KR960005736B1

KR960005736B1 - 히아루론산의 신규 생산방법

Info

Publication number: KR960005736B1
Application number: KR1019870003999A
Authority: KR
Inventors: 히데오 호소야; 마사유끼 기무라; 히로시 엔도; 요시오 히라끼; 쇼지 야마모또; 사또시 요시까와; 히데다까 오미네; 고지 미야자와
Original assignee: 가부시끼가이샤 야쿠르트혼샤; 마쯔조노 히사미
Priority date: 1986-05-01
Filing date: 1987-04-25
Publication date: 1996-05-01
Also published as: EP0244757A3; AU7196087A; US5023175A; DE3750733D1; EP0244757A2; EP0244757B1; AU598809B2; DE3750733T2; CA1314508C; KR870011252A

Abstract

내용 없음.

Description

히아루론산의 신규 생산방법

제1도는 본 발명의 실시예 2의 히아루론산 생산 박테리아의 배양과정을 나타내는 도면이다.

제2도는 실시예 3의 배양과정을 나타내는 도면이다.

제3도는 실시예 2에서 얻어진 고분자 히아루론산의 IR 흡수 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

제4도는 고분자 히아루론산의 NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.

제5도에서 제7도는 실시예 4의 화장수들을 각각 사용한 후 경시변화에 따른 표피에서의 수분함량의 변화를 도표상에 나타낸 것이다.

제8도는 실시예 5의 화장수들을 각각 사용한 후 시간 경과에 따른 표피에서의 수분 함량의 변화를 도표상으로 나타낸 도면이다.

제9도와 제10도는 실시예 6의 화장수들을 각각 사용한 후 60분까지의 표피에서의 수분함량의 평균값을 도표상으로 나타낸 도면이다.

본 발명은 히아루론산의 신규 생산방법에 관한 것이다. 히아루론산은 동물의 모든 연결조직에 존재하는 것으로 알려졌으며 공업적으로는 닭의 볏과 소라의 제강(umbilicus) 같은 생체 조직으로부터 추출에 의하여 얻어지고 있다. 히아루론산은 세포들 사이의 수분을 유지하고, 세포의 형태를 유지하기 위하여 세포들 사이에 겔 같은 세포 간질을 형성하며, 물질의 세포간 이동을 조절하며, 외부의 물리적 충격 또는 외부 박테리아의 감염으로부터 세포를 보호하는 등의 여러 가지 기능들을 갖는 것으로 알려졌다. 히아루론산은 상술한 기능들을 효과적으로 사용하여 약품(관절염 치료제, 안염 치료제, 외상용약 등), 화장품 등에 사용되고 있다. 그러나 히아루론산의 분리 및 정제과정이 복잡하므로, 생체조직으로부터 추출에 의한 히아루론산의 생산은 대량 생산으로는 부적절하며, 비용이 많이 든다. 상기 사실은 히아루론산의 효용성을 개발하는 데 심각한 장애 요인이 된다.

히아루론산 생산 박테리아로는 스트렙토코쿠스(streptococcus) 박테리아 중에서 란스필드(Lancefield) 분류법 상으로 그룹 A, C 그리고 D에 속하는 박테리아, 예를 들어 스트렙토코쿠스 피요제네스, 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스, 스트렙토코쿠스 에퀴, 스트렙토쿠쿠스 에퀴시미리스, 스트렙토코쿠스 디스갈락티에, 스트렙토코쿠스 페칼리스, 변종 자이모게네스, 파스테우렐라, 물코시다 등이 알려져 있다. 히아루론 산의 생산은 예를 들어, 켄달[F. E. Kendall et. al., J. Biol. Chem., 118, 61 (1937)], 피얼스[W. A. Pierce et al., J. Bact., 63, 301 (1952)], 맥렌난{A. P. MacLennan, J. Gen. Microbiol., 14, 134-142 (1956); J. Gen. Microbiol., 14, 134-142 (1956); J. Gen. Microbiol., 15, 485-491(1956)], 홀름스퇴름[B. Holmstrom et al., Appln. Microbiol., 15, 1409-1413 (1967)], 울코크[J. B. Woolcock, J. Gen. Microbiol., 85, 372∼375 (1974)], 크젬스[E. Kjems et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 84, 162-164 (1976)], 베르간[T. Bergan et al., Acta Path. Microbiol. Scan., 75, 97-103 (1969)] 그리고 시포넬리[J. A. Cifonelli, Carbohyd. Res., 14, 272∼276 (1970)] 등에 의하여 이미 보고되었다. 그리나 상기 논문들의 목적은 히아루론산의 대량생산이 아니었다. 배양은 탄소원으로 글루코오즈를 1-1.5% 농도로 사용하여 수행되었다. 히아루론산의 수율은 0.5-0.6g/ℓ 이하, 즉 글루코오즈에 대하여 6% 이하였다. 맥렌난은 상기 논문에서 스트렙토코쿠스 박테리아에서 란스필드 분류법상으로 그룹 C에 속하는 박테리아의 1종을 호기성 배양함으로써 히아루론산의 생산을 가속화할 수 있는 가능성에 대하여 보고하였다. 상술한 히아루론산 생산 박테리아 중에서, 스트렙토코쿠스 박테리아에서 란스필드 분류법상으로 그룹 A 박테리아와 파스테우렐라 박테리아는 인체의 병원균으로, 실제적으로 대량 배양에는 부적당하다.

일본국 특허 공개 제 56692/1983호에는 스트렙토코쿠스에 속하는 히아루론산 생산 박테리아를 배양한 배양액으로부터 히아루론산을 추출, 정제하는 공업적인 방법이 제시되어 있다.

상기 방법에서는 히아루론산을 얻기 위하여 스트렙토코쿠스 박테리아에서 란스필드 분류법상으로 그룹 A 또는 C에 속하는 박테리아 1종을 대량으로 배양하였다. 배양액에 탄소원으로 글루코오즈 8% 농도로 가하고, 배양하여 히아루론산을 4g/ℓ의 수율로 얻었다. 상기 방법에서 히아루론산의 수율은 글루코오즈에 대하여 5%였으며, 수율은 글루코오즈의 첨가 농도를 1 내지 8%로 변화시켰을 때도 동일하였다. 그러므로, 상기 논문의 히아루론산 생산 박테리아와 비교하여 글루코오즈에 대한 히아루론산의 수율은 실제적으로 차이가 없다. 스트렙토코쿠스 박테리아를 이용하여 히아루론산을 생산하는 다른 방법으로는 일본국 특허 공게 제500597/1985호, 제133984/1985호, 그리고 제15698/1986호를 참조할 수 있다. 그러나, 상기 방법들은 얻어지는 히아루론산이 저분자량이거나 또는 수율이 낮다는 1가지 이상의 문제점을 갖고 있다. 또한, 상기 히아루론산 생성 박테리아 균주는 스트렙톨리신(가용성용혈소)을 생성하고 β-용혈현상을 나타내는 것으로 알려졌다. 그러므로 상기의 박테리아를 대량으로 배양하여 히아루론산을 생산할 경우 용혈소 생성물, 즉, 히아루론산에 혼합될 수 있는 잠재적인 위험이 있으며, 상기 히아루론산를 화장품 또는 약품에 첨가하는 것은 바람직하지 못한다.

상술한 결점을 개선하기 위하여 일본국 특허 공개 제251898/1985호에는 히아루론산 생성 박테리아 균주에서 변이유발소(mutagen)로 돌연변이를 일으켜 스트렙톨리신 생성 능력을 제거한 후, 세포를 배양하여 히이루론산을 얻는 방법이 개시되어 있다. 상기 특허에서는 6%의 글루코오즈를 첨가함으로써 히아루론산을 3.6g/l의 수율로 얻었으며, 따라서 글루코오즈에 대하여 히아루론산의 수율은 6%이다. 그러므로 글루코오즈에 대한 히아루론산의 생산성은 수율면에서 아직도 낮다.

한편, 외부의 자극과 피부 균열로부터 피부를 보호하고 화장품을 피부에 바를 때 사용감을 개선하기 위하여 폴리올, 피부성분 그리고 바이오폴리머 같은 습윤제(보습제)를 화장품에 첨가한다.

상기 피부 성분 중에서 히아루론산이 피부의 수분을 유지하는 작용에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 근래에는 화장품에 첨가되어 뛰어난 보습효과를 나타내고 있다[Fragrance Journal, 79, 64-71 (1986)]. 그러나 종래에 화장품에 첨가되는 히아루론산은 분자량이 300,000∼1,500,000으로 작으며, 습윤효과도 완전히 만족스럽지 못하였다.

그러므로, 본 발명의 목적은 박테리아 균주를 이용하여 히아루론산의 대량생산에 적절한 경제적이고 효율적인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에서 실제적으로 이용되는 박테리아 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 히아루론산을 함유하며, 보습효과가 뛰어나고, 사용감이 탁월한 화장품을 제공하는 것이다.

상술한 여건 하에서 본 발명자들은 히아루론산의 생산에 대하여 광범위한 연구를 한 결과 자연으로부터 분리한 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스의 히아루론산 생성 박테리아에 돌연변이를 일으켜 얻은 박테리아 균주에서 한번 더 돌연변이를 일으킴으로써 얻은 박테리아 균주는 용혈현상을 나타내지 않으며, 히아루로니다제 생산 능력을 갖기 않고, 높은 히아루론산 생산 능력을 갖는다는 사실을 발견하였다. 상술한 박테리아 균주를 이용하여 생산되는 히아루론산은 종래의 히아루론산과 비교하여 분자량이 더 크며, 즉 분자량이 2,000,000 이상이며 뛰어난 보습효과를 갖는다. 상기의 하이루론산을 첨가함으로써 뛰어난 보습효과와 사용감이 탁월한 화장품을 제조할 수 있다.

본 발명은 후술하는 과정을 포함하는 히아루론산 생산방법을 제공하는 것이다: (a) 히아루론산 생산 능력을 가지며, 히아루로니다제를 생성하지 않고, 비용혈성인 스트렙토코쿠스에 속하는 균주를 배지에서 배양하고; (b) 배양액으로부터 히아루론산을 수집한다.

본 발명의 다른 목적은 히아루론산 생산 능력을 가지며, 히아루로니다제를 만들지 않고, 비용혈성인 스트렙코쿠스 주에피데미쿠스를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 분자량이 최소한 2,000,000 이상인 히아루론산 또는 그의 염을 함유하는 화장품을 제공하는 것이다.

본 발명의 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스의 돌연변이종은 종래에 보고된 스트렙토코쿠스 박테리아에서의 히아루론산의 생산 방법보다 훨씬 높은 수율과 생산성, 그리고 낮은 단가로 스트렙톨리신이 완전히 제거된 고분자량의 히아루론산을 생산한다.

본 발명의 방법에 의하여 생산되는 히아루론산은 화장품과 약품의 원료로서 이상적이다. 특히 화장품에 첨가할 경우, 분자량 2,000,000 이상의 본 발명의 히아루론산은 종래 사용된 분자량 1,500,000 이하의 히아루론산에 비하여 습윤효과가 훨씬 월등하다. 그러므로, 본 발명의 히아루론산을 첨가한 화장품은 습윤 효과가 높으며, 사용감, 예를 들어 피부에서의 퍼짐성, 피부의 보습감, 피부의 부드러움 등이 매우 양호하다.

본 발명의 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스는 히아루론산 생성능력을 가지며, 히아루론니다제를 생성하지 않고 비용혈성으로, 예를 들어 후술하는 방법으로 얻을 수 있다.

첫째, 높은 히아루론산 생산성을 가지며, 란스필드 분류법상으로 그룹 C에 속하는 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스를 코의 점막으로부터 얻는다[the identification of the bacterium was conducted following Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition (1974)], 맥렌난이 지적(MacLennan, J. Gen. Microbiol., 14, 134-142 (1956)]한 바와 같이, 상기 박테리아 균주는 호기성 조건 하에서 히아루론산 생성이 매우 양호하며, 글루코오즈를 탄소원으로 사용하는 경우 4% 농도의 글루코오즈를 첨가하면 히아루론산을 2g/l얻는다(글루코오즈에 대하여 히아루론산의 수율은 5%임). 상기에서 얻어진 히아루론산의 분자량은 300,000∼600,000이다. 통상적인 방법[Bacteria/Phage Genetic Laboratory Techniques, Special Edition of "Proteins-Nucleic Acids-Enzymes", The Kyoritsu Publishing Co., Ltd. (1972)]애 의하여, 박테리아 균주는 자외선 또는 변이유발소{N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethyl methansulfonate, or the like]로 처리한다. 상기 처리딘 세포들을 혼합하고 블리드 아가(blood agar) 배지에 접종한다. 용혈현상을 나타내지 않는 박테리아 집락(colony)을 회수한 후, 박테리아에 다시 돌연변이를 유발시켜, 히아루론산을 함유하는 뉴트리언트 아가(untrient agar) 배지상에 코팅한다. 히아루론산이 분해되지 않은 박테리아 집락을 회수하여 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 변종을 얻는다(후술하는 실시예1 참조).

얻어진 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스의 돌연변이중 (이하 "본 발명의 박테리아"로 칭함)은 매우 점성이 강하며 토드-휴이트(Todd-Hewitt) 고형 배지상에서 투명한 박테리아 집락을 이룬다. 상기 박테리아는 비용 혈성이고 (β-용혈현상:음성), 히아루로니다제를 만들지 않으며, 란스필드 분류법상으로 그룹 C에 속하는 스트렙토코쿠스 박테리아이다. 본 발명의 박테리아는 후술하는 사상균학적(mycological) 특정을 갖는다.

(a) 그람(Gram)균주: 양성

(b) 10℃에서서의 성장: 음성

(c) 45℃에서서의 성장: 음성

(d) 0.1% 메틸렌 블루 내성: 음성

(e) 6.5% 식염수 내성: 음성

(f) 40% 담즙 내성: 음성

(g) 바시트라신(Bacitracin)내성: 양성

(h) pH 9.6에서의 내성: 음성

(i) 60℃에서 30분간 처리시 내성: 음성

(j) 젤라틴 액화성: 음성

(k) 전분 분해성: 양성

(l) 힙퓨레이트 나트륨 분해성 음성

(m) 에스쿨린(Esculin)분해성: 약한 양성

(n) 아르기닌 분해성: 양성

(o) 당 발효성:

글루코오즈, 갈락토스, 자당, 유당, 맥아당 소르비톨 및 살리신: 양성

글리세린, 만니톨, 트레할로스 및 아라비노스: 음성

상술한 본 발명의 사상균학적 특성으로부터, 본 발명자들은 본 발명의 박테리아를 "스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 YIT 2030"라고 명명하고, 상기 박테리아를 FERM BP-1305로 발효 연구소(Fermentation Research Institute), 국제기탁기관인 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물공업기술연구소에 1986년 4월 23일 기탁하였다. (또한 이 균주를 한국종균협회에 1987년 6월 9일에 기탁(기탁번호 KFCC-10379)하였다.)

후술하는 내용은 본 발명의 박테리아를 배양하고, 배양애으로부터 분자량 2,000,000 이상의 히아루론산을 회수하는 방법에 관한 것이다.

히아루론산을 생산하기 위하여 본 발명의 박테리아의 배양에 사용하는 배지는 바람직하게는 탄소원, 유기와 무기 질소원을 포함하며, 필요한 경우 무기염류와 유기 미량영양소를 포함한다. 탄소원으로는 글루코오즈, 갈락토스, 자당, 유당, 과당, 맥아당, 소리비톨 또는 전분 가수분해물과 같은 당 또는 그의 유사물을 사용하는 것이 바람직하며, 또한 대용품으로 유기산, 지방족 알코올 등을 사용할 수도 있다.

질소원으로는, 통상의 물질을 유기 및 무기 질소원으로 사용할 수 있다. 그러나 다양한 육즙류, 아미노산 혼합물류, 펩톤, 효모 추출물 등이 바람직하다. 또한 필요한 경우, 염산, 황산, 인산, 질산 그리고 탄산 등의 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 철염과 비타민류를 1종 이상 첨가할 수도 있다.

호기성 조건은 배양에 필수적인 요인으로 배양액의 점도가 증가함에 따라 교반 속도를 증가시키는 것이 바람직하나, 과도한 교반은 바람지하지 못하다. 배양온도는 본 발명의 박테리아가 성장할 수 있는 25∼38℃가 바람직하다. 본 발명의 박테리아는 배양 중에 젖산을 만들어 내고, 본 발명의 박테리아의 성장과 히아루론산의 생성은 젖산에 의해 모두 억제되므로 배양액의 pH를 6∼8의 범위내로 유지하기 위하여 젖산을 증화할 수 있는 알칼리 수용액을 더하는 것이 좋다. 그 예로는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨의 수용액, 또는 암모니아수를 들 수 있다.

본 발명의 박테리아는 고분자량의 하이루론산(분자량:2,000,000 이상)을 매우 높은 수율과 생산능력으로 생산한다. 글루코오즈를 탄소원으로 사용하는 경우, 특히 좋은 결과를 얻을 수 있다. 글루코오즈를 첨가함으로써 목적하는 생성물 즉 히아루론산의 생산성을 상당히 증진시킬 수 있으며, 글루코오즈주는 0.5-6% 농도로 첨가함이 바람직하다.

본 발명의 박테리아의 경우 배양액 중에 히아루론산 이외의 고분자 물질이 축적되지 않는다. 그러므로 배양후 배양액 중에 축적된 히아루론산을 용이하게 분리 및 정제할 수 있다. 상기 과정은 공지의 다량류의 분지 및 정제 방법에 의해 수행될 수 있다.

히아루론산의 분리 및 정제방법은 후술하는 실시예에서 설명한다. 배양액의 점도를 적당한 수준(바람직하게는 100 cps 이하임)으로 낮추기 위하여 물로 희석하고, 트리클로로아세트산으로 pH를 4 이하로 조정한 후, 원심분리 또는 막 여과(구멍크기:0.2㎛ 이하)로 세포들을 분리 제거한다. 용액 중에 용해되어 있는 저분자 물질들을 울트라여과(ultrafitration), 투석, 유기용매 침전 또는 이온교환수지에의 흡착등의 방법으로 제거한 후, 분자량 2,000,000 이상의 히아루론산을 유기 용매에 의한 침전, 동결 건조 또는 스프레이 건조 등의 방법으로 얻을 수 있다. 히아루론산의 표준 샘플(분자량: 약 630,000:시그마 화학 주식회사 제품)과 비교하여 상술한 배양액으로부터 추출 정제하여 얻는 히아루론산에 대해서 광범위한 조사를 실시한 결과, 생성물이 히아루론산임이 확인되었다.

히아루론산의 특성은 후술하는 바와 같다.

(1) 셀루로오즈 아세테이트 막을 사용하는 전기영동 실험에서 샘플과 동일한 이동성(mobilty)을 나타냈다.

(2) 악티노마이세트(Actinomycetes)의 히아루로니다제(아미노 제약회사 제품)에 의하여 분해되었다. 분해 생성물을 실리카 겔 판상에서 얇은 막 크로마토그래피 하였을 때, 같은 방법으로 처리한 샘풀의 분해 생성물의 TLC 상에서 나타낸 위치와 동일한 위치에서 2개의 점이 나타났다.

(3) 분해 생성물의 화학 조성을 분석하였을 때, N-아세틸-D-글루코오즈아민과 D-글루쿠론산이 1:1의 몰비로 존재하는 것으로 밝혀졌다.

(4) 비선광도(specific rotatory power) [α]20D=-69°

(5) 얇은 막 방법(thin film method)에 의한 히아루론산의 자외선 흡수 스펙트럼을 제3도에 나타내었으며, 이것은 샘플의 자외선 흡수 스펙트럼과 동일하다.

(6) 히아루론산을 중수에 용해하여 측정한 13C-NMR 스펙트럼을 제4도에 나타내었으며, 이것은 샘플의 13C-NMR 스펙트럼과 동일하다.

(7) 히아루론산의 분자량을 점도 측정법 [T. C. Laurent at al., Biochim. Biophys. Acta, 42, 476-485(1960)]에 의해 측정한 결과 2,000,000 내지 3,000,000인 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 화장품에 분자량 2,000,000 이상의 상술한 히아루론산 또는 그의 염을 0.005-3.0 중량% (이하 간략히 "%"로 나타냄)의 분량으로, 특히 0.05-2.0%로 가하는 것이 바람직하다. 히아루론산의 염의 예로는 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 마그네슘, 칼슘염, 리신염, 암모늄염, 트리에탄올아민염, 프로판올아민염 등을 언급할 수 있다.

본 발명의 화장품은 예를 들어 여러 종류의 크림류, 밀크로션, 화장수, 에센스, 팩, 모발린스, 모발 트린트먼트, 샴푸, 립스틱, 파운데이션, 모발 성장 촉진제 등의 원하는 형태로, 상술한 히아루론산을 화장품에 통상적으로 사용하는 여러 종류의 오일류, 계면활성제, 방부제, 점성 조정제, 의약상 효능이 있는 물질, 향료, 알코올, 물 등과 그리고 필요한 경우 다른 습윤제와 배합하여 적절히 첨가함으로써 제제화 할 수 있다.

후술하는 특정 물질들은 상술한 첨가 성분들의 예로 들 수 있다는 것이다: 오일류로 광물유, 페트롤라튬, 파라핀 왁스, 스쿠알렌, 밀랍, 고급알코올, 지방산 등이 있으며; 계면활성제로 폴리옥시에틸렌 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린 지방산에스테르, 폴리옥시에틸렌-수첨 피마자유, 폴리옥시에틸렌소르비톨 지방산에스테르류 등이 있으며; 알코올로 에탄올 등이 있으며; 점도 조정제로 카르복시메틸셀루로오스, 히드록시에틸셀루로오스, 폴리비닐알코올, 카르복시비닐폴리머, 크산탄 고무(xanthan gum)등이 있으며; 습윤젤로 소르비톨, 글리세린, 유산균의 배양액, 1,3-부틸렌 글리콜, 나트륨 피롤리돈카르복실레이트, 나트륨락테이트, 폴리에틸렌글리콜 등이 있으며; 방부제로 알킬 파라-히드록시벤조에이트, 나트륨벤조에이트, 칼슘소르비테이트 등이 있으며; 의약상 효능이 있는 물질로는 비타민, 소염제, 살균제 등이 있다.

상술한 임의의 성분들 중에서 유산균의 배양액이 첨가된 화장품은 특히 양호한 보습 효과와 사용감을 갖는다.

본 발명에서 사용하는 유산균의 배양액은 통상적인 방법으로 즉, 우유 같은 가축의 젖으로 주로 이루어진 배양액에 유산균을 접종하고, 유산 발효를 한 후 배양액으로부터 유장(milk serum)을 회수하여 만들어질 수 있다.

유산균으로는 예를 들어 락토바실루스 에시도필루스, 락토바실루스 불가리쿠스, 락토바실루스 카제인 또는 스트렙토코쿠스 써모필루스를 사용할 수 있다. 배양액으로 사용되는 가축의 젖으로는 모유, 우유, 양젖 등이 있다. 또한 가축의 젖의 탈지유, 또는 분유(탈지분유 포함)을 조제한 우유를 사용할 수 있다. 이 중에서 탈지유 또는 조제 분유는 유산 발효 후의 처리가 용이하므로 특히 바람직하다. 배양액에 가축의 젖 이외에 유산균의 성장을 촉진시키는데 효과적인 글루코오즈 또는 자당을 첨가하는 것이 바람직하며, 특정한 배양 조건을 사용할 필요는 없다. 표준조건으로, 상술한 배양액을 115℃에서약 15분(또는 110℃에서 90분) 동안 가열 멸균한 후 유산균을 접종하고 37℃에서 2∼3일 동안 유산균을 배양한다.

배양액으로부터 여과 또는 웜심분리에 의해 유장을 회수한다. 얻어진 유장, 즉 유산균의 배양액은 그대로 사용할 수도 있다. 그러나 유장은 독특한 냄새를 가지므로, 본 발명에서는 유장을 방향 성분이 실질적으로 제거될 때까지 유장의 일부를 증류하여 제거하는 일본국 특허 공재 제192811/1983호의 방법과 같이 유장을 사용하기 이전에 감압하에서 가열하는 것이 바람직하다. 또한 유산균의 배양액을 농축액의 형태로 사용할 수도 있다.

유산균의 배양액은 농도와 화장품의 형태에 따라 사용량이 변할 수 있지만, 바람직하게는 0.1∼90% 분량으로 사용한다.

본 발명의 고분자 히아루론산과 유산균 배양액에 1,3-부틸렌글리콜을 첨가하는 경우 습윤 효과는 더욱 증가된다. 1,3-부틸렌글리콜을 바람직하게는 0.05∼20% 분량으로 더욱 바람직하게는 1∼10%로 첨가한다.

본 발명을 다음의 실시예에서 상세히 설명하면, 본 발명은 후술하는 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

[실시예 1]

β-용혈현상을 나타내고 히아루로니다제와 히아론산을 생선하는 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스를 소의 코 점막으로부터 얻어내어, 토드-휴이트 고형배지(디프코사 제품)상에서 37℃에서 10시간 동안 배양한다. 로그 성장기의 세포를 원심분리하여 회수한다. 저온에서 원심분리를 반복하면서 멸균 상태에서 세포들을 0.05M 트리스-말레산 완충액(pH 6.0)으로 2회 세척한다. 세척된 세포를 새로 만든 상기 완충액에 1×10⁸세포/㎖의 농도로 분산시키고, MNNG를 200 ㎍/㎖ 농도로 가한다. 얻어진 혼합물을 37℃에서 30분 동안 교반한다. 저온에서 세포를 0.05M 트리스-말레산 완충액(pH 6.0)으로 2회 세척한 후, 토드-휴이트 배지에 접종하고 37℃에서 18시간 동안 배양한다. 얻어진 배양액을 멸균 식염수로 1×10³세포/㎖ 농도가 되도록 희석한다. 희석한 세포 배양액 0.1 ㎖을 블러드(피브린을 제거한 토끼혈액) 고형배지(20 ㎖)에 혼합 희석한 후 세포를 배양하고 용혈 현상을 나타내지 않는 박테리아 집락을 모은다. 동열변이종의 발생 빈도는 40×10^-6이다. 상술한 과정과 동일한 방법으로, 비용혈성의 박테리아 균주를 토드-휴이트 배지에서 37℃에서 배양하고 로그 성장기에서 세포를 수집한다. 세포를 0.05M 트리스-말레산 완충액(pH 6.0)으로 세척한 후 200 ㎍/㎖의 MNMG가 첨가된 새로 만든 상기 완충액 중에서 37℃에서 20분 동안 교반한다.

저온에서 상기 완충액으로 세포를 세척한 후, 울트라 여과된 배지(아미콘 회사 제품인 "YM-10" 울트라 여과막으로 토드-휴이트 배양액 중의 고분자 물질들을 제거하여 얻음)에 접종하고 37℃에서 18시간 동안 배양한다. 얻어진 배양액을 1∼5×10²세포/㎖의 농도가 되도록 멸균한 생리 식염수로 희석한다. 0.1% 나트륨히아루로네이트(분자량:약 630.000; 시그마 회사 제품)를 함유하는 상술한 울트라 여과된 고형배지(고순도의 한 천사용)에 상기 희석한 배양액 0.1㎖를 코팅한다. 세포를 습실(moisture chamber)에서 20∼40시간 동안 37℃에서 배양한다. 성장한 집락의 세포를 리플리카 플레이팅(replica plating) 방법으로 모든다. 한천에 10% 세틸 피리디니움 클로라이드 수용액을 분무한다. 500,000 개의 세포로부터 불투명한 주변을 갖는 집락을 형성하는 히아루로니다제를 만들지 않는 세포인 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 YIT 2030을 얻었다.

상술한 박테리아 균주의 히아루로니다제 생성여부의 확인은 에리카-발케 등의 방법을 보완 수정하여 실시하였다[Erika-Balke et al., Zbl. Bakt. Hyg. A, 259, 194-200, (1985)].

[실시예 2: [뱃치(batch)식 배양]]

10ℓ 용량의 발효기에 하기 조성의 배양액(pH 7.0)을 넣는다: 글루코오즈 6%, 폴리펩톤[대고 에이요 카가구(Daigo Eiyo Kagaku K. K.)사 제품] 1.5%, 식용효모 추출물 (오리엔탈이스트 주식회사 제품) 0.5%, 수소 인산 2칼륨 0.2%, 마그네슘 술페이트 6수화물 0.1%, 염화칼슘 0.005% 그리고 "아데카놀(Adekanol) LG-09" (상표명;소포제;Asahi Denka Kogyo K. K 제품), 0.001%를 포함한다. 배양액을 멸균한 후, 배양한 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 YIT 2030 1% 용액을 배양액에 접종한다. 6N 수산화나트륨 수용액으로 배양액의 pH를 7로 계속 조정하면서 37℃에서 통기, 교반하면서 박테리아를 42시간 동안 배양한다. 글루코오즈는 별도로 멸균하여, 배양을 시작할 때 가한다. 배양과정을 제1도에 나타내었다. 배양을 계속함에 따라 더 많은 양의 히아루론산이 축적된다. 배양 후 29시간이 지나면, 배양액의 점도는 약 8,000cps로 증가하고 배양액은 거의 유동성을 나타내지 않는다. 배양을 시작한 후 42시간이 경과하면서 배양액 중의 글루코오즈의 농도가 0에 이르면 배양을 중단한다.

얻어진 배양액은 유동성이 없으므로, 점도가 100cps 이하가 되도록 물로 희석한다. 상기 희석한 용액을 트리클로로아세트산으로 pH를 4로 조정한 후 중공섬유(hollowfiber)마이크로필터 모듈("PW-103"; 아사히 화학공업 주식회사 제품)을 통과시켜 세포와 불용성 성분들을 제거한다. 여액을 내부 용액으로 물을 넣은 중공섬유 울트라 여과막("HIP30-42"' 아미콘 회사 제품)을 통과시켜 저분자 물질을 제거한다. 얻은 용액을 동결건조시키면 배양의 11당 히아루론산 6.7g이 얻어진다. 얻은 히아루론산의 분자량은 약 2,160,000 이다(점도 측정법으로 측정함).

[실시예 3: (연속배양)]

10ℓ 용량의 발효기에 글루코오즈의 농도를 2.5%로 변경한 이외에는 실시예 2와 동일한 조성으로 이루어진 배양액을 넣는다. 멸균 후(글루코오즈는 별도로 멸균함, 배양한 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 YIT 2030을 1% 분량으로 접종한다. 6N 수산화나트륨 수용액으로 배양액의 pH를 7로 조정하면서, 통기, 교반을 하면서 37℃에서 15시간 동안 박테리아를 배양한다. 글루코오즈 농도를 2%로 변경한 이외에는 실시예 2와 동일한 조성의 배양액을 0.3 hr^-1의 희석 속도로 계속 주입하면서 통기와 교반하에 37℃, pH 7에서 1주일 동안 연속배양을 수행한다. 배양과정을 제2도에 나타내었다. 배양탱크에서 나오는 배양액을 주기적으로 수집하고,히아루론산(분자량:점도 측정법으로 측정한 결과 약 2,160,000임)을 실시예 2에서와 동일한 방법으로 추출, 정제한다. 히아루론산의 수율은 글루코오즈에 대하여 15%이며, 생산성은 0.9 g/ℓ/시간으로 1일에 히아루론산을 21.6 g/ℓ으로 얻은 것이 가능하다.

[실시예 4]

표 1에 기재된 조성의 화장수를 제조하여, 타가미 등에 의해 제안된 전기적 측정법 [Tagami et al., J. Invest. Dermatio., 75, 500-507 (1980)]을 개선한 표피의 유전상수(dielectric constant)측정법 [Karl Mosle, Sonderdruck aus Parafumerie und Kosmetik, 64, 375∼379 (1983)]에 의하여 상기 화장수를 인체 피부에 바를 때의 습윤 효과를 조사한다.

표 1에서는 닭볏(테이코쿠 호르몬 Mfg. 회사 제품)에서 얻은 히아루론산을 저분자 히아루론산으로 사용하고 실시예 2의 생성물을 고분자 히아루론산으로 사용하였다.

표 1에 기재된 수치는 모두 중량%를 나타내는 것이다.

[표 1]

시험방법:

건강한 남자(27세)의 팔뚝의 안쪽 피부를 피누로 씻은 후, 오른팔과 왼팔 각각에 3곳의 조사부의 즉 전체적으로 6군데의 조사부위를 4×4cm 면적으로 표시한다.

30분 후, 화장수를 바르기 이전에 각각의 조사 부위에서 표피의 유전상수를 표피의 수분 분석기("SKICOS 3"; 아믹 그룹 제품; 프로우브 지름; 16mm)로 3회 측정하여 평균값을 계산한다. 즉시 각각의 조사부의 (16cm2)에 샘플 화장수 30μl를 손가락으로 가능한 한 균일하게 바른 후, 표피의 유전 상수를 주기적으로 3회 측정하여 평균값을 계산한다. 표피의 수분 함량을 상술한 문헌 [Karl mosler, Sonder-druck aus parfumerie und Kosmetik 64, 375-379 (1983)]에 따라서 표피의 유전상수로부터 각각 계산한다. 샘풀을 바르기 이전의 표피의 수분함량을 0으로 나타내고 표피의 수분함량의 변화를 나타내었다.

조사부위들 사이의 차이와 다른 에러 요인들을 최소화하기 위하여, 화장수를 바르는 조사부위를 바꾸어서 상기의 측정을 6회 반복하고 평균값을 사용한다. 상술한 측정 과정에서 실온을 27∼29℃로, 상대습도를 45∼70%로 유지한다.

시험결과:

결과를 제5도∼제7도에 나타내었으며, 표피의 수분 함량이 높으면 습윤효과가 높은 것을 나타낸다. 고분자 히아루론산을 함유하는 본 발명의 화장수는 저분자 히아루론산을 함유하는 비교용 제품보다 습윤효과가 월등하다.

[실시예 5]

표 2에 기재된 조성의 화장수를 제조하여 인체 피부에 바른다. 습윤효과는 표피의 수분 함량으로 조사한다.

표피의 수분함량은 실시예 4와 동일한 방법으로 측정한 표피의 유전 상수로부터 구한다. 샘플을 바르기 이전의 표피의 수분 함량을 0으로 나타내고, 표피의 수분함량의 증가분을 제8도에 나타내었다. 측정시의 상대 습도는 44±2%로 실온은 26±1℃로 유지한다.

표 2에서, 분자량 약 780,000의 히아루론산(데이코쿠 호르몬 Mfg. 주식회사 제품)을 저분자 히아루론산으로 사용하고 실시예 2의 생성물을 고분자 히아루론산으로 사용하였다.

표 2에 기재된 수치는 중량%를 나타내는 것이다.

[표 2]

결과적으로, 저분자 히아루론산을 함유하는 화장수와 비교하여 본 발명의 화장수들은 모두 탁월한 보습효과를 나타낸다.

[실시예 6]

표 3에 기재된 조성의 화장수를 제조하여 실시예 4와 동일한 방법으로 표피의 수분 함량을 측정하였다. 화장수를 바른 후 10,20,30,45 그리고 60분에서의 표피의 수분 함량의 평균값을 제9도와 제10도에 각각 나타내었다. 측정시 상대습도는 27±7%, 실온은 26±2℃로 유지하였다. 표 3와 4에서 분자량 780,000의 히아루론산을 저분자 히아루론산으로 사용하고, 실시예 2의 생성물을 고분자 히아루론산으로 사용하였다. 젖산균 배양액으로 방향 성분을 제거한 유장[0.016g (건조 중량(/㎖의 분량]를 사용하였다. (이후의 실시예에서도 동일한 유장을 사용함)

[표 3]

[표 4]

상기의 결과로부터 고분자 히아루론산을 함유하는 화장수는 저분자 히아루론산을 함유하는 화장수보다 습윤 효과가 탁월하며, 1,3-부틸렌 글리콜을 부가적으로 함유하는 본 발명의 화장수는 더욱 양호한 습윤 효과를 나타낸다.

[실시예 7]

표 5에 기재된 조성의 화장수를 제조하여 사용감을 측정하였다. 표 5의 수치는 중량%를 나타내는 것이다.

[표 5]

평가 방법 및 결과:

표 5에 기재된 각각의 화장수를 10명(남자 5명, 여자 5명)의 손등에 정한 분량 만큼 바른다. 피부에서의 퍼짐성, 마찰감, 끈끈함, 고감도, 부드러움 그리고 습윤효과에 대하여 조사 대상 각각에서 질문을 하여 평가한 결과, 본 발명의 제품 10은 비교용 제품 7과 8에 대하여 사용감이 현저하게 우수하였다. 본 발명의 제품 9는 비교용 제품 7보다 사용감이 월등히 우수하며, 비교용 제품 8과 사용감이 비슷하였다. 그러므로, 본 발명의 제품에 첨가된 고분자 하이루론산은 종래의 저분자 하이루론산에 비하여 후자의 1/4 분량을 사용하였을 경우 비슷한 효과를 나타낸다.

[실시예 8]

하기 조성의 밀크 로션을 제조하여 사용감을 평가한다.

조성 :

평가 방법 및 결과:

고분자 나트륨 히아루로네이트 대용으로 동일한 분자량의 저분자 나트륨 히아루로네이트(분자량:약 780,000)를 첨가한 이외에는 상기 본 발명의 로션과 화장수와 동일한 조성의 제품을 13명의 전문가가 3일 동안 사용하였다. 피부에서의 퍼짐성, 끈끈함, 고감도, 부드러움과 습윤효과를 포함하는 4가지 특성에 대하여 각각의 평가 대상에게 질문을 평가하였다.

결과적으로 본 발명의 밀크 로션은 저분자 나트륨 히아루네이트를 첨가한 이외에는 동일한 조성으로 이루어진 밀크 로션에 비하여 특히 피부에서의 퍼짐성과 습윤 효과를 탁월하였다.

[실시예 9]

하기 조성의 크림을 제조하여 사용감을 평가한다.

조성:

평가 방법 및 결과:

실시예 7에서와 동일한 방법으로 평가를 실시한 결과 본 발명의 크림은 저분자 나트륨 히아루로네이트를 첨가한 이외에는 동일한 조성으로 이루어진 크림과 비교하여 끈적거림이 없으며, 특히 피부에의 부드러움과 습윤 효과가 탁월하였다.

[실시예 10]

하기 조성의 화장수를 제조하였다.

조성:

제조 방법:

고분자 나트륨 히아루로네이트를 정제수에 분산시킨 후, 나머지 성분들을 가한다. 혼합물을 충분히 교반하면 화장수를 얻는다.

[실시예 11]

하기 조성의 밀크 로션을 제조한다.

조성:

제조 방법:

1,3-부틸렌 글리콜과 메틸 파라-히드록시벤조에이트를 정제수에 가한 후, 고분자 나트륨 히아루로네이트를 분산시켜 분산액을 얻는다. 80℃에서, 분산액에 향료 이외의 다른 성분들의 혼합물을 가하여 유화한다. 향료를 유화액에 가하고, 혼합물을 실온으로 냉각시키면 밀크로션이 얻어진다.

[실시예 12]

하기 조성의 크림을 제조한다.

제조 방법:

1,3-부틸렌 글리콜과 메틸 파라-히드록시벤조에이트를 정제수에 가하고, 고분자 나트륨 히아루로네이트를 분산시켜 분산액을 얻는다. 80℃에서 분산액에 향료 이외의 성분들의 혼합물을 가하여 유화한다. 향료를 유화액에 가하고 얻은 혼합물을 실온으로 냉각시키면 크림이 얻어진다.

[실시예 13]

하기 조성의 모발 성장 촉진제를 제조한다.

조성:

[실시예 14]

하기 조성의 모발 린스를 제조한다.

조성:

[실시예 15]

하기 조성의 샴푸를 제조한다.

조성:

[실시예 16]

하기 조성물의 파운데이션을 제조한다.

조성:

[실시예 17]

표 6에 기재된 조성의 화장수를 제조하여 사용감을 평가한다. 표 6의 수치는 중량 %를 나타낸다.

[표 6]

평가 방법 및 결과:

표 6의 화장수 각각을 10명의 조사대상(5명의 남성과 5명의 여성)의 손등에 일정 분량을 바른 후, 피부에서의 퍼짐성, 마찰감, 끈적거림, 고감도, 부드러움 그리고 습윤 효과에 대하여 각각의 조사 대상에게 질문을 하여 평가하였다.

그 결과 본 발명의 제품 11은 비교용 제품 9에 비하여 각각의 항목에서 사용감의 훨씬 양호하였다. 본 발명의 제품 12는 비교용 제품 10에 비하여 사용감이 탁월하였다. 통계적으로도 본 발명의 제품의 사용감은 비교용 제품에 비하여 특히 고감도 부드러움에서 현저한 차이를 나타낸다는 사실을 알 수 있다.

[실시예 18]

표 7에 기재된 조성의 밀크로션을 제조하여 사용감을 평가하였다. 표 7의 수치는 중량%를 나타낸다.

[표 7]

평가 방법 및 결과:

실시예 17에서와 동일한 방법으로 평가한 결과, 본 발명의 제품 13은 비교용 제품 11과 12에 비하여 사용감이 탁월하였다. 통계적으로도 본 발명의 제품 13은 비교용 제품 11과 12에 비하여 사용감, 특히 고감도와 습윤효과에서 현저한 차이를 보인다는 것을 알 수 있었다.

[실시예 19]

표 8에 기재된 조성의 크림을 제조하여 사용감을 평가하였다. 표 8의 수치는 중량%를 나타낸다.

[표 8]

평가방법 및 결과:

실시예 17에서와 동일한 방법으로 평가한 결과, 본 발명의 제품 14는 비교용 제품 13과 14에 비하여 사용감이 탁월하였다. 통계적으로도 본 발명의 제품 14는 비교용 제품 13과 14에 비하여 사용감에서 특히 습윤 효과와 고감도에서 현저한 차이를 나타낸다.

[실시예 20]

하기 조성물의 화장수를 제조한다.

조성:

제조방법:

나트륨 히아루로네이트를 젖산균 배양액에 분산시킨 후, 나머지 성분들을 가한다. 얻어진 화합물을 충분히 교반하여 화장수를 제조한다.

[실시예 21]

하기 조성물의 밀크로션을 제조한다.

조성:

제조 방법:

1,3-부틸렌 글리콜과 메틸 파라-히드록시벤조에이트를 젖산균 배양액에 가하고, 나트륨 히아루로네이트를 분산시켜 분산액을 얻는다. 80℃에서 분산액에 향료 이외의 나머지 성분들의 혼합물을 가하여 유화한 후, 유화액에 향료를 가하고 얻어진 혼합물을 실온으로 냉각시키면 밀크로션이 얻어진다.

[실시예 22]

하기 조성의 크림을 제조한다.

조성:

제조 방법:

1,3-부틸렌 글리콜과 메틸 파라-히드록시벤조에이트를 젖산균 배양액에 가하고, 나트륨 히아루로네이트를 분산시켜 분산액을 얻는다. 80℃에서 분산액에 향료 이외의 나머지 성분들의 혼합물을 가하여 유화한다. 유화액에 향료를 가하고 얻은 혼합물을 실온으로 냉각시키면 크림이 얻어진다.

Claims

히아루론산 생성능력을 가지며, 히아루로니다제 비생성이며, 비용혈성을 나타내는 스트렙토코쿠스 주에 피데미쿠스 균주를 배지에서 배양하고 생성 배양으로부터 히아루론산을 수집하는 것을 특징으로 하는 히아루론산의 생산방법.
제1항에 있어서, 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스가 후술하는 세균학적 특성을 나타냄을 특징으로 하는 방법:

(a) 그람(Gram)균주: 양성

(b) 10℃에서서의 성장: 음성

(c) 45℃에서서의 성장: 음성

(d) 0.1% 메틸렌 블루 내성: 음성

(e) 6.5% 식염수 내성 음성

(f) 40% 담즙 내성: 음성

(g) 바시트라신(Bacitracin)내성: 양성

(h) pH 9.6에서의 내성: 음성

(i) 60℃에서 30분간 처리시 내성: 음성

(j) 젤라틴 액화성: 음성

(k) 전분 분해성: 양성

(l) 나트륨히퓨레이트 나트륨 분해성 음성

(m) 에스쿨린(Esculin)분해성: 약한 양성

(n) 아르기닌 분해성: 양성

(o) 당 발효성:

글루코오즈, 갈락토스, 자당, 젖당, 맥아당 소르비톨 및 살리신: 양성

글리세린, 만니톨, 트레할로스 및 아라비노스: 음성
제1항 또는 제2항에 있어서, 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스가 스트렙토코쿠스 주에피데미쿠스 YIT 2030(FERM BP-1305)임을 특징으로 하는 방법.