FI79555B - Foerfarande foer framstaellning av ett hyaluronsyrapreparat. - Google Patents

Description

! 79555

Menetelmä hyaluronlhappovalmlsteen valmistamiseksi

Esillä oleva keksintä koskee menetelmää hyaluroni-happovalmisteen valmistamiseksi.

5 Hyaluronihappo on luonnossa esiintyvä, suurimole- kyylipainoinen polysakkaridi, jonka empiirinen kaava on (Ci4 H20N Na 0Xx )n, jossa n > 1000. Hyaluronihapon yleinen kaava kuvataan Merck Indexissä, yhdeksäs laitos (kolmas painos, 1978), sivulla 624. On tunnettua, että hyaluroni-10 happoa ja sen suoloja, joita tässä yhteydessä myöhemmin nimitetään HA:ksi, voidaan saada ainakin kolmesta lähteestä: ihmisen napanuorasta, kukonharjasta sekä tietyistä bakteeriviljelmistä, kuten esimerkiksi ryhmän A ja ryhmän B hemolyyttlsiltä streptokokeilta. Kuitenkin ainoastaan 15 napanuoraa ja kukonharjaa on käytetty kaupallisesti saatavan HA:n lähteenä. Tämä on jossain määrin yllättävää, kun ottaa huomioon tietyt haitat, jotka liittyvät näihin kahteen lähteeseen (esim. suhteellisen alhaiset saannot, kondroitiinisulfaatin aiheuttama kontaminaatio sekä inten-20 siivinen työn määrä valmistus- sekä puhdistusvaiheissa).

Koska HA:a esiintyy kammiovedessä sekä lasiaisnes-teessä ja nisäkkäiden nivelten nivelnesteessä, on kohdistettu huomattavaa mielenkiintoa puhdistetun HA:n saantiin korvaavana nesteenä suoritettavaa käyttöä varten silmässä 25 ja nivelissä esiintyvien patologisten tilojen korjaamiseksi. HA:n valmistusta kukonharjasta ja ihmisen napanuorasta sekä sen käyttöä silmissä sekä nivelissä kuvataan E. A. Balazsin US-patentissa 4 141 973. Patenttiin sisältyy myös HA:n eristämistä, karakterisointia sekä käyttöä kuvaavaa 30 teknistä kirjallisuutta koskeva selonteko.

Yhdysvaltain patentti 4 303 676, joka on myös Balazsin, kuvaa kosmeettisia formulaatioita, jotka sisältävät kukonharjasta valmistettuja natriumhyaluronaatin Jakelta vaihtelevln molekyylipainoaluein. L. G. Papen US-35 patentti 4 328 803 julkaisee äärimmäisen puhtaan hyaluro- 2 79555 nihapon suolan käytön silmäkirurgiassa. Käytetty HA-tuote oli natriumhyaluronaattisuola, jota on saatavissa Pharmacia Inc.:Itä, jolloin sen rekisteröity tavaramerkki on HYARTIL®, ja sitä on onnistuttu saamaan kaupallisia mää-5 riä kukonharjoista.

Ainoa löydetty kirjallisuus, joka kuvaa hyaluroni-hapon uuttamista bakteereista (katso Kjem ja Lebech, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 84:162-164, 1976), koskee elatusaineiden sekä menetelmän käyttöä, joita ei voida 10 hyväksyä joihinkin tarkoituksiin. Kuvatut elatusaineet eivät pidä yllä useimpien streptokokkien kasvua. Kuvattu menetelmä alkaa siten, että streptokokki tapetaan lämpökäsittelyn avulla. Tämä menettely uuttaa mikro-organismeja vapauttaen lukuisia sisäisiä epäpuhtauksia, jotka toden-15 näköisemmin ovat reagoivia ja joita on vaikea poistaa lopputuotteesta. Sen tähden on todennäköistä, että syntyvää HA:a ei voitaisi ruiskuttaa nisäkkäisiin.

Koska HA:n lääketieteellisten sovellutusten vuoksi edellytetään, että HA:a ruiskutetaan nisäkkääseen (esim.

20 korvaavana nesteenä), on tärkeää, että ruiskutetut tuotteet ovat niin puhtaita kuin mahdollista, jotta vältytään reaktiivisuusongelmilta. Tätä puhtauden tärkeyttä kuvataan Yhdysvaltain patentissa 4 141 973, joka kuvaa äärimmäisen puhdasta HA-tuotetta, joka on valmistettu kukonharjoista 25 tai vaihtoehtoisesti ihmisen napanuorasta. Lisäksi näyttää siltä, että HA-tuotteen molekyylipainon tarkastus on tärkeää (esim. patentti 4 141 973 esittää keskimääräiseksi molekyylipainoksi vähintään 750 000 ja Yhdysvaltain patentin 4 303 676 mukaan on kaksi erillistä tarkastetun mole-30 kyylipainon jaetta, yksi alhaisen ja yksi korkean molekyylipainon jae). Vaikka Swannin julkaisussa, Arch. Opthal. 88, ss. 544-8 (1972), kuvataan suurimolekyylipainoista (1 200 000), erittäin puhdasta (sisältää vähemmän kuin 0,05 % proteiinia) HA-valmistetta, tiedossa ei ole yhtään 35 kuvausta, joka koskee HA-tuotetta, jolla on seuraavia etu- 3 79555 ja: (1) saatavissa mikrobilähteestä suhteellisen alhaisin kustannuksin, korkein saannoin ja sellaisena, että reaktiivisuus injektion yhteydessä on alhainen; (2) valmisteen keskimääräinen molekyylipaino on halutun suuruinen ja tar-5 koin määrätty; ja valmiste on oleellisesti proteiiniton eikä siinä ole nukleiinihappoepäpuhtauksia. Nyt on yllättäen havaittu mahdolliseksi valmistaa sellainen tuote.

Keksintö koskee menetelmää hyaluronihappovalmisteen valmistamiseksi, jonka proteiinipitoisuus on alle noin 10 1,25 mg/ml ja nukleiinihappopitoisuus on alle noin 45 pg/ml ja jonka molekyylipaino on sellainen, että 98 % valmisteesta on molekyylipainoalueella noin 2,0-4,0 miljoonaa määritettynä suuren erotuskyvyn nestekromatrogra-fiällä (HPLC), viljelemällä hyaluronihappoa tuottavaa 15 streptokokkimikro-organlsmin ryhmää A tai C. Menetelmälle on tunnusomaista, että (1) streptokokkimikro-organismia viljellään vesipitoisessa, kemiallisesti määritellyssä väliaineessa, joka ei sisällä eksogeenista proteiinia, (2) käytetään mikro-organismina hyaluronidaasinegatiivista tai 20 hyaluronidaasi-inhiboitua kantaa, (3) talteenotossa vähintään 0,01 paino-% anionista detergenttiä lisätään viljelmään, minkä jälkeen ei-ionista detergenttiä lisätään flok-kuloitumisen aikaansaamiseksi, ja (4) saostunut hyaluroni-happo otetaan talteen ja puhdistetaan suorittamalla mah-25 dollisesti toistuvasti vaiheet, jotka käsittävät liuottamisen veteen, suodattamisen nitroselluloosasuodattimen läpi ja saostamisen alkoholilla.

Edullisissa patentinsuoritusmuodoissa HA valmistetaan ryhmän C streptokokki-organismeista (kuten esimerkik-30 si Streptococcus eguista), jota mieluummin viljellään ela-tusaineessa, jossa ei ole vieraita proteiineja, lopullisen tuotteen ollessa steriili valmiste, jolla on tiukasti säädetty keskimääräinen molekyylipaino ja joka sisältää vähemmän kuin 1,25 mg/ml proteiinia (mieluummin vähemmän 35 kuin noin 0,10 mg/ml) ja vähemmän kuin noin 45 pg/ml nuk- 4 79555 leiinihappoja (mieluummin vähemmän kuin noin 5 pg/ml), ja sitä käytetään nisäkkäillä (esimerkiksi) nivelnesteen korvaajana.

Kuten jäljempänä esitetyistä esimerkeistä ilmenee, 5 eroaa keksinnön mukaisesti valmistettu HA-tuote kaupallisesti saatavissa olevista HA-tuotteista siinä suhteessa, että se on valmistettu hyaluronidaasin suhteen negatiivisesta tai inhiboidusta mikrobiologisesta lähteestä, sillä on tiukasti säädetty keskimääräinen molekyylipaino ja, 10 mikä on hyvin tärkeää, se on oleellisesti proteiiniton ja nukleiinihapoton eikä se sisällä konroitiinisulfaattia, joita kaikkia pidetään ei-suotavina epäpuhtauksina missä tahansa tuotteessa, joka on tarkoitettu korvaamaan jotain elävässä olennossa esiintyvää nestettä. Tässä yhteydessä 15 käytettynä ilmaus "olennaisesti ilman", kun se koskee HA-valmisteen proteiini- tai nukleiinihapposisältöä, tarkoittaa, että tuotteen proteiinisisältö on alhaisempi kuin 1,25 mg/ml (mieluummin vähemmän kuin 0,10 mg/ml)ja nukle-iinihapposisältö on alhaisempi kuin noin 45 pg/ml (mie-20 luummin vähemmän kuin 5 pg/ml). Ilmaisu tiukasti säädetty, suuri molekyylipaino tarkoittaa, että vähintään 98 % HA:sta on annetun suuren keskimääräisen molekyylipainon alueella (noin 2,0 miljoonasta (MM) noin 4,0 MM:aan ja alla kuvatun HPLC-tekniikan avulla suurin piirtein symmet-25 rinen molekyylipainon jakautumishuippu). Hyaluronidaasin suhteen negatiivinen tarkoittaa, ettei organismiin liity mitattavia määriä ekstrasellulaarista hyaluronidaasia (joka pystyy pilkkomaan HA:n pieniksi molekyyleiksi). Hyaluronidaasin suhteen inhiboitu tarkoittaa, että on käytet-30 ty inhibiittoria, kuten esimerkiksi lämpöä tai entsyymi- inhibiittoria eliminoimaan HA:n pilkkoutuminen pienemmiksi molekyyleiksi.

Keksinnön mukaisesti valmistetun HA:n puhtaus ja tehokkuus on osoitettu jäljempänä esitetyissä esimerkeis-35 sä, ja niitä on verrattu olemassa oleviin kaupallisiin i, s 79555 tuotteisiin käyttämällä HA:a nivelnesteen korvaajana hevosella. Voidaan ymmärtää täysin, että tuotetta voidaan myös soveltaa muihin nisäkkäisiin, ihmiset mukaan luettuina, yhteyksissä, joissa tarvitaan erittäin puhdasta HA-valmis-5 tetta korvaavana nesteenä tai muihin tarkoituksiin, kuten esimerkiksi kosmeettisiin aineisiin.

Jäljempänä esitetyissä spesifissä valmistusesimer-keissä käytettiin HA:n tuottajana tunnettua streptokokki C-ryhmää (Streptococcus equi), ja uusien viljely- ja puh-10 distusmenetelmien avulla osoitettiin, kuinka täten on mahdollista saada erittäin suurin saannoin (esim. keskim.

31 % (paino/paino) verrattuna 0,079 % (paino/paino) kukon-harjoista) erittäin puhdas tuote, jonka molekyylipaino on säädetty, ja kuinka täten on mahdollista tarjota suuremman 15 puhtauden suomat edut sekä tuotteen parempi molekyylipai-non kontrolli selvin taloudellisin eduin. Alla käytetyn Streptococcus equi kannan näyte on talletettu laitokseen American Type Culture Collection, Rockville, MO 20852, numerona A.T.C.C. no 39 506.

20 Kuten edellä mainittiin, on pitkään ollut tiedossa, että HA on streptokokki-tyyppien A ja C kapselin pääkompo-nentti. Beachey ja Stollerman ovat julkaisseet streptokok-kiorganismia koskevan kuvauksen, joka valaisee HA:n sijaintia kapselissa (hyaluronaatti-kapseli), ja kuvaus on 25 esitetty julkaisussa Trans. Assoc. Am. Physicians Phila., 85: 212-221, 1972.

Kuten on osoitettu, HA-kapseli on ulkoisin komponentti muodostaen suuren osan streptokokin koko solusta. Streptokokki-viljelmän kasvun aikana sellainen kapseli 30 saatetaan havaita viljelmän tusslvärjäyksen jälkeen kirkkaana kehänä kunkin solun ympärillä. Tämän menetelmän avulla on määritetty, että suurin kapselin tuotto saadaan useilta streptokokki-kannoilta, joita on kasvatettu kontrolloiduissa käymisjärjestelmissä noin 4-6 tunnin ajan 35 kasvun logaritmisen vaiheen alkamisen jälkeen. Myöhemmän 6 79555 logaritmisen vaiheen sekä stationäärisen vaiheen aikana näkyvä kapseli häviää. Tiedetään, että joillakin streptokokki-kannoilla tämä kapselin häviäminen johtuu hyaluroni-daasilla tapahtuvasta entsymaattisesta pilkkoutumisesta.

5 Pitkäaikaisissa käymistutkimuksissa (2-5 päivän mittaisissa kasvatuksissa), jotka on suoritettu ainakin yhdellä streptokokki C-ryhmällä (Streptococcus equi) ja joissa pH, lämpötila ja glukoositasot olivat kontrolloidut, todettiin HA:n tasojen oleellisesti nousseen, vaikka, hämmästyttä-10 vää kylläkin, kapseli ei ollut viljelmässä selvästi nähtävissä. Tällaisissa kokeissa pääteltiin tältä kannalta hyaluronidaasin luultavasti puuttuvan. Täten kun ekstra-sellulaarisen hyaluronidaasin suhteen negatiivisia streptokokki-kantoja kasvatetaan HA:n valmistumisen suhteen 15 tarkoin määritellyissä olosuhteissa, saavutetaan harvinaisen puhtaan HA:n saantoja, jonka molekyylipaino on erittäin tarkoin määritelty, ja tätä hyaluronidaasi-ent-syymin puutetta pidetään HA:n valmistuksen tärkeänä näkökohtana .

20 Kyseessä olevan keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan C-ryhmän streptokokin aikaansaamaa käymistä jatkettiin pH 7,0-7,2:ssa 24 tunnin - 120 tunnin ajan 37eC:ssa. Kasvatukseen käytettiin erityistä kemiallisesti määriteltyä elatusainetta, jota I. van de Rijn on kuvannut julkai-25 sussa Infect, and Immun., 27: 444-448, 1980. Tämä elatus-aine on parempi, koska se ei sisällä mitään vieraita proteiineja, jotka olisi poistettava myöhemmissä puhdistus-vaiheissa. 24 tunnin välein lisätään dekstroosia, joka toimii hiilen lähteenä. Viljelmää saatetaan kasvattaa 30 ajoittaisen pH-säätelyn alaisena säätämällä pH 7,6:ksi kunkin dekstroosilisäyksen yhteydessä. Noin 12 tuntia ennen kasvuston kokoamista pH:n säätäminen katkaistaan, ja pH:n annetaan pudota 6,5-6,8:aan, jossa viljelmän kasvu pysähtyy. Tällöin sentrifugointi on tehokkaampaa ja hyalu-35 ronihapon saannot ovat paremmat.

7 79555

Kasvustoa koottaessa viljelmään lisätään ainakin 0,01 % natriumlauryylisulfaattia (SLS) tai ekvivalentti määrä anionista detergenttiä, jotta hyaluronihappo vapautuu soluista. Vähintään 15 minuutin kuluttua SLS-viljelmä 5 titrataan saostuman muodostumisen suhteen sen jälkeen kun on lisätty vaihtelevia määriä 10-%:ista heksadesyylitri-metyyliammoniumbromidia tai ekvivalenttinen määrä ioniton-ta detergenttiä.

Tätä toista detergenttiä lisätään yleensä 100-10 400 ml 10 l:aan SLS-viljelmää HA:n ja SLS:n saostamiseksi.

Sen jälkeen kun on annettu ainakin yhden tunnin ajan suurimman mahdollisen sakan määrän muodostua, se kootaan sentrifugoiden tai suodattamalla seulan läpi. Tämä sakka liuotetaan sitten 2 M CaCl2:een, jota on noin 1/10-1/20 15 alkuperäisestä tilavuudesta. Liuotus suoritetaan vähintään 6 tunnin kuluessa 4e-30eC:ssa. Syntyvä suspensio sentrifu-goidaan tai suodatetaan seulan läpi, jotta poistetaan saostuma, joka sisältää solujen muodostamat epäpuhtaudet sekä detergent!t. Supernatantti säästetään ja se uutetaan 20 2 tilavuudella sopivaa alkoholia (95 % EtOH tai 99 % iso- propanoli ovat edullisia). Muodostuu hyytelömäinen saostuma, joka kootaan vähintään 1 tunnin kuluttua sentrifu-goimalla tai suodattamalla siivilän lävitse. Saostumaa liuotetaan yön yli 4°-10eC:ssa ionittomassa, tislatussa 25 vedessä, arviolta noin 1/10-1/20 tilavuudessa alkuperäisestä tilavuudesta. Suspensio sentrifugoidaan tai suodatetaan siivilän läpi saostuman poistamiseksi. Supernatant-tiin lisätään yksi prosentti NaCl:a (paino/tilav.) sekä liuotetaan. Sitten HA:n saostamiseksi lisätään 2 tilavuut-30 ta sopivaa alkoholia. Tällaisen saostuman annetaan laskeutua ainakin yhden tunnin ajan, jonka jälkeen se kootaan sentrifugoimalla tai suodattamalla siivilän läpi.

HA:n liuottaminen veteen suoritetaan lisäämällä 1,0 % NaCl, ja alkoholisaostusta jatketaan pienentämällä 35 tilavuutta (1/20 - 1/100 alkuperäisestä tilavuudesta), 8 79555 kunnes HA-vesiliuos on kirkas. Tämä tavallisesti edellyttää ainakin neljä lisäksi tulevaa saostusvaihetta. Seuraa-vana esitetään menetelmän yhteenveto.

Bakteeriperäisen hyaluronihapon uuttamismenetelmää 5 koskeva yhteenveto 1. Streptococcus-organismin kasvatus 2. 1 ml/1 SLS 10 % 3. 10-40 ml/1 heksadesyylitrimetyyliammoniumbromidia 10 % 10 4. Saostuman keräys 5. Liuotus 2M CaCl2:een 6. Supernatantin kokoaminen 7. 2 tilavuutta alkoholia (saostuu HA:a, vähän nukleiini happoja, jonkin verran proteiineja) 15 8. Saostuman keräys 9. Saostuman liuotus Dl-H20:een 10. Liukenemattoman saostuman pois heittäminen 11. Supernatantin saostaminen 12. 1 % NaCl 20 2 tilavuutta alkoholia (HA:n saostuminen) 13. Saostuman keräys 14. Liuotus DI-H20:een 15. Saostuman pois heittäminen Supernatantin kokoaminen 25 16. 1 % NaCl 2 tilav. alkoholia (HA:n saostuminen) 17. Saostuman kokoaminen 18. Liuottaminen DI-H20:een 19. Saostuman pois heittäminen 30 Supernatantin kokoaminen 20. Suodatus - proteiinia sitova tapa (esim. nitrosel-luloosa) (joidenkin vähäisten proteiinijäännösten poistaminen) 21. 1 % NaCl 35 2 tilavuutta alkoholia (HA:n saostuminen) 9 79555 22. Saostuman kokoaminen 23. Liuotus 0,15M fosfaatilla puskuroituun keittosuolaliuokseen, pH 7,2 24. Säätö 1 %:iin HA:a spektrofotometri-määrityksen perus- 5 teella 25. Sterilointi 0,1-%:sella beetapropiolaktonilla 26. Beetapropiolaktonin hydrolysointi 37°C:ssa 24-48 tunnin ajan 27. Ruiskujen täyttö 10 Tuotteen valmistus voi lopuksi käsittää 95 %:sella ja 99 %:sella asetonilla suoritetun pesun sekä sitä seuraavan kuivauksen tyhjössä. Kuivattu HA lietetään uudelleen 0,15 M natriumfosfaattipuskuriin 1,0 %:n konsentraatioksi. Tämä voidaan steriloida suodattamalla se viimeisen 15 0,45 pm nitroselluloosatyyppisen suodattimen läpi ja/tai steriloimalla se lopullisessa päämassan muodossa 0,1 % beeta-propiolaktonin kanssa. Beeta-propiolaktonisteriloin-ti suoritetaan 4°C:ssa 24-48 tunnin ajan, jonka jälkeen beeta-propiolaktoni hydrolysoidaan 37°C:ssa 24-48 tunnin 20 aikana. Lopullinen tuote sisältää 10 mg/ml HA:a 0,15M nat-riumfosfaattipuskurissa. Kun noudatetaan näitä valmistusvaiheita, saadaan erittäin puhdasta HA:a suurin saannoin (>99,90 % HA).

Eräänä esimerkkinä saannosta, keskimäärin 10 litran 25 vetoinen Streptococcus equin käymisastia tuottaa 5-7 g kuivapainoa soluja sekä 1,0-2,5 g kuivapainoa HA:a. Saanto on sen tähden 14,3-50 % (paino/paino). HA:n saannot kukon-harjojen uutteista ovat Yhdysvaltain patentin 4 141 973;n mukaan noin 0,079 %.

30 On huomattava, että sopivan, proteiineja sitovan suodattimen läpi suoritettava loppuvaiheen suodatus (esim. nitroselluloosasuodattimen läpi) on välttämätön vaihe lopullisen HA-tuotteen reaktiivisuuden poistamiseksi. Suodattimien muut tyypit (yksinkertainen selluloosa ja sel-35 luloosa-asetaatti) eivät poista reaktiivisuutta riittäväs- 10 79555 sä määrin, kuten on havaittu hevosen niveleen suoritetussa ruiskutuskokeessa. Arvellaan, että tämä vaihe poistaa HA:hän jääneen reaktiivisen proteiinimateriaalin pienet määrät.

5 Kyseessä olevan keksinnön mukaisen bakteeriperäisen HA:n puhtaus on tutkittu kolorimetrisen proteiinimäärityk- sen avulla, UV-spektrofotometrian, HPLC:n sekä levyllä suoritettavan geelielektroforeesin avulla. Ensimmäisissä kokeissa proteiiniepäpuhtauden määrä mitattiin BIO RAD 10 -proteiini määrityksen avulla. Tällä menetelmällä voidaan havaita niinkin alhaisia proteiinimääriä kuin 200 pg/ml. Taulukossa I esitetään tulokset, jotka on saatu tutkimalla Streptococcus equin neljästä eri käymisastiasta uutetun hyaluronihapon 1,0 prosenttisia vesiliuoksia.

15 Taulukko I

BIO RAD -proteiinimäärityksen tulokset Näyte O.D. 595 nm:ssä Proteiinin konsentraatlo Käymisastia 1 0.00,0.000 < 200 pg/ml Käymisastia 2 0.00,0.010 < 200 pg/ml 20 Käymisastia 3 0.00,0.005 < 200 pg/ml Käymisastia 4 0.00,0.005 < 200 pg/ml

Kyseessä olevien tulosten mukaisesti 1,0 %:isen, baktee-peräisen HA-liuoksen proteiinimäärä saattaa olla 0,001 %.

Toinen menetelmä proteiinin, peptidin ja/tai amino-25 happosisällön määrittämiseksi on UV-absorption mittaus 280 nm:ssä. Kontrollina käytettiin härän seerumin albumiinin tunnettua konsentraatiota. Taulukossa II vertaillaan näitä tuloksia samojen liuosten 257 nm:ssä suoritettujen mittaustulosten kanssa. Absorptio 257 nm:ssä edustaa nuk-30 leotidien tai nukleiinihappojen, kuten esim. DNA:n tai RNA:n aiheuttamaa kontaminaatiota. Huomattakoon, että 280 nm:ssä spektrofotometrillä suoritettavassa mittauksessa havaitaan proteiinien aiheuttama epäpuhtaus tarkemmin kuin Bio Rad -määrityksessä. Bakteeriperäiset, 1,0 pro-35 senttiset HA-liuokset sisältävät enintään 0,12 % epäpuh- 11 79555 tauksia, jotka absorboivat 280 nm:ssä. Koska nämä samat liuokset eivät sisällä epäpuhtautena nukleiinihappoja, niiden puhtaus on vähintään 99,88 %:n alueella. Tässä suhteessa on havaittava, että samalla tavalla uutettu HA si-5 sälsi <0,04 % proteiinia. Tämä tarkoittaisi, että HA:n puhtaus on 99,96 %. Tätä verrataan kukonharjoista peräisin olevan, kaupallisesti saatavan HA:n (HYARTIL®, joka on saatavissa Pharmacialta, tai Hyalovent™, joka on saatavissa Trans Bussanilta) puhtauteen, jolloin kokeidemme 10 mukaisesti puhtaudet ovat vastaavasti 99,78-99,86 %:n alueella.

i2 79555

Taulukko II

1,0 %:sen hyaluronihapon proteiini- ja nukleiinihappo-epäpuhtaus UV-spektrofotometrilla mitattuna UV-absorbanssi Konsentraatio 5 0.0. 0.0. Proteiini Nukleiini- Näyte 280 nm:ssä 257 nm:ssä mg/ml happo mg/ml Käyminen 1 0,45 0,00 0,66 0,0 Käyminen 2 0,83 0,00 1,22 0,0 Käyminen 3 0,75 0,00 1,10 0,0 10 Käyminen 4 0,47 0,00 0,69 0,0

Miles Labs.

(kukonharja) puhtaus alhainen 1,16 1,31 1,70 48,5

Pharmacia 15 HYARTIL R 0,91 1,63 1,33 60,3

Trans Bussan TM

Hyalovet 1,27 >2,0 1,86 >74<300 1/30 laim. = 0,27 20 Puhtautta koskevat lisätutkimukset suoritettiin bak teeriperäisen HA:n avulla. Kahden alkoholipuhdistusmenetelmän tehokkuutta seurattiin spektrofotometrillä 280 nm:ssä, 257 nm:ssä sekä 195 nm:ssä. Absorbanssi 195 nm:ssä edustaa HA:n varsinaista absorbanssia ja se on lineaarisesti 25 johdettavissa HA:n konsentraatioon. Taulukossa III esitetään optista tiheyttä koskevat tulokset, kun taas taulukossa IV kaikki lukemat on muutettu proteiinin, nukleiinihapon ja HA:n konsentraatioksi. Nämä kaksi uudempaa käymis-astiaa tuottivat bakteeriperäistä HA:a, joka oli 99,99 pro-30 senttisesti puhdasta, käytettäessä uuttamiseen joko 95 prosenttista EtOH:a tai 99 prosenttista isopropyylialkoholia.

i3 79555 Ή

rH

> >. ro co

ft TT Οϊ CN CN O VO CO CO CO

90 M * ·» * * to ft o o T- T- 10 o

·· CO

Ej H

• Q m • en o O m ® o vo o O t~~ o r·" en tn***·.

W o »- t- T-

•H

iH

>1

>. r- O CN O

ft vf ιη oo (N

OfOCNr—r—

ft O O O O

H W O

U) CO 10

CO CO H

C ·· ro ή e

Λ co C

^ co 0 G Ω r-~ vo tt T- o co ro · m ® m o en «i·

Xj ,ft O CN O 'CT CN t- r- (0 >h E-i * ·> - * | o w o o o o

> CO

D Λ (0

1 I

> -H

<u n h O >1

^ > CN 00 UO O

co & oo in

3 O ^ CN r— O

-P SO M *.*.*.»

CO CO ft o O O O

•rl CO O

Ό ..co

Λ e H

3 2 ft Ω o C ·οο o m m oo

Cl) O IN S 00 r r n

+J Q *T CN CN O

CO pr *.*.«. «.

O W o o o o 3 •H «—*

rH OP

o <u ftl ,G 1—

H ft -H to CO CO CO

Hrö COOOOOG

H x: > 3 3 3 3 CU

•H to -H -H -H -H g

OG 3 H H rl H H

x o +j I I I I rH

Λί>Η CO O O O O rH

rj<3 -H CN CN CN CN G

rH rH Ό K K K K ft 3 ro Λ o

10 >1 3 · · · · rH

EH® Oi r (N CO Vf - i4 79555

H

rH

O >1 (¾ ft m σι oo co ft O ·.«.«. - (0 j-ι ro s1 σ σ

Ε ft H rH O

c c e m

o O H

ft i-i tn

fΰ 3 E

e -h •H (0

C >i E

O E O o n cm 5-| tn - > *· * C M -m* m σ o rH t— 10 >1 £1

-P -H

O Ή H >1 •P O >i oo m σ m (0 ft ft ·>·* «· Π) ft O <M 00 Ό M’ P rö P *- -P E ft

C O -h i-H O

ω -H C e W

in -P -H \ H

C ro -p tri O (0 <U 3 M P <H \

0 -P E

ft 3 3 E ro ιο O o ft Φ Z O - rO in E-i t~~ c— c—- in EC W <-

•H O

c «

•H

•H

0)

rH *H

E -H

3

C >, co rr cm O

ft VO M· CM r- (0 o * »· * * n nj p o o o o C -H ft

1 -H CO

•H C -H rH in

C -P -h e H

H -p Φ \ h ro -P tn ω p o e

P P P

0 Φ ft tt CM CM CM 0Ο p > O m m m o 0u E-* ^ ^ *

C W O O O O äP

1 O

O T— Φ -h tn in in tn >o-p ooooc — H^ro I CC33Q)t0 tn ro in -h -h -h -h ö tn O 3 p 3 i-HrHr-Hi—1'Hin E -P -P -P I I I I rH ··

Eine in O O O O rH o

C-Ηφ -H d) CM CM CM (M C <M

ΕΌΐη Ό E E E E E ft K

3 E C E ·Η O

(030 3 (0 · · · · H <

H CU E CU > «— cm m m1 ’—' E

15 79555

Erilaisten, taulukossa II lueteltujen, 1,0 prosenttisten hyaluronihappovalmisteiden lisäanalysointiin nukleiinihappojen suhteen käytettiin levyllä suoritettavaa geeli-elektroforeesia. Tällaisen tekniikan avulla voidaan erottaa 5 DNA RNAtsta. Elektroforeesin jälkeiseen nukleiinihappojen visualisointiin käytettiin 0,8 % alhaista endosmoosi-agaroo-sia, joka sisälsi 2 ^ug/ml etidiumbromidia, yhdistettynä lyhytaaltoiseen UV-valoon. DNA, joka on molekyylipainoitaan suurempi, jää lähelle lähtökohtaa, kun taas RNA vaeltaa 10 puskuririntaman kanssa. Elektroforeesi ajettiin 25 ^ul:n näytteestä 18 tunnin ajan, 90 voltin jännitettä käyttäen, Canalcon geelilevylaitteessa. Tulosten mukaan ei havaittu nukleiinihappoja missään neljästä valmisteestamme tai HYAR- öö tm TIL^-tuotteessa. Hyalovet -tuote sisälsi merkittävän määrän 15 nukleiinihappoa RNA:n muodossa.

Erilaisten HA-vaImisteiden analysointiin käytettiin korkeapainenestekromatografiaa (HPLC). Mainittu menetelmä on uudempi ja tarkempi kuin patentissa n:o 4 141 973 mainittu viskometri. Tähän mennessä on käytetty ainoastaan yhtä 20 pylvästä (Waters Micro Bondagel/E-High A) molekyylipainon määrittämiseen. On ollut mahdotonta ajaa vesiliukoisia standardeja molekyylipainon alueella, joita edellytetään koenäytteiden kanssa ajettaviksi tarkkoja molekyylipainoja määritettäessä. Kuitenkin on kyseessä olevan keksinnön yh-25 teydessä määritetty suhteellisia molekyylipainoja pylvään retentioaikojen perusteella. Teoreettisesti tällä menetelmällä määritettynä molekyylipaino on sitä suurempi, mitä aiempi huipun havaitsemisaikä on. Pylvään vähimmäisretentio-aika on 10 minuuttia ja maksimi molekyylipainon erotuskyvyt 30 ovat 15 000 - 7 000 000. Kuvat 1-4 esittävät kyseessä olevan keksinnön mukaisten neljän ensimmäisen käymistuotteen HPLC-seurantoja. Kuvat 5-7 esittävät Milesin Hyaluronia,

Pharmacian HYARTILIA® sekä Trans Bussanin Hyalovetia. Huippujen ja olkapäiden retentioajat on määritetty ja on las-35 kettu molekyylipainon (15 000 - 7 000 000) ja retentioajan (0-10 minuuttia) lineaarisen suhteen perusteella. Kyseessä ie 79555 olevat suhteelliset molekyylipainot on esitetty taulukossa V. Kuten kuvista 1-4 voidaan nähdä, tämän julkaisun mukainen, HPLC:n erottama HA antaa pääasiallisesti yhden ainoan, suurin piirtein symmetrisen, suurimolekyylipainoisen (keskim.

5 suurempi kuin noin 2 MM) jakaantumishuipun. Kuvissa 1-4 ainakin noin 98 % HA:n sisällöstä on esitettyjen yksinkertaisten huippujen sisällä. Suurimolekyylipainoisen jakaantuman loppuun asti suoritettu säätely ei käy ilmi olemassa olevista kaupallisista tuotteista, joilla saatuja tuloksia 10 kuvat 5-7 esittävät. Kuva 5 (aiempi tutkimus #= 1) kuvaa

Milesin Hyaluronin HA-tuotteen HPLC-seurantaa. Kuva 6 esittää (aiempi tutkimus =# 2) esittää Hyalovet-tuotetta ja kuva 7 (aiempi tutkimus #= 3) esittää HYARTIL^ -tuotetta. Lopullisen molekyylipainoalueen loppuun asti suoritetun 15 säätelyn arvellaan johtuvan auttamismenetelmän yksinkertaisuudesta, joka edellyttää vähimmäismäärää leikkausta aikaansaavia vaiheita, sekä hyaluronidaasin puuttumisesta, joka voisi pilkkoa suurimolekyylipainoista HA:a.

Taulukko V

20 Hyaluronihappo-osien suhteelliset molekyylipainot eri valmisteissa

Suhteelliset molekyylipainot miljoonina Näyte Alue Keskimääräinen Käymisastia 1 2,2-3,9 2,8 25 Käymisastia 2 2,5-4,0 3,8 Käymisastia 3 1,7-2,8 2,4 Käymisastia 4 1,1-3,9 2,6

Hyaluroni 0,015-3,0 0,015 HYALOVET <0,010-3,7 .015, 1,8, 3,7 30 HYARTIL® <0,010-3,8 1,9

Kuten edellä on esitetty, bakteeriperäisessä HA:ssa esiintyvien HA-osien suhteellisen molekyylipainon alue on suhteellisen kapea, päämittausalueen (98 %) ollessa noin 35 1 100 000 tai 2 200 000 - 4 000 000. Samalla menetelmällä käytettynä Hyalovet sisältää kolme erillistä molekyylipaino- 17 79555 osaa, nimittäin 2 700 000, 1 700 000 ja 300 000. Lopuksi HYARTIL-tuote sisälsi HA-molekyylipainojen joukon <10 000:sta 3 700 000:aan. Kuten on osoitettu, HYARTIL® -tuote sisältää molekyylipainon kokojen laajimman vaihtelun.

5 Tässä yhteydessä kuvattujen erilaisten analyyttisten testien perusteella on määritetty, että yksinkertaisen menetelmän avulla bakteereista uutettu HA on puhtaampi kuin kolme kaupallista tuotetta, jotka on valmistettu joko kukonhar-joista tai napanuorista. Viimeksi mainittu on valmistettu 10 monimutkaisen menetelmän avulla, joka on tehoton, tuottaen ainoastaan 0,079 % HA:a. Tätä verrataan HA:n kanssa, joka on streptokokista uutettu ja joka voidaan saada niin suurin saannoin kuin 50 % (paino/paino).

Nivelnesteen korvaaminen 15 Tässä yhteydessä kuvatulla tavalla bakteereista val mistettu hyaluronihappo on tutkittu reaktiivisuuden suhteen hevosten sääri-nilkka- (tibiotarsal) sekä värttinäluun puoleisissa ranne- (radial-carpal) nivelissä. Suunniteltiin seuraava kliinisen indeksin antava testi HA-valmisteiden 20 reaktiivisuuden mittaamiseksi hevosille suoritetun nivelensisäisen injektion jälkeen.

Koesuunnitelma on seuraava: 1. Määrätään ruiskutettavan nivelen normaali liikkuvuus. Määrätään raajarikkoisuusindeksit 0-5 seuraavien 25 määritelmien mukaisesti.

Raajarikkoisuusindeksi 0 = Ei raajarikkoisuutta 1 = Vähäistä raajarikkoisuutta - kohtuullinen 2 = Havaittavaa raajarikkoisuutta - kohtuullinen 30 3 = Selvää raajarikkoisuutta 4 = Ankaraa raajarikkoisuutta - haluton liikkumaan tai kantamaan painoa 5 = Ei voi kantaa painoa. Jos eläin on makuuasen nossa, se ei kykene nousemaan ylös.

35 2. Annetaan rauhoittavaa lääkettä hevoselle (esim.

(S)

Rompun^ - sedatiivia) .

18 79555 3. Ihokarvat ajellaan ruiskutettavan nivelen ympäriltä.

4. Määritetään turvotuksen havainnointi-indeksi seu-raavien määritelmien mukaisesti.

Turpoamisen havannointi-indeksi 5 0 = Ei turpoamista 1 = Ei mitään selvää - käsin kosketellen havaittavaa nestettä 2 = Jossain määrin näkyvää - käsin kosketellen havait tavaa nestettä 10 3 = Koko nivelen alueella havaittavaa turvotusta 4 = Ankaraa turvotusta injektiokohdassa 5 = Ankaraa turvotusta, joka ulottuu laajemmalle kuin yksinään niveleen 5. Kankaisella mittanauhalla mitataan nivelen vmpärys- 15 mitta välittömästi jalkapöydän (sääri-nilkka-nivelen) etummaisen sijainnin etupuolelta tai välittömästi distaalisesti ylimääräisen ranneluun, joka sijaitsee värttinäluun (ranne-nivelen) ympärillä, kyhmyn suhteen.

Merkitään muistiin nivelen tarkka ympärysmitta (milli- 20 metreinä) ennen injektiota ja injektion jälkeen. Lasketaan ero alkuperäisen ympärysmitan ja kunakin injektion jälkeisenä päivänä vallitsevan ympärysmitan välillä. Jos ero on suurempi kuin 1,0 cm, tarkka mitta lisätään kahteen muuhun indeksin arvoon kliinisen indeksin määrittämiseksi.

3 25 6. Poistetaan nivelneste (1,0-2,0 cm ) ennen mjek- 3 tiota 3,0 cm :n ruiskulla, jossa on 25,4 mm pitkä 20-22 gaugen neula.

3 7. Niveleen ruiskutetaan 2,0 cm hyauluronihapon 1 % valmistetta, joka on arvioitu reaktiivisuuden suhteen.

3 30 Tämän ruiskeen antamiseen käytetään 3,0 cm :n ruiskua, jossa on sama neula (ainoastaan neulaa vaihtaen), jota käytettiin nivelnesteen poistamiseen. Toimenpide suoritetaan siten, että niveleen kohdistuvaa vammaa pienennetään niin paljon kuin mahdollista.

35 8. Injektiokohtaa painetaan sormella 1-3 minuutin ajan ruiskeen jälkeen. Tämä suoritetaan hyvin viskoosisen i9 79555 HA:n takaisinvirtauksen estämiseksi.

9. Havainnot ja mittaukset suoritetaan neljänä peräkkäisenä päivänä ruiskeen jälkeen, sitten seitsemäntenä päivänä.

5 10. Kliininen indeksi (CI) lasketaan seuraavasti:

Kokonaisraajarikkoisuusindeksi (TLI) = Päivittäisten raajarikkoisuusindeksien summa

Kokonaisturvotusindeksi (TSI) = Päivittäisten turvo-tushavaintojen summa + 1,0 cm suurempien nivelen ympäristön 10 mittausten summa.

CI = TLI + TSI

11. Tulkinta

Niveleen suoritettu ruiskutus yksinään aiheuttaa vammaa vähäisen turvotuksen ja raajarikkoisuuden kehittyessä. 15 Tämä näytettiin toteen arvioimalla monia niveliä, joihin oli ruiskutettu fosfaatilla puskuroitua keittosuolaliuosta (PBS) sekä joitakin niveliä, joista oli poistettu ainoastaan neste. CI:t laskettiin näiden vammautuneiden nivelien perusteella. Ne vaihtelivat 0:sta 18,7:ään 56 nivelen joukossa.

20 Kuitenkin keskimääräiset CI:t, jotka saatiin vammautuneiden nivelien kolmessa erillisessä tutkimuksessa, osoittivat laajoja yksilöllisiä vaihteluita, jotka olivat 0,7, 5,3 sekä 3,4. Täten on ajateltavissa, että ainakin kymmenellä nivelellä saatu keskimääräinen CI-arvo 6,0 olisi otaksuttavasti 25 peräisin ruiskeen aiheuttamasta vammasta. Tällä perusteella määrätään, että 10 nivelen keskimääräisen CI-arvon on oltava 6,0 tai vähemmän, jotta se olisi hyväksyttävä hevosen nivelen reaktiivisuustestissä HA—valmisteiden arvioimiseksi.

Mikä tahansa tuote, joka antaa 10:lle nivelelle keskimää-30 räiseksi CI:n arvoksi >6,0, ei ole hyväksyttävä. Näitä arviointiperusteita käyttäen testattiin useita HA-valmisteita. Tulokset esitetään taulukossa VI.

Taulukko VI

Hyaluronihappovalmisteiden arviointi hevosen nivelen reaktiivisuuskokeessa 20 7 9 5 5 5 5 Nivelien Keskim. Valmisteen

Valmiste lukumäärä CI Hyväksyttävyys

Mikrobiologinen 14 4,6 Hyväksyttävä lähde, HA suodatettu nitrosellu- 13 5,5 Hyväksyttävä 10 loosan läpi

Mikrobiologinen 11 16,4 Ei hyväksyttävä lähde, HA:a ei : suodatettu 6 17,4 Ei hyväksyttävä 15

Aiempi tutkimus -j #=1/ puhdistettu 10 6,2 Ei hyväksyttävä ja suodatettu 20 Taulukossa VI mainittu mikrobiologinen lähde oli aiemmin kuvatulla tavalla saatu fermenttoreista 1-4. On huomattava, että tämä materiaali hyväksytään niveleen ruiskutettavaksi nitroselluloosasuodatuksen jälkeen, mutta ei ennen suodatusta. Toisaalta aiemman tutkimuksen φφ 1 25 (katso kuva 5) mukainen valmiste on ei-hyväksyttävän rajalla vieläpä nitroselluloosasuodatuksen jälkeen. Reaktiokykyinen proteiinikuormitus aiemman tutkimuksen =# 1 mukaisessa valmisteessa on selvästi liian suuri, jotta se voidaan poistaa proteiineja sitovan suodatusvaiheen avulla.

30 Samaa kliinistä indeksiä voidaan käyttää arvioitaessa HA:11a suoritetun sairaiden nivelten hoidon tehokkuutta.

Tässä koejärjestelmässä kliiniset oireet on aiheutettu niveliin ruiskuttamalla niihin täydellistä tai epätäydellistä Freundin adjuvanttia. Tämä adjuvantti aiheuttaa nivelen 35 ensimmäisen akuutin ja sitten kroonisen patologian, jolle on ominaista äärimmäinen raajarikkoisuus sekä turvotus, joka 2i 79555 ei näytä palautuvan itsestään kahdessa kuukaudessa.

Joitakin tällaisia tehokkuuskokeita on johdettu bakteeriperäisten HA-kokeiden perusteella.

Suoritettiin kokeita vaikutuksen arvioimiseksi pois-5 tettaessa nivelnestettä nivelistä, joihin adjuvantti oli indusoinut patologisen tilan sekä korvaamalla se bakteeriperäisellä HA:11a. Tämä suoritettiin sekä akuuteille nivelille (HA:n injektio kolmen päivän sisällä Freundin ruiskeesta) sekä kroonisille nivelille (HA ruiskutettiin 12-34 10 päivän kuluttua Freundin ruiskeesta). Kliinisen indeksin arviointi alkoi adjuvantin ruiskutuksen suorituspäivänä sekä sitä jatkettiin neljän päivän ajan, jonka jälkeen ruiskutettiin HA:a ja tämän jälkeen tehtiin havaintoja päivittäin kolmen viikon ajan. Kuvat 8 ja 9 esittävät 30 päivän 15 ajanjaksoilta saatuja tuloksia.

Kuva 8 kuvaa akuuttia tilannetta. Päivänä 0 lukemat säädettiin seitsemäksi suhteellisen indeksiskaalan avulla, niin että vertailuista voitiin muodostaa paremmin selvä kuva. Päivä 0 edustaa kolmea päivää akuutteihin niveliin suori-20 tetun Freundin ruiskeen jälkeen. Kuva 8 kuvaa kliinisessä indeksissä tapahtuvaa muutosta ensimmäisen 30 päivän aikana fermenttoreista 1 ja 2 saadulla sekä aiemman tutkimuksen #= 1 mukaisella HA:11a puhdistuksen jälkeen suoritetun ruiskeen jälkeen. Näitä tuloksia verrataan samanlaisella adjuvantilla 25 ruiskutettuihin niveliin, jotka on jätetty käsittelemättä (kontrolli). On huomioitava, että kontrollihevoset huonontuvat jatkuvasti neljänä päivänä Freundin ruiskeen jälkeen, ennen kuin ne osoittavat jonkinlaista itsekseen tapahtuvaa parantumista. Kuitenkaan tämä parantuminen ei saavuta lähtö-30 tasoa kolmeen päivään, ja neljäntenä päivänä ilmenee taso-kohdan muodostumista. Tämä on tyypillinen kuva kroonisen patologian induktiolle. Akuuteissa oireissa havaitaan merkittävää parantumista HA-ruiskeen jälkeen.

Kuva 9 esittää kroonista tilannetta. Hevoset, joihin 35 on ruiskutettu Freundin täydellistä tai epätäydellistä adju-vanttia 12-34 päivää ennen HA-käsittelyä, voivat toimia 22 79555 omina kontrolleinaan, koska nämä hevoset ovat stabiileja ainakin seitsemän päivän ajan ennen päivää 0. Kontrolliviiva edustaa näiden kontrolli-indeksien tasoja. Jälleen havaitaan välitön kliininen parantuminen HA:11a suoritetun käsittelyn 5 jälkeen. Näiden hevosten pitempiaikainen tarkastelu on ilmaissut, että parantumisella on taipumus muodostaa taso.

Sen tähden otaksutaan, että useampi kuin yksi käsittely saattaa olla tarpeen.

Kyseessä olevaan tutkimukseen sisältyi yksi hevonen, 10 jolla oli epäspesifisestä syystä sairaalloinen nivel. Kuten kuvassa 10 on esitetty tähän niveleeseen annettiin kaksi bakteeriperäisen HA:n ruisketta 30 päivän päästä toisistaan. Tässä tapauksessa päivän 0 lukemat säädettiin 10:ksi ilmaisemaan täydellisen käsittelyn vastetta. Välitön parantuminen 15 havaittiin sekä ensimmäisen että toisen HA-ruiskeen jälkeen. Ensimmäisen ruiskeen jälkeistä parantumista seurasi vähäinen patologian palautuminen, joka ilmeni ainoastaan turvotuksena. Toisen HA-ruiskeen jälkeen nivelen turpoaminen oli hävinnyt, eikä se palannut kolmeen kuukauteen hoidon jälkeen.

20 Tässä yhteydessä esitettyjen tulosten perusteella on ilmeistä, että äärimmäisen puhdas bakteeriperäinen HA ei reagoi hevosen nivelissä, ja se palauttaa tehokkaasti sai-: rastuneiden nivelten raajarikkoisuuden ja/tai turvotuksen.

Koska tässä yhteydessä kuvattu bakteeriperäinen HA on puh-25 taampi kuin mikään kaupallinen, saatavissa oleva tuote, silmätautiopillisissa hoidoissa käytetyt tuotteet mukaan luettuina, on erittäin luultavaa, että HA-valmisteita voitaisiin myös käyttää korvaamaan silmän lasiaisneste leikkauksen aikana. Niitä voitaisiin käyttää korvaamaan mikä tahansa 30 muu käyttö, jota on sovellettu kukonharjasta tai napanuorasta saadulla HA:lie.

li

Claims (3)

23 7 9 5 5 5

1. Menetelmä hyaluronihappovalmisteen valmistamiseksi, jonka proteiinipitoisuus on alle noin 1,25 mg/ml ja 5 nukleiinihappopitoisuus on alle noin 45 pg/ml ja jonka molekyylipaino on sellainen, että 98 % valmisteesta on molekyylipa inoalueel la noin 2,0-4,0 miljoonaa määritettynä suuren erotuskyvyn nestekromatografiällä (HPLC), viljelemällä hyaluronihappoa tuottavaa streptokokkimikro-organis-10 min ryhmää A tai C, tunnettu siitä, että (1) strep-tokokkimikro-organismia viljellään vesipitoisessa, kemiallisesti määritellyssä väliaineessa, joka ei sisällä ekso-geenista proteiinia, (2) käytetään mikro-organismina hya-luronidaasinegatiivista tai hyaluronidaasi-inhiboitua kan-15 taa, (3) talteenotossa vähintään 0,01 paino-% anionista detergenttiä lisätään viljelmään, minkä jälkeen ei-ionis-ta detergenttiä lisätään flokkuloitumisen aikaansaamiseksi, ja (4) saostunut hyaluronihappo otetaan talteen ja puhdistetaan suorittamalla mahdollisesti toistuvasti vai-20 heet, jotka käsittävät liuottamisen veteen, suodattamisen nitroselluloosasuodattimen läpi ja saostamisen alkoholilla.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että organismi on ryhmän A tai ryh- 25 män C hemolyyttinen streptokokki.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että organismi on Streptococcus equi.