JPH0813847B2 - ヒアルロン酸の分画法 - Google Patents
ヒアルロン酸の分画法Info
- Publication number
- JPH0813847B2 JPH0813847B2 JP62199087A JP19908787A JPH0813847B2 JP H0813847 B2 JPH0813847 B2 JP H0813847B2 JP 62199087 A JP62199087 A JP 62199087A JP 19908787 A JP19908787 A JP 19908787A JP H0813847 B2 JPH0813847 B2 JP H0813847B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は分子量分布が狭く任意の平均分子量に調製さ
れたヒアルロン酸又はその塩を採取する方法に関する。
れたヒアルロン酸又はその塩を採取する方法に関する。
ヒアルロン酸は保湿性にすぐれ、化粧品や外用塗布剤
に利用されている。また、医薬分野において白内障の手
術時の眼球保持剤として利用され、さらに関節炎・腎炎
など応用が展開されている、従来、任意の平均分子量に
調製さる法として加熱、酸アルカリ処理、超音波処理、
酵素処理等分解し、得られたヒアルロン酸またはその塩
を、水に溶解して分子過により分画する方法などが知
られている。
に利用されている。また、医薬分野において白内障の手
術時の眼球保持剤として利用され、さらに関節炎・腎炎
など応用が展開されている、従来、任意の平均分子量に
調製さる法として加熱、酸アルカリ処理、超音波処理、
酵素処理等分解し、得られたヒアルロン酸またはその塩
を、水に溶解して分子過により分画する方法などが知
られている。
サイエンス（Science）228,4705,1324〜1328（1985）
においてヒアルロン酸の分解物のうち、二糖類が４〜５
個連結したヒアルロン酸塩フラグメントである分画にお
いて脈管形成反応の誘発が認められるが、元の高分子量
のヒアルロン酸塩や徹底的に分解したものには脈管形成
能は認められないことが記載されておりある特定の分子
量範囲を有するヒアルロン酸が特定の用途及び効果を有
することが示唆されている。
においてヒアルロン酸の分解物のうち、二糖類が４〜５
個連結したヒアルロン酸塩フラグメントである分画にお
いて脈管形成反応の誘発が認められるが、元の高分子量
のヒアルロン酸塩や徹底的に分解したものには脈管形成
能は認められないことが記載されておりある特定の分子
量範囲を有するヒアルロン酸が特定の用途及び効果を有
することが示唆されている。
しかしながらヒアルロン酸又はその塩の水溶液を限外
過やゲル過、ゲル浸透等のクロマトグラフィーでは
ヒアルロン酸のもつ特異性つまり巨大なランダムコイル
を形成しその水和比容積は２〜６×103ml/gにもなる為
分子量分画する為には希薄溶液の状態でないとできない
ので工業的でない。
過やゲル過、ゲル浸透等のクロマトグラフィーでは
ヒアルロン酸のもつ特異性つまり巨大なランダムコイル
を形成しその水和比容積は２〜６×103ml/gにもなる為
分子量分画する為には希薄溶液の状態でないとできない
ので工業的でない。
本発明者らは効率よくヒアルロン酸またはその塩を分
画できる方法を鋭意検討の結果本発明を完成した。
画できる方法を鋭意検討の結果本発明を完成した。
本発明はヒアルロン酸またはその塩とカチオン界面活
性剤との複合体とし、その複合体を水溶性有機溶剤に溶
解した後、クロマトグラフィーより分画し、次いで複合
体を解離させ、分画されたヒアルロン酸またはその塩を
得ることを特徴とするヒアルロン酸またはその塩の製造
法に関するものである。
性剤との複合体とし、その複合体を水溶性有機溶剤に溶
解した後、クロマトグラフィーより分画し、次いで複合
体を解離させ、分画されたヒアルロン酸またはその塩を
得ることを特徴とするヒアルロン酸またはその塩の製造
法に関するものである。
以下本発明について具体的に説明する。
ヒアルロン酸またはその塩とカチオン界面活性剤との
複合体はヒアルロン酸又はその塩の水溶液にカチオン界
面活性剤、例えばセチルトリメチルアンモニウムハライ
ド（例えばクロライド又はブロマイド）、セチルピリジ
ニウムハライド（例えばクロライド又はブロマイド）を
滴下混和することにより得ることができる。複合体は水
不溶性となり沈澱するので、過または遠心分離により
単離することができる。得られた複合体に水溶性有機溶
媒（好ましくは水100gに50g以上溶解するもので、更に
好ましくは水と無制限に混和するもの）例えばメタノー
ル、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等の低
級アルコール、変性アルコールまたはアセトンなどの低
級アルキルケトン等を加えて溶解する。
複合体はヒアルロン酸又はその塩の水溶液にカチオン界
面活性剤、例えばセチルトリメチルアンモニウムハライ
ド（例えばクロライド又はブロマイド）、セチルピリジ
ニウムハライド（例えばクロライド又はブロマイド）を
滴下混和することにより得ることができる。複合体は水
不溶性となり沈澱するので、過または遠心分離により
単離することができる。得られた複合体に水溶性有機溶
媒（好ましくは水100gに50g以上溶解するもので、更に
好ましくは水と無制限に混和するもの）例えばメタノー
ル、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等の低
級アルコール、変性アルコールまたはアセトンなどの低
級アルキルケトン等を加えて溶解する。
この場合の複合体の濃度は分画するヒアルロン酸もし
くはその塩の分子量にもよるが0.01〜５％（w/v）程度
であり、高分子量の場合程溶液の粘性が増加するため低
濃度となる。例えば数十万〜百万程度の平均分子量のも
のを分画する場合には0.1〜２％程度が好ましい。平均
分子量が100万〜300万の場合には0.02〜１％程度好まし
くは0.02〜0.5％程度である。
くはその塩の分子量にもよるが0.01〜５％（w/v）程度
であり、高分子量の場合程溶液の粘性が増加するため低
濃度となる。例えば数十万〜百万程度の平均分子量のも
のを分画する場合には0.1〜２％程度が好ましい。平均
分子量が100万〜300万の場合には0.02〜１％程度好まし
くは0.02〜0.5％程度である。
クロマトグラフィーには例えば複合体を溶解する有機
溶剤と同じ種類の有機溶剤で洗浄した目的の分画分子量
範囲をもつゲル過又はゲル浸透用担体例えばセファロ
ースCL-6B、セファロースCL-4B、セファロースCL-2B、
セファデックスG200等使用される。
溶剤と同じ種類の有機溶剤で洗浄した目的の分画分子量
範囲をもつゲル過又はゲル浸透用担体例えばセファロ
ースCL-6B、セファロースCL-4B、セファロースCL-2B、
セファデックスG200等使用される。
クロマトグラフィーでの分画は、担体をカラムに充填
し、有機溶剤に溶解した複合体溶液を静かにカラム上に
のせ空間流速（SV）５以下好ましくはSV1以下でゲル中
に浸透させ、同種類の有機溶剤でSV5以下好ましくはSV1
以下で溶出する。溶出した液を一定量ずつ例えば使用し
た担体量の1/10液量ずつ分画する。また一般的なゲル
過法例えば、バスケット遠心器、過筒等に上記担体を
充填して分画を行ってもよい。
し、有機溶剤に溶解した複合体溶液を静かにカラム上に
のせ空間流速（SV）５以下好ましくはSV1以下でゲル中
に浸透させ、同種類の有機溶剤でSV5以下好ましくはSV1
以下で溶出する。溶出した液を一定量ずつ例えば使用し
た担体量の1/10液量ずつ分画する。また一般的なゲル
過法例えば、バスケット遠心器、過筒等に上記担体を
充填して分画を行ってもよい。
分画した溶液に、分画に用いた有機溶媒に溶解する有
機酸の無機塩、好ましくは低級脂肪酸のアルカリ金属塩
例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等を添加すること
により、複合体は解離し、ヒアルロン酸ナトリウムやヒ
アルロン酸カリウムなどのヒアルロン酸塩となって沈澱
する。これを過または遠心分離で採取し、エタノール
で洗浄した後乾燥すると所望の分子量に分画されたヒア
ルロン酸塩を得ることができる。またこの塩を常法によ
り酸でフリーにすることによりヒアルロン酸とすること
ができる。
機酸の無機塩、好ましくは低級脂肪酸のアルカリ金属塩
例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等を添加すること
により、複合体は解離し、ヒアルロン酸ナトリウムやヒ
アルロン酸カリウムなどのヒアルロン酸塩となって沈澱
する。これを過または遠心分離で採取し、エタノール
で洗浄した後乾燥すると所望の分子量に分画されたヒア
ルロン酸塩を得ることができる。またこの塩を常法によ
り酸でフリーにすることによりヒアルロン酸とすること
ができる。
実施例1. 平均分子量の異なるヒアルロン酸ナトリウム３種（平
均分子量26万、91万および130万）を15mgずつ計45mgを
水10mlに溶解した。その1mlをとりその溶液の平均分子
量を極限粘度より求める、残り9mlにセチルトリメチル
アンモニウムクロライドを３％添加して複合体をつくり
これを遠心分離して、上澄液を捨てメタノール10mlでこ
の複合体を溶解する。予めメタノールで洗浄したセファ
ロースCL-2B 200mlをガラスカラムに充填する。複合体
のメタノール溶液を静かにセファロースCL-2B上にのせ
ゲル内に浸透させ、続いてメタノールを空間流速（SV）
0.5で通液する。通過液を40mlずつ13分画した。各分画
液に無水酢酸ナトリウムを0.1gずつ添加すると分画番号
4,5,6,12にヒアルロン酸ナトリウムが析出した。これを
取し、エタノールで洗浄後乾燥し、0.2モル食塩水に
溶解し、粘度、並びにカルバゾール硫酸法よりヒアルロ
ン酸含量を求め、極限粘度を求め分子量を算出した。
均分子量26万、91万および130万）を15mgずつ計45mgを
水10mlに溶解した。その1mlをとりその溶液の平均分子
量を極限粘度より求める、残り9mlにセチルトリメチル
アンモニウムクロライドを３％添加して複合体をつくり
これを遠心分離して、上澄液を捨てメタノール10mlでこ
の複合体を溶解する。予めメタノールで洗浄したセファ
ロースCL-2B 200mlをガラスカラムに充填する。複合体
のメタノール溶液を静かにセファロースCL-2B上にのせ
ゲル内に浸透させ、続いてメタノールを空間流速（SV）
0.5で通液する。通過液を40mlずつ13分画した。各分画
液に無水酢酸ナトリウムを0.1gずつ添加すると分画番号
4,5,6,12にヒアルロン酸ナトリウムが析出した。これを
取し、エタノールで洗浄後乾燥し、0.2モル食塩水に
溶解し、粘度、並びにカルバゾール硫酸法よりヒアルロ
ン酸含量を求め、極限粘度を求め分子量を算出した。
実施例2. 実施例１と同様にサンプルを調製し、セファロースCL
-6Bを使って分画を行った。
-6Bを使って分画を行った。
比較例 実施例１で用いた平均分子量の異なるヒアルロン酸ナ
トリウム酸３種を15mg/mlずつ計45mgを水10mlに溶解し
た。1mlを原液サンプルとし残りの9mlをセファロースCL
-2Bで分画したが分子量分画はできなかった。
トリウム酸３種を15mg/mlずつ計45mgを水10mlに溶解し
た。1mlを原液サンプルとし残りの9mlをセファロースCL
-2Bで分画したが分子量分画はできなかった。
〔効果〕 以上のようにヒアルロン酸またはその塩は水溶液の状
態では分子ふるいによる分画でも分子量分画はできない
が、カチオン界面活性剤と複合体とし有機溶媒のもとで
分子ふるいにかければ分子量分画ができ、しかも分子量
分布幅の小さい好みのサイズのヒアルロン酸またはその
塩を取得できる。現在のところ真にヒアルロン酸を分子
量分画した例はなく、この方法は工業的にも実施可能な
方法である。
態では分子ふるいによる分画でも分子量分画はできない
が、カチオン界面活性剤と複合体とし有機溶媒のもとで
分子ふるいにかければ分子量分画ができ、しかも分子量
分布幅の小さい好みのサイズのヒアルロン酸またはその
塩を取得できる。現在のところ真にヒアルロン酸を分子
量分画した例はなく、この方法は工業的にも実施可能な
方法である。
Claims (1)
- 【請求項１】ヒアルロン酸またはその塩とカチオン界面
活性剤との複合体とし、その複合体を水溶性有機溶剤に
溶解した後、クロマトグラフィーにより分画し、次いで
複合体を解離させ、分画されたヒアルロン酸またはその
塩を得ることを特徴とするヒアルロン酸の分画法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62199087A JPH0813847B2 (ja) | 1987-08-11 | 1987-08-11 | ヒアルロン酸の分画法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62199087A JPH0813847B2 (ja) | 1987-08-11 | 1987-08-11 | ヒアルロン酸の分画法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6443502A JPS6443502A (en) | 1989-02-15 |
| JPH0813847B2 true JPH0813847B2 (ja) | 1996-02-14 |
Family
ID=16401886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62199087A Expired - Lifetime JPH0813847B2 (ja) | 1987-08-11 | 1987-08-11 | ヒアルロン酸の分画法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0813847B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1247175B (it) * | 1991-04-19 | 1994-12-12 | Fidia Spa | Procedimento per la purificazione di acido ialuronico e frazione di acido ialuronico puro per uso oftalmico. |
| US6946551B2 (en) | 2003-03-12 | 2005-09-20 | New Life Resources, Llc | Preparation of hyaluronic acid from eggshell membrane |
| US8580315B2 (en) | 2004-03-10 | 2013-11-12 | Esm Technologies, Llc | Anti-inflammatory activity of eggshell membrane and processed eggshell membrane preparations |
| JP6064541B2 (ja) * | 2012-11-22 | 2017-01-25 | 住友ベークライト株式会社 | 糖鎖精製方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS609042A (ja) * | 1983-06-09 | 1985-01-18 | ジ−・テイ−・イ−・プロダクツ・コ−ポレイシヨン | 添加ガスのイオン化電位選択を使用するシングルエンドのメタルハライド放電ランプ |
| JPS60133894A (ja) * | 1983-11-25 | 1985-07-17 | マイルス・ラボラトリース・インコーポレーテツド | ヒアルロン酸およびその製造法 |
-
1987
- 1987-08-11 JP JP62199087A patent/JPH0813847B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS609042A (ja) * | 1983-06-09 | 1985-01-18 | ジ−・テイ−・イ−・プロダクツ・コ−ポレイシヨン | 添加ガスのイオン化電位選択を使用するシングルエンドのメタルハライド放電ランプ |
| JPS60133894A (ja) * | 1983-11-25 | 1985-07-17 | マイルス・ラボラトリース・インコーポレーテツド | ヒアルロン酸およびその製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6443502A (en) | 1989-02-15 |
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