NO301169B1

NO301169B1 - Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive komplekser av deprotonisert hyaluronsyre

Info

Publication number: NO301169B1
Application number: NO904584A
Authority: NO
Inventors: Kalman Burger; Geza Takacsi Nagy; Ivan Rethey; Janos Illes; Bela Stefko; Erzsebet Neszmelyi; Istvan Gebhardt; Istvan Racz; Arpadne Kiraly; Viktoria Varkonyi
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1989-02-24
Filing date: 1990-10-23
Publication date: 1997-09-22
Also published as: EP0413016A1; IE62408B1; GEP19981358B; AU623232B2; PT93237A; JPH03505231A; JP2571312B2; AR243538A1; CA2027596C; UA26324A; SK279530B6; CN1051228C; MY105168A; FI101707B; PL163417B1; IE900637L; ES2061016T3; KR960015624B1; NO904584L; LV10112B

Description

Oppfinnelsen vedrører analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive komplekser av deprotonisert hyaluronsyre og 3d-metallioner i 4. periode i "d"-feltet i Mendelejews periodiske system, det vil si grunnstoffene fra

Sc til Zn. I disse grunnstoffene "bygger" det "nye" elektron inn den umettede 3d-orbital.

Ifølge en særlig foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles de vandige oppløsninger som inneholder de nye forbindelsene av deprotonisert hyaluronsyre med 3d-metallioner fra 4. periode i det periodiske system, direkte fra en vannoppløsning av natriumhyaluronat.

De nye forbindelsene fremstilt ifølge foreligg-

ende oppfinnelse, omfatter hovedsakelig sink- og kobolthyaluronat. Forbindelsene anvendes i farmasøytiske (terapeutiske) preparater. Indikasjonsområder for preparatene som inneholder de nye forbindelsene, er

f.eks.: akselerasjon av epitelisering av epitelfattige kroppsflater, heling av lårsår, liggesår (sengsår), sår som til å begynne med ikke vil gro, brannsår, strålings- og varmeinduserte sår, alminnelig akne og kompliserte akner, men de kan anvendes også på andre områder.

Hyaluronsyre er et makromolekyl som har vært kjent i

mer enn 50 år, og som først ble beskrevet av Meyer et al. (J. Biol. Chem., 107, s. 629 (1954), og J. Biol. Chem., 114,

s. 689 (1936)). Strukturbestemmelsen ble utført av Wéissman et al. (J. Am. Chem. Soc. , 76_, s. 1753 (1954)). Hyaluronsyre er et høyviskøst, naturlig forekommende glukosaminoglykan som inneholder avvekslende 8^_3~glukoronsyre-og 3-j-_^-glukos-aminrester, og dens molekylvekt er mellom 50.000 og flere millioner (8-13 millioner). Utvinningen av hyaluronsyre er en gammel oppgave. Separasjonen og bruken av en ekstra ren hyaluronsyre er beskrevet f.eks. i US patentskrifter nr. 4.141.973 og 4.303.676, og i europeisk patentskrift nr.

114.019. Opp tilde siste årene er hyaluronsyre blitt anvendt som natriumsalt, f.eks. i terapi, hovedsakelig i optalmolo-gien, kirurgien og som kosmetika. Saltene av hyaluronsyre dannet med alkali-, jordalkali-, magnesium-, aluminium-, ammonium- eller substituerte ammonium ioner, kan tjene som bærere for å fremme absorpsjonen av legemidler (se belgisk patentskrift nr. 904.547). Tungmetallsalter av hyaluronsyre (hvor "tungmetaller" betyr grunnstoffene i den 5., 6. og 7. periode av det periodiske system, samt lantanidene og actinidene) og blant disse sølvsaltet, anvendes som fungi-cide midler, mens gullsaltet anvendes til behandlingen av artritt (se PCT patentsøknad WO 87/05517).

Det ble bevist ved hjelp av forskjellige struktur-belysningsmetoder at sekundærstrukturen, dvs. konformasjonen til hyaluronsyre, endres ved binding av metallioner (W.T. Winter og A. Sruther, J. Mol. Biol., 517, s. 761 (1977);

J.K. Sheehan og E.D.T. Atkins, Int. J. Biol. Macromol, 5_,

s. 215 (1983) og N. Figueroa og B. Chakrabarti, Biopolymers, 17, s. 2415 (1978)). Betydelig varierende virkninger på mole-kylstrukturen kan utøves selv ved hjelp av metallioner av lignende karakter som vist ved komparativ røntgenundersøkelse av kalium- og natriumhyaluronat (A.K. Mitra et al., J. Macromol., Sei. Phys. 824, s. 1 og 21 (1985)). Dette er særlig gyldig for forbindelser av hyaluronsyre dannet med metallioner av forskjellige sorter som bærer forskjellige lad-ninger .

I litteraturen kan det ikke finnes noen henvisning vedrørende forbindelser (komplekser) av hyaluronsyre dannet med 3d-metallioner fra den 4. periode i det ..periodiske system; faktisk er hyaluronsyre i henhold til gelfiltrerings-kromatografiundersøkelser, i motsetning til heparin, ute av stand til å binde sinkioner (R.F. Parish og W.R. Fair, Biochem. J., 193, s. 407-410 (1981)).

Til tross for det faktum at hyaluronsyre (eller dens natriumsalt) ifølge litteraturen er ute av stand til å binde sinkioner, foretok oppfinnerne til den foreliggende oppfinnelse en undersøkelse av koordinasjonskjemien til interaksjonen mellom hyaluronsyre og 3d-metallioner fra den 4. periode i det periodiske system, og blant disse hovedsakelig sink- og koboltioner. Ettersom hyaluronsyre nesten utelukk-ende er kommersialisert som natriumsaltet derav som således er det grunnleggende stoff i alle systemer som inneholder hyaluronat, ble våre undersøkelser påbegynt på interaksjonen av natriumioner og hyaluronat. For dette formål ble aktiviteten av det frie natriumion i vandige natriumhyaluronatopp-løsninger målt ved å bruke en natriumselektiv glasselek-trode. Det ble utvetydig fastslått fra disse målingene at ikke mer enn 60% av natriumioner innført som ekvivalent sammen med carboxylatgrupper av hyaluronat, er til stede som frie ioner i vannoppløsningene, mens de gjenværende 40% er den form som er bundet til hyaluronatet.

Ifølge våre målinger kan mengden av natriumioner bundet økes til 50-55% beregnet for alle tilgjengelige carboxylatgrupper ved å øke natriumionkonsentrasjonen. Det er således blitt bekreftet at natriumhyaluronat i motsetning til de vanlige egenskapene til salter, ikke dissosieres fullstendig i vannoppløsning.

I det neste trinn av vår undersøkelse ble en vannopp-løsning av natriumhyaluronat titrert med sinkkloridoppløsning ved å bruke en natriumion-selektiv elektrode nevnt ovenfor for å følge endringen i aktiviteten til frie natriumioner i systemet. En karakteristisk kurve som gjenspeiler prosessen, er vist i figur 1. Det er verdt å legge merke til at natriumioner opprinnelig bundet til hyaluronat, frigjøres ved virkningen av sinkioner. Basert på resultatene av disse målingene frigjøres hele natriumionkonsentrasjonen ved hjelp av en ekvivalent mengde sink, et faktum som utvetydig beviser at sinkioner bindes sterkere til hyaluronat enn natriumioner gjør. Den tidligere fastslåelse av at hyaluronsyre ville være ute av stand til å binde sinkioner (R.F. Parrish og W.R. Fair, Biochem. J., 193, s. 407 (1981)), har således blitt eksperimentelt tilbakevist.

En alminnelig anerkjent kunnskap som har vært gyldig opptil nå, ble derved motbevist.

Fra våre undersøkelser omtalt ovenfor, ble det klart

at gjennom interaksjonen av ekvivalente mengder av natriumhyaluronat og sinkioner (sinkklorid) i vandig oppløsning, dannes en sinkhyaluronatforbindelse med en støkiometerisk sammensetning. Etter en passende isotonisering kan den erholdte oppløsning anvendes direkte til terapeutiske formål,

og sinkforbindelsen behøver ikke å bli fremstilt i fast tilstand i en separat fremgangsmåte. Preliminære undersøkelser utført ved å bruke koboltion og andre 3d-metallioner, førte til lignende resultater.

Komplekset ble ikke desto mindre fremstilt i fast tilstand for karakterisering, og det direkte miljøet til sinkionet ble bestemt ved å bruke metoden "Extended X-ray Absorption Fine Structure" (EXAFS). Det er blitt fastslått at sink er omgitt av fire oxygenatomer i den første koordina-sjonssfære. Lengden av Zn-O-bindingsstrekningene er 199 pm, mens to carbonatomer er til stede i en lengre strekning på 241 pm fra sinkatomet.

Ifølge våre undersøkelser adskiller sinkhyaluronat seg betydelig fra det analoge kobberkompleks som inneholder fire ekvatoriale og to aksiale Cu-O-bindinger med verdiene på hhv. 194 og 234 pm. Avstanden mellom kobberatomet og de neste to carbonatomene er 258 pm. Strukturen til koboltkomplekset er lik med sinkkomplekset, men ikke med kobberkomplekset.

Foreliggende oppfinnelse vedrører således fremstilling av komplekser av deprotonisert hyaluronsyre med 3d-metallioner fra den 4. periode i det periodiske system.

Kompleksene kan anvendes i et preparat som inneholder som aktiv bestanddel eller bærer, et slikt kompleks av hyaluronsyre med 3d-metallioner fra den 4. periode i det periodiske system, eventuelt i blanding med én eller flere andre aktive bestanddel(er) og/eller additiver.

Ifølge oppfinnelsen er det tilveiebrakt en analogifremgangsmåte for fremstilling av de nye komplekser, som er kjennetegnet ved at

a) en vandig oppløsning inneholdende den ekvivalente mengde av et salt, fortrinnsvis kloridet av et av 3d-metallionene i den 4. periode i det periodiske system, tilsettes til en vandig oppløsning av natriumhyaluronat eller til et alkali- eller jord-alkalimetallsalt, eventuelt et sølvsalt av

hyaluronsyre, eller

b) en forbindelse dannet av hyaluronsyre og et kvaternært ammoniumsalt i en vandig suspensjon, oppløses i

et oppløsningsmiddelpar inneholdende vannoppløsningen av et 3d-metallion i 4. periode av det periodiske

system og et oppløsningsmiddel som er delvis blandbart med vann, fortrinnsvis n-butanol, hvoretter - det erholdte kompleks av deprotonisert hyaluronsyre og 3d-metallionet i 4. periode av det periodiske system utfelles med en alkanol eller et alkanon på kjent måte, eller - utfellingen skilles fra oppløsningen og, deretter, om ønsket,

- tørkes den under milde betingelser.

Basert på det ovenfor anførte, er det blitt utviklet en fremgangsmåte for fremstilling av vandige oppløsninger som inneholder som aktiv bestanddel hhv. en sinkhyaluronatforbindelse (kompleks) eller en lignende forbindelse av et 3d-metallion fra den 4. periode i det periodiske system. Disse oppløsningene ble i hvert tilfelle fremstilt ved direkte om-setning av metallionet med hyaluronkomponenten. Denne frem-gangmåten for fremstilling gjorde det unødvendig på forhånd å fraskille de aktive bestanddelene nevnt ovenfor i en fast tilstand. I oppløsningen fremstilt ved å bruke fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er mengden av fritt (metall-ubundet) hyaluronat neglisjerbar selv i nærvær av en ekvivalent mengde sink. Etter virkningen av et overskudd av sinkioner blir dannelsen av sinkhyaluronatforbindelsen (komplekset) kvantitativ.

I løpet av fremstillingen av metallforbindelsene på den ovenfor omtalte måte forblir pH ved en verdi på ca. 5. I tilfellet med en 0,2 vekt/volum% (v./vol.) hyaluronatoppløs-ning når pH en verdi på 5,4, mens i tilfellet med 0,5 v/vol% er pH-verdien 5. Når det er nødvendig, kan pH i det sistnevnte system reguleres til en verdi på 5,5-5,6 ved tilset-. ning av noen få dråper av en isoton natriumacetatoppløsning. To sorter oppløsning som inneholder sinkhyaluronat som aktiv bestanddel, er blitt fremstilt ved å anvende fremgangsmåten omtalt ovenfor. 1. Sinkhyaluronatoppløsning gjort isoton ved hjelp av et overskudd av sinkklorid: Idet man tok i betraktning at fritt sinkklorid alene også fortrinnsvis kan anvendes innen dermatologien, ble det osmotiske trykk til sinkhyaluronatoppløsningen regulert til den isotone verdi ved å bruke et overskudd av sinkklorid. Den derved erholdte oppløsning inneholdt ikke noe fritt (sink-ubundet) hyaluronat i det hele tatt, men et overskudd av sinkklorid var til stede i systemet sammen med sinkhyaluronat . 2. Sinkhyaluronatoppløsning gjort isoton ved hjelp av et monosakkarid eller en sukkeralkohol: For en terapeutisk anvendelse hvor tilstedeværelsen av hyaluronat-bundne sinkioner ikke er indikert, ble oppløs-ningen inneholdende sinkioner i en mengde ekvivalent med hyaluronatet, gjort isoton ved å bruke en polyalkohol (sukkeralkohol, fortrinnsvis sorbitol) eller et mono- eller disakkarid (fortrinnsvis glukose). Innholdet av fritt sinkion og fritt hyaluronat i disse sistnevnte systemer nådde ikke 5% av hhv. det totale sink- eller totale hyaluronatinnhold.

Under anvendelse av forbindelsene

kan det eventuelt være påkrevet med ionefrie preparater. Forbindelsene fremstilt ifølge fremgangsmåten ovenfor ifølge oppfinnelsen, inneholder nemlig vanligvis natriumklorid eller et annet salt dannet fra utgangshyaluronatkationet og

-anionet av 3d-metallsaltet.

To forskjellige fremgangsmåtevarianter kan anvendes til fremstillingen av en saltfri hyaluronsyreforbindelse

dannet med et 3d-metallion. Disse er som følger:

a) En oppløsning av et kvaternært ammoniumsalt tilsettes porsjonsvis til oppløsningen av et kjent hyaluronat, fortrinnsvis natriumhyaluronat. Etter tilfredsstillende rensing oppløses den utfelte, nye, kvaternære ammoniumhyaluronatfor-bindelse under kraftig omrøring i et oppløsningsmiddelpar bestående av en vandig oppløsning av et 3d-metallion fra 4. periode i det periodiske system, og et oppløsningsmiddel som er delvis blandbart med vann, fortrinnsvis n-butanol. De to fasene får adskilles, så utfelles hyaluronatforbindelsen ved å tilsette en alkanol eller et alkanon til vannfasen, utfellingen fraskilles og vaskes, eller b) etter tilsetning av 2,0-3 volumer av en C-^j-alkanol eller et C3_^-alkanon under omrøring til en sinkhyaluronat-oppløsning passende til en ikke isotonisert oppløsning inneholdende sinkklorid i en mengde som er ekvivalent med hyaluronatet, frafiltreres det utfelte sinkhyaluronat og vaskes med alkanolen eller alkanonet, alt etter hva som er brukt til utfellingen. Når det er nødvendig, oppløses sinkhyaluronatet i ionefritt vann og utfellingen gjentas.

Når det trengs et fast, ionefritt sinkhyaluronat, tørkes utfellingen under redusert trykk under milde betingelser. I tilfellet med et krav for en ionefri sinkhyaluronat-oppløsning er det foretrukket å oppløse sinkhyaluronatet som er gjort fritt for oppløsningsmidlet. Ifølge hvilken som helst av de to fremgangsmåtevariantene fås et ionefritt, fast eller oppløst produkt med en renhet som er avhengig av kvaliteten på utgangssinkhyaluronatet.

Resultatene av den klinisk-farmakologiske undersøkelse av et preparat (eksempel 13) inneholdende som aktiv bestanddel sinkhyaluronatet fremstilt ifølge oppfinnelsen, er vist på en behandling av lårsår brukt for akselereringen av epitelisering av epitelfattige overflater. Et preparat inneholdende natriumhyaluronat, ble brukt som kontroll.

Denne undersøkelsen ble utført på 12 eller 14 sår, hhv. på 8 eller 12 pasienter som led av lårsår. Fordelingen av pasientene i de to gruppene etter kjønn og alder, samt etter typen av sykdom, var som følger:

Behandlingene ble utført på en slik måte at før behandlingen begynte, ble det utført en rensebehandling alt etter sårets kliniske tilstand. Behandlingen med hhv. sink-eller natriumhyaluronat ble påbegynt på sår som var nesten renset, eller i tilfeller hvor en betydelig forminsking av sårene var observert. Behandlingen ble utført én gang daglig på en slik måte at preparatet ble dryppet på overflaten av det rensede sår i en mengde som fuktet overflaten av såret med et tynt lag.

Preparatet ble brukt i 4 uker. Ved begynnelsen av behandlingen og så en gang i uken ble dataarket utfylt, og sårene til pasientene ble dokumentert ved hjelp av foto-grafier. En pussprøve ble tatt for bakteriologisk undersøk-else.

Kjennetegnene samt alvorligheten av epitelskadene ble angitt med de følgende symboler og poeng.

Evaluering

For evaluering ble verdiene for de forskjellige karakteristika bestemt, og det generelle alvorlighetsresultat ble beregnet ved å bruke den følgende formel:

Resultatene av de klinisk-farmakologiske undersøk-elser er illustrert i figur 2. Resultatene av behandlingen med sinkhyaluronat er vist på kurven merket med et kryss, mens resultatene av behandlingen med natriumhyaluronat er vist på kurven med et kvadrat, som en funksjon av antallet uker med behandling. Poengverdien plottet på ordinaten, ut-gjør den generelle alvorlighetsindeks beregnet ved å bruke formelen ovenfor.

For en mer korrekt sammenligning av sinkhyaluronat og natriumhyaluronat brukt som kontroll, er de relativt korrekte verdier i forhold til utgangspoengverdiene som 100%, vist i figur 3.

Endringen i de relative, korrekte verdier ble evaluert statistisk som en funksjon av antallet (1-4) uker. Etter sink- og natriumhyaluronatbehandling avtok antallet sår til under en relativ poengverdi på hhv. 90, 80, 70 og 60% etter 1, 2, 3 og 4 uker med undersøkelse. Resultatene er oppsummert i tabell 1.

Det kan fastslås fra tabell 1 at behandlingen med sinkhyaluronat i hver uke var fordelaktig sammenlignet med resultatene oppnådd med natriumhyaluronat brukt som kontroll.

Den statistiske analyse av den oppnådde respons for den aktuelle hypotese beviste at fordelen med sinkhyaluronat-preparatet var svært signifikant (p > 99%) sammenlignet med natriumhyaluronat.

Ved en ytterligere statistisk bearbeidelse ble en nærmere fordeling av de relative poengverdier undersøkt som en funksjon av behandlingstiden. De oppnådde resultater er oppsummert i tabell 2.

Dataene i tabell 2 understøtter likeledes fordelen ved sinkhyaluronat. Den nærmere statistiske undersøkelse viser at signifikansen avtar avhengig av behandlingstiden.

Som oppsummering: etter en evaluering av de klinisk-farmakologiske undersøkelser kunne den større virkningsfull-het av sinkhyaluronat bevises selv ved et lavt antall sår; denne fordel kunne særlig underbygges i startperioden av behandlingen .

Oppfinnelsen er nærmere illustrert ved hjelp av de følgende eksempler.

Proteininnholdet av hyaluronat (HA) ble bestemt ved å bruke fremgangsmåten til O.H. Lowry (J. Biol. Chem., 193

(1951)); viskositeten av hyaluronat ble målt i et Ostwalds viskosimeter i en fysiologisk saltoppløsning ved 25°C. Verdien av grenseviskositeten ekstrapolert til "0" konsentrasjon, dvs. //^/25~Oq " ' er 93en9:i-tt nedenunder. HA-innholdet ble bestemt ved å bruke Bitters metode (Anal. Biochem. , 4_,

s. 330 (1962)).

Eksempel 1

Fremstilling av en sinkhyaluronatoppløsning

40,18 mg natriumhyaluronat ble oppløst i 20,0 ml to ganger destillert vann. Startkonsentrasjonen av hyaluronsyre er således 2,009 mg/ml, den ekvivalente konsentrasjon av oppløsningen er 4,241 x 10~^ mol/liter (Na<+> eller hyaluronsyre-dimerenhet). I løpet av målingen ble en sinkkloridopp-løsning med 0,05154 mol/liter konsentrasjon tilsatt til reaksjonsblandingen gjennom en mikrobyrette. Oppløsningen ble først tilsatt i små porsjoner (0,05 ml) og så i større porsjoner (0,1-0,2 ml). Spenningsendringen i oppløsningen måles ved å anvende et presisjonspotensiometer med digitaldisplay og natriumionselektive glass- og sølv/sølvklorid-elektroder. Titreringen ble fortsatt inntil den målte spenning ikke lengre endres ved tilsetning av en ytterligere porsjon av titreringsoppløsningen. (Målesystemet ble kalibrert under betingelser som var analoge med målingen i praksis).

Selektiviteten til den natriumionselektive elektrode ble observert også i nærvær av Zn^<+->ioner for å kontrollere at spenningsendringen ved måling i praksis var forårsaket av de frigjorte Na<+->ioner og ikke av Zn^<+->ioner innført i opp-løsningen. En 2,00 x 10-<3> m natriumkloridoppløsning ble titrert ved å anvende sinkkloridtitreringsoppløsningen under lignende betingelser som betingelsene ovenfor. Etter økning av konsentrasjonen av Zn^<+> fra 0 og opp til 4 x 10"^ mol/liter, ble det observert en spenningsøkning på 2 mV, mens målingen i praksis viste en endring på ca. 20 mV under lignende betingelser. Det var følgelig ingen hindringer for evalueringen. I løpet av målingene bekreftet økningen i natriumionaktiviteten beregnet ut fra måledataene den kvan-titative dannelse av sinkforbindelsen.

Fremstilling av en sinkkloridoppløsning

Ettersom en oppløsning inneholdende sinkklorid i en nøyaktig konsentrasjon ikke kan fremstilles ved direkte inn-veiing, ble først en oppløsning med den tilnærmet ønskede konsentrasjon fremstilt. Etter fremstilling av denne oppløs-ningen bør ikke noe syre anvendes ettersom det kan hende at det innveide sinkklorid ikke vil bli fullstendig oppløst. Etter sedimentasjon av den uoppløselige rest (ca. 30 minutter) ble den volumetriske kolbe fylt opp til merket, og oppløsningen ble filtrert gjennom et filterpapir.

Den nøyaktige konsentrasjon av filtratet ble bestemt ved kompleksometrisk titrering under anvendelse av buffer 10 og "eryochrom black-T" indikator. Sinkkloridoppløsningen med en nøyaktig konsentrasjon på 0,100 mol/liter ble fremstilt ved nøyaktig fortynning av denne oppløsning*

Karakteristikaene til natriumhyaluronat anvendt til fremstillingen av oppløsning, var som følger:

Eksempel 2

Fremstilling av en oppløsning for dermatoloqisk og kosmetisk anvendelse

12,5 ml av en sinkkloridoppløsning med 0,100 mol/liter konsentrasjon fremstilt med ionefritt vann, ble tilsatt til 0,50 g natriumhyaluronat innveid i en 100 ml volumetrisk kolbe. (En annen konsentrasjon av sinkklorid kan også anvendes, men mengden av sinkklorid bør være den samme). Natriumhyaluronat fikk svelle (i 12 timer) i oppløsningen fylt opp til merket med ionefritt vann, hvorved man fikk en sinkhyaluronatoppløsning på 0,5 vekt/volum%.

Karakteristikaene til natriumhyaluronat anvendt for fremstilling av den ovenfor nevnte oppløsning, var som følger:

Viskositet M' 25 °C <:> 16'5 d1/ 1?

Proteininnhold : 0,8 vekt%

Eksempel 3

Fremstilling av en sinkhyaluronatoppløsning for anvendelse i injiserbare oppløsninger

De operasjoner som er beskrevet i dette eksemplet, ble utført under sterile betingelser.

5,0 ml av en sinkkloridoppløsning med 0,100 mol/liter

konsentrasjon fremstilt med to ganger destillert vann (vann for injeksjonsbruk, pyrogenf ritt, sterilt), ble tilsatt til 0,20 g natriumhyaluronat (av ren pulverkvalitet) innveid i en 100 ml volumetrisk kolbe, og så ble volumet fylt opp til 50 ml med to ganger destillert vann. Natriumhyaluronat fikk svelle over natten, ble så oppløst ved rysting, og oppløsningen ble fylt opp til merket med to ganger destillert vann. Den erholdte oppløsning ble filtrert gjennom et membranfilter (0,45 /um porestørrelse), hvorved man fikk en sinkhyaluronat-oppløsning på 0,2 vekt/volum%.

Karakteristikaene til natriumhyaluronatet som ble anvendt for fremstilling av den ovenfor nevnte oppløsning, var som følger:

Eksempel 4

Fremstilling av en ionefri sinkhyaluronatoppløsning

600 ml ethanol av analytisk finhetsgrad ble tilsatt under omrøring til 200 ml 0,50 vekt/volum% sinkhyaluronat-oppløsning erholdt ifølge eksempel 2, det utfelte sinkhyaluronat ble filtrert på et glassfilter, vasket to ganger med 50 ml ethanol av den samme kvalitet og så tørket under redusert trykk. Derved ble det erholdt 0,88 g sinkhyaluronat som ble brukt til fremstilling av en 0,50 vekt/volum% sink-hyaluronatoppløsning på den måte som er beskrevet i eksempel 2. Den erholdte sinkhyaluronatoppløsning inneholdt ikke noe natriumklorid oppstått fra reaksjonen mellom natriumhyalur-

onat og sinkklorid; den er således praktisk talt ionefri.

Eksempel 5_

Fremstilling av ionefritt sinkhyaluronat eller dets opp-løsning for terapeutisk bruk

Operasjonene som er beskrevet i dette eksemplet, ble utført under sterile betingelser.

1500 ml ethanol (reneste kvalitet) ble porsjonsvis tilsatt til 500 ml sinkhyaluronatoppløsning fremstilt ifølge eksempel 3 under omrøring. Etter tilsetningen ble systemet omrørt i 30 minutter, sinkhyaluronatutfellingen ble filtrert på et glassfilter, vasket 3 ganger med 100 ml ethanol (reneste kvalitet) hver gang og tørket under redusert trykk under milde og sterile betingelser.

Eksempel 6

Fremstilling av ionefritt sinkhyaluronat

200 ml av en 10 vekt% oppløsning av "Hyamine 1622"

(puriss ) (benzyldimethyl- [2 - [2-[p- (1,1,3, 3-tetramethylbutyl) - fenoxy]ethoxy]ethyl]ammoniumklorid) ble tilsatt under omrør-ing til oppløsningen inneholdende 1 g natriumhyaluronat i 400 ml to ganger destillert vann. Den dannede utfelling, dvs. den kvaternære hyaluronsyreammoniumforbindelse, ble fraskilt ved sentrifugering, vasket to ganger med 100 ml to ganger destillert vann hver gang og på nytt sentrifugert. Den vaskede utfelling ble oppløst i et oppløsningsmiddelpar bestående av 400 ml 2 vekt/volum% sinkklorid i vandig oppløs-ning (pH 5,0-5,4) og 400 ml n-butanol. Etter at de to fasene hadde fått skilles, ble vannlaget inneholdende det oppløste sinkhyaluronat filtrert gjennom et membranfilter (0,45 /um porestørrelse), så ble sinkhyaluronat utfelt ved å tilsette 3 volumdeler ethanol, det ble filtrert på et glassfilter, vasket med ethanol og tørket i en nitrogenatmosfære under milde betingelser, hvorved man fikk 0,82 g sinkhyaluronat.

Når det er nødvendig, fremstilles en 0,50 vekt/volum% oppløsning fra det erholdte sinkhyaluronat som så renses videre som beskrevet i eksempel 4. Karakteristikaene til natriumhyaluronat anvendt som utgangsmateriale, er som følger:

Viskositet °C : 16,5 dl/g

Proteininnhold : 0,18 vekt/volum%

Sinkhyaluronat kan fremstilles som beskrevet ovenfor også fra forbindelser dannet fra andre kvaternære ammonium-salter. Kvaternære salter som kan anvendes for dette formål, er f.eks.: a) carbotetradecyloxymethyl-trimethylammoniumklorid (se ungarsk patentskrift nr. 188.537),

b) hexadecylpyridiniumklorid,

c) cetylpyridiniumklorid,

d) trimethylammoniumklorid og lignende.

Eksempel 7

Fremstilling av kobolthyaluronat

Fremgangsmåten beskrevet i eksempel 6, ble fulgt, bortsett fra at kvaternær hyaluronsyreammoniumforbindelse ble oppløst i et oppløsningsmiddelpar bestående av en 2 vekt/volum-% kobolt(II)-klorid.6H2O vandig oppløsning og n-butanol.

Eksempel 8

Fremstilling av en vandig oppløsning inneholdende 0, 50 vekt/ volum% sinkhyaluronat gjort isoton ved hjelp av sinkklorid

Ca. 50 ml av en sinkkloridoppløsning-med 0,110 mol/liter konsentrasjon ble tilsatt til 0,50 g natriumhyaluronat i en 100 ml volumetrisk kolbe og fikk så svelle over natten. Natriumhyaluronatet ble så oppløst ved rysting, og kolben ble fylt opp til merket med en sinkkloridoppløs-ning med 0,110 mol/liter konsentrasjon.

Det osmotiske trykk til den erholdte oppløsning er 0,1491 mol/liter uttrykt som ekvivalent natriumkloridkonsentrasjon, og pH-verdien er 5,0. Når det er nødvendig, reguleres pH-verdien til 5,5-5,6 ved å tilsette 2,00 ml av en natriumacetatoppløsning med 0,150 mol/liter konsentrasjon. Etter regulering av pH-verdien er det osmotiske trykk for oppløsningen 0,1489 uttrykt i ekvivalent natriumkloridkonsentrasjon.

Sinkhyaluronatoppløsning fremstilles fra det særlig rene natriumhyaluronat beskrevet i eksempel 3 med to ganger destillert vann under aseptiske forhold, og så filtreres oppløsningen gjennom et membranfilter (0,45 /um porestørr-else).

Den erholdte oppløsning kan anvendes også i injiserbare preparater.

Eksempel 9

Fremstilling av en vandig oppløsning inneholdende 0, 2 vekt/ volum% sinkhyaluronat gjort isoton ved hjelp av sinkklorid

For et sluttvolum på 100 ml ble 0,20 g natriumhyaluronat innveid og oppløst i en sinkkloridoppløsning med 0,120 mol/liter konsentrasjon.

Oppløsningen og fremstillingen av sinkkloridoppløs-ningen med nøyaktig 0,120 mol/liter konsentrasjon ble utført ifølge eksempel 1 (idet mengden av sinkklorid ble endret).

Det osmotiske trykk for oppløsningen er 0,154 mol/ liter uttrykt i ekvivalent natriumkloridkonsentrasjon, og pH har en verdi på 5,3-5,4.

Oppløsningen ble fremstilt ved å anvende natriumhyaluronatet av kvaliteten som er karakterisert i eksempel 2, og brukt først og fremst for fremstillingen av dermatologiske og kosmetiske preparater.

Eksempel 10

Fremstilling av en vandig oppløsning inneholdende 0, 50 vekt/ volum-% sinkhyaluronat gjort isoton ved hjelp av glukose

Oppløsningen ifølge dette eksemplet inneholder natriumhyaluronat og den beregnede, ekvivalente mengde sinkklorid.

12,50 ml av en sinkkloridoppløsning med 0,100 mol/ liter konsentrasjon ble tilsatt til 0,50 g natriumhyaluronat innveid i en 100 ml volumetrisk kolbe. (En annen konsentrasjon av sinkklorid kan også anvendes, men mengden av sinkklorid bør være den samme). Natriumhyaluronat fikk svelle i 12 timer i oppløsningen av sinkklorid fylt opp til 50 ml med ionefritt vann, og så oppløst ved rysting. Deretter ble 24,50 ml av en glukoseoppløsning med 1,00 mol/liter konsentrasjon tilsatt og fylt opp til merket med ionefritt vann.

Det osmotiske trykk for oppløsningen er 0,1495 mol/- liter uttrykt i ekvivalent natriumkloridkonsentrasjon, og pH har en verdi på 5,4.

Total sinkkonsentrasjon = 1,25 x 10"^ mol/liter.

Oppløsningen ble fremstilt ved å anvende natriumhyaluronatet med den kvalitet som er karakterisert i eksempel 2, og først og fremst brukt til fremstillingen av dermatologiske og kosmetiske preparater.

Eksempel 11

Fremstilling av en vandig oppløsning inneholdende 0, 2 vekt/- volum% sinkhyaluronat gjort isoton ved hjelp av glukose

5,0 ml av en sinkkloridoppløsning med 0,100 mol/liter konsentrasjon ble tilsatt til 0,20 g natriumhyaluronat innveid i en 100 ml volumetrisk kolbe, og så ble volumet fylt opp til 50 ml med avionisert vann. Etter at det hadde fått

svelle over natten, ble natriumhyaluronat oppløst ved rysting, 27,0 ml av en glukoseoppløsning med 1,00 mol/liter konsentrasjon ble tilsatt og kolben fylt opp til merket med ionefritt vann.

Det osmotiske trykk for oppløsningen var 0,151 mol/- liter uttrykt i ekvivalent natriumkloridkonsentrasjon, og pH har en verdi på 5,6-5,7. Total sinkkonsentrasjon = 5 x 10~^ mol/liter.

Eksempel 12

Fremstilling av en vandig oppløsning inneholdende 0, 5 vekt/- volum% sinkhyaluronat gjort isoton ved hjelp av sorbitol

Sinkhyaluronatoppløsningen beskrevet nedenunder, ble fremstilt under aseptiske forhold fra natriumhyaluronat med særlig høy renhet beskrevet i eksempel 3 og destillert vann. Oppløsningen inneholder sinkklorid i en ekvivalent mengde beregnet for natriumhyaluronat.

Fremgangsmåten beskrevet i eksempel 10 blir fulgt, bortsett fra at i stedet for glukoseoppløsningen ble 23,50 ml av en sorbitoloppløsning med 1,00 mol/liter konsentrasjon (182,19 g D-sorbitol i 1 liter) tilsatt til sinkhyaluronat-oppløsningen.

Den således fremstilte oppløsningen ble filtrert gjennom et membranfilter (0,45 /um porestørrelse). Denne oppløsningen kan anvendes for hvilket som helst formål, inkludert injiserbare preparater.

Det osmotiske trykk for oppløsningen var 0,1520 mol/ liter uttrykt i ekvivalent natriumkloridkonsentrasjon, og pH har en verdi på 5,5. Total sinkkonsentrasjon = 1,25 x 10"^ mol/liter.

Eksempel 13

Fremstilling av en vandig oppløsning inneholdende 0, 2 vekt/ volum% sinkhyaluronat gjort isoton ved hjelp av sorbitol

Oppløsningen beskrevet i dette eksemplet, inneholder sinkklorid i en ekvivalent mengde beregnet for natriumhyaluronat .

Sinkhyaluronatoppløsningen beskrevet nedenunder, ble fremstilt under aseptiske forhold fra natriumhyaluronat med særlig høy renhet beskrevet i eksempel 3, og to ganger destillert vann.

Fremgangsmåten ifølge eksempel 12 ble fulgt, bortsett fra at 0,2 g natriumhyaluronat ble oppløst, 5 ml sinkklorid-oppløsning med 0,100 mol/liter konsentrasjon, så ble 26,50 ml av en sorbitoloppløsning med 1 mol/liter konsentrasjon tilsatt, og til sist ble oppløsningen fylt opp til 100 ml. Den derved fremstilte oppløsning ble filtrert gjennom et membranfilter (0,45 yum porestørrelse). Denne oppløsningen kan anvendes til hvilket som helst formål, inkludert injiserbare preparater.

Det osmotiske trykk for oppløsningen er 0,1501 mol/ liter uttrykt i ekvivalent natriumkloridkonsentrasjon, og pH har en verdi på 5,6. Total sinkkonsentrasjon = 5 x 10-^ mol/liter.

Eksemplene 14- 26

I de følgende eksempler er bestanddelene i forskjellige preparater gjengitt i forhold til preparattypene valgt av oss. Fremstillingen av sinkhyaluronatoppløsninger gjort isotone, er beskrevet i de forutgående eksempler. Her betyr "destillert vann for injeksjonsformål" to ganger destillert vann fremstilt under aseptiske forhold.

I. Injiserbare oppløsninger

Preparater ifølge eksemplene 14-17 ble anvendt til intrakutan administrering, mens preparatet ifølge eksempel 18 tjener for intraokular bruk. Den aktive bestanddel av den kvalitet som er beskrevet i eksempel 3, anvendes i disse eksemplene.

Eksempel 14

Eksempel 15

Eksempel 16

Eksempel 17 Eksempel 18

Preparater beskrevet i eksemplene 20-28, anvendes

hovedsakelig for dermatologiske formål. Den aktive bestanddel med den kvalitet som er beskrevet i eksempel 2, ble anvendt i disse eksemplene.

II. Oppløsninger for topisk anvendelse

Eksempel 19

Eksempel 20

III. Geler for topisk anvendelse Eksempel 21 Eksempel 22

IV. Kremer og salver for topisk anvendelse

Eksempel 23

Eksempel 27

V. Preparater for rensing og arrdannelse av

materieholdige sår og forbrenninger

Eksempel 28

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive komplekser av deprotonisert hyaluronsyre og 3d-metallioner i 4. periode av det periodiske system, karakterisert ved at a) en vandig oppløsning inneholdende den ekvivalente mengde av et salt, fortrinnsvis kloridet av et av 3d-metallionene i den 4. periode i det periodiske system, tilsettes til en vandig oppløsning av natriumhyaluronat eller til et alkali- eller jord-alkalimetallsalt, eventuelt et sølvsalt av hyaluronsyre, eller b) en forbindelse dannet av hyaluronsyre og et kvaternært ammoniumsalt i en vandig suspensjon, oppløses i et oppløsningsmiddelpar inneholdende vannoppløsningen av et 3d-metallion i 4. periode av det periodiske . system og et oppløsningsmiddel som er delvis blandbart med vann, fortrinnsvis n-butanol, hvoretter - det erholdte kompleks av deprotonisert hyaluronsyre og 3d-metallionet i 4. periode av det periodiske system utfelles med en alkanol eller et alkanon på kjent måte, eller - utfellingen skilles fra oppløsningen og, deretter, om ønsket, - tørkes den under milde betingelser.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som 3d-metallion anvendes sinkion.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som 3d-metallion anvendes koboltion.