JPH0412960B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物によるヒアルロン酸の製造方法
に関するものである。 従来、ヒアルロン酸はウシの眼のガラス液、ニ
ワトリのトサカ、このほか臍帯、関節液等より単
離され、タンパク質および水と結合してゼリー状
を保ち、潤滑剤的な役割、バクテリアの侵入から
の保護、水分の保持等に役立つている。 しかし、極めて高価であることが問題点であつ
た。 一方ストレプトコツカス属細菌を利用したヒア
ルロン酸の生成についてはストレプトコツカス・
ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレ
プトコツカス・エキ（Streptococcus equi）、ス
トレプトコツカス・エキシミリス
（Streptococcus equisimilis）ストレプトコツカ
ス・デイスガラクテイエ（Streptococcus
dysgalactiae）およびストレプトコツカス・ズー
エピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）
等の細菌によりヒアルロン酸を生産する事がすで
に知られている。その報告はホルムストレーム
（B.Holmstrom Appl・Microbial 1967）、ジエ
ー・ビー・ウールコツク（J.B.Woolcock 85，
372〜375J.Gen.Microbial 1974）、イー・キエム
（E.Kjem Acta Pathol.Microbial.Scand 1976）
らによつてすでに報告されている。しかしいずれ
も大量生産を目的としたものではなく、グリコー
ス１％、培養時間24時間、PH7.0〜7.6、温度30〜
37℃等の条件で行なうもので収量は0.6g／以下
と低いものであつた。 本発明者らは簡単で安価な培地でヒアルロン酸
を収量良く安全に生成せしめる事を意図して鋭意
研究した結果、特定の条件で上記細菌を培養する
事により収量が増加する事を見出し、本発明を完
成するに至つた。 即ち、本発明は糖成分３％以上を主炭素源とす
る栄養培地にてストレプトコツカス属のヒアルロ
ン酸を生成する能力を有する微生物を通気攪拌培
養し、培養液中にヒアルロン酸を生成せしめ、こ
れを採取するものである。 本発明のヒアルロン酸を生産する能力を有する
細菌としてはストレプトコツカス・ピオゲネス、
ストレプトコツカス・エキ、ストレプトコツカ
ス・エキシミリス、ストレプトコツカス・デイス
ガラクテイエ、ストレプトコツカス・ズーエピデ
ミカス等があげられる。 本発明においてヒアルロン酸の生産は上記ヒア
ルロン酸生産菌を特定の栄養培地にて培養するこ
とより行なわれる。培地としては、炭素源、窒素
源、無機塩及びその他に必要ならば有機微量栄養
素を含有する培地がよい。炭素源としては例えば
有機酸、脂肪族アルコール等いろいろあるが本発
明では澱粉加水分解物、グルコース、蔗糖、フラ
クトース等の糖分が必須成分として必要である。 次に窒素源としては硫安、硝酸ナトリウム、リ
ン酸第二アンモニウム肉エキス、ペプトン、各種
アミノ酸混合物、酵母エキス等の一般的な原料が
用いられる。 さらこの他に塩化ナトリウム、あるいはマグネ
シウム、カリウム、鉄、カルシウム等の燐酸塩硫
酸塩あるいは炭酸塩等及び微量のビタミン類が必
要に応じて添加される。 ヒアルロン酸の収量増加には炭素源のうちグル
コースを用いると特に良い結果が得られる。糖の
添加は一度に多量添加するよりも少量に分割して
適時添加する方が良い結果となる。糖の濃度は３
％以上添加するとヒアルロン酸の生産量が１％の
時に比べ顕著に増加する。その濃度は６〜８％添
加すれば十分で、これ以上添加しても収量の増加
はない。３％未満では本発明の効果は発揮出来な
い。 表−に培地組成を示した。培地中のグルコー
スの添加量を変えて培養した結果を表−に示し
た。グルコース３％以上添加の場合は１％と比較
するとかなり収量が増加する事が分かる。 すなわち、

【表】

【表】

【表】 グルコース８％添加時のヒアルロン酸の収量は
常法に従い精製した結果4.0g／であつた。 培養時においては通気攪拌が必須である。通気
攪拌の方法としては振とう培養あるいは空気吹込
みによる通常の通気攪拌培養があるが、いずれを
使用してもよい。その際、攪拌力は弱く、通気量
を多くした法が良い結果が得られる。通気の有無
を表−に示す。通気する事によつて収量が明ら
かに増加することが分かる。 さらに培養時に、アリカリ水溶液にてPHを5.5
〜9.0に調整するとヒアルロン酸が安定に生成出
来、より好ましい。アルカリ水溶液としては水酸
化ナトリウム、水酸化カリウム、塩基性アミノ
酸、低級アミン等の通常用いられるアルカリの単
独あるいは混合溶液が使用出来る。 培養後培養液中に蓄積されたヒアルロン酸を分
離、採取するにあたつては、培地を酸性にして処
理すると純度がよくなり処理しやすい。 ヒアルロン酸の分離には従来から行われてい
る。多糖類の分離採取法が利用出来る。 例えば培養液中の菌体、その他の不溶成分は
過又は遠心分離等により分離除去する。溶液中に
混在する蛋白質はトリクロル酢酸、又はクロロホ
ルム、イソアミルアルコール混液での除去あるい
は活性白土、活性炭等の吸着剤あるいはペプシ
ン、パパイン、プロナーゼ等の蛋白質分解酵素に
て除去することが出来る。 また、混在する低分子物質は限外過、透析あ
るいは有機溶媒再沈法等により分解除去する。そ
の後有機溶媒による沈澱法又はカチオン活性剤に
よる吸着法あるいはイオン交換樹脂による吸着法
で精製後凍結乾燥、噴霧乾燥あるいは溶媒沈澱法
等の方法でヒアルロン酸を単離する事が出来る。 このようにして得られたヒアルロン酸は水に可
溶、メタノール、エタノール、アセトン、クロロ
ホルム、エーテル等の有機溶媒には不溶の白色繊
維状、無味、無臭の乾燥物である。 次にストレプトコツカス、ズーエピデミカスで
培養して得られた精製ヒアルロン酸の性質を以下
に述べる。 呈色反応 アンスロン −硫酸反応：緑色 カルバゾール−硫酸反応：紅色 赤外吸収スペクトル KBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトル
は第１図の通りである。 0.1％水溶液の比旋光度：〔α〕^20/D＝−67.5° 電気泳動による分析 等速電気泳動のチヤートを第２図に示した。泳
動条件は下記の通りで、本多糖のポテンシアルユ
ニツトバリユー（Potential Unit Value）は0.23
であるところから、本粘質物はヒアルロン酸であ
ることを確認した。

【表】

【表】 又、セルロースアセテート膜を用いるろ紙電気
泳動でも0.1M酢酸亜鉛電極液で本多糖はヒアル
ロン酸と一致した。その際、真菌性ヒアルロニダ
ーゼ（Streptomyces hyalurolyticus）で処理後
電気泳動にて分析したものは標品と同様スポツト
を示さず、本酵素により分解される事からもヒア
ルロン酸である事が確認出来た。 実施例 １ グルコース８％、酵母エキス0.5％、ペプトン
1.5％、リン酸第１水素カリウム0.2％、チオ硫酸
ナトリウム0.11％、亜硫酸ナトリウム0.02％の組
成のの培地を１のジヤーフアーメンターいわし
や製MA型500mlミニジヤーに400ml分注し、120
℃、15分間加熱殺菌後、前培養したストレプトコ
ツカス・ズーエピデミカスを接種し、PH７，33℃
で４日間通気攪拌（通気量２／ｍ(Q)、回転数
200rpm）培養した。 培養終了後培養液より遠心分離により、菌体及
びその他の夾雑物を除去し、上澄液へ２倍量のエ
タノールを攪拌しつつ加えると繊維状物質が沈殿
した。これを別した後、エーテル、ついでエタ
ノールで充分洗浄後、再び水に溶解し、セチルピ
リジニウムクロライドを加え、生じた沈殿を取
し、水および0.1M NaC水溶液にて十分洗浄後
0.5M NaCにてヒアルロン酸を抽出し、その溶
液を透析法により脱塩後、溶液を凍結乾燥して培
養液１より4.0gのヒアルロン酸を得た。本品は
紙電気泳動にて標品のヒアルロン酸と同じ位置
に泳動され、等速電気泳動のユニツトバリユーも
0.23と標品のそれと一致した。さらに赤外線吸収
スペクトルも標品のスペクトルと一致した。 一方、グリコース８％の代りにグリコース１％
添加した培地で同様にストレプトコツカス・ズー
エピデミカスを培養した場合には、培養液１よ
り0.5g／のヒアルロン酸が得られたにすぎなか
つた。 実施例 ２ 実施例１に施て使用した培地中のグリコースの
量を４％におきかえた培地を用いてストレプトコ
ツカス・ズ−エピデミカスを実施例１と同様の方
法で培養した。ヒアルロン酸の収量は2.1g／で
あつた。ただし、本条件で通気攪拌しなかつた場
合の収量は0.05g／と低かつた。 実施例 ３ 実施例１に於て使用した培地中のグリコースの
量を３％におきかえた培地を用いてストレプトコ
ツカス・ズーエピデカミスを実施例１と同様の方
法で培養し、処理した。ヒアルロン酸の収量は、
2.0g／であつた。 実施例 ４ 実施例１と同様の方法でストレプトコツカス・
エキ（ATCC9527）を培養し、培養液からヒアル
ロン酸を単離精製し、培養液１より3.8gのヒア
ルロン酸を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本培養により得たヒアルロン酸の赤外
線吸収スペクトルである。第２図は本培養により
得たヒアルロン酸の等速電気泳動のチヤートであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ グルコース３％以上を主炭素源とする栄養培
   地にてストレプトコツカス属のヒアルロン酸を生
   成する能力を有する微生物を通気攪拌培養して、
   好気的条件下で培養液中にヒアルロン酸を生成蓄
   積せしめ、これを採取することを特徴とする微生
   物によるヒアルロン酸の製造方法。