JPH0455675B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、醗酵法によるヒアルロン酸の製造方
法に関する。

［従来の技術］ 従来、ヒアルロン酸はウシの眼球のガラス液、
ニワトリのトサカの他、臍帯や関節液などから単
離され、蛋白質や他のコム多糖および水と結合し
てゼリー状を保ち、潤滑剤的な役割、バクテリア
の侵入からの保護、水分の保持などに役立つてい
ることが知られているが、極めて高価であること
が問題点であつた。

ストレプトコツカス属の細菌を利用したヒアル
ロン酸の製造については、ストレプトコツカス・
ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレ
プトコツカス・エキ（Streptococcus equi）、ス
トレプトコツカス・エキシミリス
（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコツカ
ス・デイスガラクテイエ（Streptococcus
dysgalactiae）およびストレプトコツカス・ズー
エピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）
などの細菌によりヒアルロン酸を比較的安価に製
造できることが知られており、ホルムストレーム
（B.Holmstrom、Appl.Microbial、1967）、ジエ
ー・ビー・ウールコツク（J.B.Woolcoock、85、
372〜375、J.Gen.Microbial、1974）、イー・キエ
ム（E.KjemActa Pathol.Microbial.Scand、
1976）らによつて報告されている。

［発明が解決しようとする問題点］ しかし、これらはいずれも大量生産を目的とし
たものではないので、たとえばグルコース１％、
培養時間24時間、PH7.0〜7.6、温度30〜37℃など
の通常の培養条件で培養を行つても、ヒアルロン
酸の収量は0.6ｇ／以下と満足できる水準では
なかつた。

本発明者らは簡単で安価な培地でヒアルロン酸
を収量よく安定に生成せしめることを意図して鋭
意研究を続けており、さきに糖成分３％以上を含
有する栄養培地上で上記菌株を培養することを特
徴とする醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法の
出願（特開昭58−56692号公報）を行つた。

この方法はヒアルロン酸を収率よく生成する方
法であるが、しかしながら、ロツトごとの生産量
が不安定であり、かつ生産量自体も工業的に実施
に移すには、まだ不充分なものであつた。

本発明者らは、かかる問題を解決すべく鋭意研
究した結果、ストレプトコツカス属の突然変異株
中からヒアルロン酸をとくに高率で生産する菌株
をとり出すことに成功し、本発明を完成するに至
つた。

［問題点を解決するための手段］ すなわち、本発明はストレプトコツカス・ズー
エピデミカスのヒアルロン酸高生産変異体である
ストレプトコツカス・ズーエピデミカス1035（微
工研菌寄第8157号を倍養し、培養物からヒアルロ
ン酸を採取することを特徴とする醗酵法によるヒ
アルロン酸の製造方法である。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明において用いるストレプトコツカス・ズ
ーエピデミカス1035は、ストレプトコツカス・ズ
ーエピデミカスを突然変異して得たヒアルロン酸
高生産菌株であり、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第8157号として受託されてい
る。

上記ストレプトコツカス・ズーエピデミカス
1035は、モルモツトの眼結膜から採取したストレ
プトコツカス・ズーエピデミカスを常法により紫
外線、Ｎ−メチルN′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン（以下、NTGという）などで処理し、
ついでブレインハートインフユジヨン寒天倍地上
に塗布してヒアルロン酸を高率で生産する変異株
を取得することによつて得られる（後述実施例１
参照）。

ストレプトコツカス・ズーエピデミカス1035の
菌学的性質は、下記の通り、羊血液寒天倍地上に
透明な粘稠性を有する集落を形成し、グラム陽性
連鎖状球菌であり、「バージーのマニユアル・オ
ブ・デタミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）、第８版、第489頁、1974体」に
記載されている菌学的性質と同一である。

グラム染色 ＋ β−溶血性 ＋ 60℃、30分熱抵抗性 − 40％胆汁抵抗性 − 6.5％食塩抵抗性 − PH9.6アルカリ抵抗性 − 馬尿酸ソーダ分解性 − エスクリン分解性 ＋ ゼラチン溶解性 − バシトラシン感受性 ＋ (11) 糖分解性 グルコース ＋ マルトース ± ラクトース ± サツカロース ＋ ソルビトース ＋ サリシン ＋ グリセリン − マンニツト − トレハロース − （＋陽性 ±擬陽性 −陰性） 本発明に係るストレプトコツカス・ズーエピデ
ミカス1035を培養する培地は、炭素源、無機塩お
よびその他に必要に応じて有機微量栄養素を含有
するものが好ましい。炭素源としてはたとえば有
機酸、脂肪族アルコールなどいろいろあるが、本
発明では澱粉加水分解物、グルコース、蔗糖ガラ
クトース、フラクトースなどの糖分を含むのであ
ることが好ましい。窒素源としては硫安、硝酸ナ
トリウム、リン酸第二アンモニウム、肉エキス、
ペプトン、各種アミノ酸混合物、酵母エキスなど
の一般的な材料が用いられる。さらに、これらに
加えて、塩化ナトリウム、あるいはマグネシウ
ム、カリウム、鉄、カルシウムなどのリン酸塩、
硫酸塩および炭酸塩、もしくはビタミンなどが添
加され得る。

糖分の添加は、一度に多量添加するよりも、少
量に分けて適時添加するほうがヒアルロン酸の収
量が増大する。

培養は、好気的条件が好ましく、たとえば振盪
培養法または通気撹拌培養法を用いて30〜37℃の
培養温度下で行うのが一般的である。

さらに培養時に、アルカリ水溶液にてPHを5.5
〜9.0に調整するヒアルロン酸が安定に大量に生
産でき好ましい。アルカリ水溶液としては水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、塩基性アミノ酸、
低級アミンなどの通常用いられるアルカリの一種
元は二種以上が使用できる。

培養後、培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を
分離、精製するにあたつては、従来から公知の多
糖類の分離、精製方法が用いられるが、培地を酸
性にしてから処理するほうがヒアルロン酸の純度
があがつて好ましい。

ヒアルロン酸の分離、精製方法の一例を記す。
まず、培養液中の菌体やその他の不溶成分を濾過
または遠心分離などにより分離除去する。次い
で、溶液中に混在する蛋白質をトリクロル酢酸ま
たはクロロホルム−イソアミルアルコール混液に
より、あるいは活性白土、活性炭などの吸着剤に
より、あるいはまたペプシン、パパインまたはプ
ロナーゼなどの蛋白質分解酵素などにより除去、
混在する低分子物質を限外濾過、透析または有機
溶媒沈澱法により、あるいはカチオン界面活性剤
またはイオン交換樹脂を用いる吸着法などで除去
した後、凍結乾燥、噴霧乾燥または有機溶媒沈澱
法などの手法を用いてヒアルロン酸を得る（後述
実施例１参照）。

実験例 １ モルモツトの眼粘膜から分離したストレプトコ
ツカス・ズーエピデミカスをブレインハートイン
フユジヨン培地（栄研製）、37℃で培養し、対数
増殖期の菌体を集めて定温で遠心を繰り返しつつ
Ｍ／20リン酸緩衝液を用いて無菌的に２回洗浄
後、NTG100〜500μｇ／mlを含むＭ／20リン酸
緩衝液中で37℃にて20分間振盪した後、氷冷し
た。

ついで、Ｍ／20リン酸緩衝液を用いて低温で菌
体を２回洗浄した後、ブレインハートインフユジ
ヨン培地に接種して37℃にて24時間培養し、ブレ
インハートインフユジヨン寒天（栄研製）培地上
に塗布してヒアルロン酸高生産変異株を取得した
（微工研菌寄第8157号）。

［実施例］ 実施例 １ グルコース４％、酵母エキス（オリエンタル酵
母株式会社製）0.5％、ペプトン（大五栄養化学
株式会社製）1.0％、アデカノールLG−805（旭電
化株式会社製）0.005％の組成の培地を30のジ
ヤーフアーメンター10分注し、殺菌後、前培養
したストレプトコツカス・ズーエピデミカス1035
を接種し、水酸化ナトリウムにてPHを7.0にコン
トロールして35℃で２日間通気撹拌培養した。な
お、グルコースは培地とは別に滅菌して添加して
いる。

培養の時間が経過するとともにヒアルロン酸が
生成し、培養液が粘稠性を帯びてくるので、ほぼ
最高粘度に達した時点（１日〜２日後）で培養を
収量した。

培養液を遠心分離にかけて不溶性分を分離除去
し、クロロホルム−イソアミルアルコール混液に
より除去、限外濾過法で低分子物質を除去した
後、凍結乾燥法を用いて培養液１より5.5ｇの
ヒアルロン酸を得た。

実施例１と同様の培養を３回くり返して行つた
が、ヒアルロン酸の生産量は常に安定していた。

また、得られたヒアルロン酸は水に可溶、メタ
ノール、エタノール、アセトン、クロロホルム、
エーテルなどの有機溶媒には不溶、無味、無臭の
白色繊維状物質であり、赤外線吸収スペクトル、
電気泳動分析、ろ紙電気及動分析および真菌性ヒ
アルロニダーゼによる分解実験によりヒアルロン
酸であることが確認できた。

比較例 １ 突然変異処理する以前のストレプトコツカス・
ズーエピデミカスの培養を実施例１と同様にして
３回くり返したが、得られたヒアルロン酸は、そ
れぞれ1.0ｇ、3.4ｇ、2.8ｇであり、生産量は実施
例１と比較して低く、また、ばらついていた。

［効果］ 本発明方法によれば、ヒアルロン酸を高収率で
しかも生産量にばらつきなく安定的に生産するこ
とができる。

本発明方法によつて製造されるヒアルロン酸
は、皮膚に使用される外用医薬品や化粧品に配合
するものとして最適である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトコツカス・ズーエピデミカス1035
   （微工研菌寄第8157号）を培養し、培養物からヒ
   アルロン酸を採取することを特徴とする醗酵法に
   よるヒアルロン酸の製造方法。