JPH03505231A - ヒアルロン酸会合物を含む新規組成物及びそれを調製するための方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒアルロン酸会合物を含む新規組成物及びそれを調整するための方法 本発明は、除プロトン化されたヒアルロン酸と周期表の第４周期の第３金属イオ ンとの新規会合物（複合体）及び活性成分としてこれらの会合物（複合体）を含 む組成物に関する。

本発明はさらに、これらの新規会合物（複合体）及び活性成分としてこれらの新 規会合物（複合体）を含む組成物の調製方法にも関する。

本発明の方法の特定の好ましい態様によれば、除プロトン化されたヒアルロン酸 と周期表の第４周期の第３金属イオンとの新規会合物が、ヒアルロン酸ナトリウ ムの水溶液から直接調製される。

本発明の新規会合物は主に、ヒアルロン酸亜鉛及びコバルトである。これらの後 者の会合物を含む組成物は、医薬性（治療性）又は化粧性及び場合によっては他 の組成物であり得る０本発明の新規会合物を含む組成物の適用分野は、他の分野 においても使用され得るが、たとえば上皮欠損体表の上皮化の促進分野；脚の潰 瘍、衰弱性壊屓（床ズレ）、創傷、火傷、放射線又は熱誘導された創傷及び尋常 性座疹の治癒分野である。

ヒアルロン酸は、最初にＭｅｇｅｒなど、（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。

１０７、６２９（１９５４）；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　１１４．６８ ９（１９３６）　）により記載された、５０年以上もの間知られている高分子で ある。その構造決定は、Ｗｅｉｓｓｍａｎなど、　　（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ 、　Ｓａｃ、　７６＋１７５３（１９５４）　）により行なわれた。ヒアルロン 酸は、交互にβ、−、グルコロン酸及びβ、−４ジ−４グルコサミン成粘性の天 然のゲルコサミノグリカンであり；その分子量は５ｏｏｏｏ〜数（８〜１３）ミ リオンである．ヒアルロン酸の回収は、従来の分離であり、そして特別に純粋な ヒアルロン酸の使用はアメリカ特許第４１４１９７３号及び第４３０３６７６号 明細書及びヨーロッパ特許第０１４４０１９号明細書に記載されている．昨年ま で、ヒアルロン酸は、治療において、主に眼科学、手術及び化粧品においてナト リウム塩として使用されて来た。アルカリ、アルカリ土類、マグネシウム、アル ミニウム、アンモニウム又は置換されたアンモニウムイオンにより形成されたヒ アルロン酸の塩は、薬物の吸着を促進するためのキャリヤーとして作用すること ができるベルギー特許第９０４５４７号明細書を参照のこと）。ヒアルロン酸の 重金属塩（ここで“重金属”とは周期表の第５，第６及び第７周期の元素並びに ランタニド及びアクチニドを意味する）及びこれらの中の銀塩が、殺カビ剤とし て使用され、そして金塩は関節炎の治療のために使用される（特許ＷＯ３７１０ ５５１７明細書を参照のこと）。

ヒアルロン酸の二次構造、すなわち立体配座は金属イオンを結合することによっ て変えられることが種々の構造を明瞭化する方法によって証明された（Ｗ．　Ｔ ．賀１ｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ａ。

（１９８３）　？及びＮ．　Ｆｉｇｕｅｒｏｕ　ａｎｄ　Ｂ．　Ｃｈａｋｒａｂ ａｒｔｔ　：　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ１７、　２４１５（１９７Ｂ））　、分 子構造に対する種々の効果は、ヒアルロン酸カリウム及びナトリウムの比較Ｘ− 線研究により示される特徴と類似する特徴の金属イオンによってさえ及ぼされ得 る（Ａ．に０Ｍ１ｔｒａなど，　：　Ｊ．　Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、　Ｓｃｉ．　 Ｐｈｙｓ．　８２４＋１及び２１　（１９８５）　）　、これは、種々の変化を 生む種々の性質の金属イオンにより形成されるヒアルロン酸の化合物のためによ り有効である。

周期表の第４周期の第３金属イオンにより形成されるヒアルロン酸の会合物（複 合体）に関する引用文はこれまで文献中に見出されておらず；実際、ゲル濾過ク ロマトグラフィー試験によれば、ヒアルロン酸は、ヘパリンとは異なって、亜鉛 イオンを結合することができない（Ｒ．　Ｆ．　Ｐａｒｔｓｈ　ａｎｄ　Ｗ。

Ｒ．　Ｆａｉｒ　：　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．　１９３．　４０７〜４１０（１９ ８１）３。

文献によれば、ヒアルロン酸（又はそのナトリウム塩）は亜鉛イオンを結合でき ない事実にもかかわらず、本発明者は、ヒアルロン酸と周期表の第４周期の第３ 金属イオン及びこれらの中で主として亜鉛及びコバルト・イオンとの相互作用の 配位化学を調べた。ヒアルロン酸はそのナトリウム塩、従ってヒアルロネートを 含むすべてのシステムの塩基性物質としてもっばら市販されているので、本発明 の研究はナトリウムイオンとヒアルロネートとの相互作用に基づいて始められた 。

この目的のためには、ヒアルロン酸ナトリウム水溶液の遊離ナトリウムイオン活 性が、ナトリウム選択性ガラス電極を用いることによって測定された。ヒアルロ ネートのカルボキシレート基と共に同等物として導入される６０％よりも高くな いナトリウムイオンがその水溶液中に遊離イオンとして存在し、そして残りの４ ０％はヒアルロネートに結合される形で存在することが、これらの測定が明白に 述べられた。

本発明者の測定によれば、ナトリウムイオン濃度を高めることによって、結合さ れるナトリウムイオンの量がすべての利用できるカルボキシレート基について計 夏して５０〜５５％に上昇され得る。従って、塩の通常の性質とは異なって、ヒ アルロン酸ナトリウムは水溶液中に完全に解離されないことが確証された。

本発明の研究の次の段階において、ヒアルロン酸ナトリウムの水溶液が、システ ム中の遊離ナトリウムイオンの活性の変化を得るために、上記ナトリウムイオン 選択性電極を用いることによって塩化亜鉛溶液により滴定された。この方法を示 す特徴的な曲線が、第１図に示される。ヒアルロネートに初めに結合されている ナトリウムイオンは亜鉛イオンの効果により遊離されることが認められる。これ らの測定の結果に基づいて、合計のナトリウムイオン濃度が亜鉛の等量により遊 離され、亜鉛イオンはナトリウムイオンよりもヒアルロネートにより強く結合さ れる事実が明確に提供される。従って、ヒアルロン酸は亜鉛イオンに結合できな い初期の言及（Ｒ。

Ｐ、　Ｐａｒｒｉｓｈ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｒ，Ｆａｉｒ　：　Ｂｔｏｃｈｅａ＋、 　Ｊ、　１９３＋　４０７（１９８］））は、実験的に拒絶された。

それによって、本発明まで正当であった当業者の知識は誤っていることが示され た。

上記で論議された本発明の研究から、水溶液における等量のヒアルロン酸ナトリ ウム及び亜鉛イオン（塩化亜鉛）の相互作用を通して、理論的な組成物のヒアル ロン酸亜鉛会合物が形成される。適切な等張化の後、その得られた溶液は治療目 的のために直接使用され、そしてその亜鉛化合物は分離工程において固体状態で 調製されるべきでない。コバルトイオン及び他の第３金属イオンを用いることに より行なわれた予備試験は、類似する結果を導びく。

それにもかかわらず、本発明の複合体は特徴づけのために固体状態で調製され、 そして亜鉛イオンの直接的な環境が”Ｅｘｔｅｎｄｅｄ　Ｘ−ｒａｇ　Ａｂｓｏ ｒｐｔｉｏｎ　Ｆｉｎｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ″（ＥＸＡＦＳ）法を用いること によって決定された。亜鉛は、第１の配位球体において４個の酸素原子により囲 まれ゛こいることが言及された。、Ｚｎ−０結合の距離の長さは１９９ｐ−であ り、そして２つの炭素原子は亜鉛原子から２４１ｐｍ＋の長さの距離に存在する 。

本発明の試験によれば、ヒアルロン酸亜鉛は、それぞれ１９４及び２３４ｐｍの 値を有する４個の赤道及び２個の軸方向のＣｕ−０結合を含む類似する銅複合体 とは育意に異なる。銅原子と次の２個の炭素原子との間の距離は２５Ｂｐｍであ る。コバルト複合体の構造は、亜鉛複合体（但し銅複合体ではない）の構造に類 似する。

従って、本発明は、除プロトン化されたヒアルロン酸と周期表の第４周期の第３ 金属イオンとの会合物（複合体）に関する。

本発明はさらに、活性成分又はキャリヤーとして、ヒアルロン酸と周期表の第４ 周期の第３金属イオンとの会合物（複合体）、場合によりでは他の活性成分及び 又は添加物を含む組成物にも関する。

本発明の他の観点によれば、本発明の新規会合物（複合体）の調製方法が提供さ れ、ここで該方法は、ａ）等量の塩、好ましくは周期表の第４周期の第３金属の １つの塩化物を含む水溶液をヒアルロン酸ナトリウムの水溶液又はヒアルロン酸 塩の他の塩（アルカリ又はアルカリ土類金属の塩、場合によっては銀塩）に添加 し；又はｂ）ヒアルロン酸と第四アンモニウム塩から形成された会合物を、周期 表の第４周期の第３金属イオンの水溶液及び水と一部混和性の溶媒、好ましくは ｎ−ブタノールを含む溶媒対の水性懸濁液に溶解し；次に 一ヒアルロン酸と周期表の第４周期の第３金属イオンから得られた会合物（複合 体）をアルカノール又はアルカノンにより既知方法で沈澱せしめ、又は 一溶液から沈澱物を分離し、そして次に−所望によりそれを適度な条件下で乾燥 せしめることを含んで成る。

前記方法に基づく方法は、活性成分としてヒアルロン酸亜鉛会合物（複合体）又 は周期表の第４周期の第３金属イオンの類似する会合物をそれぞれ含む水溶性の 調製のために開発された。これらの溶液は、それぞれの場合、金属イオンとヒア ルロン酸塩成分との直接的な反応により調製された。この調製方法は、固体状態 での前記活性成分の前もっての分離を必要にしなかった。本発明の方法を用いる ことによって調製された溶液において、遊Ｍ（金属−未結合）ヒアルロン酸塩の 量は、等量の亜鉛の存在下でされ無視できる。過剰の亜鉛イオンの結果として、 ヒアルロン酸亜鉛会合物（複合体）が定量化になる。

上記で論議される方法での金属会合物の調製の間、ｐＨは約５の値で存続する。

０，２重量％／体積（重量／体積）のヒアルロン酸塩溶液の場合、ｐＨは５．４ の値に達し、そして０．５重量％／体損の場合、そのｐＨは５である。必要な場 合、後者のシステムのｐＨは、酢酸ナトリウム等張溶液の数滴を添加することに よって５６５〜５．６の値に調整され得る。

活性成分としてヒアルロン酸亜鉛を含む２種の溶液は、上記で論議された方法を 用いることによって調製された。

１、　ヒアルロン酸亜鉛は過剰の塩化亜鉛により等張性にされた； 遊離塩化亜鉛のみがまた、皮膚科学において使用され得ることを考慮する場合、 ヒアルロン酸亜鉛溶液の浸透圧は、過剰の塩化亜鉛を用いるごとによって等張値 に調整された。このようにして得られた溶液は、いづれの遊Ｍ（亜鉛未結合）ヒ アルロン酸塩をまったく含まないが、過剰の塩化亜鉛がヒアルロン酸亜鉛と共に システムに存在した。

λ　ヒアルロン酸亜鉛溶液は、単糖類又は糖アルコールによって等張性にされた ： ヒアルロン酸塩−未結合亜鉛イオンの存在が示されていない治療的使用のために は、ヒアルロン酸塩と同じ量で亜鉛イオンを含む溶液が、ポリアルコール（糖ア ルコール、好ましくはソルビトール）又は単−又は二ｌ１ｉ（好ましくはグルコ ース）を用いることによって等張性にされた。これらの後者のシステム中の遊離 亜鉛イオン及び遊離ヒアルロン酸塩含有率は、それぞれ合計亜鉛又は合計ヒアル ロン酸塩含有量の５％に達しなかった。

本発明の会合物を利用する場合、イオンフリー組成物が結局必要とされる。すな わち、本発明の上記方法により調製される会合物は通常、出発のヒアルロン酸塩 カチオン及び第３金属塩のアニオンから形成される塩化ナトリウム又は他の塩を 含む。

２種の異なった変法は、第３金属イオンにより形成された塩−フリーヒアルロン 酸会合物の調製のために使用され得る。

これらは次の通りである。

ａ）第四アンモニウム塩の溶液が既知のヒアルロン酸塩、好ましくはヒアルロン 酸ナトリウムの溶液に滴下される。満足する精製の後、沈澱せしめられた新規の ヒアルロン酸第四アンモニウム会合物は、周期表の第４周期の第３金属イオンの 水溶液及び水と一部混和性である溶媒、好ましくはｎ−ブタノールから成る溶媒 対に激しい撹拌下で溶解される。二相の分離を可能にし、次にヒアルロン酸塩会 合物をその水溶液にアルカノール又はアルカノンを添加することによって沈澱せ しめ、その沈澱物を分離し、そして洗浄し；又はｂ）ヒアルロン酸亜鉛溶液に、 適切にはヒアルロン酸塩と等量、塩化亜鉛を含む等長比されていない溶液に撹拌 下でＣ＋−Ｓアルカノール又はＣ２−４アルカノン２．０〜３体積を添加した後 、沈澱されたヒアルロン酸亜鉛を濾過し、そして沈澱のためにそれぞれ使用され るアルカノール又はアルカノンフリー水に溶解され、そして沈澱がくり返えされ る。

固体イオン−フリーヒアルロン酸亜鉛が必要とされる場合、沈澱物は適切な条件 下で、減圧下で乾燥せしめられる。イオン−フリーヒアルロン酸亜鉛溶液が必要 とされる場合、溶媒を含まないヒアルロン酸亜鉛を溶解するのが好ましい。両度 法のいづれかの場合、イオン−フリー固体又は溶解された生成物が、出発ヒアル ロン酸亜鉛の質に依存する任意の純度を伴って得られる。

活性成分として、本発明のヒアルロン酸亜鉛を含む組成物（例１３）に基づく臨 床学的薬理学的研究の結果が、上皮欠損表面の上皮形成の促進のために使用され る脚の潰瘍治療に対して示される。ヒアルロン酸ナトリウムを含む組成物が対照 として使用された。

この試験は、脚の潰瘍を有する８又は１２人の患者のそれぞれの１２又は１４個 の潰瘍に対して行なわれた。性別及び年齢並びに疾患の性質に従っての両グルー プの患者の分布は次の通りであった。

処置は、その処置を始める前、浄化治療が潰瘍の実際の臨床状態に従って行なわ れるような態様で行なわれた。それぞれヒアルロン酸亜鉛又はナトリウムによる 処置は、浄化される近くの潰瘍に対して又は潰瘍の有意な低下が観察される場所 で始められた。処置は、組成物が浄化される潰瘍の表面上に薄層により創傷の表 面を湿潤する量で滴下されるような態様で１日１度、行なわれた。

組成物は４週間使用された。処置の開始点で及び−週間に１度、データシートを 満たし、そして患者の潰瘍を写真により記録した０分泌物サンプルを、細菌学的 試験のために採取した。

上皮病変の特徴及び重度を、次の記号及び評点により示した。

特徴　　　　　　　　重度 面積（ａ） １０Ｃ４以下　　　　　　　　　　　　　　　　１１０Ｃ４〜２５ｃｄ　　　　 　　　　　　　　　　　　２２５Ｃ４以上　　　　　　　　　　　　　　　　　 ３感染性（ｂ） 臨床的に純性　　　　　　　　　　　　　　０５０％の感染性　　　　　　　　 　　　　　、１１００％の感染性　　　　　　　　　　　　　　２壊死（ｃ） （動脈性潰瘍の場合においてのみ） 負　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０１０％以下　　　 　　　　　　　　　　　　　１１０％〜１５％　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　２１００％　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ３評価のために、別々の特徴の値を決定し、そして一般的な重度評点を次の式を 用いて計算した： Ｓ＝ｊ丁７丁Ｘ丁 臨床的な薬理学的研究の結果は第２図に示される。ヒアルロン酸亜鉛による処理 の結果は、十字により示された曲線で示され、そしてヒアルロン酸ナトリウムに よる処理の結果は、処理を行なう週の数の関数として正方形により示される曲線 で例示される。縦座標上にプロットされる評点値は、上記式を用いて計算された 一般的な重度指数を表わす。

対照として使用されるヒアルロン酸ナトリウムに対するヒアルロン酸亜鉛のより 正しい比較のために、１００％としての出発評点値に対する相対的な正しい値が 第３図に示される。

相対的な正しい値の変化は、週の数（１〜４）の関数として統計学的に評価され た。ヒアルロン酸亜鉛及びナトリウム処理に基づけば、１，２．３及び４週間後 、それぞれ９０％。

８０％、７０％及び６０％の相対的評点値以下に減少する潰瘍の数が観察された 。その結果は、第１表に要約される。

見上ｌ 第１週　　第２週　　第３週　　第４週以下　以上　以下　以上　以下　以上　 以下　以上ヒアルロン酸亜鉛による処理は、対照として使用されるヒアルロン酸 ナトリウムにより得られる結果に比べて、あらゆる週において好都合であったこ とが第１表から明らかである。

問題の仮説のために得られた応答の統計学的分析は、ヒアルロン酸亜鉛組成物の 利点は、ヒアルロン酸ナトリウムに比べて、ひじょうに有意（９９９％）である ことを評明した。

追加の統計学的研究において、相対的評点値のより詳細な分布が、処理の時間の 関数として調べられた。その結果は、第２表に要約される。

１呈ｌ 潰瘍の数及び評点値 第２表のデータは、ヒアルロン酸亜鉛の利点を同様に支持する。より詳細な統計 学的試験は、処理の時間に依存して低下する有意性を示す。

略述：臨床学的薬理学的研究の評価に基づけば、ヒアルロン酸亜鉛のより高い効 果が潰瘍の少ない数でさえ、示され：この利点は処理の出発期において一部支持 され得た。

本発明は、次の非制限的な例により詳細に例示される。

ヒアルロン酸塩（ＨＡ）のタンパク質含有率は、Ｏ，Ｈ。

Ｌｏｗｒｙ　　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅａｐ、　１９３（１９５１））の方法 を用いて決定され；ヒアルロン酸塩の粘度は２５°Ｃで、生理食塩水中において Ｏｓｔｗａｌｄの粘度計で測定された。“０”濃度に外挿される極限粘度数の値 ；すなわち〔η〕１；シゝが下記に与えられる。

を用いて測定された。

ヒアルロン酸亜鉛溶液の調製 ヒアルロン酸ナトリウム４０．１８■を、２度蒸留された水２０、Ｏｄ中に溶解 する。従って、ヒアルロン酸の出発濃度は２．００９■／ｄであり、その溶液の 濃度は４．２４１　Ｘ　１０−’モル／１２　（Ｎａ”又はヒアルロン酸＝量体 単位）である。測定の間、０．０５１５４モル／！の濃度の塩化亜鉛溶液を、前 記反応混合物にマイクロビユレットを通して添加する。その溶液を、まず少量（ ０，０５ｄ）、そして次に多量（０，１〜ｏ、２ｕｒｉ）添加する。

溶液の電位変化を、数表示及びナトリウムイオン−選択性ガラス及び銀／塩化銀 電極を備えた正確な電位差計を用いて測定する。滴定は、測定される電位が滴定 溶液の追加の部分を添加することによってさらに変化を受けなくなるまで続けら れる。（測定システムは、実際の測定に類似する条件下で検量された。） ナトリウムイオン−選択性電極の選択性をまた、実際の測定における電位の変化 が発生するＮａ”イオン（溶液に導入されるＺ　ｎ”イオンによってではない） により引き起こされることを制御するためにＺ　ｎ”の存在下で観察した。２． ００Ｘ１０−’Ｍの塩化ナトリウム溶液を、上記条件に類似する条件下で塩化亜 鉛滴定溶液を用いて滴定した。０から４Ｘ１０−”モル／２までのＺｎ”の濃度 の上昇に基づいて、約２ｍＶの電位上昇が観察され、そして実際の測定は、類似 する条件下で約２０ｍＶの変化を示した。従って、その評価は障害を有さなかっ た。

測定の間、その測定データから計算されるナトリウムイオン活性の上昇が、亜鉛 会合物の量的な形成を実証した。

塩化亜鉛溶液の調製 正確な濃度で塩化亜鉛を含む溶液は直接的な計量により調製され得ないので、ま ず、はぼ所望する濃度の溶液を調製する。この溶液を調製する場合、酸は使用さ れるべきでなく、従って、計量された塩化亜鉛は完全に溶解されないであろうこ とが起こり得る。不溶性残留物の沈殿の後（約３０分）。メスフラスコを印まで 満たし、そして溶液をフィルター紙を通して濾過する。

濾液の正確な濃度は、緩衝液１０及びエルクロムブラック−Ｔ指示薬を用いるこ とによって錯滴定により測定される。

０．１００モル／ｌの正確な濃度を有する塩化亜鉛溶液は、この溶液の正確な希 釈により調製される。

溶液の調製のために使用されるヒアルロン酸ナトリウムの特徴は次の通りである ： 分子量　　　　　　　　　　１８５００００ダルトンタンパク質含有率　：　　 　　０．０７重量％ＵＶ吸光度Ａｉｒｙ　＝　　　　０．１３３Ａ’ｚＬ　　： 　　　　０．０７５ 粘度　〔η〕シ；；％　：　　　　１３．７ｄ　ｆ　／　ｇＨＡ’″含有率　　 　・　　　９８．１２重量％（”ＨＡ＝ヒアルロン酸、本明細書で略される）皮 膚化学及び化粧使用のための溶液の調製イオン−フリー水により調製された０、 １００モル／ｌの濃度の塩化亜鉛溶液１２．５ｄを、１００ｄのメスフラスコ中 、計量されたヒアルロン酸ナトリウム０．５０ｇへ添加する。（塩化亜鉛の他の 濃度も使用され得るが、しかし塩化亜鉛の量は同じであるべきである。）ヒアル ロン酸ナトリウムを、イオン−フリー水により印まで満たされた溶液中において 膨潤しく１２時間）、０．５％重重量体積のヒアルロン酸亜鉛溶液を得る。

上記溶液を調製するために使用されるヒアルロン酸ナトリウムの特徴は次の通り である： 粘度　〔η）　（、；、０％：　　　　１６．５ｄ　ｆ　／　ｇタンパク質含有 率　：０．８重量％　。

特表千３−５０５２３１（５） 貫Ｌ−１ 注射溶液に使用するためのヒアルロン酸亜鉛溶液の調製この例に記載される操作 は、滅菌条件下で行なわれる。

２度蒸留された水（発熱物質を含まない、滅菌された注射用水）により調製され た０、１００モル／２の濃度の塩化亜鉛溶液５．　Ｏｄを、１００ｄのメスフラ スコ中、計量されたヒアルロン酸ナトリウム（純粋な粉末品質の）０．２０ｇに 添加し、次にその体積を２度蒸留された水により満たし、５０ｍにする。ヒアル ロン酸ナトリウムを一晩、膨潤し、次に振盪により溶解し、そしてその溶液を２ 度蒸留された水により印まで満たす。

その得られた溶液を膜フイルタ−（０，４５μの孔サイズ）を通して濾過し、０ ．２％重重量体積のヒアルロン酸亜鉛溶液を得上記溶液を調製するために使用さ れるヒアルロン酸ナトリウムの特徴は次の通りである： 品質　　　　　　　：純粋な発熱物質を含まない滅菌粉末分子量　　　　　　　 　　　１８５００００タンパク質含有率　：　　　　０．０７重量％ＵＶ吸光度 　Ａ４５ｔ　：　　　　０．１３３ＩＲ０：　　　　０．０７５ ＨＡ含有率　　　　・　　　９８．１２重量％粘度　〔η〕５″ｓ％’　　：　 　　　１３．７ｄ　ｌ　／　ｇ■−土 イオン−フリーヒアルロン酸亜鉛溶液の調製分析用エタノール６００ｄを、例２ で得られた０、５０％重量／体積のヒアルロン酸亜鉛溶液２００ｄに撹拌しなが ら添加し、その沈殿せしめられたヒアルロン酸亜鉛をガラスフィルター上で濾過 し、それぞれ同じ品質のエタノール５０Ｍ１により２度洗浄し、そして次に減圧 下で乾燥せしめる。このようにして、ヒアルロン酸亜鉛０．８８ｇを得、そして これは、例２に記載される方法により０．５０％重量／体積のヒアルロン酸亜鉛 溶液を調製するために使用される。その得られたヒアルロン酸亜鉛溶液は、ヒア ルロン酸ナトリウム及び塩化亜鉛の反応から生じるいづれの塩化ナトリウムも含 まず；従って、それは実質的にイオン−イオン−フリーヒアルロン酸亜鉛又は治 療的使用のためのその溶液の調製 この例に記載される操作は、滅菌条件下で行なわれる。

エタノール（最っとも純粋な品質）　１５００ｄを、例３で調製されたヒアルロ ン酸亜鉛溶液５００ｄに撹拌しながら滴下する。

添加の後、このシステムを３０分間撹拌し、ヒアルロン酸亜鉛沈澱物をガラスフ ィルター上で濾過し、それぞれエタノール（最っとも純粋な品質）１００ｄによ り３度洗浄し、そして適切且つ滅菌条件下で減圧下で乾燥せしめる。

■一旦 イオン−フリーヒアルロン酸亜鉛の調製Ｈｙａｓｉｎｓ”　１６２２（ｐｕｒｉ ｓｓ）　（ベンジルジメチル／−２−７２−Ｐ−（１、１、３、３−テトラメチ ルブチル）フェノキシ／エトキシ／エチル／アンモニウムクロリド）の１０重量 ％溶液２００ｄを、２度蒸留された水４００ｄ中、ヒアルロン酸ナトリウム１ｇ を含む溶液に撹拌しながら添加する。沈殿物、すなわち形成されるヒアルロン酸 第四アンモニウム会合物を遠心分離により分離し、２度蒸留された水１００ｄに よりそれぞれ２度洗浄し、そして再び遠心分離する。洗浄された沈澱物を、２％ 重Ｉ／体積の塩化亜鉛水溶液（ｐＨ５，０〜５．４　）４００ｄ及びｎ−ブタノ ール４００ｊｌｅから成る溶媒対に溶解する。２相を分離した後、溶解されたヒ アルロン酸亜鉛を含む水性相を膜フイルタ−（０，４５μの孔サイズ）を通して 濾過し、次にヒアルロン酸亜鉛をエタノール３体積を添加することによって沈澱 せしめ、ガラスフィルター上で濾過し、エタノールにより洗浄し、そして適切な 条件下で窒素雰囲気において乾燥せしめ、ヒアルロン酸亜鉛０．８２ｇを得る。

必要な場合、０．５０％重量／体積の溶液を得られたヒアルロン酸亜鉛から調製 し、次にこれを例４に記載されるようにして精製する。出発材料として使用され るヒアルロン酸ナトリウムの特徴は次の通りである： 粘度　（７７）　’ｚｇ”　”　　　　１６．５ｄ　ｌ　／　ｇタンパク質含有 率　：　　　　０．１８％重量／体積　。

ヒアルロン酸亜鉛を、他の第四アンモニウム塩から形成された会合物から上記の ようにして調製することができる。この目的のために有用な第四塩は、たとえば 次のものである：ａ）カルポテトラデシルオキシメチルートクメチルアンモニウ ムクロリド（ハンガリー特許第１８８５３７号明細書を参照のこと）、 ｂ）ヘキサデシルピリジニウムクロリド、Ｃ）セチルピリジニウムクロリド、 ｄ））リメチルアンモニウムクロリド及び同様のもの。

■−１ ヒアルロン酸コバルトの調製 例６に記載される方法に従かう、但し、ヒアルロン酸第四アンモニウム会合物を 、２％重量／体積の塩化コバル）（Ｉｔ）・６１　！０水溶液及びｎ−ブタノー ルから成る溶媒対に溶解する。

■一旦 塩化亜鉛により等強性にされた０、５０％重量／体積のヒアルロン酸亜鉛を含む 水溶液の調製 ０、１１０モル／２の濃度の塩化亜鉛溶液的５０１ｄを、１００ｄのメスフラス コ中、ヒアルロン酸ナトリウム０．５０ｇに添加し、そして次に一晩膨澗する。

次に、そのヒアルロン酸ナトリウムを振盪することによって溶解し、そしてその フラスコを０．１１０モル／ｌの濃度の塩化亜鉛溶液により印まで満たす。

その得られた溶液の浸透圧は、相当する塩化ナトリウム濃度で表わされる場合、 ０．１４９１モル／１であり、そのｐＨＯ値は５、０である。必要な場合、ｐＨ 値は、０．５０モル／ｌの濃度の酢酸ナトリウム溶液２．００ｄを添加すること によって５．５〜５．６に調整される。ｐＨ（！を調整した後、溶液の浸透圧は 、相当する塩化ナトリウム濃度で表わされる場合、０．１４８９である。

ヒアルロン酸亜鉛溶液を、例３に記載される特別に純粋なヒアルロン酸ナトリウ ム及び２度蒸留された水から滅菌条件下で調製し、次にその溶液を膜フイルタ− （０，４５μの孔サイズ）を通して濾過する。

その得られた溶液は、また注射用組成物に使用され得る。

五−主 塩化亜鉛により等強性にされた０、２％重量／体積のヒアルロン酸亜鉛を含む水 溶液の調製 １００１ｆ！の最終体積のためには、ヒアルロン酸ナトリウム０．２０ｇを計量 し、そして０．１２０モル／ｌの濃度の塩化亜鉛溶液に溶解する。

正確に０．１２０モル／！の濃度の塩化亜鉛の溶解及び調製を、例１に従って行 なう（塩化亜鉛の量を変えることによって）。

その溶液の浸透圧は、相当する塩化ナトリウム濃度で表わされる場合、０．１５ ４モル／ｌであり；そのｐＨは５．３〜５．４の値を示す。

ＨＡ含有率　　　　　　　　　　１．９６■／ｄ粘度　　　　　　　　　　　　 　１５．９ｄｆ／ｇタンパク質含有率　：　　　　　　０．０１５■／ｄ溶液の 純度”　　　　　　　　Ａ　’ｈ’ｈ”ｏ　＝　０．０１５傘　：１ａｗのキュ ベツトにおいて６６０ｎ＊で測定された吸光度に基づく。

その溶液を、例２で特徴づけられた品質のヒアルロン酸ナトリウムを用いること によって調製し、そして初めに、皮膚化学及び化粧用組成物の調製のために使用 する。

五−刊 グルコースにより等強性にされた０、５０％重量／体積のヒアルロン酸亜鉛を含 む水溶液の調製 この例の溶液は、ヒアルロン酸ナトリウム及び計算された当量の塩化亜鉛を含む 。

０．１００モル／！の濃度の塩化亜鉛溶液１２．５０ｄを、１００ｄのメスフラ スコ中、計量されたヒアルロン酸ナトリウム０．５０ｇに添加する。（塩化亜鉛 の他の濃度もまた使用され得るが、しかし塩化亜鉛の量は同じであるべきである 。）ヒアルロン酸ナトリウムを、イオン−フリー水により５０ｍまで満たされた 塩化亜鉛溶液に１２時間、膨潤し、次に振盪することによって溶解する。その後 、１．００モル／ｌの濃度のグルコース溶液２４．５０ｍを添加し、そしてイオ ン−フリー水により印まで満たす。

その溶液の浸透圧は、相当する塩化ナトリウム濃度で表わされる場合、０．１４ ９５モル／２であり；そのｐＨは５．４の値を示す。合計亜鉛濃度＝　１．２５ Ｘ１０−”モル／Ｉ！、。

その溶液を、例２で特徴づけられた品質のヒアルロン酸ナトリウムを用いること によって調製し、そして初めに、皮膚化学及び化粧用組成物の調製のために使用 する。

■一旦 グルコースにより等強性にされた０、　２％重量／体積のヒアルロン酸亜鉛を含 む水溶液の調製 この例の溶液は、ヒアルロン酸ナトリウム及び計算された当量の塩化亜鉛を含む 。

０、１００モル／！の濃度の塩化亜鉛溶液５．０ｄを、１００Ｉ１１のメスフラ スコ中、計量されたヒアルロン酸ナトリウム０．２０ｇに添加し、次にその体積 を脱イオン水により５０ｄにする。−晩、膨潤した後、ヒアルロン酸ナトリウム を振盪により溶解し、１．００モル／ｌの濃度のグルコース溶液２７．ＯＩｄを 添加し、そしてそのフラスコをイオン−フリー水により印まで満たす。

その溶液の浸透圧は、相当する塩化ナトリウム濃度で表わされる場合、０．１５ １モル／！であり；そのｐｉは５．６〜５．７の値を示し；合計亜鉛濃度＝　５ 　Ｘｌ０−３モル／！。

ソルビトールにより等強性にされた０、５％重量／体積のヒアルロン酸亜鉛を含 む水溶液の調製 この後記載されるヒアルロン酸亜鉛溶液は、例３に記載される特に高い純度のヒ アルロン酸ナトリウム及び蒸留水から滅菌条件下で調製される。その溶液は、ヒ アルロン酸ナトリウムのために計算される等量で塩化亜鉛を含む。

例１０に記載される方法に従う。但し、グルコース溶液の代わりに、１．００モ ル／ｉの濃度のソルビトール溶液（ｌｌ中にＤ−ソルビトール１８２．１９　ｇ 　）　２３．５０ｄをヒアルロン酸亜鉛溶液に添加する。

このようにして調製された溶液を、膜フイルタ−（０，４５μの孔サイズ）を通 して濾過する。この溶液を、注射用組成物のために使用することができる。

その溶液の浸透圧は、相当する塩化ナトリウム濃度で表わされる場合、０．１５ ２０モル／！であり；そのｐＨは５．５の値を示し；合計亜鉛濃度＝　１．２５ Ｘ１０−”モル／ｌ。

■一旦 ソルビトールにより等強性にされた０、２％重量／体積のヒアルロン酸亜鉛を含 む水溶液の調製 この例に記載される溶液は、ヒアルロン酸ナトリウムのために計夏される当量で 塩化亜鉛を含む。

この後に記載されるヒアルロン酸亜鉛溶液は、例３に記載される特に高い純度の ヒアルロン酸ナトリウム及び２度蒸留された水から滅菌条件下で調製される。

例１２の方法に従う。但し、ヒアルロン酸ナトリウム０．２ｇ。

０．１００モル／Ｉ！、の濃度の塩化亜鉛溶液５ＩＩｔ１．１モル／ｉ！、の濃 度のソルビトール溶液を添加し、そして最後に、その溶液を１００ｍまで満たす 、このようにして調製された溶液を、膜フイルタ−（０，４５μの孔サイズ）を 通して濾過する。この溶液を、注射用組成物のために使用することができる。

その溶液の浸透圧は、相当する塩化ナトリウム濃度で表わされる場合、０．１５ ０１モル／！であり；そのｐＨは５．６の値を示し；合計亜鉛濃度＝　５　Ｘｌ ０−’モル／ｌ。

ヒアルロン酸塩の含有率：　　　　　２．０３ｍｇ／ｄ粘度　　　　　　　　　 　　　　　１６．　ｌｄ　ｆｆｉ　／　ｇタンパク質含有率　　　・　　　　０ ．０１６■／ｄ溶液の純度°　　　　　・　　　Ａ　’６’６”Ｏ”＝　０．０ １０本　：１ｃｍのキュベア）において６６０ｎ＋ｗで測定された吸光度に基づ く。

貫り一ロニ弓■ 次の例においては、種々の組成物（医薬及び化粧用組成物）の成分が、本発明者 によって選択された配合タイプに関して与えられている０等張性にされたヒアル ロン酸亜鉛溶液の調製法は、前記例に記載されている。ここで、“注射目的のた めの蒸留水”とは、滅菌条件下で調製された、２度蒸留された水を意味する。

土−止■亙主亘 例１４〜１７の組成物は皮下投与のために使用され、そして例１８の組成物は眼 内使用のためのものである。例３に記載される品質の活性成分を、これらの例に 使用する。

ヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　　２．０＋ａｇソルビトール　　　　　 　　　　　　　　４８．３ｍｇヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　　５．０ ＋ｇソルビトール　　　　　　　　　　　　　４２．８■ヒアルロン酸亜鉛活性 成分　　　　　　　２．０　［プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート０．０５■ メチルｐ−ヒドロキシベンゾエート０．５■グルコース　　　　　　　　　　　 　　　４８．６■ヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　　５．０■プロピルｐ −ヒドロキシベンゾニー）　　　０．０５ｎ＋ｇメチルｐ−ヒドロキシベンゾエ ート０．５■グルコース　　　　　　　　　　　　　　　４４．１■ヒアルロン 酸亜鉛活性成分　　　　　　１０．０■ソルビン酸カリウム　　　　　　　　　 　　１．０　ｍｇソルビトール　　　　　　　　　　　　　４１．０■例２０〜 ２８に記載される組成物は、主に皮膚化学及び化粧用目的のために使用される。

例２に記載される品質の活性成分を、これらの例に使用する。

■、　　。　　のためのｒ゛ ■−川 ヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　　５．ＯＫソルビン酸カリウム　　　　 　　　　　　１．０■酢酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　２４．６■ヒア ルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　　２．０■ソルビン酸カリウム　　　　　　 　　　　　１．０■ソルビトール　　　　　　　　　　　　　４８．３■＝Ｗ旧 虹ｌ立穴１ゴピＬと ■一旦 ヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　２０．０■アクリル酸重合体　　　　　 　　　　　２００　　■３０％濃度の水酸化ナトリウム　　　　　　５０　　■ ソルビン酸カリウム　　　　　　　　　　１０　　ｍｇ蒸留水　　　　　　　　 　　　　　　　　１０．０■まで五−ｎ ヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　２０．０■アクリル酸重合体　　　　　 　　　　　５０　　ｗｇ３０％濃度の水酸化ナトリウム　　　　　　４０　　■ プロピレングリコール　　　　　　　１５００　　■ソルビン酸カリウム　　　 　　　　　　　１０　１ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　１０．０　Ｉ Ｉｇまでヱー里里仇里皇太支坐至酉二互及グ艶皇五−益 ヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　　５０■ソルビン酸カリウム　　　　　 　　　　　　１０　Ｗｉｇ軟かなホワイトハチの田螺　　　　　　　１２５　＊ ソルビタンオレエート　　　　　　　　　　Ｉ５０■セチルステアリルアルコー ル　　　　　　８４０■グリセリルモノステアレート　　　　　　１１００■プ ロピレングリコール　　　　　　　　　４７５０■蒸留水　　　　　　　　　　 　　　　　　　１０　ｇまで側ヨ」■ ヒアルロン酸コバルト活性成分５０■ ソルビン酸カリウム　　　　　　　　　　　１０■軟かなホワイトハチの田螺　 　　　　　　１２５■ソルビタンオレエート　　　　　　　　　　１５０ＩＩｇ セチルステアリルアルコール　　　　　　８４０■グリセリルモノステアレート 　　　　　　１１００１ｇプロピレングリコール　　　　　　　　　４７５０　 ｇ蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　ｇまで■−益 ヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　　５０■２−フェノキシエタノール　　 　　　　　１００■ラウリル硫酸ナトリウム　　　　　　　　１００■セチルパ ルミテート　　　　　　　　　　４００１１ｇステアリン　　　　　　　　　　 　　　　４００１ｇステアリルアルコール　　　　　　　　　４５０１ｇセチル アルコール　　　　　　　　　　　４５０にホワイトワセリン　　　　　　　　 　　　５００１ｇプロピレングリコール　　　　　　　　　５５０　ｍｇグリセ ロール　　　　　　　　　　　　６００■蒸留水　　　　　　　　　　　　　　 　　１０．０ｇまで班−匹 ヒアルロン酸コバルト活性成分５０■ ２−フェノキシエタノール　　　　　　　１００１１ｇラウリル硫酸ナトリウム 　　　　　　　　１００１ｇセチルパルミテート　　　　　　　　　　４００■ ステアリン　　　　　　　　　　　　　　４００■ステアリルアルコール　　　 　　　　　　４５０■セチルアルコール　　　　　　　　　　４５０■ホワイト ワセリン　　　　　　　　　　　５００■プロピレングリコール　　　　　　　 　　５５０■グリセロール　　　　　　　　　　　　６００　ｇ蒸留水　　　　 　　　　　　　　　　　　１０　ｇまで■−Ｆ ヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　　５０．０■微小結晶性！Ｉｔ　　　　 　　　　　　　　　２５０　　■プロピレングリコール　　　　　　　　５００ 　　■ソルビトール　　　　　　　　　　　　　４００　　■羊毛蝋　　　　　 　　　　　　　　　　５００　１ｇホワイトワセリン　　　　　　　　　　　１ ０　　ｇまで■、ヒ　　ｌ　　びヤ　ドの′　ヒ　び　　ヒのための■−益 ヒアルロン酸亜鉛活性成分　　　　　　　１０　　■ソルビン酸カリウム　　　 　　　　　　　　１．０■親水性コロイド状二酸化珪素　　　　　　５０　　■ ソルビトール　　　　　　　　　　　　　　ｌ　ｇまで噛七、＋、Ａ直 国際調査報告

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．除プロトン化されたヒアルロン酸と周期表の第４周期の第３金属イオンとの 会合物（複合体）。
2. ２．第３金属イオンとして亜鉛イオンを含んで成る請求の範囲第１項記載の会合 物。
3. ３．第３金属イオンとしてコバルトを含んで成る請求の範囲第１項記載の会合物 。
4. ４．活性成分として、除プロトン化されたヒアルロン酸と周期表の第４周期の第 ３金属イオンとの会合物（複合体）の有効量及び医薬産業において通常使用され るキャリヤー及び又は添加剤、場合によっては、他の治療的に活性な物質を含ん で成る医薬組成物。
5. ５．活性成分として、除プロトン化されたヒアルロン酸と亜鉛イオンとの会合物 を含んで成る請求の範囲第４項記載の医薬組成物。
6. ６．活性成分として、除プロトン化されたヒアルロン酸と周期表の第４周期の第 ３金属イオンとの会合物（複合体）の有効量及び場合によっては他の添加物を含 んで成る化粧用組成物（治療効果を有する）。
7. ７．活性成分として、除プロトン化されたヒアルロン酸と亜鉛イオンとの会合物 又はキャリヤーを含んで成る化粧用組成物。
8. ８．除プロトン化されたヒアルロン酸と周期表の第４周期の第３金属イオンとの 新規会合物（複合体）を調製するための方法であって、 ａ）等量の塩、好ましくは周期表の第４周期の第３金属の１つの塩化物を含む水 溶液をヒアルロン酸ナトリウムの水溶液又はヒアルロン酸塩の他の塩（アルカリ 又はアルカリ土類金属の塩、場合によっては銀塩）に添加し；又はｂ）ヒアルロ ン酸と第四アンモニウム塩から形成された会合物を、周期表の第４周期の第３金 属イオンの水溶液及び水と一部混和性の溶媒、好ましくはｎ−ブタノールを含む 溶媒対の水性懸濁液に溶解し；次に −脱プロトン化されたヒアルロン酸と周期表の第４周期の第３金属イオンから得 られた会合物（複合体）をアルカノール又はアルカノンにより既知方法で沈殿せ しめ、又は−溶液から沈殿物を分離し、そして次に−所望によりそれを適度な条 件下で乾燥せしめることを含んで成る方法。
9. ９．第３金属イオンとして亜鉛イオンを用いることを含んで成る請求の範囲第８ 項記載の方法。
10. １０．第３金属イオンとしてコバルトを用いることを含んで成る請求の範囲第８ 項記載の方法。
11. １１．ヒアルロン酸亜鉛を含む水性組成物の直接的な調製方法であって、等張状 態を達成するのに必要とされる等量又はその等量以上の量で塩化亜鉛を含む水溶 液を添加することを含んで成る方法。
12. １２．医薬組成物の調製方法であって、活性成分として、請求の範囲第８項記載 の方法を用いることにより調製された、除プロトン化されたヒアルロン酸と周期 表の第４周期の第３金属イオンとの会合物、及び通常使用されるキャリヤー、希 釈剤並びに、場合によっては等張化剤又は他の添加物を混合し、又は溶解し、そ してそれらを医薬組成物に転換することを含んで成る方法。
13. １３．化粧用組成物（治療効果を有する）調製方法であって、活性成分として、 請求の範囲第８項記載の方法を用いることにより調製された、除プロトン化され たヒアルロン酸と周期表の第４周期の第３金属イオンとの会合物、通常使用され るキャリヤー及び希釈剤を混合し、そして場合によっては、等張化剤及び／又は 他の添加物と共にそれらを混合し又は溶解し、そしてそれらを化粧用組成物に転 換することを含んで成る方法。
14. １４．周期表の第４周期の第３金属イオンにより形成される会合物として亜鉛会 合物を用いることを含んで成る請求の範囲第１２又は１３項記載の方法。
15. １５．周期表の第４周期の第３金属イオンにより形成される会合物としてコバル ト会合物を用いることを含んで成る請求の範囲第１２又は１３項記載の方法。