JPH0443637B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒアルロン酸の製造方法およびこれに
用いる菌株に関し、更に詳細にはヒアルロン酸生
産能を有し、かつヒアルロニダーゼ非生産性のス
トレプトコツカス属に属する細菌を培地に培養
し、高分子量のヒアルロン酸を効率よく製造する
方法に関する。

〔従来の技術およびその問題点〕

ヒアルロン酸は今日では動物体の結合組織のあ
らゆる部分に存在することが認められており、工
業的には鶏のトサカや臍帯等の生体組織から抽出
法によつて得られ、その機能としては細胞間に水
を保持し、又組織内にゼリー様マトリツクスを形
成して細胞を保持したり、細胞間の物質移動を制
御したり、外からの物理的シヨツクあるいは細菌
等の感染を防ぐことが挙げられている。このよう
な機能を利用してヒアルロン酸は医薬品（関節炎
治療薬、眼薬、創傷治癒剤等）、化粧品等に使用
されている。

しかしながら生体組織からの抽出によるヒアル
ロン酸の製造は、分離精製手段の複雑性のため大
量生産がむづかしく極めて高価である。そしてこ
のことがヒアルロン酸の用途開発の道を閉さして
いる。

微生物によるヒアルロン酸の生産についてはス
トレプトコツカス属細菌にうちの、ランスフイー
ルド（Lancefield）血清群のＡ，ＣおよびＤ型
菌、例えばストレプトコツカス・ビオゲネス
（Streptococcus pyogenes），ストレプトコツカ
ス・ズーエピデミカス（Streptococcus
zooepidemicus）、ストレプトコツカス・エクイ
（Streptococcus equi）、ストレプトコツカス・エ
クイシミリス（Streptococcus equisimilis）、ス
トレプトコツカス・デイスガラクチイエ
（Streptococcus dysgalactiae）およびストレプ
トコツカス・フエカリス・バー・ザイモゲネス
（Streptococcus faecalis var.zymogenes）そし
てパスツレラ・マルトシダ（Pasteurella
multocide）等がヒアルロン酸を生成することが
既に知られており、例えばケンドール等（F.E.
Kendall et al.，J.Biol.Chem.，118，61，
1937）、ピアース等（W.A.Pierce et al.，J.
Bact.，63，301，1952）、マツクレナン（A.P.
MacLennan，J.Gen.Microbiol.，14，134−142，
1956；J.Gen.Microbiol.，15，485−491，1956）、
ホルムストレーム等（B.Holmstrom et al.，
Appl.Microbiol.，15，1409−1413，1967）、ウー
ルコツク（J.B.Woolcock，J.Gen.Microbiol.，
85，372−375，1974）、キエム等（E.Kjems et
al.，Acta Path。Microbiol.Scand Sect.B，84，
162−164，1976）、バーガン等（T.Bergan et
al.，Acta Path.Microbiol.Scand.，75，97−
103，1969）そしてシフオネリ（J.A.Cifonelli，
Carbohyd.Res.，14，272−276，1970）によつて
既に報告されている。これらの報告はヒアルロン
酸の大量生産を目的としたものではなく、炭素源
としてグリコースを１−1.5％用いて培養したも
ので、そのヒアルロン酸生産量は0.5−0.6ｇ／
以下であり、対糖収率は６％以下であつた。マツ
クレナンは上記の報告の中でストレプトコツカス
属のランスフイールド血清群Ｃ型菌の一種につい
て好気条件による培養はヒアルロン酸の生産を促
進する可能性があることを報告している。上記の
ヒアルロン酸を生産する微生物のうち、ストレプ
トコツカス属のランスフイールド血清群Ａ型菌や
パスツレラは人に対する病原菌として知られ、実
際大量培養するに不適である。

工業的にストレプトコツカス属のヒアルロン酸
生産菌を培養し、その培養液からヒアルロン酸を
抽出し、精製する方法が特開昭58−566692号に開
示されている。この方法はストレプトコツカス属
のランスフイールド血清群Ａ，Ｃ型菌を培養して
ヒアルロン酸を大量に得る方法で、炭素源として
グリコースを培地に８％添加して培養し、４ｇ／
のヒアルロン酸を得ている。この場合のヒアル
ロン酸の対糖収率は５％であり、グリコース添加
量を１％から８％と変化させても変わつていな
い。したがつてこの対糖収率（５％）は既報告に
おけるヒアルロン酸生産菌の対糖収率とほとんど
かわりはない。この他にストレプトコツカス属細
菌を使用してヒアルロン酸を得る方法として、特
開昭60−500597号、特開昭60−133894号、特開昭
61−15698号、特開昭60−251898号、特開昭61−
219394号があるが、得られるヒアルロン酸が低分
子量であつたり、収率が低いなどの問題点が存在
する。

〔問題点を解決するための手段〕

上記問題点に鑑み、本発明者らは、高分子量の
ヒアルロン酸を大量に効率よく製造することを目
的として鋭意研究の結果、先に自然界から単離し
たヒアルロン酸生産能を有するストレプトコツカ
ス属に属する細菌から変異処理によつて得た溶血
性をしめさなくなつた菌株を、再度変異処理する
ことにより、ヒアルロニダーゼ生産能を欠如し、
高分子量ヒアルロン酸の生産能が極めて高い菌
株、ストレプトコツカス・ズーエピデミカス
YIT−2030（Streptococcus zooepidemicus YIT
−2030、（微工研条寄第1305号）を得、該菌株を
培養することにより高分子量のヒアルロン酸が製
造できることを見い出し、特許出願した（特願昭
61−99446号、同61−99447号）。

本発明者らは更にヒアルロン酸の高生産株を得
ることを目的として研究を重ねた結果、ヒアルロ
ン酸生産能を有し、溶血性を示すがヒアルロニダ
ーゼ非生産性のストレプトコツカス・ズーエピデ
ミカスに属する細菌を得、該菌を培養すれば高分
子量のヒアルロン酸が効率よく製造できることを
見い出し、本発明を完成した。

すなわち本発明はヒアルロン酸生産能を有し、
かつヒアルロニダーゼ非生産性のストレプトコツ
カス・ズーエピデミカスに属する細菌を培地に培
養し、培養物からヒアルロン酸を採取することを
特徴とするヒアルロン酸の製造方法を提供するも
のである。

本発明のヒアルロン酸生産能を有し、かつヒア
ルロニダーゼ非生産性であるストレプトコツカ
ス・ズーエピデミカスは例えば次の如くして得ら
れる。すなわち、まず鼻粘膜よりヒアルロニダー
ゼ（ヒアルロン酸分解酵素）の強い生成能を有し
かつヒアルロン酸を生産するランスフイールド血
清群Ｃ型に属するストレプトコツカス・ズーエピ
デミカス（本菌の同定は、バージエイズ・マニユ
アル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロ
ジイー第８版、1974によつた）を得る。この菌株
はマツクレナン（MacLennan，J.Gen.
Microbiol.，14，134−142，1956）が指摘したよ
うに好気条件においてヒアルロン酸を良く生産
し、炭素源としてグリコースを用いた場合、４％
のグリコース添加によつて２ｇ／のヒアルロン
酸を生産した（ヒアルロン酸の対糖収率は５％）。
そしてこの時得られたヒアルロン酸の分子量は30
−60万であつた。この菌株を常法（細菌・フアー
ジ遺伝実験法、蛋白質核酸酵素別冊、共立出版
1972）によつて紫外線や化学剤（Ｎ−メチル
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG），
エチルメタンスルフオン酸等）で処理し、この処
理菌体をヒアルロン酸を含有した栄養寒天培地上
に塗布し、ヒアルロン酸を分解しない集落を採取
することによつてストレプトコツカス・ズーエピ
デミカスの変異株を得る。（後記実施例１参照）。

斯くして得られるストレプトコツカス・ズーエ
ピデミカスの変異株（以下本菌という）は、トツ
ド・ヒユーイツト・ブロス（Todd
Hewittbroth）寒天培地上で極めて強い粘性を有
する透明な集落を形成し、溶血性（β−溶血性：
陽性）、ヒアルロニダーゼ非生産性、ランスフイ
ールド血清群Ｃ型に属する連鎖状球菌であり、本
菌の菌学的性質は下記の通りである。

(a) グラム染色性：陽性 (b) 10℃増殖性：陰性 (c) 45℃増殖性：陰性 (d) 0.1％メチレンブルー抵抗性：陰性 (e) 6.5％食塩抵抗性：陰性 (f) 40％胆汁抵抗性：陰性 (g) バシトラシン抵抗性：陽性 (h) PH9.6抵抗性：陰性 (i) 60℃、30分抵抗性：陰性 (j) ゼラチン分解性：陰性 (k) 澱粉分解性：陽性 (l) 馬尿酸ソーダ分解性：陰性 (m) エスクリン分解性：弱陽性 (n) アルギニン分解性：陽性 (o) 糖醗酵性：グリコース、ガラクトース、シユ
ークロース、ラクトース、マルトース、ソルビ
トールおよびサリシンは陽性、グリセリン、マ
ンニトール、トレハロースおよびアラビノース
は陰性。

従来、ヒアルロン酸を生産し、かつヒアルロニ
ダーゼを生産しない細菌は知られていないことお
よび上記の菌学的性質から、本発明者らは本菌を
ストレプトコツカス・ズーエピデミカス
YIT2041（ストレプトコツカス・ズーエピデミカ
スHdN−96）と命名し、工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研菌寄第9556号として寄託し
た。

次に本菌を培養して、該培養物からヒアルロン
酸を採取する方法について説明する。

本菌を培養してヒアルロン酸を得る培地は、炭
素源、有機・無機窒素源およびその他必要に応じ
て無機塩や有機微量栄養素を含有するものである
ことが好ましい。炭素源としては、グリコース、
ガラクトース、シユークロース、ラクトース、フ
ラクトース、マルトース、ソルビトール、澱粉加
水分解物質等の糖分を含むものが好ましく、他に
は有機酸や脂肪族アルコール等でもよい。窒素源
としては有機・無機を問わず一般的な材料でよい
が、各種肉エキス、アミノ酸混合物、ペプトン、
酵母エキス等が好ましい。更にナトリウム、カリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、鉄等の塩化
物、硫酸塩、燐酸塩、硝酸塩、炭酸塩そしてビタ
ミンなどが必要に応じて添加されうる。

培養は好気的条件が必須であり、培養液の粘度
の上昇に応じ攪拌速度を上げるのが良いが過度の
攪拌は好ましくない。培養温度は菌の増殖が行わ
れる25−38℃が好ましい。更に培養時、本菌が乳
酸を生成しその乳酸によつて菌の増殖ならびにヒ
アルロン酸の生産が抑制されることから、乳酸の
中和の為にアルカリ水溶液を添加して、培養液の
PHを６−８の範囲内に調整するのが好ましい。こ
の時使用するアルカリ水溶液としては、例えば水
酸ナトリウム、水酸化カリウムの水溶液やアンモ
ニア水が挙げられる。

本菌は高分子量のヒアルロン酸（分子量200万
以上）を極めて高い収率、生産率で生産する菌株
であるが、炭素源としてグリコースを用いると特
に良い結果がえられる。すなわち、グリコースを
添加すると目的とするとヒアルロン酸の生産率が
極めて向上し、その添加量は0.5−６％が好まし
い。

本菌は高分子物質として、ヒアルロン酸以外の
物質を培養液中に蓄積しないので、培養後、培養
液中に蓄積されたヒアルロン酸の分離・精製は容
易で、既に公知に多糖類の分離精製法を用いれば
よい。

ヒアルロン酸の分離、精製法の一例を示す。培
養液を適当な粘度となるように（100センチポア
ズ以下が好ましい）水で希釈し、トルクロルー酢
酸にてPHを４以下にする。次いで遠心分離、濾過
あるいは膜濾過（ポアーサイズ0.2μm以下）によ
つて菌体を分離除去する。次ぎに溶液中に溶解し
ている低分子物質を、限外濾過、透析、有機溶媒
沈澱法又はイオン交換樹脂等による吸着法などに
よつて除去した後、有機溶媒沈澱法、凍結乾燥又
は噴霧乾燥などの手段を用いて高分子量のヒアル
ロン酸を得ることができる。

このようにして上記培養液から抽出精製して得
たヒアルロン酸について、ヒアルロン酸標品（分
子量約63万、Sigma社製）と対比しながら種々の
検討を行つた結果、本品はヒアルロン酸でること
を確認した。以下にその性質を示す。

(1) 酢酸セルロース膜を用いる電気泳動において
標品と同じ移動度を示す。

(2) 放線菌ヒアルロニダーゼ（天野製薬製）によ
つて分解を受け、その分解物をシリカゲル薄層
クロマトグラフイーにかけると、処理後の標品
分解物と同じ移動度で二つのスポツトが現れ
る。

(3) 化学組成を分析すると、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンとＤグルクロン酸がモル比１：１
で存在する。

(4) 比施光度〔α〕D20＝−69°である。

(5) KBr錠剤法による赤外吸収スペクトルは第
３図に通りで標品と同じ。

(6) 重水に溶解して測定した¹³Ｃ−NMRスペク
トルは第４図の通りで標品と同じ。

(7) 分子量は粘度測定法（T.C.Laurent et al.，
Biochim.Biophys.Acta，42，476−485，1960）
による結果、200−300万であつた。

〔発明の効果〕

本発明によるストレプトコツカス・ズーエピデ
ミカス変異株を培養することによつて、高分子量
のヒアルロン酸を高収率、高生産率で安価に得る
ことができる。この様にして製造した高分子量の
ヒアルロン酸は化粧品、医薬品原料として最適な
ものである。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明
する。

実施例 １ 牛鼻粘膜より採取した、β−溶血性を示し、ヒ
アルロニダーゼを生産し、かつヒアルロン酸を生
産するストレプトコツカス・ズーエピデミカスを
トツド・ヒユーイツト・ブロス培地（デイフコ
製）中、37℃で10時間培養し、対数増殖期の菌体
を遠心分離によつて集め、低温下遠心分離を繰り
返しつつ２回の0.05Mトリスーマレイン酸緩衝液
（PH6.0）を用いて、無菌的に洗浄した後、１×
10⁸／mlの菌濃度となるように同緩衝液に懸濁し、
これにNTGを200μg／mlとなるよう添加して37
℃にて３分間振とうした。つづいて、低温下菌体
を0.05Mトリスーマレイン酸緩衝液（PH6.0）で
２回洗浄した後、限外濾過処理培地（トツド・ヒ
ユーイツト・ブロス培地からアミコン製限外濾過
膜YM−10にて高分子画分を除去したもの）に接
種して37℃、18時間培養した。この培養液を滅菌
生理食塩水にて１−５×10²／mlとなるように希
釈し、その0.1mlをヒアルロン酸ソーダ（分子量
約63万、シグマ社製）0.1％を含む上記限外濾過
処理培地寒天（高純度寒天）上に塗布して37℃、
20−40時間モイスチヤーチヤンバー中で培養し、
増殖した集落中の菌をレプリカ法にて採取してお
き、寒天上に10％セチルピリジニユームクロライ
ド水溶液を噴霧して集落周囲が濁る集落を形成す
るヒアルロニダーゼ非生産性変異株ストレプトコ
ツカス・ズーエピデミカスYIT2041を取得した。

なお上記ヒアルロニダーゼ生産・非生産菌の職
別法はエルカバルケ等の方法（Erika Balkeet
al.，Zbl.Bakt.Hyg.A，259，194−200，1985）
を改変して行つた。

実施例２ （バツチ培養） グリコース６％、ポリペプトン（大五栄養化学
製）1.5％、パン酵母エキス（オリエンタル酵母
工業製）0.5％、燐酸第二カリ0.2％。硫酸マグネ
シウム７水塩0.1％。塩化カルシウム0.005％、ア
デカノールLG−109（消泡剤 旭電化工業製）
0.001％の組成の培地（PH7.0）を10のジヤーフ
アーメンターに５入れ、滅菌後、前培養したス
トレプトコツカス・ズーエピデミカスYIT2041
を１％接種し、6N−水酸化ナトリウム水溶液に
て培養PHを７に連続的に調節しながら37℃で42時
間通気攪拌培養した。

グリコースは別滅菌して、培養開始時に一度に
添加した。このときの培養経過を第１図に示す。
培養の経過と共に、ヒアルロン酸が蓄積し培養29
時間で、培養液の粘度は8000センチポアズ近くに
達しほとんど流動性がなくなり、培養42時間後、
培養液中のグリコースが零に達した時点で培養を
終了した。

収穫した培養液は流動性がないため、これを水
にて粘性が100センチポアズ以下となるように希
釈した。次ぎににこの溶液をトリクロ酢酸にてPH
を４以下にして、中空系マイクロフイルターモジ
ユール（PW103旭化成製）に通し、菌体および
不溶成分を除去し、更に中空系限外濾過膜
（HIP30−43アミコン製）に、濾過内液に水を注
加しながら通し溶液中の低分子物質を除去した。
そしてこの溶液を凍結乾燥法によつて乾燥しヒア
ルロン酸を培養液１当たり７ｇ得た。得られた
ヒアルロン酸の分子量は約216万（粘度測定法）
であつた。

実施例３（連続培養） グリコース濃度を2.5％にした以外は実施例２
と同一の組成の培地を10のジヤーフアーメンタ
ーに５入れ、滅菌後（グリコースは別滅菌）、
前培養したストレプトコツカス・ズーエピデミカ
スYIT2041を１％接種し、6N−水酸化ナトリウ
ム水溶液にて培養PHを７に調節しながら、37℃で
14時間通気攪拌培養した。その後グリコース濃度
を２％にした以外は実施例２と同一の組成の培地
を、希釈率0.3（hr^-1）で連続的に注加しながら、
37℃、PH７で通気攪拌連続培養を一週間おこなつ
た。このときの培養経過を第２図に示す。培養槽
外に流出した培養液を一定時間ごとに集め、実施
例２と同様にしてヒアルロン酸（分子量約21万
〔粘度測定法〕）を抽出精製した。この結果、ヒア
ルロン酸の対糖収率は16％、その生産性は0.96
ｇ／／hrであり一日当たり23ｇ／のヒアルロ
ン酸を得ることができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例２におけるヒアルロン
酸の培養経過を示す図面であり、第２図は実施例
３における培養経過を示す図面であり、第３図お
よび第４図はそれぞれ実施例２で得られたヒアル
ロン酸の赤外吸収スペクトルおよびNMRスペク
トルを示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒアルロン酸生産能を有し、かつヒアルロニ
   ダーゼ非生産性のストレプトコツカス・ズーエピ
   デミカスに属する細菌を培地に培養し、培養物か
   らヒアルロン酸を採取することを特徴とするヒア
   ルロン酸の製造方法。 ２ ストレプトコツカス・ズーエピデミカスに属
   する細菌がストレプトコツカス・ズーエピデミカ
   スYIT2041（微工研菌寄第9556号）である特許請
   求の範囲第１項に記載のヒアルロン酸の製造方
   法。