CN114767608B - 一种天然植物养护焕颜复配护肤品原料、其制备方法及其应用 - Google Patents

一种天然植物养护焕颜复配护肤品原料、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种天然植物养护焕颜复配护肤品原料、其制备方法及其应用。本申请充分发挥马齿苋中的相关成分额作用，利用发酵方法充分发挥其与芦荟和积雪草中相关成分的协同作用，获得了高含量黄酮类化合物的护肤品原料，证实了其皮肤保湿等作用。以该护肤品原料制得的护肤膏能保持皮肤莹润亮泽，细腻肌肤柔和肌底，具有很好的市场应用前景。

Description

一种天然植物养护焕颜复配护肤品原料、其制备方法及其 应用
技术领域
本申请涉及一种天然植物养护焕颜护肤品技术领域，具体涉及种天然植物养护焕颜复配护肤品原料、其制备方法及其应用。
背景技术
大量天然草本植物能够应用于化妆品领域，充分利用天然草本植物的功效，达到消除个体容貌上的某种缺陷或改善容貌，达到中医所说的“驻颜”、“美颜”、“留颜”、“益容”之目的。
然而现有的中医技技术对于天然草本植物的成分研究不够深入，比如，马齿苋(Portulucu oleruceu L.)是马齿苋科马齿苋属一年生肉质草本植物，是菜药兼用植物，在中国大部分地区均有分布，又名长命菜、五行草、瓜子菜、麻绳菜、五色觅、马食菜等。
马齿苋具有清热解毒、凉血比血的功能，用于治疗热毒血痢、痈肿疗疮、湿疹、丹毒、痔血和崩漏下血等病症。马齿苋中含有多种微量元素、黄酮、多糖、氨基酸、多酚、维生素、不饱和脂肪酸等生物活性成分，具有防治心脏病、冠心病、心绞痛、糖尿病、白疲风、白发病，抗癌、抗衰老、降血压、降低中风率等作用。马齿苋还可起到保湿、美白、舒缓肌肤的作用。然而对于其活性成分往往通过提取、萃取等方法得到，不仅提取物含量较低，提取效率不佳，而且提取的活性成分单一，往往不能真正应用对美白亮肤化妆品领域，而综合发挥其美白功能。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于充分发挥马齿苋中相关抗氧化和衰老活性成分作用，利用发酵方法充分发挥其与芦荟和积雪草中相关活性成分的协同作用，获得了高含量黄酮类化合物的护肤品原料，以该护肤品原料制得的美白护肤膏不仅能够美白皮肤，还能保持皮肤莹润亮泽，细腻肌肤柔和肌底，具有很好的市场应用前景。
第一方面，本申请实施例公开了一种天然植物养护焕颜复配护肤品原料的制备方法，包括以下步骤：
分别制得马齿苋干药材的研磨粉、芦荟液和积雪草干药材的研磨粉；
制备罗伊氏乳杆菌的菌株活化液；
制备种子液，所述种子液是将所述活化液接种至含有马齿苋干药材的研磨粉、芦荟液和积雪草干药材的研磨粉的种子培养基发酵制得；
制备发酵液，所述发酵液是将所述种子液接种至含有马齿苋干药材的研磨粉、芦荟液和积雪草干药材的研磨粉的发酵培养基发酵制得；
对发酵液进程灭菌处理，加入10～15m/v％活性炭，静置过夜后，过滤取上清液，减压浓缩后，冷冻干燥，得到所述护肤品原料。
在本申请实施例中，所述种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉34～62g/L、芦荟液25～36g/L和15～25g/L积雪草干药材的研磨粉；其中，所述芦荟液为芦荟叶片果肉压制和过滤后的滤液。
在本申请实施例中，所述种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉34～62g/L、芦荟液25～36g/L和15～25g/L积雪草干药材的研磨粉、酵母提取物10～25g/L、胰蛋白胨5～14g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10～12g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.5～0.65g/L。
在本申请实施例中，所述发酵培养基包含马齿苋干药材的研磨粉34～62g/L、芦荟液30～40g/L和20～35g/L积雪草干药材的研磨粉；其中，所述芦荟液为芦荟叶片果肉压制和过滤后的滤液。
在本申请实施例中，所述种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉34～62g/L、芦荟液30～40g/L和20～35g/L积雪草干药材的研磨粉、酵母提取物8～25g/L、胰蛋白胨5～10g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10～12g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.5～0.65g/L。
在本申请实施例中，所述活化液以6v/v％的接种量接种至所述种子培养基中，并于37℃厌氧条件下静置培养26h，即可制得所述种子液。
在本申请实施例中，所述种子液以4v/v％的接种量接种至所述发酵培养基中，调节初始pH7.0，于37℃、100rpm搅拌转速和1:2(v/v)通气量的培养条件下进行连续培养活菌数不低于100亿CFU/mL为止，即可得到所述发酵液。
第二方面，本申请实施例公开了第一方面所述的制备方法制得的天然植物养护焕颜复配护肤品原料，包含不低于26.78mg/g的槲皮素、不低于20.784mg/g的山奈酚、不低于14.21mg/g的杨梅素、不低于11.57mg/g的橙皮苷、不低于18.52mg/g的木犀草素、不低于21.23mg/g的芹菜素、不低于29.37mg/g的槲皮素-3-O-ɑ-L-鼠李糖苷、不低于9.55mg/g的木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷、不低于11.06mg/g的芹菜素7-葡萄糖醛酸苷、不低于28.77mg/g的芦荟苷A、不低于21.48mg/g的芦荟苷B、不低于10.3mg/g的芦荟大黄素、不低于10.6mg/g的芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、不低于8.99mg/g的芦荟苦素、不低于12.25mg/g的芦荟新苷D、不低于12.96mg/g的芦荟宁、不低于27.47mg/g的积雪草苷、不低于16.75mg/g的积雪草苷B和不低于16.1mg/g的羟基积雪草苷。
第三方面，本申请实施例公开了一种美白护肤膏，包含第一方面所述的制备方法制得的天然植物养护焕颜复配护肤品原料10～18wt％、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯3～5wt％、鲸蜡硬脂醇基葡萄糖苷0.8～2.0wt％、油醇芥酸酯3～3.5wt％、鲸蜡硬脂醇1～1.5wt％、角鳖烷3～5wt％、羟苯丙酯0.1～0.25wt％、甘油3～5wt％、烟酰胺0.5～2wt％、失水山梨醇脂肪酸酯0.25～0.5wt％、丁二醇4.5～5.2wt％、对羟基苯甲酸酯0.2～0.4wt％、香精0.05～0.1wt％和乳酸0.05～0.2wt％，余量为水，pH4.5～5.0之间。
第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述的制备方法制得的天然植物养护焕颜复配护肤品原料、或第二方面所述的天然植物养护焕颜复配护肤品原料在制备美白、亮肤和抗衰老领域相关化妆品中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请中涉及通过以马齿苋、芦荟和积雪草作为培养基，利用罗伊氏乳杆菌进行发酵，通过对发酵液进行简单处理得了一种天然植物养护焕颜复配护肤品原料，该护肤品原料中黄酮类化合物含量显著降高于一般的马齿苋提取物、芦荟提取物或积雪草提取物，以该护肤品原料制得的美白护肤膏不仅能够美白皮肤，还能保持皮肤莹润亮泽，细腻肌肤柔和肌底，具有很好的市场应用前景。
附图说明
图1为本申请细胞实验提供的对照组细胞形态图。
图2为本申请细胞实验提供的实验组(实施例1)细胞形态图。
图3为本申请细胞实验提供的实验组(对比例1)细胞形态图。
图4为本申请动物实验提供的正常组豚鼠皮肤组织切片显微图。
图5为本申请动物实验提供的模型组豚鼠皮肤组织切片显微图。
图6为本申请动物实验提供的阳性对照组豚鼠皮肤组织切片显微图。
图7为本申请动物实验提供的治疗组(实施例1)豚鼠皮肤组织切片显微图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
马齿苋、芦荟和积雪草的发酵
一、材料与方法
1、马齿苋提取物的制备
(1)马齿苋：干药材，研磨成粉，国舜堂。
(2)提取方法
一个具体的对比例1的提取过程为：
取粉碎好的马齿苋药材粉末适量，置加压提取罐中，按照要求加入75％乙醇作为提取溶剂(料液比为1:45g/mL)后，密封加压提取装置，于80℃、0.20MPa下加压浸提30min，提取完毕后，将提取液过滤，浓缩，挥干溶剂得浸膏，冷冻干燥得到马齿苋提取物。
2、芦荟提取物的制备
一个具体的对比例2的提取过程为：
(1)将芦荟叶片，洗净，去皮，果肉均质5min，过滤后得滤液，8000rpm低温离心10min，取上清液缓慢加入2倍体积的-20℃的冷丙酮溶液，混匀后，密闭添加置于冰浴条件处理5h，8000rpm离心收集沉淀；
(2)用pH＝6.8的PBS溶液重悬沉淀后，按照15～50mg/L的浓度加入果胶酶(CAS:9032-75-1，上海迈瑞尔化学技术有限公司)，于45.0℃水浴条件下酶解45～60min后，以100～105℃蒸煮10～15min，进行灭酶处理，再次以8000rpm低温离心10min后，取上清液，用75％的饱和硫酸铵溶液进行盐析处理，4℃放置下12h后，4℃、8000rpm离心10min后收集沉淀，冷冻干燥，即可得到所述的芦荟提取物。
3、积雪草提取物的制备
(1)积雪草：研磨成粉，亳州市谯城区陈峰中药材种植专业合作社。
(2)一个具体的对比例3的提取过程为：
取粉碎好的积雪草药材粉末适量，置加压提取罐中，按照要求加入70％乙醇作为提取溶剂(料液比为1:20g/mL)后，密封加压提取装置，于50℃、0.20MPa下加压浸提30min，提取完毕后，将提取液过滤，浓缩，挥干溶剂得浸膏，冷冻干燥得到积雪草提取物。
4、发酵
一个具体的发酵实施例1的实施过程如下：
(1)菌株：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，货号B84147，明舟生物。
(2)菌株的活化
从-80℃取出菌株在菌株活化平板上划线培养，挑取形态良好的单菌落接种至菌株活化液体培养基中，37℃恒温培养14h，作为活化的菌种备用。
其中，菌株活化平板培养基包含：酵母提取物50g/L，葡萄糖10g/L，蔗糖50g/L，柠檬酸铵2g/L，吐温-80 1.5g/L，七水硫酸镁0.58g/L，无水乙酸钠5g/L，四水硫酸锰0.25g/L和琼脂20g/L，调节pH至6.3左右，分装后121℃高压灭菌20min，冷却备用。菌株活化液体培养基与菌株活化平板培养培养基的配方基本相同，区别仅在于去掉其中的琼脂。
(3)制备种子液
按照上述方法进行菌株活化，可活化多次，收集菌液浓度在吸光值OD600达到4左右的菌液左右活化液，将活化液以6％(v/v)的接种量接种到装有250mL种子培养基的锥形瓶中(250mL)，37℃厌氧条件下静置培养26h，即可制得种子液。
其中，种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉50g/L、芦荟液25g/L、积雪草干药材的研磨粉15g/L、酵母提取物10g/L、胰蛋白胨14g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L，调节pH6.8，其中，马齿苋干药材的研磨粉和积雪草干药材的研磨粉分别为上述对比例1和3的原材料，芦荟液为芦荟叶片果肉压制和过滤后的滤液。
(4)制备发酵液
将上述制得的种子液，以4v/v％的接种量接种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，调节初始pH7.0，于37℃、100rpm搅拌转速和1:2(v/v)通气量的培养条件下进行连续培养活菌数不低于100亿CFU/mL为止。
其中，发酵培养基包含马齿苋干药材的研磨粉45g/L、芦荟液40g/L、积雪草干药材的研磨粉35g/L、酵母提取物8g/L、胰蛋白胨8g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L，调节pH7.0。
(5)发酵液处理
收集发酵液，于121℃处理10～15min，以对发酵液进行灭活，向灭活后的发酵液中加入10～15m/v％(质量体积比)活性炭，静置过夜后，过滤取上清液，减压浓缩后，冷冻干燥，得到冻干粉。
一个具体的实施例2的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：菌株活化液体培养基还包含马齿苋干药材的研磨粉2.5g/L、芦荟液1.8g/L和积雪草干药材的研磨粉0.75g/L。
一个具体的实施例3的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：菌株活化液体培养基还包含马齿苋干药材的研磨粉3.5g/L、芦荟液1.4g/L和积雪草干药材的研磨粉0.5g/L。
一个具体的实施例4的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉34g/L、芦荟液36g/L、积雪草干药材的研磨粉20g/L、酵母提取物10g/L、胰蛋白胨14g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L。
一个具体的实施例5的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉62g/L、芦荟液30g/L、积雪草干药材的研磨粉25g/L、酵母提取物10g/L、胰蛋白胨14g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L。
一个具体的实施例6的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉50g/L、芦荟液25g/L、积雪草干药材的研磨粉15g/L、酵母提取物25g/L、胰蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖12g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L。
一个具体的实施例7的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉50g/L、芦荟液25g/L、积雪草干药材的研磨粉15g/L、酵母提取物10g/L、胰蛋白胨14g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.5g/L。
一个具体的实施例8的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：发酵培养基包含马齿苋干药材的研磨粉34g/L、芦荟液36g/L、积雪草干药材的研磨粉20g/L、酵母提取物8g/L、胰蛋白胨8g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L。
一个具体的实施例9的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：发酵培养基包含马齿苋干药材的研磨粉62g/L、芦荟液30g/L、积雪草干药材的研磨粉25g/L、酵母提取物8g/L、胰蛋白胨8g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L。
一个具体的实施例10的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：发酵培养基包含马齿苋干药材的研磨粉45g/L、芦荟液40g/L、积雪草干药材的研磨粉35g/L、酵母提取物25g/L、胰蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖12g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L。
一个具体的实施例11的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：发酵培养基包含马齿苋干药材的研磨粉45g/L、芦荟液40g/L、积雪草干药材的研磨粉35g/L、酵母提取物8g/L、胰蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.5g/L。
一个具体的对比例4的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：种子培养基不包含马齿苋干药材的研磨粉、芦荟液和积雪草干药材的研磨粉。
一个具体的对比例5的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：发酵培养基不包含马齿苋干药材的研磨粉、芦荟液和积雪草干药材的研磨粉。
一个具体的对比例6的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉10g/L、芦荟液10g/L、积雪草干药材的研磨粉10g/L、酵母提取物10g/L、胰蛋白胨14g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L。
一个具体的对比例7的发酵实施过程中，采用的菌株、菌株的活化、制备种子液和制备发酵液大致与实施例1相同，区别仅在于：发酵培养基包含马齿苋干药材的研磨粉10g/L、芦荟液10g/L、积雪草干药材的研磨粉10g/L、酵母提取物10g/L、胰蛋白胨14g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.65g/L。
5、黄酮类物质含量检测
(1)黄酮类化合物的提取
将各实施例1～11和对比例1～7提供的护肤品原料置于索氏提取器中，加入100mL75％乙醇溶液，于75℃索氏提取3h，旋转蒸发浓缩，过滤，向所得25mL滤液中加入200mg聚酞胺粉，搅匀后，将其转移到装有400mg聚酞胺细粉(80％乙醇预处理)的砂芯层析柱中，用乙醇梯度洗脱：45％乙醇、60％乙醇、75％乙醇、95％乙醇和无水乙醇，每个梯度洗脱1倍柱体积。收集合并各级洗脱液，用60％乙醇定容至500mL容量瓶中，即得总黄酮提取液备用。
(2)黄酮类化合物的成分分析
待测样品：将上述制得的总黄酮提取液冷冻干燥后，用色谱纯甲醇溶解，采用超声波清洗器处理35min，抽滤、浓缩，用色谱甲醇溶解，用注射器吸取1mL样品，过0.25μm微孔滤膜，注入样品瓶待测。
标准品：槲皮素、山奈酚、杨梅素、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素7-葡萄糖醛酸苷、芦荟苷A、芦荟苷B和芦荟大黄素均购自Sigma公司；芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟苦素、芦荟新苷D、芦荟宁、积雪草苷、积雪草苷B和羟基积雪草苷均购自Acmec公司；槲皮素-3-O-ɑ-L-鼠李糖苷购自深圳菲斯生物科技有限公司。将这些标准品分别用色谱甲醇配制成浓度为100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1mg/mL、20mg/mL和100mg/mL，分别制成标准品溶液备用。
HPLC色谱条件：色谱柱为SHIMADZU-C18柱(150mm×4mm，5μm)，开启高效液相色谱仪，设置柱温300C，检测波长360nm，时间60min，调节流动相为45:55的甲醇-0.2％磷酸，控制流1.0mL/min，进样量10μL。将不同浓度的各标准品溶液按照此HPLC条件分析，根据色谱峰面积和标准品溶液浓度制作标准曲线，得到标准方程，根据待测样品对应保留时间的色谱峰面积计算待测样品液中的各活性成分含量，进而计算实施例1～11和对比例1～7的护肤品原料中含量。
6、抗氧化性能测定
参照“王梅霖，张志国，玫瑰黄酮的提取及抗氧化活性的研究[J]，中国调味品，2021，第7期：1000-9973”方法测定各实施例1～11和对比例1～7提供的护肤品原料在不同加入浓度下的DPPH清除率，并计算各自对应的IC50。
7、酪氨酸酶抑制活性检测
供试品溶液：pH＝5.6的醋酸缓冲液溶解各护肤品原料后，稀释成相应受试浓度0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL和2.0mg/mL。参照“严子军，韦寿莲，汪洪武，等.美容川芎、白芷、益母草在化妆品中的应用[J].肇庆学报,2013,34(5):29-32”公开的方法测定实施例1～11和对比例1～7分别提供的护肤品原料的酪氨酸酶抑制率的IC50。
8、透明质酸酶抑制活性检测
构建透明质酸酶体外抑制Elson-Morgan法反应体系，来评价实施例1～11和对比例1～7分别提供的护肤品原料对透明质酸酶的抑制效果。供试品溶液：pH＝5.6的醋酸缓冲液溶解各护肤品原料后，稀释成相应受试浓度0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL和5.0mg/mL。参照“王占一，廖成斌，公金艳，赵春林，孙晓梅，向兰；石榴瓤多糖提取工艺的优化及其抑制透明质酸酶活性[J]中成药,2020,第9期：1001-1528”公开的方法，检测各供试品对透明质酸酶的抑制率的IC50。
9、数据处理
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。
二、结果
表1含量mg/g
Figure BDA0003637352220000121
Figure BDA0003637352220000131
表2含量mg/g
Figure BDA0003637352220000132
表3含量mg/g
Figure BDA0003637352220000133
Figure BDA0003637352220000141
表1～3中，“－”表示未检出。由表1～3可知，实施例1～11制得的护肤品原料中均包含槲皮素、山奈酚、杨梅素、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素-3-O-ɑ-L-鼠李糖苷、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素7-葡萄糖醛酸苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟苦素、芦荟新苷D、芦荟宁、积雪草苷、积雪草苷B和羟基积雪草苷，并且这些活性成分含量均显著高于对比例1～7。
具体而言，实施例8、9制得护肤品原料中含有的各种黄酮类化合物的含量最高。而对比例1～3分别为马齿苋提取物、芦荟提取物和积雪草提取物，其中的黄酮类化合物较为单一，并且含量显著低于实施例。而对比例例4、5的黄酮类化合物含量显著低于实施例1，是由于其发酵过程中的种子培养基不包含马齿苋、芦荟和积雪草作为原料。同样地，对比例例6、7的黄酮类化合物含量显著低于实施例1，是由于其发酵过程中的发酵培养基包含的马齿苋、芦荟和积雪草成分含量过低。
表4
Figure BDA0003637352220000151
表4中，“－”表示未检出。由表4可知，实施例1～11提供的护肤品原料对DPPH清除率、酪氨酸酶抑制率和透明质酸酶抑制率的IC50值均显著低于对比例1～7。由此表明，实施例1～11提供的护肤品原料不仅具有体外抗氧化活性，还具有显著地抑制酪氨酸酶活性和透明质酸酶的活性。而酪氨酸酶为黑色素合成的关键控制酶；透明质酸酶可水解透明质酸，使得皮肤中透明质酸含量降低使得皮肤失水。由此提示，实施例1～11提供的护肤品原料不仅具有体外抗氧化活性，还具有减少皮肤黑色素合成和增强皮肤保湿的功能。
细胞试验
一、材料与方法
1、细胞
小鼠皮肤黑色素瘤细胞B16-F10，货号：CL-0319，普诺赛公司。人皮肤成纤维细胞(HDF)，货号：QCLL-1012111，德尔夫公司。
2、供试品溶液
用pH＝5.6的醋酸缓冲液溶解实施例1～11和对比例1～7分别提供的护肤品原料后，稀释受试浓度0.1mg/mL，以作为供试品溶液。
3、B16-F10细胞黑色素合成抑制试验
选择对数生长期的B16-F10细胞，用质量分数0.25％胰蛋自酶消化后，以DMEM完全培养基配成密度为5×104个/mL的细胞悬液，接种于6孔培养板，每孔2mL，于37℃、5％CO2培养箱内培养24h后，弃除孔板中的培养液。将其分为实验组和对照组，实验组中添加含有0.1mg/mL供试品溶液的DMEM完全培养基，对照组加入相同体积的DMEM完全培养基，每组设5个复孔。置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h后，弃掉上清液，加入400μL的1mol/L NaOH溶液(含有质量分数10％DMSO)，80℃下恒温2h，取100μL在酶标仪490nm处测其吸光度值。黑色素抑制率＝(对照组吸光值－实验组吸光值)/对照组吸光值×100％。
4、成纤维细胞增殖实验
收集对数生长期细胞，铺板使待测细胞密度至5000个/孔，于37℃、5％CO2下培养，细胞生长至105个/mL的细胞悬液，换液加入含有0.1mg/mL供试品溶液的DMEM完全培养基，以加入相同体积的DMEM完全培养基为对照组。继续培养24h，每孔加入20μL 0.5％MTT溶液(5g/L)，培养4h后弃去培养液，用PBS冲洗2～3遍后，每孔加入150μL二甲基亚飒，于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。于490nm处测量各孔的吸光度。细胞存活率＝(测定孔吸光度－空白对照组吸光度)/(对照组吸光度－空白对照组吸光度)×100％。
取上述实验组成纤维细胞24后的培养液，2 000～3 000r/min离心20min，得上清液，采用Col-I(48T/96T，南京信帆生物)和透明质酸检测试剂盒(GOY-E6088，上海谷研)分别检测其中Col-I和透明质酸含量，具体根据说明书的步骤进行操作。
5、数据处理
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。
二、结果
对B16-F10细胞黑色素合成抑制试验中对照组和实验组细胞在给药后24h，采用倒置荧光显微镜下观察细胞形态。对照组的细胞形态如图1所示。如图2所示，给药含实施例1提供的护肤品原料的供试品溶液后，细胞无明显形态变化；如图3所示，给药含对比例1提供的护肤品原料的供试品溶液后，细胞变大，轮廓模糊；其他实施例和对比例给药后，细胞形态均无明显变化。
表5
实施方式 黑色素抑制率％ 细胞存活率％ Col-I增长率％ 透明质酸增长率％
实施例1 47.5±4.1b 115.6±12.3c 17.2±1.8b 8.5±1.1b
实施例2 52.2±3.7a 114.7±7.5c 16.4±2.1b 7.2±0.7c
实施例3 54.3±3.6a 109.8±5.9cd 21.3±2.7a 6.8±0.9c
实施例4 56.7±5.2a 111.8±5.4c 19.5±1.8ab 7.8±0.6c
实施例5 48.4±3.3b 113.5±3.8c 22.1±2.2a 8.2±1.2b
实施例6 51.8±4.5ab 116.3±10.5c 18.7±1.6b 8.7±0.9b
实施例7 50.6±3.9ab 114.2±12.2c 20.3±2.1a 9.5±1.2a
实施例8 56.7±4.5a 111.6±8.4c 23.6±4.3a 9.9±1.3a
实施例9 57.3±2.8a 107.5±9.2d 24.5±2.7a 10.8±1.1a
实施例10 51.5±4.2ab 105.3±6.4d 17.6±1.5b 8.5±0.8b
实施例11 53.8±3.7ab 113.6±7.8c 19.6±2.4ab 8.1±0.6b
对比例1 － 143.5±13.2b 0.8±0.2d -0.2±0.1f
对比例2 － 147.9±12.5b 0.2±0.3d -0.1±0.2f
对比例3 － 151.6±14.7a 0.3±0.5d -0.1±0.1f
对比例4 4.7±0.5c 143.1±11.4b 2.8±0.9c 1.6±0.5d
对比例5 － 154.8±7.7a 1.5±0.7c -0.4±0.2f
对比例6 5.2±0.3c 146.3±12.2b 3.4±1.3c 1.9±0.6d
对比例7 3.5±0.6c 157.8±11.3a 4.2±1.5c 0.8±0.4e
表5示出了B16-F10细胞黑色素合成抑制试验中，给药各供试品溶液后黑色瘤细胞的黑色素抑制率，以及成纤维细胞增殖实验中各供试品溶液作用后的细胞存活率、Col-I增长率和透明质酸增长率；其中，Col-I增长率和透明质酸增长率分别是实验组相对于未添加供试品溶液的对组组的增长率。表5中，“－”表示未检出。
由表5可知，各供试品溶液作用于小鼠黑色素瘤细胞后，实施例1～11的黑色素抑制率均显著高于对比例1～7，而对比例1～3和对比例5均未检出对小鼠黑色素瘤细胞的黑色素抑制率具有明显的抑制作用。由此说明，本申请实施例提供的经过对马齿苋、芦荟和积雪草发酵后获得的护肤品原料具有更强的抑制黑色素生成的作用，提示其具有应用于减少皮肤黑色素沉积，达到美白亮肤的功效。而单一的马齿苋提取物、芦荟提取物和积雪草提取物对于小鼠黑色素瘤细胞的作用不明显。
由表5可知，各供试品溶液作用于人皮肤成纤维细胞后，细胞的存活率无显著减低，说明本申请实施例提供的经过对马齿苋、芦荟和积雪草发酵后获得的护肤品原料对人皮肤成纤维细胞的增殖无明显抑制作用。而相对于对照组，实验组中实施例1～11提供的各供试品溶液作用于人皮肤成纤维细胞后，其Col-I和透明质酸的表达均显著提高；而对比例1～7提供的供试品溶液作用于人皮肤成纤维细胞后，其Col-I和透明质酸的表达无显著提高，甚至出现负增长。而皮肤下垂、衰老与真皮层的胶原蛋白缺失有关，皮肤的亮度保湿性能也能够决定皮肤的衰老进程，表现为随年龄增加引起的弹性降低以及皱纹产生。由此提示，本申请实施例提供的经过对马齿苋、芦荟和积雪草发酵后获得的护肤品原料具有调控皮肤成纤维细胞对于胶原蛋白和透明质酸的表达，提升皮肤弹性，减少皮肤皱纹，提高皮肤亮度和保湿性能，进而影响皮肤衰老进程。
皮肤实验
一、材料与方法
1、实验动物
Hartley豚鼠，5-6周，雌性，上海甲干生物科技有限公司；饲养温度21±2℃，相对湿度30-70％，光照周期，12/12小时。
2、供试品
本申请以上述实施例经过对马齿苋、芦荟和积雪草发酵后获得的护肤品原料为基础，进一步提供了一种美白护肤膏，该美白护肤膏包含上述的护肤品原料10～18wt％、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯3～5wt％、鲸蜡硬脂醇基葡萄糖苷0.8～2.0wt％、油醇芥酸酯3～3.5wt％、鲸蜡硬脂醇1～1.5wt％、角鳖烷3～5wt％、羟苯丙酯0.1～0.25wt％、甘油3～5wt％、烟酰胺0.5～2wt％、失水山梨醇脂肪酸酯0.25～0.5wt％、丁二醇4.5～5.2wt％、对羟基苯甲酸酯0.2～0.4wt％、香精0.05～0.1wt％和乳酸0.05～0.2wt％，余量为水，pH4.5～5.0之间。
为将该美白护肤膏作为本实验的供试品，将其分为A、B、C、D和E相。其中，A相包含鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯5wt％、鲸蜡硬脂醇基葡萄糖苷1.5wt％、油醇芥酸酯3wt％、鲸蜡硬脂醇1wt％、角鳖烷5wt％、羟苯丙酯0.1wt％；B相包含甘油5wt％、烟酰胺2wt％、失水山梨醇脂肪酸酯0.5wt％和丁二醇5.2wt％，以及余量的水；C相包含经过对马齿苋、芦荟和积雪草发酵后获得的护肤品原料13wt％和8wt％的水；D相包含对羟基苯甲酸酯0.4wt％和香精0.1wt％；E相为乳酸0.2wt％。上述各组分的重量百分比均为占该美白护肤膏的总重量百分比。其中，护肤品原料是由实施例1～11和对比例1～7分别制得的粉末样品提供。
该美白护霜膏的配制方法为：称取A相和B相的各组分，然后分别于不同容器中混合后，在80℃的水浴条件搅拌加热半小时完全溶解；在80℃的水浴条件下，将A相缓慢加入B相后，持续搅拌10min后，用高速剪切分散机在10000rpm下均质3min；然后边搅拌边降温至50℃，加入预先在50℃下混合均匀的C相，搅拌降温至45℃，加入D相各组分，搅拌混合均匀。最后用E相调节体系的pH值在4.8～5.5间，搅拌均匀即可出料。
3、豚鼠色素沉着模型建立
使用SS-04B型紫外线光疗仪建立豚鼠色素沉着模型。照光前电动剃毛刀将豚鼠背部棕黄色长毛剃除，再以女用脱毛膏脱去短毛以充分裸露背部皮肤。将豚鼠置于紫外光疗仪灯具下照射，照射距离40cm，每天照射15min，出现水疤、红肿等，光照暂停至症状缓解，连续照射20d，达到累计照射剂量UVB为1.8mJ/cm2,，豚鼠背部皮肤形成稳定而均匀的色素沉着造模完成。紫外线的照射剂量按公式：照射剂量(J/cm2＝照射强度(W/cm2)×照射时间(s)计算，照射强度通过紫外线辐照计测量来测定。
4、动物分组实验
将建立的模型豚鼠分为模型组、治疗组、阳性对照组，另外设正常的Hartley豚鼠作为正常组。治疗组豚鼠在造模2周后每天于造模皮肤区涂抹供试品0.1g。阳性对照组豚鼠在造模2周后每日于造模皮肤区涂抹0.1g玉兰油新生塑颜金纯而霜(广东宝来实业有限公司)。
连续实验第31天，取材，处死豚鼠，剃毛，常规手术取下实验暴露部位皮肤，一部分浸入10％福尔马林中固定，做好标记并制成病理切片。另一部分皮肤组织制成10％组织匀浆液待测。
5、各组豚鼠皮肤切片制作及观察
制作各组豚鼠皮肤常规石蜡切片，分别进行FeSO4染色，Olumpus显微镜物镜观察，首先测量切片中有盖玻片但无组织块区域作为背景灰度，每张切片随机选择3个视野，每例观察2张切片；由Image-proplus6.0图像软件分析其累积光密度和面积，计算得到平均光密度值(MD)。
6、各组豚鼠皮肤制备检测
皮肤组织样本制备：取各组豚鼠皮肤组织块(0.1～0.2g)，用4℃生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，准确称重，放入5ml的匀浆管中。按重量(g):体积(ml)1:9的比例加入9倍体积PBS于匀浆管中，冰水浴条件下用眼科小剪剪碎组织块。用中通量组织匀浆机匀浆，匀浆时间10s/次，间隙30s，连续10次，在冰水中进行，离心20min左右((2000～3000r/min)，收集上清，即得10％组织匀浆，使得试剂盒检测其中超氧化物歧化酶(SOD，试剂盒YX-C-A500，合肥莱尔生物科技有限公司)、过氧化氢酶(CAT，试剂盒YX-C-A501，合肥莱尔生物科技有限公司)、酪氨酸酶(TYR，试剂盒BC4055，北京索莱宝科技有限公司)、酪氨酸相关蛋白酶-2(TRP-2，赛诺利康生物技术有限公司)的活力测定。
7、数据处理
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对数据进行多重比较和显著性差异标记。
二、结果
如图4～7所示，本实验中的豚鼠经高能紫外线(总量2500mJ/cm2)照射背部后，模型组豚鼠表皮基底层可见大量黑素颗呈粒带状分布，棘层黑素颗粒帽状分布；正常组的黑素颗粒减少，说明模型豚鼠建立成功。治疗组中，实施例1～11提供的供试品涂抹后，其黑色颗粒相对于模型组显著减少；而阳性对照组仍然有较多黑素颗粒。
表6
Figure BDA0003637352220000211
Figure BDA0003637352220000221
表6示出了各实验组豚鼠的皮肤组织切片在显微镜下的平均光密度值，以及皮肤组织匀浆中SOD酶、CAT酶活、酪氨酸酶活和酪氨酸相关蛋白酶-2的酶活水平。由表6可知，相对于正常组，模型组豚鼠皮肤组织切片平均光密度显著升高，再次说明其皮肤组织中黑素颗粒增多，说明造模成功。相对于模型组，实施例1～11提供的美白护肤膏显著涂抹模型豚鼠后，其皮肤组织切片平均光密度显著降低，甚至与正常组相当，再次说明本申请以对马齿苋、芦荟和积雪草发酵后获得的护肤品原料为基础制得的美白护肤膏具有明显的减少紫外线引起的黑素颗粒沉积作用。
由表6可知，相对于模型组，实施例1～11提供的美白护肤膏涂抹模型豚鼠后，其皮肤组织匀浆中SOD酶和CAT酶酶活显著升高，而酪氨酸酶活和酪氨酸相关蛋白酶-2的酶活显著减低，说明以对马齿苋、芦荟和积雪草发酵后获得的护肤品原料为基础制得的美白护肤膏能够激活紫外线至黑素豚鼠皮肤组织中抗氧化酶活，并以抑制酪氨酸酶和酪氨酸相关蛋白酶-2酶活，以此发挥减少皮肤组织黑素沉积和提高其抗氧化的功效。
而治疗组中，对比例1～3提高的美白护肤膏涂抹模型豚鼠后，其皮肤组织切片光密度值不仅无显著降低，其SOD酶和CAT酶酶活无显著升高，酪氨酸酶和酪氨酸相关蛋白酶-2酶活无显著降低，其对豚鼠皮肤组织黑色沉积和抗氧化作用非常有限。
由此说明，相对于实施例，对比例1～3并未对马齿苋、芦荟和积雪草进行发酵，对比例4～7对马齿苋、芦荟和积雪草发酵控制不佳均导致了其制得的护肤品原料中黄酮类化合物含量显著降低，进而导致其制得的美白护肤膏的美白功效欠佳。而本申请实施例利用此三种天然草本植物提取物制备得到了一种成分天然的美白护肤膏，柔滑细腻，能够层层呵护肌肤，使肌肤润滑丝滑，不仅能够美白皮肤，还能保持皮肤莹润亮泽，细腻肌肤柔和肌底，具有很好的市场应用前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种天然植物养护焕颜复配护肤品原料的制备方法，包括以下步骤：
分别制得马齿苋干药材的研磨粉、芦荟液和积雪草干药材的研磨粉；
制备罗伊氏乳杆菌的菌株活化液；所述活化液的活化方法包括：通过从-80℃取出菌株在菌株活化平板上划线培养，挑取形态良好的单菌落接种至菌株活化液体培养基中，37℃恒温培养14h，作为活化的菌种备用；其中，所述菌株活化平板培养基包含：酵母提取物50g/L，葡萄糖10g/L，蔗糖50g/L，柠檬酸铵2g/L，吐温-80 1.5g/L，七水硫酸镁0.58g/L，无水乙酸钠5g/L，四水硫酸锰0.25g/L和琼脂20g/L，调节pH至6.3左右，分装后121℃高压灭菌20min，冷却备用；
制备种子液，所述种子液是将所述活化液以6v/v%的接种量接种至种子培养基，并于37℃厌氧条件下静置培养26 h制得；所述种子培养基包含马齿苋干药材的研磨粉34~62g/L、芦荟液25~36g/L和15~25g/L积雪草干药材的研磨粉、酵母提取物10~25g/L、胰蛋白胨5~14g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10~12g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.5~0.65g/L；
制备发酵液，所述发酵液是将所述种子液以4v/v%的接种量接种至发酵培养基中，调节初始pH7.0，于37℃、100 rpm搅拌转速和1:2(v/v)通气量的培养条件下进行连续培养活菌数不低于100亿CFU/mL为止，即可得到；所述发酵培养基包含马齿苋干药材的研磨粉34~62g/L、芦荟液30~40g/L和20~35g/L积雪草干药材的研磨粉、酵母提取物8~25g/L、胰蛋白胨5~10g/L、葡萄糖10g/L、低聚果糖10~12g/L、柠檬酸铵2g/L、吐温-80 1.5g/L、七水硫酸镁0.58g/L、无水乙酸钠5g/L、四水硫酸锰0.25g/L和L-半胱氨酸0.5~0.65g/L；
对发酵液进程灭菌处理，加入10~15m/v%活性炭，静置过夜后，过滤取上清液，减压浓缩后，冷冻干燥，得到所述护肤品原料；
其中，所述芦荟液为芦荟叶片果肉压制和过滤后的滤液。
2. 一种美白护肤膏，包含权利要求1所述的制备方法制得的天然植物养护焕颜复配护肤品原料10~18wt%、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯 3~5wt%、鲸蜡硬脂醇基葡萄糖苷0.8~2.0wt%、油醇芥酸酯 3~3.5wt%、鲸蜡硬脂醇 1~1.5wt%、角鳖烷3~5wt%、羟苯丙酯0.1~0.25wt%、甘油3~5wt%、烟酰胺0.5~2wt%、失水山梨醇脂肪酸酯0.25~0.5wt%、丁二醇4.5~5.2wt%、对羟基苯甲酸酯0.2~0.4wt%、香精0.05~0.1wt%和乳酸0.05~0.2wt%，余量为水，pH4.5~5.0之间。
3.权利要求1所述的制备方法制得的天然植物养护焕颜复配护肤品原料在制备美白领域化妆品中的应用。
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