JPS62257393A - ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り果上ｑ肌几分肚 本発明はヒアルロン酸の製造方法に関する。

より詳細にはヒアルロン酸生産能を有し、ヒアルロニダ
ーゼ非生産性でかつ非溶血性を示すストレプトコッカス
属に属する細菌を培地に培養して、溶血素を含まずかつ
高分子量のヒアルロン酸を効率よく製造する方法に関す
る。

藍来曵致恵 ヒアルロン酸は今日では動物体の結合組織のあらゆる部
分に存在することが認められており、工業的には鶏のト
サカや調帯等の生体組織から抽出法によって得られ、そ
の機能は細胞間に水を保持し、又組織内にゼリ一様マト
リ・ノクスを形成して細胞を保持したり、細胞間の物質
移動を制御したり、外からの物理的シヨ・ツクあるいは
細菌等の感染を防ぐことが挙げられている。

このような機能を利用してヒアルロン酸は医薬品（関節
炎治療薬、眼薬、創傷治癒剤等）、化粧品等に使用され
ている。

しかしながら生体組織からの抽出によるヒアルロン酸の
製造は、分離精製の複雑性のため大量生産がむつかしく
極めて高価である。そしてこのことがヒアルロン酸の用
途開発の道を閉ざしている。

微生物によるヒアルロン酸の生産についてはストレプト
コッカス属細菌のうちの、ランスフィールド（Ｌａｎｃ
ｅｆ　１ｅｌｄ）血清群のＡ、ＣおよびＤ型苗、例えば
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）　、ストレプトコッカス
・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｚｏ
ｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・エク
イ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）、ストレ
プトコッカス。

エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕ
ｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ディスガラ
クチイエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌ
ａｃｔｉａｅ）およびストレプトコッカス・フェカリス
・バー・ザイモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　
ｆａｅｃａｌｉｓ　ｖａｒ、　ｚｙｍｏｇｅｎｅｓ）　
そしてパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌ　
Ｉａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）等がヒアルロン酸を生成する
ことが既に知られており、例えばケンドール等（Ｆ、Ｅ
。

Ｋｅｎｄａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、、１１８，６１．１９３７）、ピアース等（Ｗ、
Ａ、Ｐｉｅｒｃｅ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ−Ｂａｃｔ、＋
６３＋３０１．１９５２）　、マンクレナン（Ａ、Ｐ、
ＭａｃＬ、ｅｎｎａｎ＋Ｊ、Ｇｅｎ、旧ｃｒｏｂｉｏ１
．，１４，１３４−１４２＋１９５６；　Ｊ、Ｇｅｎ。

旧ｃｒｏｂｉｏ１．，１５，４８５−４９１．１９５６
）　、ホルムストレーム等（Ｂ、Ｈｏ１ｍ５ｔｒＱｎ　
ｅｔ　ａｌ、、八ｐｐ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

１５、１４０９−１４１３．１９６７）、ウールコック
（Ｊ、Ｂ。

Ｗｏｏ　Ｉｃｏｃｋ　＋　Ｊ　、　Ｇｅｎ　、旧ｃｒｏ
ｂｉｏ１．，８５，３７２−３７５．１９７４）、キエ
ム等（Ｅ、Ｋｊｅｍｓ　ｅｔ　ａｌ、、ＡｃＬａ　Ｐａ
ｔｈ、旧ｃｒｏｂｉｏｌ　。

５ｃａｎｄ、５ｅｃｔ、Ｂ、８４，１６２−１６４．１
９７６）　、バーガン等（Ｔ、Ｂｅｒｇａｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ａｃｔａ　ＰａＬｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５ｃ
ａｎｄ、。

７５．９７−１０３．１９６９）そしてシフォネリ（Ｊ
、＾、Ｃ１ｆｏｎｅｌｌｉ。

Ｃａｒｂｏｈｙｄ、Ｒｅｓ、　、　１４．２７２−２７
６、１９７０）によって既に報告されている。これらの
報告はヒアルロン酸の大量生産を目的としたものではな
く、炭素源としてグルコースを１−１．５％用いて培養
したもので、そのヒアルロン酸生産量は０．５−０．６
ｇ１ｌｌ以下であり、対糖収率は６％以下であった。

マソクレナンは」−記の報告の中でストレプトコッカス
属のランスフィールｌ゛血清群Ｃ型苗の一種について好
気条件による培養はヒアルロン酸の生産を促進する可能
性があることを報告している。上記のヒアルロン酸を生
産する微生物のうち、ストレプトコッカス属のランスフ
ィールド血清群Ａ型苗やパスツレラは人に対する病原菌
として知られ、実際大量培養するには不適である。

工業的にストレプトコッカス属のヒアルロン酸生産菌を
培養して、その培養液からヒアルロン酸を抽出し、精製
する方法が特開昭５８−５６６９２号に開示されている
。この方法はストレプトコッカス属のランスフィールド
血清ＷＡ。

Ｃ型菌を培養してヒアルロン酸を大量に得る方法で、炭
素源としてグルコースを培地に８％添加して培養し、４
ｇ／ｊ！のヒアルロン酸を得ている。この場合のヒアル
ロン酸の対糖収率は５％であり、グルコース添加量を１
％から８％と変化させても変わっていない。したがって
この対ｔｌ率（５％）は既報告におけるヒアルロン酸生
産菌の対糖収率とほとんどかわりはない。この他にスト
レプトコッカス属細菌を使用してヒアルロン酸を得る方
法として、特開昭６０−５００５９７、特開昭６０−１
３３８９４、特開昭６１−１５６９８が有るが、得られ
るヒアルロン酸が低分子量であったり、収率が低いなど
の問題点が存在する。又いずれも、ヒアルロン酸生産菌
株がストレプトリジン（可溶性溶血素）を生成し、β−
溶血性を示す事が知られている。

この様な菌を大量に培養してヒアルロン酸を生産しよう
とする場合、該溶血素がヒアルロン酸生産物へ混入する
おそれがあり、かかるヒアルロン酸を化粧品や医薬品に
配合することは好ましくない。

この欠点を改良する為に、化学変異剤による変異処理に
よって、ストレプトリジン生成能を欠如させたヒアルロ
ン酸住産菌株を培養することによってヒアルロン酸を得
る方法が特開昭６０−２５１８９８に開示されている。

この中には、グルコースを６％添加することにより３．
６ｇ／ｌのヒアルロン酸が得られたことが記載されてお
り、この時のヒアルロン酸の対糖収率は６％であり、や
はり対糖収率の観点からは生産性の低いものである。

光塑がゞ　しようとする。照点 上記問題点に鑑み、溶血素（ストレプトリジン）を含ま
ずかつ高分子量のヒアルロン酸を大量に効率よく製造す
ることを目的として鋭意研究の結果、自然界から単離し
たヒアルロン酸生産能を有するストレプトコッカス属に
属する細菌から変異処理によって得た溶血性をしめさな
くなった菌株を、再度変異処理することにより、ヒアル
ロニダーゼ生成能を欠如し、高分子量ヒアルロン酸の生
産能が極めて高い菌株を得、該菌が上記目的に叶うもの
であることを見出した。

本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであり、
したがって本発明はヒアルロン酸生産能を有し、ヒアル
ロニダーゼ非生産性でかつ非溶血性を示すストレプトコ
ッカス属に属する細菌を培地に培養して、溶血素を含ま
ずかつ高分子量のヒアルロン酸を効率良く製造する方法
を提供するものである。

い　占を　ンするための手 （１１変異株の取得 本発明者らは、本発明の目的を達成するべく、次の方法
により新規変異株を取得した。まず牛ｊｌ　粘Ｗよりヒ
アルロニダーゼ（ヒアルロン酸分解酵素）の強い生成能
を有しかつヒアルロン酸を生産するランスフィール１゛
血清群Ｃ型に属するストレプトコッカス・ズーエピデミ
カス（本閑の同定は、バージエイズ・マニュアル・オブ
・デターミネイティブ・バクテリオロジイー第８版、１
９７４によった）を得た。この菌株はマソクレナン（Ｍ
ａｃＬｅｎｎａｎ、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
　、　。

１４、１３４−１４２．１９５６）が指摘したように好
気条件においてヒアルロン酸を良く生産し、炭素源とし
てグルコースを用いた場合、４％のグルコース添加によ
って２ｇ／βのヒアルロン酸を生産した（ヒアルロン酸
の対糖収率は５％）。そしてこの時得られたヒアルロン
酸の分子量は３０−６０万であった。この菌株を常法（
細菌・ファージ遺伝実験法、蛋白質核酸酵素別冊、井守
出版１９７２）によって紫外線や化学剤（Ｎ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エ
チルメタンスルフォン酸等）で処理して、この処理菌体
を血液寒天培地に混釈してまき、溶血性を示さない集落
を採取し、次にこの菌株を再び変異処理した後、ヒアル
ロン酸を含有した栄養寒天培地上に塗布し、ヒアルロン
酸を分解しない集落を採取することによってストレプト
コッカス・ズーエピデミカスの変異株１株を得た（後記
参考例１参照）。

（２）菌学的性質 後記参考例１で得たストレプトコッカス・ズーエピデミ
カスの変異株（以下本菌という）は、トッド・ヒュイソ
ト・ブロス（Ｔｏｄｄ　Ｈｅｗｉｔｔｂｒｏｔｈ）寒天
培地上で極めて強い粘性を有する透明な集落を形成し、
非溶血性（β−溶血性：陰性）、ヒアルロニダーゼ非生
産性、ランスフィールド血清群Ｃ型に属する連鎖状球菌
であり、本菌の菌学的性質は下記の通りである。

（１１）ダラム染色性：陽性 ０１１１０℃増殖性：陰性 （Ｃ１４５℃増殖性：陰性 （ｄｌ　０．１％メチレンブルー抵抗性：陰性ｔｅｌ　
６．５％食塩抵抗性：陰性 （ｆｌ　４０％胆汁抵抗性：陰性 （ｇｌバシトラシン抵抗性：陽性 （ｈｌ　ｐＨ９，６抵抗性：陰性 （１１６０℃、３０分抵抗性：陰性 Ｕ）ゼラチン分解性：陰性 （ｋｌ澱粉分解性：ｇＪ性 （１）馬尿酸ソーダ分解性：陰性 ＋ｍｌエスタリン分解性二弱陽性 （ｎｌアルギニン分解性：陽性 Ｔｏ）　糖醜酵性ニゲルコース、ガラクトース、シュー
クロース、ラフ１−ス、マルトース、ソルビトールおよ
びサリシンは陽性、 グリセリン、マンニトール、トレハロースおよびアラビ
ノースは陰性。

本発明者らは本閑の菌学的性質から、本菌をストレプト
コッカス・ズーエピデミカスＹＴＴ２０３０と命名し、
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８７４
６号として寄託されている。

（３）本菌によるヒアルロン酸の製造 本菌を培養してヒアルロン酸を得る培地は、炭素源、有
機無機窒素源、無機塩およびその他必要に応じて有機微
量栄養素を含有するものであることが好ましい。炭素源
としては、グルコース、ガラクトース、シュークロース
、ラクトース、フラクトース、マルトース、ソルビトー
ル、澱粉加水分解物等の糖分を含むものが好ましく、他
には有機酸や脂肪族アルコール等でもよい。窒素源とし
ては有機無機一般的な材料でよく、各種肉エキス、アミ
ノ酸混合物、ペプトン、酵母エキス等が好ましい。更に
、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、
鉄等の塩化物、硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、炭酸塩そして
ビタミンなどが必要に応じて添加されうる。

培養は好気的条件が必須であり、培養液の粘度の上昇に
応じ攪拌速度を上げるのが良いが過度の攪拌は好ましく
ない。培養温度は菌の増殖が行われる２　５−３８℃で
行うことが一般的である。更に培養時、本菌が乳酸を生
成しその乳酸によって菌の増殖ならびにヒアルロン酸の
生産が抑制されることから、乳酸の中和の為にアルカリ
水溶液を添加して、ｐ　Ｈ６−８の範囲内に調整するこ
とが必要である。この時使用するアルカリ水溶液は水酸
化ナトリウム、水酸化カリウムの水溶液やアンモニア水
でよい。

本菌は高分子量のヒアル１コン酸（分子量２０〇−３０
０万）を極めて高い収率、生産率で生産する菌株である
が、炭素源としてグルコースを用いると特に良い結果か
えられる。糖の添加量３％以下では対糖収率１４−１５
％であり、それ以上の添加量では若干対糖収率は減少す
る傾向にあった。糖の添加を６％にすると（実施例１参
照）、培養液の粘性は３６℃で８０００センチポアズ（
ｃＰ）となり、はとんど培養液は流動性がなくなり攪拌
速度を上げても影響なく培養の限界となった。

第１表に培地中のグルコースの添加量を変えて培養した
ときのヒアルロン酸生産量を示した。

即ち生成ヒアルロン酸を常法により精製した結果、グル
コース１％添加時には対糖収率１５％で１．５　ｇ／　
ｊ！、６％添加時には対糖収率１１％で６、７　ｇ／　
Ｉｌのヒアルロン酸が得られた。

第１表 次いでグルコース２％の組成の培地を使用し、希釈率０
．３　（ｈｒ”）で連続培養を行うと、操作し易い低粘
度で極めて安定に連続的に高収率、高生産率でヒアルロ
ン酸を生産することができた。ヒアルロン酸の対糖収率
は１５％、その生産性はＯ−９ｇ／　ｐ、　／ｈｒであ
り、−日当たり２１．６ｇ／７！のヒアルロン酸を生産
することができた（実施例２参照）。

本菌は高分子物質として、ヒアルロン酸以外の物質を培
養液中に蓄積しないので、培養後、培養液中に蓄積され
たヒアルロン酸の分離、精製は容易で、既に公知の多１
１Ｍ１の分離精製法を用いればよい。

ヒアルロン酸の分離、精製法の一例を示す。

培養液を適当な粘度となるように（１００センチポアズ
以下が好ましい）水で希釈し、トリクロル酢酸にてｐＨ
を４以下にする。次いで遠心分離あるいは膜濾過（ボア
ーザイズ　０．２μｍ以下）によって菌体を分離除去す
る。次ぎに溶液中に溶解している低分子物質を、限外濾
過、透析、有機溶媒沈澱法又はイオン交換樹脂等による
吸着法などによって除去した後、有機溶媒沈澱法、凍結
乾燥又は噴霧乾燥などの手段を用Ａ いてヒアルロン酸を得ることができる（実施例１参照）
。

このようにして上記培養液から抽出精製して得たヒアル
ロン酸について、ヒアルロン酸標品（Ｓｉｇｍａ社製）
と対比しながら種々の検討を行った結果、本島はヒアル
ロン酸であることを確認した。以下にその性質を示す。

ｆｌｌ酢酸セルロース膜を用いる電気泳動において標品
と同じ移動度を示す。

（２）放線菌ヒアルロニダーゼ（天野製薬製）によって
分解を受け、その分解物をシリカゲル薄層クロマトグラ
フィーにかけると、処理後の標品分解物と同じ移動度で
二つのスポットが現れる。

（３）化学組成を分析すると、Ｎ−アセチル−Ｄ−グル
コサミンとＤ−グルクロン酸がモル比１：１で存在する
。

（４）比施光度は〔αｆニーー６９°である。

（５）薄膜法による赤外吸収スペクトルは第３図の通り
で標品と同じ。

（６）重水に溶解して測定した■３０−ＮＭＲスペクト
ルは第４図の通りで標品と同じ。

（７）分子量は粘度測定法（Ｔ、Ｃ，Ｌａｕｒｅｎｔ　
ｅｔ　ａｌ、＋Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ
ｔａ、　４２．４７６−４８５．１９６０）による結果
、２００−３００万であった。

以下に参考例および実施例を示して本発明をさらに詳細
に説明する。

〔参考例１〕 手鼻粘膜より採取した、β−溶血性を示し、ヒアルロニ
ダーゼを生産し、かつヒアルロン酸を生産するストレプ
トコッカス・ズーエピデミカスをトッド・ヒユーイツト
・ブロス培地（ディフコ製）中、３７℃で１０時間培養
し、対数増殖期の菌体を遠心分離によって集め、低温下
遠心分離を繰り返しつつ２回０．０５Ｍ１−リス−マレ
イン酸緩衝液（ｐｌ＋６．０）を用いて無菌的に洗浄し
た後、Ｉ　Ｘ　１０１１／ｍｌの菌濃度となるように同
緩衝液に懸濁し、これにＮＴＧを２００μｇ／ｍｌとな
るよう添加し３７℃にて３０分間振とうした。つづいて
、低温下菌体を０．０５Ｍ１−リスーマレイン酸緩衝液
（ｐｉ（６，０）で２回洗浄した後、トッド・ヒユーイ
ツト・ブロス培地に接種して３７℃、１８時間培養した
。この培養液を滅菌生理食塩水にてＩ　Ｘ　１０’　／
ｍｌとなるよう希釈し、その０．１＋ｎｌを血液（ウサ
ギ脱繊血）寒天（２０ｍｌ）に混釈してまき培養後、溶
血性を示さない集落を採取した。この変異株の取得頻度
は約４Ｘ１０−’であった。次ぎにこの非溶血性菌株を
、上と同様に、トッド・ヒユーイツト・ブロス培地に３
７゛Ｃで培養し、対数増殖期の菌体を集め、０．０５Ｍ
１−リス−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で洗浄後、
ＮＴＧ　２００　＃ｇ／ｍｌを含む同緩衝液中で３７゛
Ｃｌ２Ｏ分間振とうした。

つづいて、低温下菌体を同緩衝液で洗浄後、限外濾過処
理培地（トッド・ヒユーイツト・ブロス培地からアミコ
ン製限外濾過膜ＹＭ−１０にて高分子画分を除去したも
の）に接種して３７℃、１８時間培養した。この培養液
を滅菌生理食塩水にて１−５Ｘ１０”／ｍｌとなるよう
希釈し、その０．１ｍｌをヒアルロン酸ソーダ０．１％
を含む上記限外濾過処理培地寒天（高純度寒天）上に塗
布して３７℃、２０−４０時間モイスチャーチャンバー
中で培養し、増殖した集落中の菌をレプリカ法にて採取
しておき、寒天上に１０％セチルピリジニュームクロラ
イド水溶液を噴霧して、約５０万の菌株の中から集落周
囲が濁る集落を形成するヒアルロニダーゼ非生産性変異
株ストレプトコッカス・ズーエピデミカスＹＩＴ２０３
０を取得した。

なお上記ヒアルロニダーゼ生産・非生産菌の識別法はエ
リカハルケ等の方法（Ｅｒｉｋａ　Ｂａ１ｋｅｅｔ　　
ａｌ、、Ｚｂｌ、Ｂａｋｔ、ｌＩｙｇ、八、２５９，１
９４−２００．１９８５）　　を改変して行った。

〔実施例１〕　バッチ培養 グルコース６％、ポリペプトン（大五栄養化学り１．５
％、パン酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）０．５
％、燐酸第二カリ０．２％、硫酸マグネシウム７水塩０
．１％、塩化カルシウム０、０　Ｏ５％、アデカノール
ＬＧ−１０９（消泡剤　旭電化工業製）０．００１％の
組成の培地（ｐＨ７，０）を１０ρのジャーファーメン
タ−に５ｐ入れ、滅菌後、前培養したストレプトコッカ
ス・ズーエピデミカスＹＩＴ２０３０を１％接種し、６
Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液にて培養ｐ　Ｈを７に連続
的に調節しながら３７′ｃで３９時間通気攪拌培養した
。

グルコースは別滅菌して、培養開始時に一度に添加した
。この時の培養経過を第１図に示す。

培養の経過と共に、ヒアルロン酸が蓄積し培養２９時間
で、培養液の粘性は８０００センチポアズ近（に達しほ
とんど流動性がなくなり、培養３９時間後、培養液中の
グルコースが零に達した時点で培養を終了した。

収穫した培養液は流動性がないため、これを水にて粘性
が１００センチポアズ以下となるように希釈した。次ぎ
にこの溶液をトリクロル酢酸にてｐＨを４以下にして、
中空糸マイクロフィルターモジュール（ＰＨ−１０３旭
化成製）に通し、菌体および不溶成分を除去し、更に中
空糸限外濾過膜（ｌｌＩＰ３０−４３アミコン製）に、
濾過内液に００注加しながら通し溶液中の低分子物質を
除去した。そしてこの溶液を凍結乾燥法によって乾燥し
ヒアルロン酸を培養液１１当たり６．７ｇ得た。

〔実施例２〕　連続培養 グルコース濃度を２．５％にした以外は実施例１と同一
の組成の培地をＩＯＮのジャーファーメンターに５１入
れ、滅菌後（グルコースは別滅菌）、前培養したスＩ・
レブトコソカス・ズーエピデミカスＹＩＴ２０３０を１
％接種し、６Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液にて培養ｐ　
Ｈを７に調節しながら、３７℃で１５時間通気攪拌培養
した。その後グルコース濃度を２％にした以外は実施例
１と同一の組成の培地を、希釈率０゜３　　（ｈｒ−’
）で連続的に注加しながら、３７℃、ｐＨ７で通気攪拌
連続培養を一週問おこなった。

この時の培養経過を第２図に示す。培養槽外に流出した
培養液を一定時間ごとに集め、実施例１と同様にしてヒ
アルロン酸を抽出精製した。

この結果、ヒアルｌコン酸の対糖収率は１５％、その生
産性は０．９　ｇ／　ｊ！　／ｈｒであり一日当たり２
１、６　ｇ／　１のヒアルロン酸を得ることができた。

発肌ｑ侠果 本発明によるストレプトコッカス・ズーエピデミカス変
異株を培養することによって、今まで報告されたストレ
プトコッカス属細菌を使ったヒアルロン酸の製造法にお
ける収率、収量をはるかに上回る、ストレプトリジンの
混入の全く無いかつ高分子量のヒアルロン酸を高収率、
高生産率で安価に得ることができる。この様にして製造
したヒアルロン酸は化粧品、医薬品原料として最適なも
のである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１におけるヒアルロン酸１０の
培養経過を示す図であり、第２図は実施例２における培
養経過を示す図であり、第３図および第４図はそれぞれ
実施例１で得られたヒアルロン酸の赤外吸収スペクトル
およびＮＭＲスペクトルを示す図である。 第１図 詩養時閏（ｈｌ）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒアルロン酸生産能を有し、ヒアルロニダーゼ非
   生産性でかつ非溶血性を示すストレプトコッカス属に属
   する細菌を培地に培養し、培養物からヒアルロン酸を採
   取することを特徴とするヒアルロン酸の製造方法。
2. （２）ストレプトコッカス属に属する細菌がストレプト
   コッカス・ズーエピデミカスである特許請求の範囲第１
   項記載のヒアルロン酸の製造方法。
3. （３）ストレプトコッカス属に属する細菌がストレプト
   コッカス・ズーエピデミカスＹＩＴ２０３０（微工研菌
   寄第８７４６号）である特許請求の範囲第１項もしくは
   第２項に記載のヒアルロン酸の製造方法