JPS60133894A - ヒアルロン酸およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒアルロン酸及びその塩の製造、精製及び使
用法、特に微生物起源からのヒアルロン酸の製造法に関
する。

ヒアルロン酸は、ｎ　＞　１０００の実験式（Ｃ，、Ｈ
２ｏＮＮａ○１１）を有する天然産の高分子量多糖類で
ある。ヒアルロン酸の一般構造式は、Ｍｅｒｃｋ　Ｔｎ
−ｄｅｘ、Ｎ１ｎＬｌ＋編（第３版、１９７８年）、６
２４頁に例示されている。総して以下１−１　Ａとして
言及されるヒアルロン酸及びその塩か少くとも３つの起
源から得られるということは公知である二人間のＨ，ｒ
；緒、ルースター・コームス（ｒｏｏｓｔｅｒ　ｃｏ＋
ｎｂｓ）及びある種のバクテリヤ培養物例えば群Ａ及び
Ｃの溶血性連鎖球菌。しかしなか呟我々の最良の知識に
よれば、　緒及びルースター・コームスだけが市販のｌ
−１Ａ　１．：、対する起ｉ原として使用される。これ
は、これらの２つの起源と関連したある種の欠点（例え
ば比較的１氏収率、フンドロイチンサル７工一卜での汚
染、手間のかがる工程、及び精製段階）を考えるといく
らが驚くべきことである。

ＨＡは水性及びガラス本渡、及び′０１１１乳動物の関
節の滑脱液中に見出されるから、目における及び関節に
おける病理学的状態を正す目的で流体代替物として使用
するために精製されたＩ−１Ａを得ることはがなり興味
がもたれてきた。ｌ−１Ａのルースター・コームス及び
人間のＪＪ：ｉ□ｊ：緒からの調製及びその目及び関節
における使用法はＥ、Ａ、Ｂａ１ａｚｓの米国特許第４
．］４．］、９７３号に記述されている。

この特許は、更にＩ−（Ａの分離、特徴及び使用法を記
述する技術的文献の詳細ら示している。

Ｅ、Ａ、　Ｂａ１ａｚｓの米国特許第４，３０３，６７
６号は、ルースター・コームスから作られる種々の分子
量範囲のヒアルロン酸す）　ｌ）ラム画分を含む化粧品
組成物も記述している。Ｌ、Ｇ、Ｐａｐｅの米国特許第
４．３２８，８０３号は服外科における超純粋なヒアル
ロン酸塩の使用を開示している。使用される１−１Ａ生
成物は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から商品名ＨＹＡＲＴＴ
Ｌ■として市販されるヒアルロン酸ナトリウム塩であり
、ルースター・コームスから商業的な量で得られる。

ヒアルロン酸のバクテリヤからの抽出を記述する唯一の
文献（参照、Ｋｊｅｍ及びＬｅｂｅｃｈ＋　ＡｃＬａ　
ｐａ−１、ｌ＋、ｍ１ｃｒｏｂｉａ１．ｓｃａ＋＋ｄ、
　５ｅｃｔ、　Ｂ　、　８４．　：　１６２−　］６４
．１９７６）では、いくつかの目的（二対ｊして受け入
れられない媒体及び工程を使用している。

この記述さ机る媒体は多くの連鎖球菌の生長を支持しな
い。また記述される工程は熱で連鎖球菌を死滅させるこ
とを最初に含む。更にこの方法は反応性のありそうであ
り且つ最終生成物から除去することか難しい多くの内部
汚染物を遊離する有機体を抽出する。それ故に、得られ
るｌ−１Ａは哺乳動物への注射に使用されえないようで
ある。

１−１　Ａの医薬的用途がＨＡを哺乳動物を体内−＼（
例えは関節液代替物として）注射することを必要とする
から、反応性の問題を避けるために注射生成物ができる
だけ純粋でなけれはならないということが非常に重要で
ある。この純度の重要性は、ルースター・フームスから
或いは池に人間の１夙緒から調製されるｌ−１Ａ生成物
を記述する米国特許ｆ５４゜］／４］、９７３号に記載
されている。純度のほかに、ＨＡ生成物の分子量の制御
は非常に重要に見える（例えば米国特許第４，１４１，
９７３号は少くとも７５０　＋　ＯＯｆ’ｌの平均分子
量を示唆し、また米国特許第４．３（１３，６７６号は
制御された分子量の２つのはっきりした両分、即ち１つ
は低く且つ１つは高い両分を有することを示唆している
）。

Ｓｕ＋ａｎｎ、Ａｒｃｈ、０ｐｔｌ＋ａ１．８１Ｌ５４
４−８（１９７２）による文献には非常に高純度（即ち
蛋白質０゜０５％以下）の高分子ＪＲ（１，２００，０
００）の）」Ａ調製物か記述されているけれど、次の利
点を有する）（Ａ生成物については記述されてない：（
１）比較的低価格で、高収率で、及び注射時における低
反応性を有して微生物学的起源から誘導される；（２）
望ましくは高い且つ綿密に制御された平均分子量を有す
る；そして（３）蛋白及び核酸不純物を実質的に含まな
いこと。全く驚くことに、年回そのような生成物を製造
できることが発見された。

その製造法、特徴及び用途の詳細は下記の通りである。

第１〜４図は本開示に従って４つの微生物学的発酵器か
ら製造されたｌ−１Ａの分子量分布を示すグラフである
。

第５〜７図は３つの市販されている従来法の１−１Ａ調
製物の分子量分布を示すグラフである。

第８〜９図は本開示の１−１　Ａ生成物の関節液代替物
としての効果を、対照物及び／又は市販の生成物と比較
するり゛ラフである。

第１０図は特定されない原因による馬の関節病における
関節液代替物としての本開示の生成物の使用法を示すグ
ラフである。

制御された高平均分子量を有する超純粋なＨＡＡ製剤を
製造する１つの方法は、）（Ａを生産するヒアルロニグ
ーゼーネガテイフ’（１＋ｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ−
ｎａＢａｔ、ｉνｅ）或いはヒアルロニダーゼ禁止の有
機体を、培養物中のＨＡ含量を高めるのに１−分な条件
下に培養し、細胞から１（／＼を遊離させ、そして遊離
した＋（／＼を精製して実質的にすべての蛋白と核酸を
除去することを含んでなる。好適な具木例において、Ｈ
Ａは好ましくは外米の蛋白を含有しない媒水中で培養す
ることにより、群Ｃの連鎖球菌有機体（例えば３　ｔｒ
ｅｐ、　ｅｑｕ　ｉ　）から製造され、結果として最終
生成物は厳密に制御された平均分子量を有し且つ約１．
　、２５　Ｂ／口１１以下（好ましくは約０゜１０　＋
ｎＢ／　ｍｌ　１）、下）の蛋白及び約４５μｇ、／　
ｒｎ　ｌす、下（好ましくは約５μＨ／　ｒｎ　ｌ以下
）の核酸しか含有しない無菌調製剤となり、（例えば）
哺乳動物における滑液代替物として使用される。

後述する実施例で示されるように、本開示の１４Ａ生ｅ
、物は、ヒアルロニグーゼーネガテイフ或いはヒアルロ
ニダーゼ禁止の微生物源から製造され、厳密に制御され
た平均分子量を有し、そして非常に重要なことには蛋白
及び核酸を実質的に含有せず、またフンドロイチンサル
７エートも含まないという点で市販の）（）＼生成物と
異なっている。ここに、上述した蛋白、核酸、フンドロ
イチンサルフエートは動物体液の代替が意図された生成
物には望ましくない汚染物であると考えられるものであ
る。本明細書で用いる如き、ｌ−１Ａ調製剤の蛋白及び
核酸含量に対する「実質的に含有しない」とは、生成物
の蛋白含量が約１．２５ｍε／　ｒｎ　ｌ　（好ましく
は約０．］Ｏ＋帽／＋ｎ　ｌ　）以下であり、また核酸
含量かオ、す・１５μＢ　／　ｍ　ｌ　（好ましくは約
５μｇ／ｍ１））υ、下であることを意味する。綿密に
制御された高分子量とは、ＨＡの少くとも９８％が与え
られた高平均分子量範囲（好ましくは約２．０百万〜約
／ＬＯ百万）の範囲内にあり且つ（下記の１−１　Ｐ　
Ｌ　Ｃ技術によれは）本質的に１つの、実質的に対称な
分子量分布ピークで表わされるということを意味する。

ヒアルロニダーゼ−ネガティブとは、認めうる量の細胞
外の（１」Ａを小分子に分解しうる）ヒアルロニダーゼ
が有機体に存在しないことを意味する。ヒアルロニダー
ゼ禁止とは、ＨＡの小分子への分解を排除するために熱
又は酵素禁止剤のような禁ｌに剤か用り・られているこ
とを意味する。

後述する実施例において、本開示に従って製造されるｌ
−１Ａの純度及び効果は、そのｌ−１Ａを馬の関節液代
替物として用いることによって例示され、且つ現有する
市販のＨＡ生生物物対比される。ここに本生成物は、高
純度のＩ−ｉ　Ａ調製剤を体液代替物として或いは池の
目的のために使用することを必要とする人間を含む池の
動物にも、いずれかの用途で使用することができる。

後述する例示的製造工程においては公知の群Ｃの連鎖球
菌１−１　Ａ生産水（Ｓ　ｔｒｅｐ、　ｅｑｕ　ｉ　）
が使用され、新規な培養及び精製法により、制御された
分子量の超純度生歳物かいか１こ好収率（例えはルース
ター・コームから平均３１ｕ＋／ｕ＋％：０．０７９Ｉ
ｌＩ／田）で得られるかが例示される。即ち高純度と良
好な生成物の分子量制御の利点が明白なる経済的利点と
共に提供される。使用されるＳ　Ｌｒｅｐ、ｅｑｕ　ｉ
種の試料は、Ａ＋ｎｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ＋＋ｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ１．ｉｏｎ＋Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ、ＭＤ　２０８　５２　ｉこ、　ノ＼ＴＣＣ第３９゜
５０６号として預託されている。

」上述したように、ＨＡがＡ及びＣ型の連鎖球菌属（Ｓ
　ｔｒｅｐＬｏｃｏｃｃ　ｉ　）の莢膜の主成分である
ことは長い間知られていた。ＨＡの莢膜位置（ヒアルロ
ン酸トｐ＞？膜）を示す連鎖球菌有【幾本の表示はｌ３
ｅａｃｈｅｙ及びＳ　ｔ、ｏ　ｌ　ｌ　ｅｒｍａｎ　ｌ
こよって公表され、ｉ’ｒａｎｓ。

Ａｓ５ｏｃ、Ａｍ、　Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ　Ｐｈｉ　
ｌａ、　、　８５　：　２　］　２−２２１（１，９７
２）に示されている。

示されているように、ｌ（Ａ；ミ膜は全速ｔｉ’４球菌
細胞の大部分を作り」−げる最も外側の成分である。

連鎖球菌培養物の生長中、そのような３、膜は培養物の
インド・イン４（ｉｎｄｉａ　１ｎｋ）染色の後、各ｉ
ｍ胞の周りの輝いたハロー（ｈａｌｏ）として観察する
ことができる。この手法の結果として、最大の莢膜の生
産は、対数相生１（ｌａ６　ｐｈａｓｅ　Ｂｒｏｕ＋Ｌ
ｈ）の開始から約４〜６時間後に、制御された発酵系に
おいて生長する連鎖球菌属のいくつかの種から得られる
ことが決定された。後続の月数及び静止相では、見える
し、膜が消失する。連鎖球菌属のいくつかの種において
、この夕、膜の消失はヒアルロニダーゼにＬる酵素分解
のためであることか知られている。

少くとも１種の群Ｃの連鎖球菌（Ｓ　Ｌｒｅｐ、ｅｑｕ
ｉ）を用い、ｐｌ−１、温度及びクルコース量を制御し
た長期間（２〜５１」間の生長）の発酵研究において、
驚くことに例え≧沖膜か培養物中で見えないとしても１
−１　Ａは実質的に増加しうるということか示された。

そのような研究において、この種は多分ヒアロニグーゼ
に欠けているということが結論された。即ち連鎖球菌属
の細胞外ヒアルロニグーゼーネガテイ７種が］（ｌ＼生
産に特異的な制御された条件下に生長する場合には、全
く純棹な高分子量のＨＡの収獲が達Ｊ＃、され、このヒ
アルロニダーセ酵素の欠如はｌ（Ａの製造の重要な観点
と考えられる。

記述されるように、本発明は優れた品質の、高分子量の
ヒアルロン酸を連鎖球菌属のようなバクテリヤから高収
量で製造する方法及びそのようなｌ−１Ａを、関節の関
節炎（Ｉ　ａｍｅｎｅｓｓ　）及び膨化（ｓｕ＋ｅｌＬ
ｉｎｇ）を）威するために、そのような病気の関節から
の滑液な代替するために使用する方法に関する。

最良の実施例では、群Ｃの連鎖球菌の発ｌＪＺを、１）
　Ｉ（７、０〜°７．２．３７°Ｃにおいて２４〜１２
０時間継続する。生長には、Ｉ　、ｖａｎ　ｄｅＲｉｊ
ｎ、ｌ１ｌ−ｆｅｃＬ、ａｎｄ　Ｉ　ｍｍｕｎ、　、　
２７．４４４．−４４８（４９８０）に記述されている
特別な化学的に定義された媒体か′使用される。この媒
体は、後の精製ニ１−程で除去しなければならない外来
の蛋白を含有しないから好適である。炭素源として役立
つデキス）。

−スを２４時間の間隔で添加する。この培養は、デキス
トロースの添加毎にｌ］　Ｉ（を７．６に調節するとい
う間断的なｇ　Ｉ−Ｉの制御下に行なうことかできる。

収獲から約１２時間前１こ、ｌ１１−１の調節器を停止
し、ｌ）　ｌ（を培養物が生長を止める６、５〜６．８
へ低下させる。これは、より効果的な遠心分離及びいく
らか良好なヒアルロン酸の収量をもたらす。

収穫時にはヒアルロン酸を細胞から遊離させるために、
少くとも０．０１％のラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ
）或いは同等のアニオン性洗剤を培養物に添加する。少
くとも１５分後に、へキサデシルトリメチルアンモニウ
ムブロマイド又は同等の非イオン性洗剤の１（）％溶液
を種／Ｚの量で添加して７０ツク（ｆｌｏｃ）を生成さ
せるためにＳ　ｌ−Ｓ培養物を処理する。

−ＩＩＱには＋−］Ａ及びＳ　Ｉ−Ｓを沈殿させるため
に、ＳＬＳ培養物１０１に対して上述の第２の洗剤を１
００〜４０（１ｍｌ添加する。最高のフロックの生成の
ために少くとも１時間放置した後、沈殿を遠心分離又は
ふるいでの濾過により捕集する。次いでこの沈殿を元の
容量の約］／１０〜１／２Ｏの２ＭＣａＣｌ２中に）８
解する。この溶解は４〜３０℃で少くとも６時間行なう
。次いで細胞の汚染物及び両洗剤を含む沈殿を除去する
ために、イ」られた懸濁液を遠心分離し又はふるいで濾
過する。」ニ澄液を集め、適当なアルコール（９５％Ｅ
ｔＯＨ又は９９％イソプロパ７−ルが好適）２容量で抽
出する。ゼラチン様の沈殿が生成し、これを少くとも１
時間後に遠心分離又はふるい濾過によって集める。この
沈殿を元の容量の約１／１ｏ〜１／２ｏの脱イオン蒸留
水に４〜１０°Ｃで夜通し溶解する。１ｑられる懸濁液
を遠心分離し或いはふるいで濾過して沈殿を除去する。

この上澄液に１％のＮａＣ１（ｕ＋／ｖ）を添加し、溶
解する。次いで適当なアルコール２容量を添加してｔ（
Ａを再沈殿させる。そのような沈殿を少くとも１時間沈
降させ、次いで遠心分離又はふるいでのン濾過１こより
集める。

１−１Ａの水への溶解、続＜１．０％ＮａＣｌの添加及
びアルコールでの沈殿工程を、ＨＡ−水ｌ８液か透明に
なるまで、漸次容量を減らして（元の容量の１７２０〜
１／１００）継続する。これは普通少くとも４回の更な
るアルコール沈殿工程を必要とする。本方法を以下に概
述する。

１、連鎖球菌有機体の生長 ２．５ＬＳ（１０％）１．ｍｌ／１ ３、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（
１０％）１０−０−４Ｏ／１ ４、沈殿の捕集 ５．２ＭＣａＣｌ２に溶解 ６、上澄液の捕集 ７、アルコール２容量（ＨＡ、いくらかの核酸、いくら
かの蛋白の沈殿） ８、沈殿の捕集 ９、沈殿のＤＩ−１−１，０への溶解 １０、未溶解沈殿の廃棄 １１、」上澄液の捕集 １２．１％ＮａＣ１、アルコール２容量（ＨＡの沈殿）
１３、沈殿の捕集 １４．１）Ｉ−Ｈ２Ｏへの溶角子 １５、沈殿の廃棄、」上澄液の捕集 １６．１％ＮａＣｌ、アルコール２容量（ＨＡの沈殿）
１７、沈殿の捕集 １８、Ｄ　Ｉ　−Ｈ２Ｏへの溶解 １９、沈殿の廃棄、上澄液の捕集 ２０、濾過−蛋白結合型（例えばニトロセルロース）（
残存する極少の蛋白の除去） ２１．１％ＮａＣｌ、アルコール２容量（＋−（Ａの沈
殿）２２、沈殿の捕集 ２３、Ｏ，１，５Ｍ燐酸塩で緩衝させた食塩水（ｐｉ（
７゜２）に溶解 ２４、分光学的評価により１％Ｉ−１Ａへ調節２５．４
〜１０℃、２４〜４８時間に亘り、（）、１％β−プロ
ピオラクトンで殺菌 ２６．３７°Ｃ１２４〜４８時間に亘り、β−プロピオ
ラクトンを加水分解 ２７、注射器に充填 生成物製造の最終工程は、９５％ＥｔＯ）−１及υ′９
９％アセトンでの洗浄、続く真空下での乾燥を含んでい
てもよい。乾燥したｌ−１ＡをＯｌ、５Ｍ燐酸ナトリウ
ム緩衝液に１．０％の濃度まで再懸濁させる。これは最
後に０．４５μのニトロセルロース型フィルターを通し
て濾過殺菌し及び／又は最終のバルク形において０．１
％β−プロピオラクトンで殺菌してもよい。このβ−プ
ロピオラクトンでの殺菌は４°Ｃで２４〜４８時間行な
われ、続いて３７°Ｃで２４〜４８時間β−プロピオラ
クトンの加水分解を行なう。最終生成物は０．１５Ｍ燐
酸ナトリウム緩衝液中に１−１　Ａを１．０　ＩｎＨ／
　ＩＴＩ　ｌで含有する。これらの工程に従えば、最高
純度のＨＡか高収量で得られる（ＨＡ＞９９．９０％）
。

収量の例として、Ｓ　ｔｒｅｐ、　ｅｑｕ　ｉの平均１
０１の発酵容器は、乾燥重量で細胞５〜７８及び）−（
Ａ　１．０〜２．５ｇを製造する。それ故に収率は１４
．３〜５％（ＩＩＩ／ｌ１Ｉ）である。米国特許第４，
１４１，９７３号における如外ルースター・コームス（
ｒｏｏｓｔｅｒｃｏｍｂｓ）の抽出からのＨＡの収率は
約０．０７９％と報告されている。

後半の工程における適当な蛋白結合フィルター（例エバ
ニトロセルロースフィルター）を通しての濾過は、最終
生成物ＨＡの反応性を除くために必要であることを特記
しなければならない。他の種類のフィルター（セルロー
スそのもの及び酢酸セルロース）は馬の関節注射試験で
観察されるように反応性を適当には除去しない。この工
程（耐」Ａ中に存在する反応性の蛋白質様の物質の極小
量を除去するものと考えられる。

本発明のバクテリヤに由来するＩ−１Ａの純度は、比色
蛋白分析法、ＵＶ分光法、ＨＰＬＣ法及び平板ゲル（ｓ
ｌａｂｇｅｌ）電気泳動法によって証明される。

最初の方法は、ＢＩＯＲＡＩ）蛋白分析法で測定される
如き蛋白汚染物の定量も包含する。この方法は２００μ
ｇ／＋ｏｌ程度の低蛋白量を検知することがでとる。第
１表は５ｔｒｅｐ、ｅｑ旧の４つの異なる発酵器から抽
出されたヒアルロン酸の水性１゜０％溶液の試験結果を
表示する。

第一１□−表 ＢＩＯＲＡＤ蛋白分析法での結果 斌−料　５９５ＭμにおけるＯＪ）　和■Ａ筏発酵１’
　０．００．０．０００　＜２００ｕａ／＋ｎ１発酵２
　０．００．０．０１０　＜２００ｕε／′ｍ１発酢３
　０．００、Ｏ，００５＜　２００ｕｇ／ｍ　１発酵４
　０．００．０．００５　＜　２００ｕｇ／ｍ　ｌデ′
−夕によれば、１．０％のバクテリヤに由来するＨＡ溶
液の蛋白含量は０．００］％程度の高さであってよい。

蛋白質、ペプチド、及び／又はアミノ酸含量を決定する
第２の方法は２８０　ｍμにおけるＵＶ吸収である。牛
の血清アルブミンの公知の濃度が対照として使用される
。第１１表は、これらの結果を、２５　’７　ｍμにお
ける同一の溶液のＵＶ吸収と比較する。２５７ｍμにお
ける吸収はヌクレオチド又は核酸１）　Ｎ　Ａ及びＲＮ
Ａでの汚染を表わす。２８０　＋ｎμにおける分光学的
吸収はＢＩＯＲＡＤ分析よりも蛋白質汚染物を検出しう
ろことが示される。

バクテリヤに由来するＨ　Ａの１．０％溶液は、２８０
口１μで吸収する汚染物を高々０．１２％含有する。こ
れらの同一の溶液は核酸汚染物を含有しないから、純度
は少くとも９９．８８％の範囲である。この点において
、同様に抽出されたｌ−１Ａのアミノ酸分析が蛋白の＜
０．０４％の存在を示すということは特記に値する。こ
れはＩ（Ａの純度か９９．９６％程度に高いということ
を意味する。これは、本申請者によるとそれぞれ９９．
７８〜９９．８６％の範囲の純度を有する市販のルース
ター・コームスに由来するＨ　Ａ　（Ｐｈａｒｍａｃ　
ｉ　ａ社のＨＹ　Ａ　Ｒ，Ｔ　Ｉ　Ｌ■及びＴ　ｒａｎ
ｓ　Ｂ　ｕｓｓａｎのＨｙａｌｏｖｅｌＴ１４）の純度
と対比できるものである。

悌ユ」七−表 ＵＶ分光法で測定される如き１．０％ヒアルロ／酸の蛋
白及び核酸汚染物 ＬＪＶ吸収　濃　度 ０、Ｄ、　０．Ｄ、蛋白質　核　酸 」（コ［豆槻恒す　Ω翌舵り　」頂ｂ１ｐＢ／＋ｎ　１
発酵器］　０，４５　０．００　０．８［ｉ　０．０発
酵器２　０，８３　０．００　１．２２　０．０発酵器
３　０．７５　０．００　１．１０　０．０発酵器４　
０．４７　０．００　０．６９　０．０Ｍ１ｌｅｓ　Ｌ
ａｂｓ。

低純度　１．１６　＋、３１　１．７０　４８．５Ｐｌ
＋ａｍａｃｉａ ＋１ＹＡＲＴＩ１．　０．９１　１．６３　１．３３　
６０．３Ｔｒａｎｓ　Ｂｕｓｓａｎ ］／３０　ｄｉ　１．　＝０．２７ 純度に関する更なる研究をバクテリヤに由来するｌ−１
Ａに対して行なった。２回のアルコール精製工程の効果
を、２８０ｍμ、２５７ｍμ、及び１９５ＩｌＩμにお
いて分光学的に追跡した。］　’、）　５　ｍμでの吸
収はＩ−１ノ＼の実際の吸収を示し、１−１Ａの濃度と
直線関係にある。第Ｉ１１表は透過度の結果を示し、第
１ｖ表はすべての読みを蛋白、核酸及びｌ（Ａの濃度に
転換しｔこものである。これらの２つの、よ【）最近の
発酵器は、抽出のために９５％ＩＥ　Ｌ　Ｏｌ−１成り
）は９９％イソプロピルアルコールを用いることにより
、純度９９．９９％のバクテリヤに由来するｌ（Ａを生
成した。

２［ＩＤＩ］］］　血　血　１ ５回回　回回３ 畷 −〜　曽　寸　。

更に第１ｔ表に表示した種々の１．０％ヒアルロン酸調
製剤を核酸に対して分析するために、平板ゲル電気泳動
法を用いた。そのような技法はＤＮＡをＲＮＡから区別
することかできる。電気泳動後に核酸を目で見るために
、エチジウム７０マイト２μｇ／ｍｌを含有する０、８
％の底内浸透アガロースを短波長のＵＶ光と組合せて使
用した。非常に大きい分子量であるＤ　Ｎ　Ａは原点近
くに留まり、一方ＲＮＡは緩衝液前端と共に移動した。

２５μｍの試料を、Ｃａｎａｌｃｏ　５ｔａｂ　Ｇｅｌ
装置におり）て９（）ボルトで１８時間電気泳動させた
。結果は本発明、）４つ、）調製剤、ｙ、１よＨＹＡＲ
ＴＴ□−１■」、機動。

いずれにも検知しうる核酸を示さなかった。１（ｙａｌ
ｏｖｅＬ　Ｔｔ’ｉ生成物はかなりの量の核酸をＲＮＡ
の形で示した。

種々のＨＡ調製剤の分子量を分析するために高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた。

これは特許第４，１４１．．９７３号に言及されている
粘度法よりも最新で正確な方法である。今日まで分子量
分布の決定には、唯１つのカラム（Ｗａｔｅ−ｒｓ　Ｍ
ｉｃｒｏ　Ｂｏｎｄａｇｅｌ／Ｅ−Ｈｉｇｈ　Ａ）が使
用されてきた。また正確な分子量を決定するために、必
要な分子量範囲の水性標準試料を試験試料と一緒に取り
扱うことは不可能であった。しかしながら、本申請者は
カラムでの保持時間に基づいて相対分子量を決定した。

理論的には、この方法の場合ピー　りの検出時間か早け
れは分子量が高いことになる。カラムは１５，０００と
７，０００，０００の範囲の最小及び最大分子量の可能
性に対して１０分間の保持時間を示した。第１〜４図は
本申請者の最初の４つの発酵器調製剤に対するＩ−１Ｐ
　Ｌ　Ｃ図を示す。Ｍｉｌｅｓのｌ−１ｙａｌｕｒｏｎ
、Ｐｌ＋ａｒｍａｃｉａのＩ４）′ＡＲＴＩＬ■及（／
’Ｔｒａｎｓ　ＢｕｓｓａｎｎＨｙａｌｏｖ。、４第５
〜７図に示す。ピーク及び肩の保持時間を決定し、分子
量（１５，０００〜７，０００，０００）と保持時間（
０〜１０分）との直線的関係に基づいて相対分子量を決
定した。そのような相対分子量を第ｖ表に示す。第１〜
４図から理解できるように、本開示のＩ−ＩＰ　Ｌ　Ｃ
で分離されたＨ／＼は、本質的に１本の、実質的に対称
な高分子量（平均約２百万以」ニ）分布ピークを示す。

第１〜４図において、ＨＡ含量の少くとも約９８％か図
示された１つのピーク内に入る。このように綿密な高分
子量分布の制御は第５〜７図に例示されるように現存す
る市販品では見られない。第５図（従来法１）はＭｉｌ
ｅｓ　）（ｙａｌｕｒｏｎ卜１Ａ生成物に刻するＩ］Ｐ
ＬＣ図を示す。第６図は〈従来法２）はｌ−１ｙａｌｏ
ｖｅＬ生成物を表わ上第７図（従来法３）ｉ、ｔＨＹＡ
Ｒ’ｒＩ］−生成物を示す。この最終分子量範囲の綿密
な制御は、最小の剪断力しか必要としない抽出工程とい
う簡単化並びに高分子量のＨＡを分解しうるヒアルロニ
ダーゼの欠如によるものと考えられる。

第ｖ表 種々の調製剤におけるヒアルロン酸部分の相分子量 発酵器］　２．２−３．９　２．８ 発酵器２　２．５−４．０　３．８ 発酵器３　１．７−２．８　２．４ 発酵器４　１．１−３．９　２．６ Ｈｙａｌｕｒｏｎ　０，０１５−３．０　０，０１５Ｈ
ＹＡＬＯＶＥＴ　＜０．０１０−３．７　．０１５．１
．８．３．７ＨＹＡＲＴｌ］＝　＜０．０１０−３．８
　１．９上述のように、バクテリヤに由来するＨＡに見
出される、ＨＡ部分の相対分子量範囲は狭く、大部分（
９８％）か約１，１００．Ｏｎ又は２，２００．０００
及び４，０００，０００の範囲にある。

同一の方法によると、Ｈｙａｌｏｖｅｔは２　、７０　
ｏ　、　。

００；１，７００，０００及び３００，０Ｏｔ）の３つ
のはっきりした分子量の部分を含む。最後に、Ｆ１ＹＡ
ＲＴＩＬ生成物は、＜１０，０００〜３，７００．００
０のＩ（Ａ分子量の存在を示す。後者は０゜０７９％に
すぎないＨＡＬか与えない効率の悪い複雑な方法によっ
て製造されるものである。これは５０ｕ＋／＋ｕ％程度
の高収率を達成することのできる連鎖球菌から抽出され
たＩ（Ａと対比される。

皿順炎０代潜 本明細書に記述する如くバクテリヤから製造されるヒア
ルロン酸を、馬の呼骨足根骨及び放射手根骨の関節にお
ける反応性に対して試験した。馬の関節内注射後のＨＡ
調製剤の反応性を測定するために次の臨床指数（ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ　１ｎｄｅｘ）試験を工夫した。

試験の手順は次の通りである二 １、注射すべき関節の正常な動ぎを評価する。

次の定義に従って関節炎指数（）〜５を固定する。

濶弾炎脂−数 Ｏ−関節炎なし １＝僅かに関節炎〜中程度 ２＝認めうる関節炎〜中程度 ３−明らかな関節炎 ４−深刻な関節炎〜歩行又は積荷に抵抗５−積荷不能、
坐った時に起き」ニがれないる。

３、注射すべき関節域の周囲の毛をそる。

４、次の定義に従って膨化観察指数を決定する。

膨Ａ七Ｉ！１ＪｉＪ斤４反 ０−膨化なし １＝明白でない−・触診しうる体液 ２−僅かに顕著〜触診しうる体液 ３＝全関節の顕著な膨化 ４−注射部位において深刻な膨化 ５＝関節の周囲も含む深刻な膨化 ５、布のテープ尺を用いて、第３中足骨（ハ争骨足根骨
関節）の前部の直ぐ前或いは放射手相骨（手根骨関節）
の回りにある補助（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）中足骨の隆起
のすく離れたところの関節の円周を測定する。

注射前後の関節の正確な円周（ｍｍ）を記録する。注射
後の毎１日の円周と元の円周との差を計算する。

差が１．０ｃｍ以上の場合、臨床的指数を決定するため
に正確な測定値を池の２つの指数値にイτｊ加する。

６、注射前に、関節液（１，０〜２．０ｃｃ）を２０〜
２２ｇａ、Ｘ　１　釦つきの３　、　Ｏｕの注射器で除
去する。

７、反応性を評価したヒアルロン酸の１％調製剤２．０
ｃｃを関節に注射する。この注射には関節液を除去する
ために用いたものと同一のｔｌつきの３、　ＯＬｌの注
射器（注射器だけを交換）を使用する。

これは関節の外傷をできるだけ減するために１１なわれ
る。

８、注射後１〜３分間、注射部位に指圧を適用する。こ
れは非常に粘稠な１１ノ＼の逆流を防止する。

９、４日の連続した日、次いで７口重に、注射後観察及
び測定を行なう。

１０、臨床指数（ＣＩ）を次のように計算する：全滑液
指数（Ｌｌ）＝毎日の滑液指数の合計全膨化指数（ＴＳ
Ｉ）＝毎日の膨化の観察の合計＋１、　、０　ＣＩＩＴ
以」二の関節の円周測定の合計ＣＩ＝”ＦＬ　Ｉ　十Ｔ
Ｓ　１ １１、　角イ釈 関節への注射はいくらがの膨化及び滑液の発現と共に外
傷をもたらす。これは、燐酸塩で緩衝された食塩水（Ｐ
ＢＳ）を注射した多くの関節及び関節液だけを除去した
いくつかの関節を評価することによって理解される。こ
れらの外傷を受けた関節についてＣＩを計算した。それ
らは５Ｇの関節において（）〜１８，７で変化した。し
かしながら、これらの広い個々の変化を示す外傷を受け
た関節の、別の３回の研究におけるＣＩの平均は０．７
．５．３及び３．４であった。即ち少くとも１０の関節
における６、０又はそれ以下のＣＩ平均値は注力・ｊの
外傷によるものとして予想しうる。これに基づけば、１
−ＩＡ調製剤の評価に対する馬の関節の反応性において
、６．０又はそれ以下の１０の関節の平均ＣＩ値は許容
できるものとして評価される。

〉６．０の１０の関節の平均ＣＩ値を示す生成物は許容
できない。これらの基準を用いて、いくつかのＨＡ調製
剤を試験した。結果を第ｖ１表に示す。

１−号一表 馬の関係の反応性試験によるヒアルロン酸調製剤の評価 初学的起源のＨＡ　６　１７．４　許容できない精製且
つ濾過した 従来法］、　１０　６．２　許容できない＠Ｖ表に示し
た微生物学的起源のＨＡ　ｌ１ｉｉｉｊ述したように発
酵器１〜４がら得られるものである。

この物質はニトロセルロースでの）濾過後には関節への
注射に対して約８できるが、そのような濾過前には許容
できないということは特記に値する。

一方従来法１　（第５図参照）はニトロセルロースでの
濾過後でさえ許容できない限界上にある。明らかに、従
来法１の調製剤における反応性の蛋白質負荷物はあまり
にも多すぎて、蛋白質を結合する濾過工程を通しても除
去できない。

病気の関節のｌ（Ａでの処置の効果を評価するには、同
一の臨床指数を用いることができる。この試験系におい
ては、完全又は不完全Ｆｒｅｕｎｄ補助剤の関節内注射
で臨床学的徴候を関節に誘導する。

この補助剤は、２ケ月間内にそれ自体逆行しないように
見える極度の関節炎と膨化が特徴の、最初に急性で、次
いで慢性の関節の病状を作り出す。

いくつかのそのような効果の研究はバクテリヤに誘導さ
れた＋（Ａの実験に則して行なわれた。

補助剤で誘導された病状の関節がら関節液のいくらかを
除去し、これをバクテリヤに由来するＩ」Ａで代替する
という効果を評価するために実験を計画した。これを急
性の関節炎（Ｆ　ｒｅｕｎｃｌ注射の３Ｈ内にＩ（ノ＼
注射）及び慢性関節炎（Ｆ　ｒｅｕｎｄ注射の１２〜３
４日以内にＩ−１Ａ注射）の両方で行なった。

臨床指数の評価を、補助剤の注射の日に始め、Ｈ−Ａの
注射から４口開継続し、次いで３週問に亘って週の観察
を行なった。第８及び９図は３０日問に亘る結果を示す
。

第８図は慢性の状態を表わす。第８図におり・て、ａは
Ｎ＝４、発酵器１、急性の場合、ｂはＮ＝２、発酵器２
、急性の場合、Ｃは対照の場合そしてｄは従来法１の場
合を示している０の日の読みを、比較物が良く見えるよ
うに、すべて相対指数尺度で７に調節した。０の日は息
性関節炎におり・てＦ　ｒｅｕｎｄ注射から３日後を表
わす。次り・で第８図は発酵器１及び２、及び更なる精
製後の従来法１、からのＩ−１Ａを注射してから最初の
３Ｏ日間における臨床指数の変化を示す。これらの結果
を、同様の補助剤を注射して、未処置のままで゛放置し
た関節（対照）と比較した。対照の馬はＦ　ｒｅｕｎｄ
ｉ−ｐ射から４日を通して連続的に悪化し、次いでそれ
自体いくらかの改善を示すということが特記される。

しカルながら、この改善は３日で出発値に達しなくて、
４日で頭打ちになるように見える。これは・陽性症状の
誘導に対する典型的な傾向である。急性の徴候における
重要な改善はＨＡの注射後に観察される。

慢性の状態は第９図ｉこ表わされる。第９図において、
ｅはＮ＝４、発酵器２、慢性の場合、ｆｌ、ｔＮ＝１、
発酵器２、自然の場合そしてｇはＮ＝１、発酵器１、慢
性の場合を示している。Ｆ　ｒｅｕｎｄの完全又は不完
全補助剤を、）−ｂ＼の処置前の１３〜；３４日に注射
した馬は、Ｏの日ｉ″ｌｊの少くとも７日間は安定であ
ったからそれ白木対照として役立ちうる。幻照線はこれ
らの対照指数値を表わす。この場合も、ｌ−１Ａでの処
置後、直ぐに臨床学的改善か′見られる。それ故に１回
以上の処置が必要であるということが予期される。

特定できない原因の関節病の１頭の馬を研究に用いた。

第１０図に示すように、３０１ヨ開離して、ハ゛クチリ
ヤに由来するｌ−１Ａをこの関節に２回注射した。この
場合０の日の読みを、完全な処置応答を示すために］Ｏ
に調節した。１回目及び２回目の両方のＨＡの注射後直
ぐに改善か認められた。

１回目の注射後の改善は膨化だけで示されるようにいく
らかの病状の戻りか（＝Ｊ随した。２回目のＨＡ注射後
、関節の膨化は排除され、処置後３ケ月以内において戻
りがなかった。

ここに提示されるデータから、超純粋な／＜クチリヤに
由来するＨ　Ａか馬の関節におり）て非反応性であり、
病気の関節における関節炎及び／又は膨化の改善に対し
て有効であることは明らかである。

本明細書に記述する如きバクテリヤに由来する１−１Ａ
は、オプサルモロンカル（ｏｐＬｌ＋ａｌｔｎｏｌｏ６
ｉｃａｌ）処置に用いるものを含めていずれの市販の生
成物よりも純棹であるから、これらのｌ−１Ａ調製剤は
外科手術中目のガラス体液を代替するためにも使用で外
る可能性が高い。それはルースター・フーム又又は雇□
（・緒１−１　Ａに当てはまるいずれかの他の用途に対
しても代替できるに違いない。

」ニ述の開示において、本発明のＨＡの製造法及び使用
法に対し、多くの変化か同業者には想起されると考えら
れる。ここに」ニ述の実施例は単なる例示と見做すべき
であり且つ本明細書に開示される本発明の範囲は特許請
求の範囲によってだけ制限されるべきであるということ
が意図される。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図は本開示に従って４つの微生物学的発酵器（
図の番号順に発酵器１．２．３および４）から製造され
たＨＡの分子量分布を示すグラフであり、 第５〜７図は３つの市販されている従来法のＩＩｌ＼調
製物の分子量分布を示すグラフであり（図の番号順に従
来法１．２および３）、 第８〜９図は本開示の１−１　Ａ生成物の関節液代替物
としての効果を、対照物及び／又は市販の生成物と比較
するグラフであり、そして 第１．０図は特定されない原因による馬の関節病におけ
る関節液代替物としての本開示の生成物の使用法を示す
クラ７である（馬　２２９番）。 特許出願人　マイルス・ラボラドリース・インコ−ボレ
ーテツド ヂ用 一一 寸　〜　ｎ　〜 ｚｚｚ 工最感蚤冑￥ 畏賓゛まく豐（ ＦＩＧ、　１０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）　ヒアルロニグーゼネガティブ或いはヒアル
   ロニグーゼ禁止であるヒアルロン酸を生産する有機体を
   、ヒアルロン酸の増大量を該有機体中に保証するのに十
   分な条件下に培養腰但し培養を実質的に蛋白を含まない
   媒体中で行ない；（１））　ヒアルロン酸を培養物から
   抽出し；そして（ｃ）　反応・四蛋白を、蛋白を結合す
   る濾過によって除去する、 工程を含んでなるヒアルロン酸の製造法。 ２、有機体を群Ａ及び群Ｂの溶血性連鎖球菌からなる群
   から選択する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　有機体がストレプトコックス・エクイである特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ４、工程（ｂ）の抽出に続いて、アルコールでの沈殿と
   ８２０への溶解を繰返す工程を含んでなる精製工程を行
   ない、次いで蛋白含量か約１．２５１ｒ１ｇ／調製物＋
   ｎｌ以下及び核酸濃度が約４５μ８／調製物■１以下と
   なるまでニトロセルロースを通してｌ濾過する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５、　ヒアルロン酸又はその塩を含んでなり、但し蛋白
   と核酸を実質的に含有せず且つＨＰ　１．、、　Ｃで決
   定される如く１つの、綿密に制御された分子量範囲を有
   する、無菌調製剤。 ６、蛋白含量が約１　、２５　ｍ（３７ｍｌ以下であり
   、核酸含量が約４５μｇ／　ｍ　ｌす、下であ１）、そ
   して調製剤が、ＨＰ　１．、、　Ｃに供したとき本質的
   に１つの、実質的に対称の分布ピークで特徴つけられる
   特許請求の範囲第５項記載の調製剤。 ７、　蛋白含量か約０．１０ｍｇ／ｍｌであり、また核
   酸含量が約５μｇ／ｍｌ以下である特許請求の範囲第６
   項記載の調製剤。 ８、　調製剤を馬の関節液の代替物として用いるとき、
   それが本明細書に記述される馬の関節の反応性試験によ
   って決定される如＜６．０以下の臨床指数を有する、特
   許請求の範囲第７項記載の調製剤。