CN115948480B - 一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液及其制备方法与应用，涉及生物发酵技术领域。本发明所述望春花发酵液的制备方法，包括以下步骤：将望春花、卤虫卵、碳源、氮源、微量营养素和水混合均匀，灭菌后得到发酵培养基；将凝结芽孢杆菌种子液接入所述发酵培养基中进行发酵，得到粗发酵液，然后灭菌、过滤，即得望春花发酵液。本发明采用微生物发酵方法制得的望春花发酵液具有优异的抗氧化、抗炎和提亮功效，将其应用于制备化妆品时，所得产品具有良好的保湿效果，能够改善皮肤暗沉、皮肤粗糙和皮肤敏感性。

Description

一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液及其制备 方法与应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液及其制备方法与应用。

背景技术

望春花又名辛夷花、迎春花、木笔花。望春花其可作为药材，味辛，性温、归肺、胃经，具有通风寒、通鼻窍的作用，在中医上发挥了巨大的作用。现代医学也一直在通过新的技术来提取其中的有效成分，也在药用价值上做了更多的探索。

目前，人们已经开发了望春花在化妆品领域中的应用。例如：将望春花提取物应用于美容护肤乳液、晒后修护组合物等，可以深层修护皮肤由于晒后带来的红斑、黑化、脱屑等问题。常见的望春花提取物的制备方法是将望春花研磨粉碎，通过水和/或乙醇进行水热提取或超声波提取。可见目前人们对望春花提取物没有进行深入研究，导致望春花提取物的护肤功效较差。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液及其制备方法与应用。该制备方法利用微生物发酵的方法，得到的望春花发酵液具有优异的抗氧化、抗炎和提亮的功效。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)将望春花、卤虫卵、碳源、氮源、微量营养素和水混合均匀，灭菌后得到发酵培养基；

(2)将凝结芽孢杆菌种子液接入所述发酵培养基中进行发酵，得到粗发酵液，然后灭菌、过滤，即得望春花发酵液。

本发明技术方案中所述望春花富含黄酮、挥发油和木脂素，其中，总黄酮类物质具有抗氧化活性，对羟基自由基和DPPH自由基有很好的清除能力，用普鲁士蓝光度法也表明其具有较强的还原能力，望春花提取物能通过抑制酪氨酸酶的活性，从而具有明显的美白作用，可起到良好的提高肤色，改善肌肤光泽度的功效，同时可以明显减少自由基，有效抑制酪氨酸酶活性，并且阻止黑色素转移。

本发明所述卤虫卵中主要功效成分是四磷酸二鸟苷，来源于一种海底浮游生物，四磷酸二鸟苷由于化学结构的特殊性，会迅速转化成ATP，从浮游生物上提取的卤虫提取物能够为肌肤补充能量，促进新陈代谢，修复和保护DNA，为肌肤抵御外源压力。

本发明采用微生物发酵的方法制备望春花发酵液，通过实验发现，望春花和卤虫卵之间存在协同作用，利用凝结芽孢杆菌进行发酵时，发酵培养基中望春花在卤虫卵、微量营养素等组分共同作用下，最终制备得到的望春花发酵液抗氧化活性成分较多，具有很好的抗氧化、抗炎和提亮功效。

优选地，所述步骤(1)中，所述发酵培养基包含以下质量百分比的组分：望春花0.5-2％、卤虫卵0.2-1％、碳源0.1-2％、氮源0.2-2％、微量营养素0.02-0.1％和余量水。

优选地，所述发酵培养基中望春花和卤虫卵的质量比为：(1-3)：1。

本发明所述发酵培养基中望春花和卤虫卵的质量比为(1-3)：1时，能够较好地发挥望春花和卤虫卵的协同作用，使发酵液中望春花中活性成分增加，得到的望春花发酵液的抗氧化、抗炎以及提亮功效更好，能够更好地改善皮肤整体状态。

更优选地，所述步骤(1)中，所述发酵培养基包含以下质量百分比的组分：望春花0.8％、卤虫卵0.5％、碳源0.9％、氮源0.6％、微量营养素0.05％和余量水。当选用所述优选配比时，望春花与卤虫卵的质量比为1.6：1，得到的望春花发酵液的抗氧化、抗炎以及提亮效果最好。

优选地，所述步骤(1)中，所述望春花选自望春花花蕾。

本发明选用望春花植物的特定部位望春花花蕾作为原料进行发酵，在发酵培养基中加入卤虫卵，望春花花蕾与卤虫卵起到协同增效的作用，能够促进望春花活性成分的析出，所得的望春花发酵液的抗氧化、抗炎和提亮的功效好。当选用望春花植物的不同部位望春花树皮进行发酵时，得到的望春花发酵液的抗氧化、抗炎和提亮效果较差。

优选地，所述步骤(1)中，所述望春花花蕾还包括预处理；所述预处理为选取干燥的望春花花蕾，用破碎机打粉，过筛。粉碎过筛可以在发酵时更好地提取到望春花中的功效成分。

优选地，所述过筛的筛网目数为60-100目。

更优选地，所述过筛的筛网目数为80目。

优选地，所述步骤(1)中，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、糊精中的至少一种；所述氮源包括大豆蛋白胨、胰蛋白胨、铵盐、硝酸盐、玉米浆、豆饼粉中的至少一种；所述微量营养素为维生素B族元素。

本发明在发酵培养基中加入维生素B族元素，促进微生物发酵，使得最终制备得到的望春花发酵液护肤功效较好。此外，选择不同种类的碳源、氮源以及维生素B族元素均会影响制得的望春花发酵液的功效。

优选地，所述微量营养素为维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B12中的至少一种。

优选地，所述碳源为糊精和蔗糖；所述碳源中糊精和蔗糖的质量比为：(1.5-3)：1。

更优选地，所述氮源为玉米浆；所述微量营养素为维生素B3。

本发明选用糊精和蔗糖作为碳源，玉米浆作为氮源，微量营养素选择维生素B3时，得到的望春花发酵液具有更优的抗氧化、抗炎和提亮效果。

更优选地，所述碳源中糊精和蔗糖的质量比为：2:1。

更优选地，所述步骤(1)中，所述灭菌为高温高压灭菌。

优选地，所述步骤(2)中，所述发酵的温度为35-45℃，所述发酵的时间为30-55h。本发明发酵温度较低或较高时，会影响微生物的发酵效果，得到的望春花发酵液功效相对较差。

更优选地，所述发酵的温度为40℃，所述发酵的时间为40h。在所述发酵温度下具有最优的发酵效果，得到的望春花发酵液的抗氧化、抗炎和提亮功效好。

优选地，所述步骤(2)中，所述凝结芽孢杆菌种子液中凝结芽孢杆菌的浓度为1.0×10⁷CFU/mL-1.0×10⁹CFU/mL，所述凝结芽孢杆菌种子液的接种量为0.5％-2％。

更优选地，所述凝结芽孢杆菌种子液的接种量为1％。优选地，所述发酵于摇床中进行，所述摇床转速为120-150r/min，优选为130r/min。

优选地，所述步骤(2)中，所述灭菌的温度为85℃～115℃，灭菌时间为15～30min。

优选地，所述步骤(2)中，所述过滤为采用硅藻土过滤器过滤。

优选地，所述凝结芽孢杆菌种子液的制备方法包括如下步骤：取凝结芽孢杆菌菌落，活化后接入液体培养基中进行扩大培养，得到所述凝结芽孢杆菌种子液。

优选地，所述活化于液体培养基中活化，所述活化的温度为35-45℃，所述活化的时间为18-35h。

更优选地，所述活化的温度为40℃，所述活化的时间为24h。

优选地，所述液体培养基为营养肉汁培养基或胰蛋白胨大豆培养基；所述扩大培养的温度为35-48℃，所述扩大培养的时间为30-80h。

更优选地，所述扩大培养的温度为40℃，所述扩大培养的时间为40h。

优选地，所述扩大培养的接种量为1％-5％。

更优选地，所述液体培养基为营养肉汁培养基。

优选地，所述的液体培养基的制备方法，包括如下步骤：

制备营养肉汁培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，MnSO₄·H₂O5mg，去离子水加入至总体积为1.0L，混合均匀，121℃灭菌15min，即得。

制备胰蛋白胨大豆培养基：胰蛋白胨17.0g，大豆胨3.0g，氯化钠5.0g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，去离子水加入至总体积为1.0L，混合均匀，121℃灭菌15min，即得。

第二方面，本发明提供了一种采用上述的制备方法制备得到的望春花发酵液。

本发明利用微生物发酵方法制得的望春花发酵液具有很好的抗氧化、抗炎和皮肤提亮功效。

第三方面，本发明提供了上述望春花发酵液在制备化妆品中的应用。

将上述望春花发酵液应用于制备化妆品精华液产品中，所得产品具有优异的保湿效果，能够改善皮肤暗沉、皮肤粗糙、皮肤敏感性和改善皮肤整体状态。

优选地，上述望春花发酵液应用于制备化妆品时，所述望春花发酵液在化妆品中的添加量为0.1wt％-5wt％。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明选用望春花花蕾作为原料，通过凝结芽孢杆菌进行发酵，发酵培养基中加入卤虫卵，望春花花蕾与卤虫卵起到协同增效的作用；发酵培养基中加入维生素B族元素，促进微生物发酵，最终制备得到具有很好的抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液。

(2)本发明所述的望春花发酵液护肤功效好，应用于制备化妆品时，所得产品具有良好的保湿效果，能够改善皮肤暗沉、皮肤粗糙、皮肤敏感性和皮肤整体状态。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围及实施方式不限于此。

实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的实施例，采用如下方法制备得到：

(1)植物原料预处理

将干燥的望春花花蕾用高速打粉机粉碎，过80目筛，得到植物原料。

(2)制备凝结芽孢杆菌种子液

选用营养肉汁培养基作为液体培养基，用接种环挑取一环凝结芽孢杆菌菌落(菌种编号：BNCC192399，购于商城北纳创联生物科技有限公司)接种至液体培养基中于40℃摇床培养，摇床转速为130r/min，发酵24h，得到活化的凝结芽孢杆菌；

以2％接种量取活化后的凝结芽孢杆菌，接入到液体培养基中，40℃培养40h，得到凝结芽孢杆菌种子液，此时凝结芽孢杆菌种子液的菌浓达10⁷CFU/mL以上。

(3)制备发酵培养基

发酵培养基的组分质量百分比组成：植物原料0.8％，卤虫卵0.5％，糊精0.6％，蔗糖0.3％，玉米浆0.6％，维生素B3 0.05％，余量水。

将上述原料混合均匀，121℃高压蒸汽灭菌15min，得到发酵培养基。

(4)制备植物发酵液

在发酵培养基中接入凝结芽孢杆菌种子液于摇床中进行发酵，种子液接种量为1％，发酵温度40℃，发酵过程中通入无菌空气，自然pH，摇床转速为130r/min，发酵时间40h，得到粗发酵液。

(5)后处理工艺

灭菌处理：利用巴氏法对粗发酵液中的微生物进行灭活处理，灭菌温度为90℃，处理时间为30min，得到灭菌后的粗发酵液。

过滤处理：将灭菌后的粗发酵液通过硅藻土过滤器除去发酵残渣，即得望春花发酵液。

实施例2-11

实施例2-11为本发明所述具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的实施例，实施例2-11的制备方法中除发酵培养基的组成和发酵温度有所不同外，其余步骤与实施例1相同，实施例2-11中制备方法的参数如下表1所示。

实施例1与实施例2、3的区别在于植物原料与卤虫卵的质量比不同；实施例1与实施例4、5的区别在于糊精和蔗糖的质量比不同；实施例1与实施例6、7的区别在于维生素B族的种类不同；实施例1与实施例8、9的区别在于氮源的种类不同；实施例1与实施例10、11的区别在于发酵的温度不同。

表1

实施例12

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的实施例，采用如下方法制备得到：

(1)植物原料预处理

将干燥的望春花花蕾用高速打粉机粉碎，过60目筛，得到植物原料。

(2)制备凝结芽孢杆菌种子液

选用营养肉汁培养基作为液体培养基，用接种环挑取一环凝结芽孢杆菌菌落(菌种编号：BNCC192399，购于商城北纳创联生物科技有限公司)接种至液体培养基中于45℃摇床培养，摇床转速为200r/min，发酵18h，得到活化的凝结芽孢杆菌；

以3％接种量取活化后的凝结芽孢杆菌，接入到液体培养基中，38℃培养80h，得到凝结芽孢杆菌种子液，此时凝结芽孢杆菌种子液的菌浓达10⁸CFU/mL以上。

(3)制备发酵培养基

发酵培养基的组分质量百分比组成：植物原料0.5％，卤虫卵0.5％，葡萄糖1％，玉米浆1.5％，维生素B3 0.1％，余量水。

将上述原料混合均匀，121℃高压蒸汽灭菌15min，得到发酵培养基。

(4)制备植物发酵液

在发酵培养基中接入凝结芽孢杆菌种子液于摇床中进行发酵，种子液接种量为1％，发酵温度38℃，发酵过程中通入无菌空气，自然pH，摇床转速为150r/min，发酵时间50h，得到粗发酵液。

(5)后处理工艺

灭菌处理：利用巴氏法对粗发酵液中的微生物进行灭活处理，灭菌温度为85℃，处理时间为20min，得到灭菌后的粗发酵液。

过滤处理：将得到灭菌后的粗发酵液通过硅藻土过滤器除去发酵残渣，即得望春花发酵液。

实施例13

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的实施例，采用如下方法制备得到：

(1)植物原料预处理

将干燥的望春花花蕾用高速打粉机粉碎，过100目筛，得到植物原料。

(2)制备凝结芽孢杆菌种子液

选用胰蛋白胨大豆培养基作为液体培养基，用接种环挑取一环凝结芽孢杆菌菌落(菌种编号：BNCC192399，购于商城北纳创联生物科技有限公司)接种至液体培养基中于35℃摇床培养，摇床转速为100r/min，发酵35h，得到活化的凝结芽孢杆菌；

以5％接种量取活化后的凝结芽孢杆菌，接入到液体培养基中，43℃培养60h，得到凝结芽孢杆菌种子液，此时凝结芽孢杆菌种子液的菌浓达10⁸CFU/mL以上。

(3)制备发酵培养基

发酵培养基的组分质量百分比组成：植物原料2％，卤虫卵1％，蔗糖0.3％，大豆蛋白胨0.3％，维生素B3 0.02％，余量水。

将上述原料混合均匀，121℃高压蒸汽灭菌15min，得到发酵培养基。

(4)制备植物发酵液

在发酵培养基中接入凝结芽孢杆菌种子液于摇床中进行发酵，种子液接种量为1％，发酵温度42℃，发酵过程中通入无菌空气，自然pH，摇床转速为180r/min，发酵时间60h，得到粗发酵液。

(5)后处理工艺

灭菌处理：利用巴氏法对粗发酵液中的微生物进行灭活处理，灭菌温度为115℃，处理时间为15min，得到灭菌后的粗发酵液。

过滤处理：将灭菌后的粗发酵液通过硅藻土过滤器除去发酵残渣，即得望春花发酵液。

对比例1

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的对比例，本对比例所述望春花发酵液采用水提法制备得到，具体步骤如下：

(1)利用粉碎机将望春花花蕾粉碎，过80目筛，得到植物原料。

(2)将0.8kg植物原料、0.5kg卤虫卵、98.7kg水混合，在80℃，130r/min的条件下提取40h，得到粗植物提取液。

(3)将粗植物提取液再通过硅藻土过滤器除去发酵残渣，即得望春花发酵液。

对比例2

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的对比例，本对比例与实施例1的区别在于发酵培养基组分中不加入卤虫卵，本对比例发酵培养基的组分质量百分比组成：望春花花蕾1.3％，糊精0.6％，蔗糖0.3％，玉米浆0.6％，维生素B30.05％，余量水。其余步骤与实施例1相同。

对比例3

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的对比例，本对比例与实施例1的区别在于发酵培养基组分中不加入望春花花蕾，本对比例发酵培养基的组分质量百分比组成：卤虫卵1.3％，糊精0.6％，蔗糖0.3％，玉米浆0.6％，维生素B30.05％，余量水。其余步骤与实施例1相同。

对比例4

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的对比例，本对比例与实施例1的区别在于发酵培养基组分中不加入微量营养素，本对比例发酵培养基的组分质量百分比组成：望春花花蕾0.8％，卤虫卵0.5％，糊精0.6％，蔗糖0.3％，玉米浆0.6％，余量水。其余步骤与实施例1相同。

对比例5

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的对比例，本对比例与实施例1的区别在于选用枯草芽孢杆菌(菌种编号：BNCC338006，购于商城北纳创联生物科技有限公司)进行发酵，其余步骤与实施例1相同。

对比例6

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的对比例，本对比例与实施例1的区别在于选用酿酒酵母菌(菌种编号：BNCC341572，购于商城北纳创联生物科技有限公司)进行发酵，其余步骤与实施例1相同。

对比例7

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的对比例，本对比例与实施例1的区别在于发酵培养基中的维生素B3用同等质量的维生素A代替，其余步骤与实施例1相同。

对比例8

本发明一种具有抗氧化、抗炎和提亮功效的望春花发酵液的制备方法的对比例，本对比例与实施例1的区别在于发酵培养基组分中的望春花花蕾用同等质量的望春花树皮代替，其余步骤与实施例1相同。

效果例1

为了验证本发明所述望春花发酵液的抗氧化效果，利用细胞实验法进行抗氧化性能测试。

实验原理：自由基学说是皮肤衰老的重要分支，抗自由基的物质可以延缓皮肤衰老。需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，包括：O₂ ^-、H₂O₂及HO₂·、·OH等，影响皮肤细胞正常的功能和生理活动。荧光探针DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCF(2',7'-二氯荧光素)。而DCF不能透过细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCF生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

使用仪器：多功能酶标仪(BioTek，Cytation 1)。

实验试剂：DMEM培养基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、DCFH-DA(Sigma)、DMSO(索莱宝)、1.5mM的H₂O₂溶液。

实验材料：细胞系：人成纤维细胞(HFF-1细胞)；培养液：含质量分数为10％胎牛血清的DMEM培养基。

培养条件：37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养。

样品制备：用上述培养液作为溶剂，将实施例1-13和对比例1-8所得的望春花发酵液分别配制成质量分数为0.5％的望春花发酵液样品。

实验步骤：将人成纤维细胞以5000/孔的密度接种至96孔板中，加0.1mL培养液，于37℃，5％CO₂浓度的培养箱孵育过夜。

随后各孔对应加入试剂。样品组：加入0.05mL 1.5mM的H₂O₂溶液和0.05mL望春花发酵液样品；空白对照组：加入0.1mL培养液；建模组：加入0.05mL 1.5mM的H₂O₂溶液和0.05mL培养液；于37℃，5％ CO₂浓度的培养箱孵育24h。

孵育24h后，用PBS洗涤上述细胞2次，各孔中加入50μM DCFH–DA孵育30min，再用PBS洗涤细胞2次，以0.1mL 1.5mM的H₂O₂溶液处理样品组和建模组的细胞1h，空白组补入0.1mL培养液，随后用PBS洗涤上述细胞2次。

采用485nm激发波长和528nm发射波长对氧化型二氯荧素(DCF)进行测量，对各组样品拍照，用Image-Pro(IPP)软件分析图片的荧光光密度，荧光光密度越低，说明望春花发酵液样品的抗氧化效果越好。实验结果如表2所示。

表2各样品图片的荧光光密度分析结果

由表2可知，实施例1-13的荧光光密度低于对比例1-8，说明实施例1-13所得望春花发酵液的抗氧化效果优于对比例1-8。其中，对比例1采用常规水提法制备得到的望春花发酵液，其测得的荧光光密度高，抗氧化效果不如实施例1-13，说明采用微生物发酵的方法，使得制备得到的发酵液具有很好的抗氧化效果。对比例2-3中发酵培养基不含有卤虫卵或望春花花蕾时，抗氧化效果差，说明在发酵过程中，望春花花蕾和卤虫卵之间存在协同作用，得到的植物发酵液中抗氧化活性成分较多，抗氧化效果也更好。对比例4、7中当发酵培养基中不加入微量营养素或替换本申请所述微量营养素时，抗氧化效果均不如实施例1-13，且实施例1的抗氧化效果优于实施例6、7，说明微量营养素在发酵过程中起到了十分重要的作用，在本发明的发酵过程中，微量营养素选择为维生素B族元素时具备良好的抗氧化效果，当选用维生素B3时具备最优的抗氧化效果。对比例5-6中替换成其他的菌种进行发酵，抗氧化效果下降，说明发酵的菌种在发酵过程中起到了十分重要的作用，更换为别的菌种制备得到的望春花发酵液的抗氧化效果较差。对比例8中使用望春花树皮替换望春花花蕾，其抗氧化效果不如实施例1-13，说明选用望春花植物的不同部位进行发酵，得到的望春花发酵液的抗氧化效果也有很大差别。此外，实施例1的抗氧化效果优于实施例2-11，说明望春花花蕾与卤虫卵的质量比、糊精和蔗糖的质量比、维生素B族的种类、氮源的种类、发酵的温度对所得的望春花发酵液影响大。在本发明中，当望春花花蕾与卤虫卵的质量比为1.6:1、糊精和蔗糖的质量比为2:1、维生素B族元素选用维生素B3、发酵温度为40℃时，得到的望春花发酵液效果抗氧化效果最好。

效果例2

NO是炎症介质之一，容易引发机体的炎症反应。本发明参照文献1(贵州废弃烟叶抗炎活性部位及其化学成分分析鉴定，孙佳玉等，广州化工，2022，50(22))和文献2(甘草总黄酮及其成分体外抗炎活性及机制研究，杨晓露等，中国中药杂志，2013，38(01))中的方法(Griess法测定细胞产生的NO含量)，验证本发明所述望春花发酵液的抗炎、舒缓效果。

Griess法测定NO的原理为：NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO₂ ^-，在酸性条件下，NO₂ ^-促使Griess反应发生而生成重氮化合物。由该反应生成的重氮化合物的浓度与NO₂ ^-浓度具有线型关系。重氮化合物可在540-560nm处进行定量测定。这一方法操作简便，可以通过商业化的NO含量试剂盒进行测试。

实验试剂：高糖DMEM、胎牛血清、脂多糖LPS(索莱宝)、NO含量试剂盒(碧云天)。

实验材料：细胞系：小鼠Raw264.7细胞；培养液：含质量分数为10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。

培养条件：37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养。

样品制备：用上述培养液作为溶剂，将实施例1-13和对比例1-8所得的望春花发酵液分别配制成质量分数为1％、2％的望春花发酵液样品。

实验步骤：细胞培养：将小鼠Raw264.7细胞接种于48孔细胞培养板，每孔细胞数为1×10⁵个，培养24h。

暴露：弃去孔中原培养液，样品组各孔加不同浓度的样品溶液。样品组：分别加入实施例1-13和对比例1-8所述望春花发酵液样品(望春花发酵液样品浓度依次为1％、2％)，所述望春花发酵液样品中还含有10ng/mL的LPS；LPS组：加入LPS浓度为10ng/mL的水溶液；空白对照组：加入同等量的培养液，培养24小时。

NO含量测试：吸取培养基，离心取上清液，测试上清液中NO的含量。NO的含量越低，说明抗炎、效果越好。其中，空白对照组的NO相对含量为0，LPS组的NO相对含量为100％。各样品组上清液中NO的相对含量测试结果如下表3所示。

表3NO相对含量测试结果

由表3可知，选用望春花发酵液的浓度为1％、2％的情况下，实施例1-13均表现出较好的抑制炎症因子NO生成的能力，并且望春花发酵液的浓度较高时，抑制炎症因子NO生成的效果较好。实施例1-13抗炎效果均优于对比例1-8。说明不使用本发明所述制备方法或发酵条件不在本发明保护范围内时，得到的望春花发酵液的抗炎效果较差。

效果例3

为了验证本发明所述望春花发酵液的皮肤提亮功效，将本发明实施例1-13和对比例1-8所得的望春花发酵液制备成精华液，进行皮肤光泽度、皮肤粗糙度测试以及整体使用效果评估。具体方法如下：

制备精华液测试样品：添加本发明实施例1-13和对比例1-8所得望春花发酵液制得对应的精华液。所述精华液的组分配方如表4所示。

所述精华液的制备方法如下：

(1)依据表4的配方将组分A、B分别预混，备用；

(2)将组分A搅拌加热至70℃左右，加入组分B，继续加热至80℃，使各成分完全溶解，保温20min，得到混合液I；

(3)降温至45℃，在混合液I加入组分C，混合均匀，得到所述精华液。

制备基质精华液测试样品：以不添加望春花发酵液的精华液作为基质精华液对照组，其他组分配方如表4所示。其制备方法与所述精华液的制备方法相同。

表4精华液的组分配方表

1、皮肤光泽度测试

测试所用仪器：皮肤光泽度测试仪Glossymeter(GL200，Courage and Khazaka，德国)。

待测样品：本发明实施例1-13和对比例1-8所得望春花发酵液制得的对应的精华液；基质精华液对照组(基质精华液中不加入望春花发酵液，以同等质量的水代替)。

测试对象：筛选18-35岁、皮肤暗沉、皮肤粗糙的健康男性或女性440人(随机分为22组，每一样品对应20名志愿者，剔除正在接受皮肤科治疗的人员，或一个月内试部位过、美容、测试区域有伤口、磨损、温升、丘疹等影响结果判定及其他可能影响测试结果的情况)。

测试步骤：清洁受试者面部区域。受试者取2-3mL精华液待测样品涂抹在测试区域，每天使用2次，早、晚各一次。在使用样品前、使用样品2周、4周后进行皮肤光泽度测试，对EvaSKIN采集的图片进行皮肤光泽度分析，测试结果取平均值。

皮肤光泽度变化率(％)＝(使用后的平均值-使用前的平均值)/使用前的平均值×100％。皮肤光泽度值越大，说明皮肤光泽越好。待测样品使用前、使用2周后和使用4周后，皮肤光泽度测试结果如表5所示。

表5

由表5可知，本发明的望春花发酵液具有优异的皮肤提亮效果。实施例1-13所得产品的提亮效果优于对比例1-8。

2、皮肤粗糙度测试

测试所用仪器：皮肤表面纹理测试系统VC 20。

待测样品：本发明实施例1-13和对比例1-8制得的对应的精华液；基质精华液对照组。

测试对象：筛选18-35岁、皮肤暗沉、皮肤粗糙的健康男性或女性440人，分为22组，每组20名志愿者，分别对应实施例1-13和对比例1-8的待测样品和基质精华液对照组。

测试步骤：清洁受试者面部区域。受试者取2-3mL精华液待测样品涂抹在测试区域，每天使用2次，早、晚各一次。在使用样品前、使用样品2周、4周后进行皮肤粗糙度测试，测试皮肤粗糙度SEr数值，测试结果取平均值。

皮肤粗糙度SEr数值越低，说明皮肤越粗糙。皮肤粗糙度改善率(％)＝(使用后皮肤粗糙度SEr-使用前皮肤粗糙度SEr)/使用前皮肤粗糙度SEr×100％。测试结果如表6所示。

表6

由表6测试结果表明，本发明的望春花发酵液可以很好地改善皮肤的粗糙度。本发明实施例1-13所得产品改善皮肤粗糙度的效果明显优于对比例1-8。

3、志愿者感官评价

待测样品：本发明实施例1-13和对比例1-8制得的对应的精华液；基质精华液对照组。

测试对象：筛选18-35岁、皮肤暗沉、皮肤粗糙的健康男性或女性440人，分为22组，每组20名志愿者，分别对应实施例1-13和对比例1-8的待测样品和基质精华液对照组。

测试步骤：清洁受试者面部区域。受试者取2-3mL精华液待测样品涂抹在测试区域，每天使用2次，早、晚各一次。在使用前、连续使用4周后让受试者对实施例1-13和对比例1-8对应的精华液、基质精华液进行评价。

评价内容：在使用4周后，让受试者对精华液的保湿效果、改善皮肤暗沉、改善皮肤粗糙、改善皮肤敏感性、改善皮肤整体状态进行评价。

评价方法：5分制，1分为“非常不认可”、2分为“不认可”、3分为“一般”、4分为“认可”、5分为“非常认可”。统计4分和5分的人数占比。评价结果如表7所示。

表7

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由表7可知，本发明实施例1-13得到的望春花发酵液制得的精华液具有很好地保湿、改善皮肤暗沉、改善皮肤粗糙、改善皮肤敏感性和改善皮肤整体状态的效果。说明本发明采用凝结芽孢杆菌发酵的方法，望春花花蕾与卤虫卵之间存在协同作用，配合本发明所述发酵条件，得到的望春花发酵液中抗氧化活性成分较多，具有良好的抗氧化、抗炎和皮肤提亮的功效。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种具有抗氧化、抗炎和提亮皮肤功效的望春花发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将望春花、卤虫卵、碳源、氮源、微量营养素和水混合均匀，灭菌后得到发酵培养基；所述望春花选自望春花花蕾；所述微量营养素为维生素B族元素；

(2)将凝结芽孢杆菌种子液接入所述发酵培养基中进行发酵，得到粗发酵液，然后灭菌、过滤，即得望春花发酵液。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述发酵培养基包含以下质量百分比的组分：望春花0.5-2％、卤虫卵0.2-1％、碳源0.1-2％、氮源0.2-2％、微量营养素0.02-0.1％和余量水。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中望春花和卤虫卵的质量比为：(1-3)：1。

4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、糊精中的至少一种；所述氮源包括大豆蛋白胨、胰蛋白胨、铵盐、硝酸盐、玉米浆、豆饼粉中的至少一种。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述碳源为糊精和蔗糖；所述碳源中糊精和蔗糖的质量比为：(1.5-3)：1。

6.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述发酵的温度为35-45℃，所述发酵的时间为30-55h。

7.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述凝结芽孢杆菌种子液中凝结芽孢杆菌的浓度为1.0×10⁷CFU/mL-1.0×10⁹CFU/mL，所述凝结芽孢杆菌种子液的接种量为0.5％-2％；

所述凝结芽孢杆菌种子液的制备方法包括如下步骤：取凝结芽孢杆菌菌落，活化后接入液体培养基中进行扩大培养，得到所述凝结芽孢杆菌种子液。

8.一种采用权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的望春花发酵液。

9.如权利要求8所述的望春花发酵液在制备化妆品中的应用。