CN113956991A - 产透明质酸菌株及其应用 - Google Patents

产透明质酸菌株及其应用 Download PDF

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谭秀梅
鲍素敏
石江水
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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产透明质酸菌株及其在发酵生产透明质酸中的应用。本发明通过自然选育和诱变育种相结合的方法筛选得到一株高产透明质酸的兽疫链球菌HEC‑SE01，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 2020231。

Description

产透明质酸菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及到一株产透明质酸菌株，及其在发酵生产透明质酸的应用。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是由葡萄醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸的生产方法有动物组织提取法和发酵法，由于动物组织提取法的制备成本高，分离纯化复杂，逐渐被发酵法所取代。发酵法生产透明质酸具有原料易得、产量高、成本低廉的优势，因此逐渐成为当今透明质酸生产的主要方式。采用发酵法高产透明质酸常常与菌株特性、发酵工艺等因素有关，其中，菌株特性往往起到至关重要的作用。为了获得一株特性优良、高产的宿主，通常需要经过从自然界多次分离和反复诱变、驯化才能获得。目前，链球菌属的A类和C类都可以用于生产透明质酸，尤其是C类的兽疫链球菌，由于其生产的透明质酸分子量大、产量相对较高、对人潜在危害较低而受到更多的关注。但是，以目前现有报导的兽疫链球菌的透明质酸产量来看，还难以满足市场的需求。
发明内容
本发明是基于发明人对以下问题的认识和发现所作出的:
目前所报道的野生型兽疫链球菌菌株在摇瓶水平的透明质酸产量一般为0.1-0.7g/L，发酵罐产量一般在6g/L。
为此，本发明的目的是为了提供一株透明质酸产量高的菌株。
同时，本发明提供了所述产透明质酸菌株的育种方法。
其次本发明还提供一种通过分子生物学和革兰氏染色鉴定所述菌株的方法。
再者，本发明提供了所述菌株在生产透明质酸中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一株产透明质酸菌株，为兽疫链球菌Streptococcusequisubsp.zooepidemicusHEC-SE01，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2020231，保藏日期：2020年06月22日。
所述兽疫链球菌HEC-SE01是从牛鼻粘膜内侧取样通过自然选育和诱变育种相结合的方法获得。
所述兽疫链球菌HEC-SE01基因组上16S rDNA具有SEQ ID NO:1序列区段。
本发明还提供了一种鉴定兽疫链球菌HEC-SE01的方法，包括16S rDNA基因序列分析和革兰氏染色。
本发明还提供了所述兽疫链球菌HEC-SE01在发酵生产透明质酸中的应用，即将兽疫链球菌HEC-SE01接种于发酵培养基中进行发酵培养，接种量为8-12％。
在一些实施例中，接种量为10％。
在一些实施例中，所述发酵培养条件为37℃，220rpm，发酵45-50h。
在一些实施例中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖30-50g/L，酵母粉3-7g/L，蛋白胨12-18g/L，K2HPO4 1-3g/L，MgSO4 0.2-0.5g/L，味精1-5g/L，无水磷酸二氢钠9.36g/L，十二水合磷酸氢二钠43.69g/L，并调节pH＝7.5。
根据本发明的具体实施例，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖30g/L，酵母粉5.55g/L，蛋白胨16.67g/L，K2HPO4 1.72g/L，MgSO4 0.36g/L，味精3.4g/L，无水磷酸二氢钠9.36g/L，十二水合磷酸氢二钠43.69g/L，并调节pH＝7.5。
在一些实施例中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖70-90g/L，蛋白胨14-20g/L，酵母粉3-7g/L,K2HPO4 1-3g/L,味精2-5g/L，MgSO4 0.4-0.9g/L。
具体地，在发酵期间通过流加NaOH调节pH维持在7.0。
在一些实施例中，所述兽疫链球菌HEC-SE01在发酵生产透明质酸中的应用，还包括将所述兽疫链球菌HEC-SE01接种于种子培养基中进行种子液培养。
在一些实施例中，所述种子培养基包括葡萄糖8-12g/L，蛋白胨13-17g/L，酵母浸粉3-7g/L，K2HPO4 1-2g/L，MgSO4 0.3-0.4g/L，调节pH 6.3-6.8。
根据本发明具体的实施例，所述种子培养基包括葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，K2HPO4 1.5g/L，MgSO4 0.35g/L，调节pH 6.5。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明通过自然选育和诱变育种相结合的方法获得了一株高产透明质酸的兽疫链球菌菌株，经摇瓶验证，透明质酸产量高达0.8-0.9g/L，分子量在200-300WDa，15L发酵罐放大实验得到7-8g/L的透明质酸产率，高于目前大多数兽疫链球菌的产能，具有很大的生产潜力。
附图说明
图1为根据本发明实施例的S2菌株的革兰氏染色镜检图。
图2为根据本发明实施例的S2菌株在不同ARTP诱变时间下的致死率。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明要求保护的范围。
实施例1：产透明质酸菌株的筛选
从市场采购一些新鲜的牛鼻，对其外围裸露部分进行消毒清洁；用棉签擦拭牛鼻内侧，并用无菌剪刀将棉签头剪下，放入BHI液体培养基中，37℃，220rpm培养12-18h。根据培养基的浑浊程度，将其稀释至10-3、10-4和10-5，分别取100μL涂布于BHI固体培养基上，37℃培养24h，表观观察单菌落的形态、粘度等，初步筛选出颜色灰白、表面光滑湿润、圆形凸起的菌落，用枪尖挑起有明显粘滞感的菌落共计20株备用，并标记为F1-F20。
实施例2血平板复筛
分别挑取F1-F20单菌落在血平板上进行划线扩培，37℃恒温培养48h，观察血平板上的溶血情况。挑取周围出现明显透明圈的、菌落较大、生长旺盛、用枪尖挑起有明显粘滞感的菌落作为候选菌株，共计6株，并分别编号S1-S6。
实施例3候选菌株产透明质酸能力考察
挑取S1-S6单菌落接种至BHI液体培养基中37℃，220rpm扩培24h，按照0.1％接种量转接到种子培养基中，37℃，220rpm培养12h；按照10％的接种量转接到发酵培养基中，37℃，220rpm发酵48h，取样进行GPC检测，透明质酸产量最高的菌株为S2，产量为0.39g/L，分子量251WDa。
实施例4 S2菌株16srDNA鉴定和革兰氏染色鉴定
提取S2菌株的基因组，采用PCR的方法，用细菌鉴定通用引物16S 27F(SEQ ID NO:1)和16S 1492R(SEQ ID NO:2)序列，对S2菌株基因组的16S rDNA进行扩增。
PCR体系为：基因组50ng，PrimerStar Max Mix(2X)50μL，16S 27F 4μL，16S 1492R4μL，加dH2O补足至100μL。
PCR程序为：98℃5min；98℃30s，55℃30s，72℃2min；72℃2min；16℃2min；30cycles。
扩增条带送测序公司测序，得到如SEQ ID NO:3(S2菌株16S)所述序列，经NCBIBLAST比对得知S2菌株为兽疫链球菌。
用革兰氏染色法对S2菌株进行染色鉴定，显微镜下菌体形态符合链球菌形态特征，为革兰氏阳性菌(如图1所示)。
实施例5 ARTP诱变育种
设置ARTP(常压室温等离子体)诱变育种仪的参数：功率100W，气流量为10SLM，等离子体发射源与样品之间的照射距离为2mm。将筛选出的兽疫链球菌S2菌种制备成菌悬液，然后取10uL均匀涂布于诱变仪配套的无菌金属载片上，共涂16个，然后分别进行ARTP诱变处理0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s和70s,每个处理时间设两个平行样，再将诱变处理的载样片放进1mL生理盐水中振荡洗脱菌体，最后用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布BHI固体平板进行菌落计数，发现诱变时间为30s，致死率为92％左右(图2)，最终确定诱变最佳时间为ARTP诱变30s。
将S2菌株在BHI平板上反复活化3次，取适量菌体接种到BHI液体培养基中培养，并加入无菌玻璃珠将菌体制备成单菌悬液，取10uL悬液均匀涂布于诱变仪配套的无菌金属载片上，ARTP诱变处理30s(ARTP诱变育种仪的其他参数设置如上保持不变)。处理完立即用生理盐水将载样片上的菌体洗脱制成诱变菌株母液。取诱变菌株母液涂布于BHI固体平板上培养至长出单菌落，挑取单菌落进行发酵验证，选取透明质酸产量较高的单菌落继续进行第二轮诱变，依此方法进行多轮诱变，最终得到一株摇瓶产量为0.8-0.9g/L的兽疫链球菌突变菌株，编号为HEC-SE01，甘油管保存于-80℃。
实施例6 HEC-SE01菌株传代稳定性及摇瓶发酵验证
取HEC-SE01菌株接种至BHI液体培养基中，37℃，220rpm培养24h，按0.1％转接至新的BHI液体培养基中，如此反复传代10次，取第10次的传代菌液按0.1％接种量接种到种子培养基中，培养至OD660＝0.5-0.6，按10％接种量转接至发酵培养基中，37℃，220rpm培养48h，取样检测透明质酸产量，发现传代10代的菌株与出发菌株具有相同的产量，为0.8-0.9g/L，分子量在200-300万Da，并没有出现退化的现象，说明诱变菌株HEC-SE01具有传代稳定性，适合工业生产。
其中，种子培养基为葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，K2HPO4 1.5g/L，MgSO4 0.35g/L，pH 6.5。
摇瓶发酵培养基为30g/L，酵母粉5.55g/L，蛋白胨16.67g/L，K2HPO4 1.72g/L，MgSO40.36 g/L，味精3.4g/L，无水磷酸二氢钠9.36g/L，十二水合磷酸氢二钠43.69g/L，pH＝7.5。
实施例7 15L发酵罐放大实验
取HEC-SE01菌种，按0.1％(v/v)接种到500ml种子培养基中，37℃，220rpm培养至OD660＝0.5-0.8，将种子液倒入15L发酵罐中，37℃发酵48h，发酵期间通过流加NaOH来调节PH维持在7.0，取样检测HA产量，最终获得7-8g/L的产量，分子量在240WDa。
其中，种子培养基为葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，K2HPO4 1.5g/L，MgSO4 0.35g/L，pH 6.5。
发酵培养基为葡萄糖70-90g/L，蛋白胨14-20g/L，酵母粉3-7g/L,K2HPO4 1-3g/L,味精2-5g/L，MgSO4 0.4-0.9g/L。
对比例1野生菌株摇瓶发酵
与实施例6接种量和培养条件相同，菌株为S2，HA产量为0.39g/L，分子量251WDa。
对比例2野生菌株15L发酵罐放大实验
与实施例7接种量和培养条件相同，菌株为S2，HA产量为4.5g/L，分子量234WDa。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市东阳光生物合成药有限公司
<120> 产透明质酸菌株及其应用
<130> 2020-7-16
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacggctacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtagaacgca gaggtcaggt gcttgcactg gactgatgtg ttgcgaacgg gtgagtaacg 60
cgtaggtaac ctacctgata gcgggggata actattggaa acgatagcta ataccgcata 120
aaagtgaatg acacatgtca ttggcttgaa agaagcaaac gcttcactat gagatggacc 180
tgcgttgtat tagctagttg gtagggtaaa ggcctaccaa ggcgacgata catagccgac 240
ctgagagggt gaacggccac actgggactg agacacggcc cagagtccta cgggaggcag 300
cagtagggaa tcttcggcaa tggggggaac cctgaccgag caacgccgcg tgagtgaaga 360
aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gagaagaaca gtgatgggag tggaaagtcc 420
atcatttgac ggtaactaac cagaaaggga cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtaggtc ccgagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggtttaa 540
taagtctgaa gttaaaggca gtggcttaac cattgtatgc tttggaaact gttaaacttg 600
agtgcagaag ggcagagtgg aattccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggagg 660
aacaccggtg gcgaaagcgg ctctctggtc cgtaactgac gctgaggctc gaaagcgtgg 720
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgctgagt gctaggtgtt 780
aggccctttc cggggcttag tgccgtagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac 840
gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 900
gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcccgat gctattctta 960
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ttaagttggg cactctagcg agactgccgg taataaaccg gaggaaggtg gggatgacgt 1140
caaatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggtt ggtacaacga 1200
gtcgcaagcc ggtgacggca agctaacctc tgaaagccaa tctcagttcg gattgtaggc 1260
tgcaactcgc ctacatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga 1320
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa 1380
gtcggtgagg taaccgttaa ggagccagcc gcctaaggg 1419

Claims (10)

1.一株产透明质酸的菌株，其特征在于，所述菌株为兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)HEC-SE01，保藏号为CCTCC NO:M 2020231。
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株基因组上16S rDNA具有SEQ IDNO:3序列区段。
3.一种根据权利要求1所述菌株的鉴定方法，其特征在于，利用16S rDNA基因序列分析和革兰氏染色，鉴定菌株的确切种属。
4.权利要求1所述菌株在发酵生产透明质酸中的应用，其特征在于，将兽疫链球菌HEC-SE01按8-12％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养；任选地，接种量为10％。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养条件为37℃，220rpm，发酵45-50h。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖30-50g/L，酵母粉3-7g/L，蛋白胨12-18g/L，K2HPO4 1-3g/L，MgSO4 0.2-0.5g/L，味精1-5g/L，无水磷酸二氢钠9.36g/L，十二水合磷酸氢二钠43.69g/L，pH＝7.5；任选地，所述发酵培养基包括葡萄糖30g/L，酵母粉5.55g/L，蛋白胨16.67g/L，K2HPO4 1.72g/L，MgSO4 0.36g/L，味精3.4g/L，无水磷酸二氢钠9.36g/L，十二水合磷酸氢二钠43.69g/L，pH＝7.5。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖70-90g/L，蛋白胨14-20g/L，酵母粉3-7g/L,K2HPO4 1-3g/L,味精2-5g/L，MgSO4 0.4-0.9g/L。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在发酵期间通过流加NaOH调节pH维持在7.0。
9.根据权利要求4-8任一项所述的应用，其特征在于，还包括将所述兽疫链球菌HEC-SE01接种于种子培养基中进行种子液培养。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述种子培养基包括葡萄糖8-12g/L，蛋白胨13-17g/L，酵母浸粉3-7g/L，K2HPO41-2 g/L，MgSO40.3-0.4g/L，pH 6.3-6.8；任选地，葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，K2HPO4 1.5g/L，MgSO4 0.35g/L，pH 6.5。
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