的化妆品以及护肤品均为具有抗氧化、抗皱、滋润、美白、和/或抗衰老作用的化妆品和护肤品。
所述的化妆品或护肤品中的微生物发酵原液作为护肤品的添加成份时，可以按照一般护肤品生产程序进行添加，其终浓度高于体积百分比0.625％；优选为高于体积百分比1.25％；更优选为体积百分比1％～10％。
本发明中，发酵滤液的结合能够最大限度地降低可溶性小分子在产品生产过程中的损失，作为化妆品原料保证氨基酸、多糖、多肽的浓度适合用于皮肤吸收及护理，甚至可以直接涂抹于皮肤表面使用；其中氨基酸是细胞合成的基本物质，能够合成很多蛋白质、细胞膜，甚至能组成胶原蛋白，是肌肤问题的救星，且发酵护肤品在发酵成分天然，发酵过程会微化为更营养的小分子，即可补充肌肤所需营养，又能避免多余的化学成分带给肌肤刺激性。
本发明制备的微生物发酵原液可以改善皮肤的微生态环境，营养成份充分得到渗透和吸收，达到滋润、美白、抗皱、抗衰老的实际效果，广泛使用在化妆品的清洗剂，乳剂，霜剂，水剂，面膜等化妆产品当中，帮助营养成份很好的渗透和吸收。
本发明采用微生物学的原理，利用微生物发酵技术，将护肤品中的各种营养成份进行发酵处理制成活性微生物发酵护肤原料，在制备过程中，由微生物的发酵和新陈代谢作用，将培养基中的各种营养成份，通过分解、合成，产生出多种不同营养成份的低分子构成物和氨基酸等，当将微生物发酵护肤原料添加到护肤品中时，可以使护肤品发挥营养多样性，高渗透性和补助表皮益生菌的作用，达到恢复表皮微生态平衡、抑制有害微生物繁殖、促进皮肤新陈代谢、加速养份穿透吸收和补充皮肤各重所需营养的护理皮肤目的。发酵产生的植物多糖和氨基酸等成分能帮助调节皮肤生理功能，保湿舒敏抗氧化，对肌肤实现全面呵护。
由于植物果实中含有丰富的多糖，如枸杞、红枣和杏中多糖，具有保湿、抗皱、祛痘、抗敏、消炎等功效，但是其用在化妆品中，存在溶解性、热稳定性、美白性能较差的缺点，从而使其用量较少，效果欠佳。
本发明的采用微生物发酵技术，利用蝇蛆，枸杞子、大枣和灵芝作为发酵底物进行发酵；其中：
蝇蛆是蝇类的幼虫，常年生活在非常腐败污秽的环境中却可以很好的生存繁衍，表现出极端环境下比其他动物更强的抵抗力，其体内的抗菌肽起到关键作用。蝇类抗菌肽是由核糖体合成，并且种类繁多，在蝇类体液免疫中发挥着重要作用。相比于传统抗生素，其独特的作用机制不但不宜产生耐药性，还能高效的杀灭耐药菌株。蝇蛆作为护肤品原料可以有效促进护肤品的生产性能、抗腐蚀等。发酵蝇蛆的护肤品原料的开发利用对寻求无防腐剂添加、促进护肤品绿色发展具有重要的理论和现实意义。
枸杞子(Fructus lucii)是著名的防衰老滋补品，古代医籍中早有记载。明朝李时珍在《本革纲目》中记载枸杞有“久服，坚筋骨，轻身不老，耐寒暑。……补精气诸不足，易颜色，变白，明目安神，令人长寿”等功效。枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)是枸杞子的主要活性成分之一，具有多种药理作用和生物活性功能，其抗氧化作用已得到初步证明。随着技术手段的提高，从枸杞子中得到了枸杞多糖及多种枸杞多糖组分和均一体，从而推动了枸杞多糖的化学、功能和药理研究。研究表明，枸杞多糖(LBP)具有免疫调节、抗肿瘤、防衰老等多种功能。如此认为，枸杞予的抑制肿瘤、抗衰老、抗疲劳等多种生物学作用应与LBP能清除自由基和具有抗氧化作用有一定关系。因此，有必要进行较为系统的科研没计，借助现代微生物发酵科学技术与方法、仪器设备等，将传统的中医药与现代科学技术紧密结合，从整体到细胞、分子，从代谢、机能到形态结构多方面进行多层次的综合研究和分析。为开发研制枸杞多糖资源提供科学的实验依据，以便开发更多的抗皮肤衰老药品和保健食品。枸杞多糖是一种良好的天然抗氧化剂，能延缓皮肤衰老，具有进一步研究的价值。
大枣的维生素含量十分可观(尤以鲜枣含量最高)，其中维生素C的含量达每百克鲜果380克至600毫克，故有活维生素C丸之称。维生素P的含量高于柠檬十多倍。大枣的含糖量也十分丰富，干果大50％至80％，比制糖原料甘蔗和甜菜的含量还高。此外，大枣还含有蛋白质、脂肪、胡罗卜素、膳食纤维、尼克酸、游离氨基酸、苹果酸、酒石酸、皂甙、生物健、黄酮类物质、维生素B2、钙、铁等多种营养物质。大枣的美容效果更是全方位的，经常食用大枣可以使身材匀称，肌肤丰润细腻、面容白嫩光洁，延缓皮肤的衰老。
灵芝作为生药，人们早已熟悉。但以灵芝子实体的乙醇萃取物有效成份具有的抑制黑色素生成和使皮肤洁白柔嫩的作用，它具有以下特性：(1)属于保健化妆品，不刺激皮肤，涂搽后有舒适感，无任何毒副作用：(2)涂搽皮肤，具有抑制黑色素生成，使皮肤柔软、滋润富有弹性和保持健美的效果。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明将复合微生物菌群包括乳酸菌、酵母菌、放线菌等多种有益微生物，经过接种、分组预培、混合扩培后，加入到有草本植物及特殊营养成份的培养液(含有蝇蛆、枸杞子、大枣及灵芝等中，进行厌氧发酵，发酵成熟后经静置、稳定、过滤及酸碱平衡后，成为具有生理活性的微生物发酵原液，可使用于美容品中，改善皮肤的状态，达到滋润、美白、抗皱及抗衰老的作用。
2、本发明制备的微生物发酵原液可以改善皮肤的微生态环境，营养成份充分得到渗透和吸收，达到滋润、美白、抗皱、抗衰老的实际效果，可广泛使用在化妆品的清洗剂，乳剂，霜剂，水剂，面膜等化妆产品当中，可以很好的帮助营养成份的渗透和吸收。
附图说明
图1是本发明制备的抗菌肽壳多糖化妆品原液对DPPH自由基清除情况图。
图2是本发明制备的抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎体表黑色素形成的影响图。
图3是本发明制备的抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎体内酪氨酸酶活性的影响图。
图4是本发明制备的抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎黑色素生成的影响图。
图5是6hpf的野生型斑马鱼胚胎镜检(1X物镜下)结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例中涉及的微生物菌，是非病原性的微生物菌种，菌种包括：植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和凝结芽孢杆菌，以上为可用于保健食品的真菌菌种；其中，
所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CMRC 19L，其保藏编号为CGMCC No.11347(已在中国专利“ZL202210169296.4”中公开)；所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BLCC2-0003，保藏编号为CCTCC NO:M2015125(已在中国专利“ZL201510416580.7”中公开)；所述嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)BLCC2-0024，保藏编号为CCTCC NO:M2015129(已在中国专利“ZL201510416580.7”中公开)；所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulansGIM1.645)，购自广东省微生物菌种保存中心。
本发明实施例中涉及的复合微生物菌剂营养基(培养基)的成份分别为：蝇蛆1～10克、枸杞子10～100克、大枣10～100克、灵芝10～100克和和水余量(以1升容量计，即加水补足至1升)；其中，干燥蝇蛆购自广东绿源生物科技有限公司，枸杞子、大枣(红枣)和灵芝可通过常规商业途径(超市或药店)购得。
本发明中所使用的术语“hpf”指受精后的小时数。举例来说，6hpf指受精后的6小时。
实施例1微生物发酵护肤原液的制备
(1)菌种活化
①配制MRS培养基：
MRS液体培养基：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物10g，柠檬酸二铵2g，K2HPO4 2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐温80lmL，MgSO4·7H2O 0.58g，加水至1000mL，调pH值至6.5，121℃灭菌15min。其中，葡萄糖溶解于200ml水中单独灭菌后混合。
MRS固体培养基：固体培养基在MRS液体培养基的基上加入15g琼脂粉，其他条件相同。
②培养基及培养条件：
植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和凝结芽孢杆菌菌种的活化和计数培养均采用MRS培养基(pH6.5)。
(2)配制微生物菌剂培养基
按表1中的配方配制微生物菌剂培养基：将蝇蛆、枸杞子、大枣和灵芝粉碎后与水混合均匀，并加水补足至1升，灭菌(121℃灭菌20分钟)，得到对应的微生物菌剂培养基。
(3)发酵培养
取固体MRS培养基上的植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和凝结芽孢杆菌分别接入到步骤(1)中配制的MRS液体培养基，置于培养箱中活化培养(37℃)，24h后分别接入步骤(2)中配制的对应的微生物菌剂培养基中，接种密度均为108CFU/mL，置37℃培养箱培养(密封)，发酵72h，收集样品进行处理，过滤，得到发酵化妆品原液。
经测定，本发明制备的发酵化妆品原液中的微生物含菌量为1×105-8CFU/g，实测细菌数达到国家化妆美容品卫生标准要求。
本发明中选择干酪乳杆菌发酵得到的发酵化妆品原液进行后续的实验。
表1培养基的成份
实施例2对发酵化妆品原液进行成分和功能性检测
一、发酵化妆品原液的成分分析
委托广东省华微检测股份有限公司，按照化妆品安全技术规范和各自功能性的检测要求，对实施例1中制备的抗菌肽壳多糖化妆品原液(即干酪乳杆菌发酵获得的发酵化妆品原液)进行成分检测，检测结果见表2至表4：
如表2检测的结果所示，抗菌肽壳多糖化妆品原液符合国家化妆品安全技术规范的要求。
如表3检测的结果所示，抗菌肽壳多糖化妆品原液中含有多肽(0.318％)、蛋白质(0.6％)、壳聚糖(32.81mg/kg)，还含有甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。
如表4检测的结果所示，抗菌肽壳多糖化妆品原液中含有如下的氨基酸(mg/100g)：天冬氨酸(Asp)1.03，谷氨酸(Glu)1.46，丝氨酸(Ser)0.46，甘氨酸(Gly)0.70，苏氨酸(Thr)0.45，组氨酸(His)<0.2，丙氨酸(Ala)1.53，精氨酸(Arg)<0.2，酪氨酸(Tyr)<0.2，缬氨酸(Val)0.33，蛋氨酸(Met)<0.2，苯丙氨酸(Phe)<0.2，异亮氨酸(Ile)<0.2，亮氨酸(Leu)0.38，赖氨酸(Lys)<0.2，脯氨酸(Pro)4.75，以上游离氨基酸的总和为11.1；其中含有8种必需氨基酸：苏氨酸、组氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸。色氨酸(Trp)<0.5、天冬氨酸(Asp)2.50，苏氨酸(Thr)<0.5，丝氨酸(Ser)1.22，谷氨酸(Glu)3.33，甘氨酸(Gly)1.45，丙氨酸(Ala)3.90，缬氨酸(Val)0.78，蛋氨酸(Met)<0.5，异亮氨酸(Ile)<0.5，亮氨酸(Leu)<0.5，酪氨酸TYR(Tyr)<0.5，苯丙氨酸(Phe)<0.5，赖氨酸(Lys)0.95，组氨酸(His)<0.5，精氨酸(Arg)1.72，脯氨酸(Pro)7.93，以上水解氨基酸的总和为23.8；其中含有8种必需氨基酸：苏氨酸、组氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和赖氨酸。
表2按照化妆品安全技术规范要求的检测结果(Test Results)
注：方法检出浓度：砷为0.01mg/kg、铅为1.5mg/kg、汞为0.002mg/kg、镉为0.18mg/kg。
以下为抗菌肽壳多糖化妆品原液的成分比例分析检测结果：
表3分析检测结果(一)
表4分析检测结果(二)
二、发酵化妆品原液的功能性检测
为了解本发明实施例1中制备的抗菌肽壳多糖化妆品原液(干酪乳杆菌发酵获得的发酵化妆品原液)的抗氧化能力、抗皱能力和美白功效，对其进行DPPH自由基清除能力、抗皱能力检测和美白功效测试(斑马鱼美白)，其具体实验过程如下：
(一)DPPH自由基清除能力检测
试验简述：试验根据DPPH自由基清除能力法进行试验设计，通过与空白对照组对比，检测待测样品是否具有自由基清除能力，阳性对照组为浓度为25μM的维生素C溶液。试验结果显示：50％抗菌肽壳多糖化妆品原液对DPPH自由基清除率为95.49±0.10％，与空白对照组(0.00±0.33％)相比明显增加，且有显著性差异(***p<0.001)；说明50％抗菌肽壳多糖化妆品原液在此试验条件下有良好的清除自由基能力，具有潜在的抗皱功效。
1.试验依据：实验根据DPPH自由基清除能力法进行试验设计，通过维生素C验证待试物的清除自由基能力。
2试验目的及原理
2.1试验目的：应用抗氧化剂能清除自由基DPPH，使其乙醇溶液褪色的机理，对待测样品的自由基清除能力进行测定，以反映其是否具有潜在的抗皱功效。
2.2试验原理：自由基的过量产生是导致肌肤衰老的主要原因之一，是否具有清除自由基能力是评价抗皱功效的重要指标，抗氧化剂通过消除自由基起抗皱作用，其消除自由基能力越强，抗皱效果越好[1,2]。DPPH·有单电子，在517nm处有强吸收，其乙醇溶液呈深紫色[3]。DPPH自由基清除能力越强，其抗氧化作用越强[4]。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，因而可进行快速的定量分析，用来评价被测样品清除自由基能力，反映其抗皱功效。
3试验材料
3.1主要仪器与试剂
3.1.1主要试验仪器：MultiskanTM GO酶标仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，SQP万分之一电子秤(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
3.1.2主要试验试剂：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，维生素C。
4.试验方法
4.1主要操作步骤
(1)设置空白对照组、阳性对照组、样品组及对应的调零组；其中：①空白对照组：DPPH+无水乙醇(即含0.1mM DPPH的乙醇溶液)；②阳性对照组：DPPH+维生素C溶液(即含10mM维生素C、0.1mM DPPH的混合溶液)；③样品组：待试物溶液+无水乙醇(即将抗菌肽壳多糖化妆品原液和无水乙醇按体积比1:1混合得到的50％抗菌肽壳多糖化妆品原液)；④调零组：待试物溶液+DPPH(即含50％抗菌肽壳多糖化妆品原液、0.1mM DPPH的混合溶液)。
(2)分别配制空白对照组、阳性对照组、样品组及对应的调零组的溶液，然后在96孔板中加入对应溶液各100μL，每个浓度平行3个复孔。避光反应30min，在酶标仪517nm条件下测定吸光度值，计算DPPH自由基的清除率。DPPH自由基的清除率公式如下：
DPPH自由基清除率(％)＝(1-(OD实验组-OD调零组)/(OD空白组-OD调零组))×100％。
4.2数据统计
采用GraphPad Prism 8.0软件统计处理数据，实验数据均用mean±SEM表示，用t检验或单因素方差分析等统计方法对数据进行统计。
4.3判定依据：
5.试验结果
50％抗菌肽壳多糖化妆品原液对DPPH自由基清除结果如表5和图1所示。空白对照组的自由基清除率为0.00±0.33％。同等条件下，阳性对照组(维生素C：25μM)对DPPH自由基清除率为32.56±0.31％，与空白对照组相比明显增加，且有显著性差异(***p<0.001)，说明阳性对照品具有良好的自由基清除能力。相同实验条件下，50％抗菌肽壳多糖化妆品原液对DPPH自由基清除率为95.49±0.10％，与空白对照组相比明显增加，且有显著性差异(***p<0.001)，说明50％抗菌肽壳多糖化妆品原液在该试验条件下有良好的清除自由基能力。
表5抗菌肽壳多糖化妆品原液对DPPH自由基清除率
| 组别 | 空白对照组 | 阳性对照组 | 50％抗菌肽壳多糖化妆品原液 |
| DPPH自由基清除率(％) | 0.00±0.33 | 32.56±0.31*** | 95.49±0.10*** |
注：阳性对照组、样品组与空白对照组相比：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
6.结论
50％抗菌肽壳多糖化妆品原液对DPPH自由基清除率为95.49±0.10％，与空白对照组(0.00±0.33％)相比明显增加，且有显著性差异(***p<0.001)；说明50％抗菌肽壳多糖化妆品原液在此试验条件下具有良好的清除自由基能力，具有潜在的抗皱功效。
(二)美白功效测试(斑马鱼美白)
试验简述：试验根据《T/HPCIA 005-2021化妆品美白功效的测定斑马鱼胚法》团体标准进行试验设计，通过空白对照验证样品的美白功效。实验结果显示：与空白对照比较，不同浓度的抗菌肽壳多糖化妆品原液处理后，对斑马鱼胚胎体内酪氨酸酶活性和黑色素生成具有抑制作用，且呈剂量依赖效应。1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液能抑制斑马鱼酪氨酸酶活性和黑色素生成，说明实验条件下抗菌肽壳多糖化妆品原液具有潜在的美白作用。
1.试验依据：实验根据《T/HPCIA 005-2021化妆品美白功效的测定斑马鱼胚法》团体标准进行试验设计。
2.试验目的及原理
2.1试验目的：应用斑马鱼鱼胚构建美白模型，对待试物的美白功效进行评价。
2.2试验原理：色斑，包括雀斑、黄褐斑和老年斑等，是由于皮肤的黑色素的增加而形成。斑马鱼与人有87％的基因高度同源性，有着控制黑色素形成的相关基因。斑马鱼体表有着标志性的斑马状条纹，主要包含黑色素细胞，黄色素细胞和银色素细胞3种。斑马鱼色素细胞起源于神经脊，在24hpf时，斑马鱼的早期色素形成，并以点状分布于全身皮肤和视网膜中。酪氨酸酶是酪氨酸转化为黑色素所必需。在16.5hpf时，酪氨酸酶基因在发育中的视网膜色素上皮转录，大约24hpf时可见色素沉积。因此，通过检测斑马鱼体内酪氨酸酶活性和黑色素的形成及分布来评价样品的美白效果。
3试验材料
3.1试验用鱼：本次测试所用斑马鱼为常规市售AB系斑马鱼。
3.2主要仪器与试剂
3.2.1主要试验仪器：Z-A-D5五层单排独立养殖单元(上海海圣生物实验设备有限公司)；SZ680连续变倍体视显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)；ZXSD-A1090生化培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；SQP万分之一电子秤(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；全波长酶标仪(赛默飞)；超声振荡器(昆山市超声仪器有限公司)；超低温离心机(湘仪离心机仪器有限公司)。
3.2.2主要试验试剂：熊果苷(98％)(麦克林)、左旋多巴(98％)(麦克林)、脱氧胆酸钠(99％，生物技术级别)(麦克林)、氢氧化钠(分析纯)(天津市致远化学试剂有限公司)。
4试验方法
4.1分组与对照
不同浓度的样品组：将实施例1中制备的抗菌肽壳多糖化妆品原液稀释为0.625％(v/v)、1.25％(v/v)抗菌肽壳多糖化妆品原液；
空白对照组：标准稀释水(保证斑马鱼胚胎的正常生理活动能够进行，同时还能保证实验数据的稳定性)。
标准稀释用水的配制方法如下：
①氯化钙储备液:称取11.76g氯化钙(CaCl2·2H2O)，用蒸馏水或去离子水定容至1000ml，可储存6个月。
②硫酸镁储备液:称取4.93g硫酸镁(MgSO4·7H2O)，用蒸馏水或去离子水定容至1000ml，可储存6个月。
③碳酸氢钠储备液:称取2.52g碳酸氢钠(NaHCO3)，用蒸馏水或去离子水定容至1000ml，可储存6个月。
④氯化钾储备液:称取0.22q氯化钾(KCI)，用蒸馏水或去离子水定容至1000ml，可储存6个月。
⑤标准稀释水:将以上四种储备液各取25ml混合，用蒸馏水或去离子水定容至1000ml。
4.2主要操作步骤
4.2.1实验用鱼及其受精卵的采集
将性成熟斑马鱼雌雄分缸饲养于斑马鱼养殖单元中。水温：26±2℃；pH：7.2；电导率：520μs/cm；
光照/黑暗周期：14h:10h。暴露实验开始前一天，将性成熟斑马鱼以雌雄1:2配对，自然交配产卵，收集胚胎。
4.2.2暴露实验
实验设置空白对照组和不同浓度的样品组：体视显微镜下挑选发育正常的6～9hpf的野生型斑马鱼胚胎于6孔细胞培养板中，每孔放入30枚胚胎，每组平行3个复孔，每孔加入5mL相对应溶液，即空白对照组加入标准稀释水，样品组分别加入0.625％、1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液。随后将斑马鱼胚胎放于培养箱中孵育72h，并在48h和72h时在体视显微镜下观察斑马鱼胚胎体表黑色素沉积情况，并拍照记录。
4.2.3酪氨酸酶活性检测
实验设置空白对照组和不同浓度的样品组：
体视显微镜下挑选发育正常的6～9hpf的野生型斑马鱼胚胎于6孔细胞培养板中(6hpf的野生型斑马鱼胚胎镜检结果见图5)，每孔放入30枚胚胎，每组平行3个复孔，每孔加入5mL相对应溶液，即空白对照组加入标准稀释水，样品组加入0.625％、1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液(标准稀释水稀释)。随后将斑马鱼胚胎放于培养箱中孵育72h，并在72h时检测斑马鱼体内酪氨酸酶活性，具体为：孵育72h后，将斑马鱼胚胎转移到EP管中，加入裂解液(5mg/mL脱氧胆酸钠)，匀浆，离心，取上清，加入5mM左旋多巴溶液，37℃孵育1h后，酶标仪(475nm)下进行检测。其中，酪氨酸酶活性抑制率的计算公式如下：
酪氨酸酶活性抑制率(％)＝(1-(OD样品组-OD调零组)/(OD空白对照组-OD调零组))×100％。
4.2.4黑色素生成检测
实验设置空白对照组和不同浓度的样品组：
体视显微镜下挑选发育正常的6～9hpf的AB系斑马鱼胚胎于6孔细胞培养板中，每孔放入30枚胚胎，每组平行3个复孔，每孔加入5mL相对应溶液，即空白对照组加入标准稀释水，样品组加入0.625％、1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液。随后将斑马鱼胚胎放于培养箱中孵育72h，并在72h时检测斑马鱼体内黑色素生成情况，具体为：孵育72h后，将斑马鱼胚胎转移到EP管中，加入裂解液(5mg/mL脱氧胆酸钠)，匀浆，离心，取上清，加入1M的氢氧化钠溶液，酶标仪(405nm)下进行检测。其中，黑色素生成抑制率的计算公式如下：
黑色素生成抑制率(％)＝(1-(OD样品组-OD调零组)/(OD空白对照组-OD调零组))×100％。
4.3判定依据
5.实验结果
5.1黑色素生成定性分析
0.625％、1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎体表黑色素形成的影响见图2。空白对照组中，斑马鱼胚胎在48hpf时，体表出现黑色素，且在72hpf时更加明显，当使用0.625％和1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液处理斑马鱼胚胎72h后，与空白对照组相比，斑马鱼体表黑色素形成和分布明显减少，说明0.625％和1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液在该实验条件下能抑制斑马鱼体表黑色素形成。
5.2酪氨酸酶活性检测
0.625％、1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎酪氨酸酶活性的影响见表6和图3。空白对照组对斑马鱼胚胎体内酪氨酸酶活性抑制率为0.00±8.18％，0.625％、1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎酪氨酸酶活性抑制率分别为8.09±2.04％和48.70±13.33％，与空白对照组相比，0.625％抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎体内酪氨酸酶活性抑制率增加，但无显著性差异(p>0.05，p＝0.7646)；1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎体内酪氨酸酶活性抑制率增加，且有显著性差异(*p<0.05，p＝0.0162)。
表6抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎体内酪氨酸酶活性的影响
| 空白对照组 | 0.625％ | 1.25％ | |
| 酪氨酸酶活性抑制率(％) | 0.00±8.18 | 8.09±2.04 | 48.70±13.33* |
| p值 | 0.7646 | 0.0162 |
注：与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
5.3黑色素生成检测
0.625％、1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎黑色素生成的影响见表7和图4。空白对照组对斑马鱼胚胎黑色素生成抑制率为0.00±3.97％，0.625％、1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎黑色素生成抑制率分别为32.78±1.50％和58.94±3.64％，与空白对照组相比，0.625％抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎黑色素生成抑制率增加，且有显著性差异(***p<0.001，p＝0.0007)；1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎黑色素生成抑制率增加，且有显著性差异(***p<0.001)，说明1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液能抑制斑马鱼黑色素生成。
表7抗菌肽壳多糖化妆品原液对斑马鱼胚胎黑色素生成的影响
注：与空白对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
6.结论
(1)浓度为0.625％和1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液处理斑马鱼胚胎后的酪氨酸酶活性抑制率分别为8.09±2.04％和48.70±13.33％，且在浓度为1.25％时有显著性差异(*p<0.05)，表明抗菌肽壳多糖化妆品原液能抑制酪氨酸酶的活性，且呈剂量依赖效应。浓度为0.625％和1.25％抗菌肽壳多糖化妆品原液处理斑马鱼胚胎后的黑色素生成抑制率分别为32.78±1.50％和58.94±3.64％，且都有显著性差异(***p<0.001)，表明抗菌肽壳多糖化妆品原液能抑制斑马鱼黑色素生成，且呈剂量依赖效应。综上所述，抗菌肽壳多糖化妆品原液在实验条件下具有潜在的美白作用，可以作为具有美白功效的依据之一。
(2)根据对发酵化妆品原液的DPPH自由基清除能力和美白功效测试(斑马鱼美白)的实验结果，得出利用本发明制备的发酵化妆品原液具有以下可用于护肤的能力。
(三)多次皮肤刺激性试验
1.检验依据和方法：《化妆品安全技术规范》(2015年版)第六章毒理学试验方法：4皮肤刺激性/腐蚀性试验。
2.检测过程：
2.1试验动物：4只普通级Hartley豚鼠(雄性，体重357.86～379.16g)，由广州市白云区龙归兴科动物养殖场提供，许可证号：SCXK(粤)2022-0042；质量合格证号：44817200001783。
2.2饲养环境：普通环境，温度20℃～26℃，相对湿度40％～70％，许可证号：SYXK(粤)2018-0194。
2.3饲料来源：广东省医学实验动物中心，生产许可证号：粤饲证(2019)05073，生产日期：2022-06-12；质量合格证号：44200300027453。
2.4样品制备：使用实施例1中制备的发酵化妆品原液。
2.5试验方法：试验前约24h，将试验动物背部脊柱两侧毛剃掉，不损伤表皮，去毛范围左、右各约3cm×3cm。取0.5mL样品涂抹于面积为2.5cm×2.5cm的左侧剃毛皮肤上，另一侧皮肤作为对照。每天涂抹1次，连续涂抹14d。从第二天开始，每次涂抹前剃毛，用温水清除残留受试物，1h后观察皮肤局部反应并进行评分。
3.结果：试验结果如表8所示。
表8发酵化妆品原液的多次皮肤刺激性试验结果
7、结论：该样品原液对Hartley豚鼠多次皮肤刺激性试验每天每只动物平均积分为0，根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)皮肤刺激性试验的皮肤刺激强度分级，属无刺激性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (8)
1.一种具有护肤作用的微生物发酵原液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）配制微生物菌剂培养基
将蝇蛆、枸杞子、大枣和灵芝粉碎后与水混合均匀，灭菌，得到微生物菌剂培养基；其中，每升所述微生物菌剂培养基中含有：蝇蛆1~10克、枸杞子10~100克、大枣10~100克和灵芝10~100克；
（2）发酵培养
将活化后的乳酸菌接种到步骤（1）中得到的微生物菌剂培养基中，于密封、35～40℃条件下进行发酵，收集发酵液，经过过滤得到所述具有护肤作用的微生物发酵原液；其中，乳酸菌为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）BLCC2-0003。
2.根据权利要求1所述的具有护肤作用的微生物发酵原液的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中的所述的每升微生物菌剂培养基中含有：蝇蛆1克，枸杞子10~30克、大枣20~30克、灵芝10克。
3.根据权利要求1所述的具有护肤作用的微生物发酵原液的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中的乳酸菌的接种密度为107～109 CFU /mL；
步骤（2）中的所述的发酵的时间为48～96 h。
4.根据权利要求3所述的具有护肤作用的微生物发酵原液的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中的乳酸菌的接种密度为108 CFU /mL；
步骤（2）中的所述的发酵的温度为37℃；
步骤（2）中的所述的发酵的时间为72 h。
5.根据权利要求1所述的具有护肤作用的微生物发酵原液的制备方法，其特征在于：
步骤（2）中的所述的乳酸菌的活化通过如下方法实现：将乳酸菌接种至种子液培养基中，于28～35℃培养24小时以上，得到活化后的乳酸菌；
所述的种子液培养基为MRS液体培养基，其配制方法如下：将蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物10g，柠檬酸二铵2g，K2HPO4 2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐温801mL，MgSO4·7H2O 0.58g，加水至1000mL，调pH值至6.3～6.5，121℃灭菌15min。
6.一种具有护肤作用的微生物发酵原液，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。
7.权利要求6所述的具有护肤作用的微生物发酵原液在制备化妆品和/或护肤品中的应用，其特征在于：所述的化妆品或护肤品中的微生物发酵原液的浓度高于或等于体积百分比1.25%。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的化妆品或护肤品中的微生物发酵原液的浓度为体积百分比1.25%～10%。
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