CN1064372C - 透明质酸钠制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及透明质酸钠制剂的新方法，该方法以鸡冠为原料，经过组织消化、季铵盐分离、提纯、精制，所得产品质量好，收率比现有方法提高5倍以上，成本大幅度下降，宜于规模型工业生产。本发明还公开了该制剂在人体心外科、小儿泌尿外科、椎管外科、妇产科、腹部外科等手术中以及鼓室成形术和防止术后肌腱粘连等方面的新应用。
Description
本发明属透明质酸钠制剂制备方法技术领域。
透明质酸钠的医用制剂(Sodium Hyaluroanale Product简称SHP)是一种用途广泛的生物材料。目前，一般采用从动物组织中提取制备透明质酸钠制剂，主要原材料有鸡冠或脐带，但因原料及加工成本高而收率低等因素影响了扩大使用。
例如美国专利USP 4,141,973(1979)揭示的工艺路线：
鸡冠→清洗→蒸馏水浮联→氯仿萃取/酶消化→氯仿萃取→己醇萃取→成品(透明质酸钠)
该方法以5公斤鸡冠投料获得3.97克，收率0.8g/公斤。
本发明的目的在于克服上述缺点，研制一种成本低、产品质量好、收率高的新方法。
本发明公开了从鸡冠中提取透明质酸钠制备透明质酸钠制剂的新方法。
本发明的制备透明质酸钠制剂的新方法的工艺流程如下：
清洗 绞碎 消化 沉淀 溶解
鸡冠——→原料——→组织——→组织液——→沉淀物——→
分离 溶解 沉淀 溶解 除菌
解离液——→粗品——→溶解液——沉淀物—→溶解液—→
沉淀 配料 灌装 灯检 包装
除菌溶液——→沉淀物——→制品——→——→—→成品
本发明的透明质酸钠制剂的制备方法包括下列步骤：
一.原料处理
取新鲜鸡冠或冷藏解冻的鸡冠，用水洗净表面污物、剪去冠尖、冠叶以及附带在鸡冠上含鸡毛的鸡皮等，同时去除鸡冠中所含的淤血块。用水漂洗数次后用蒸馏水漂洗3次，沥干后，置电动绞肉机中绞碎，粉碎的鸡冠组织用乙醇或丙酮浸渍，换浸渍液3次后将该鸡冠组织沥干备用；
二.鸡冠组织消化
取上述沥干的鸡冠组织，加入2倍量蒸馏水进行热萃取，热萃取的温度30～50℃，萃取时间为2～8小时，然后进入酶消化。
(1)胃蛋白酶消化，消化条件为PH1.0～4.0，反应温度25～45℃，消化时间1～6小时，酶用量每公斤原料为10～50克胃蛋白酶，
(2)胰蛋白酶消化，消化条件为PH6.0～9.0，反应温度30～50℃，消化时间1～6小时，酶用量每公斤原料为1～20克胰蛋白酶，消化完毕后升温至60～80℃，保温10～30分钟，自然冷却至室温备用；
三.季铵盐沉淀及解离液分离
取上述消化液，加1～5倍量蒸馏水稀释，依据总体积按重量体积比，加入硅藻土，硅藻土用量为1～5％(w/v)，搅拌均匀后，用真空抽滤法或高速离心法，去除硅藻土，收集澄清上清液，量取体积，加入季铵盐，该季铵盐可以是氯代十六烷基、溴代十六烷基吡啶或硫酸铵，加量为每公斤原料加5～15克季铵盐，搅拌、静置。收集沉淀物、废弃上清液，收集的沉淀物称重，用解离液解离。解离液的配制，1000ml蒸馏水中含0.1～1M Nacl，10～50％的乙醇，PH6～9之间，解离后备用；
四.有机溶液分离
取上述解离液，量取体积，按重量体积比加入硅藻土，硅藻土用量为1～5％(w/v)，搅拌1～3小时后，用真空抽滤法或高速离心法，去除硅藻土，收集上清液，量取体积，根据体积加入1～5倍量的乙醇或丙酮，搅拌、静置、过滤，收集沉淀物，脱水干燥后得透明质酸钠干粉备用；
五.除菌过滤
取上述的脱水干燥后的透明质酸钠干粉，用蒸馏水配成一定浓度(0.01～2％)，用0.3um醋酸纤维膜进行除菌过滤，收集除菌滤液，加入1～5倍量无菌丙酮或乙醇过滤，收集沉淀物，真空干燥后得无菌的透明质酸钠制品备用；
六.配制灌装透明质酸钠医用制剂
取上述无菌的透明质酸钠制品干粉，用无菌配制液将该品配制为0.5-2％浓度的液体或胶体制剂，然后进行灌装可以装在瓶内，亦可直接装入注射器中。该配制液可以是常规药用的生理平衡液、防腐剂、稳定剂、细胞营养液，如氯化钠、磷酸缓冲液、林格氏液等。
经上述方法制得透明质酸钠的收率为4.5克纯透明质酸钠/每1公斤鸡冠。比现有方法提高5倍。
用本发明方法制得的透明质酸钠制剂检测结果如下：
经上海生物材料研究测试中心抽样测试结果：
外观 无色透明粘稠状液体
蛋白质含量 0.025％(w/v)
葡萄糖醛酸含量 39，78(w/v)
特性粘度 1694.16cm3/g
平均分子量 9.8×105
紫外吸收：
257nm波长 1.72
280nm波长 0.30
PH值 7.33
无菌试验 合格
细胞毒性试验 1级毒性反应(0～5分级)
溶血试验 无溶血反应
热源试验 无热源反应
全身急性毒性试验 无急性毒性反应
皮内刺激试验 无刺激反应
短期肌肉种植试验 合格(3个月)
测试结论：合格
用本发明方法制得的透明质酸钠制剂的急性毒性实验结果如下：(由苏州医学院药理教研室实验)一.材料：
药材(辅料)：1％透明质酸钠，无色透明，胶体状，PH7.1，由上海建华精细生物制品厂生产提供，(批号：930301)。
动物：昆明种小白鼠，由苏州医学院实验动物中心供应。二.方法和结果：
取小白鼠40只，体重18.5～21克，雌雄各半，均分两组，一组为灌胃，另一组为腹腔注射给药。实验前禁食18小时，不禁水，每只小鼠分别给1％透明质酸钠0.5ml/10g(体重)，观察给药后动物活动、进食、饮水及存活情况。
实验结果：给药后动物活动如常，腹腔注射给药动物未见腹部刺激症状，给药后共观察7日，小鼠活动、进食、饮水、毛的光泽等均未见异常，实验动物全部存活，药后7日称各鼠体重，体重增长均正常。
实验结果表明，用相当人临床用量(5ml/次/成人计)500倍的1％透明质酸钠给小鼠灌胃或腹腔注射，未出现动物死亡，也未见任何异常反应。表明该透明质酸钠制剂毒性甚低。该制剂为静脉禁注剂。
根据本实验结果，灌胃或腹腔注射给药的LD50＞＞50ml/kg，因而用于各科临床的量是相当安全的。
透明质酸钠医用制剂已用于人体临床，例如眼外科、骨关节等，但至今未见其他临床应用的报道。本发明人致力于探索其在临床上的新应用，经悉心研究和试验，现证实透明质酸钠医用制剂在人体心外科、小儿泌尿外科、椎管外科、妇产科、腹部外科等手术中以及鼓室成形术和防止术后肌腱粘连等方面有新的应用。
本发明的另一目的是公开了透明质酸钠医用制剂在人体心外科、小儿泌尿外科、椎管外科、妇产科、腹部外科等手术中以及鼓室成形术和防止术后肌腱粘连等方面的新应用。一.透明质酸钠医用制剂用于心外科手术的临床观察
上海中山医院选用上海建华精细生物制品厂提供的医用透明质酸钠制剂-(SHP)应用于心脏病手术防止术后心包粘连，现将观察结果报告如下：
材料和方法：5例中女性3例，男性2例，年龄平均为35岁。病种：动脉导管未闭1例，二尖瓣狭管扩张术2例，先天心脏病1例，二尖瓣换瓣术1例。
手术方法：动脉导管未闭1例采用怀管结扎术后在纵腹胸膜内注入SHP3CC后再缝合纵腹胸膜。另4例，均在心包膜内手术结束，止血后在心脏切口表面及心包膜内注入SHP3CC后缝合心包。
术后12小时、24小时、2、3、7天观察全身情况及有无不良反应，记录如下，观察结果：
术后能正常复苏，术后12小时内无一例出血，心律正常，血压均在正常范围，无高热等，24小时至7天内隔日查血常规，WBC由高逐日降至正常，与原来未用SHP的病人术后情况相同，病员使用SHP后无肝功能、肾功能损害或衰落现象，无恶心呕吐、血压等异常现象，伤口均愈合。
结论：临床应用证明，透明质酸钠医用制剂无菌、无毒、无感染、无异常反应，经5例病人应用观察，未发现不良反应，术后病人恢复良好。二.透明质酸钠医用制剂在小儿泌尿外科应用的报告
上海医科大学儿科医院采用由上海建华精细生物制品厂生产的医用透明质酸钠制剂，进行临床观察。方法：1.先天性肾盂积水10例，男8例，女2例：年龄5个月-10岁。2.局部病变情况：肾盂输尿管连接及输尿管上端2-3厘米段狭窄7例，粘连扭曲2例，输尿管腔外血管压迫1例。3.手术方法：切除病变输尿管3-4厘米，作肾盂和输尿管上段端的吻合术，在吻合四周注入SHP溶液5ml。4.高位隐睾作为分期睾丸固定术5例。术后睾丸只能降至外环口下方水平。将睾丸固定在该水平的皮下组织间隙内，在睾丸及精索周围注入SHP溶液5ml。结果：
10例作肾盂输尿管上段端吻合术后2-3周，经肾盂造瘘管注入15％泛影葡胺40-60ml，在电光镜下见肾盂、输尿管的蠕动波将造影剂推过吻合口向下传递，吻合口通畅。10例均拔除造瘘管出院，随访时间1个月至半年，复查B超均提示肾盂积水明显改善临床症状消失。
5例高位隐睾，需半年至一年后再作手术固定时观察。结论：
以往，肾盂、输尿管吻合术后失败的主要原因是吻合口周围产生粘连后的疤痕狭窄，及吻合漏致尿液外渗引起继发感染后的炎性狭窄。而应用SHP制剂后能减少吻合的炎性粘连反应，其主要是抑制成纤维细胞的活性和抑制毛细血管形成，从而降低炎性狭窄的发生率。此外，SHP制剂是一种高分子化合物，遇水后能膨胀，在吻合周围注入SHP溶液后能起到隔开组织表面作用，防止由于粘连后的疤痕狭窄。经过10例病儿术后在电镜下造影观察，可见造影剂能顺利通过吻合口的蠕动波，证实术后2-3周吻合口已能恢复良好的排空功能，肾盂输尿管吻合口的通畅率大大提高。
临床应用证明本制剂无菌、无毒、无感染，使用安全，效果良好。15例病人术后12小时、24小时、2、3、7天观察全身情况，无恶心呕吐、高热、出血现象。血压、呼吸、心率均在正常范围。24小时至7天内隔日查血常规和尿常规，未见异常情况。术后复查肝、肾功能均正常。伤口一期愈合。
结果证明由上海建华精细生物制品厂提供的医用透明质酸钠在临床使用无不良反应，在预防术后粘连提高手术成功率方面临床效果明显，是值得推广应用的。三.透明质酸钠医用制剂在椎管手术中的应用
上海市长宁区中心医院骨科应用透明质酸钠在腰椎骨内手术中预防术后神经粘连取得初步结果。
男性15例，女性8例，年龄25-46岁。椎板减压19例，髓核摘除4例，共23例。
选用透明质酸钠(关节腔注射用)，每例2.5ml。每例在手术缝合关闭前严格止血，冲洗缝合创面后吸尽液体和血块，基本做到手术区内无出血点和血液，然后将透明质酸钠涂布在脊膜和神经根。
术后均无心率、体温、血尿常规、肝脾功能异常改变，无过敏反应，大小便均正常，鞍区及双下肢无烧灼感、无神经刺激症状。
术后随访时间较短尚难定论，但从术后0.5-4个月观察21例病例(91.3％)术后均感无下肢任何牵拉不舒感。
透明质酸钠在椎管内手术中应用的初步观察表明，本品使用方便、安全，为预防术后神经粘连提供了一个值得可取的手段。四.透明质酸钠医用制剂在妇产科应用的临床小结
长征医院妇产科对166例患者在手术中应用了透明质酸钠医用制剂，其中妇科手术97例，产科手术69例。患者年龄为23-70岁，平均42.05±9.54岁。
妇科急腹症包括6例异位妊娠，1例卵巢囊肿；恶性肿瘸中2例为卵巢囊腺癌，1例子宫内膜癌。子宫肌腺症与子宫内膜异位症一并在子宫内膜异位症中统计。
透明质酸钠医用制剂由上海建华精细生物制品厂提供。为妇产科手术专用型，规格为5ml/瓶，每个患者用1瓶。在手术关腹前，将透明质酸钠均匀涂布在手术创面上
术后严密观察血压、脉搏、血压和血、尿常规。术后一至两月门诊随访，详细询问是否存在肠粘连引起的自觉症状。
结果：患者手术后，心率和血压均正常，除术后2-3天有吸收热和短暂白细胞增高外，无因应用透明质酸钠引起的炎症反应。无恶心、呕吐及腹泻等胃肠道副反应，无皮疹、高热、寒战等过敏反应。住院期间，在活动很少的情况下，无一例患者有腹腔炎症粘连的表现，妇科手术组住院天数为10.55±2.62天，无因用透明质酸钠引起副作用面需延长住院时间者。术后一至两月门诊随访，患者腹部柔软，盆腔内无压痛，无阵发性腹痛发作史。5例行输卵管显微吻合术的患者，均在术后2月内妊娠。
讨论：透明质酸钠医用制剂的主要成份是多糖，仅含0.025％的蛋白质，因此不会引起免疫反应。也没有种族特异性。由于其不是药品，故在妇产科手术中应用没有绝对的禁忌症，本研究显示，透明质酸钠制剂在应用中，无毒无刺激，未引起任何副作用。五.透明质酸钠医用制剂在腹部外科临床应用的小结
长征医院普外科对接受腹部手术的186例病人术中应用了透明质酸钠医用制剂。其中，男性97例，女性89例；年龄28-85岁，平均52.64岁；急诊手术25例(13.44％)，平诊140例(86.56％)；I类手术23例(12.37％)，II类140例(75.27％)，III类23例(12.37％)。186例疾病种类及具体手术情况见表1和表2。
透明质酸钠医用制剂系上海建华精细生物制品厂产品。手术结束关腹前，取该药20ml倒入腹腔，并使之均匀涂布于创面。术后除常规观察必要指标外，定期严密观察病人体温、有无过敏征象，腹部情况，血象，必要时复查腹腔B超。出院后门诊随访，调查有无肠粘连征象及其它情况。
表1 186例病人病种分布
例数 百分比(％)胆囊炎胆石症 60 32.26胆管结石 10 5.38胆管癌 2 1.08原发性肝癌 24 12.90肝血管癌 4 2.15胃癌 30 16.13消化性溃疡 8 4.30结肠癌 21 11.29直肠癌 16 8.60阑尾炎 4 2.15胰腺癌 2 1.08肠粘连 2 1.08门脉高压 3 1.61合 计 186 100.0
结果：全部病人均顺利渡过围手术期。体温和血象多于术后6-7天内恢复正常。肠鸣音多天2-3天内恢复。患者无高热、剧吐、阵发性腹痛等症状。切口愈合良好，均如期拆线，复查B超无腹腔积液。
表2 186例病人手术情况
例数 百分比(％)胆囊切除术 60 32.26胆切+T管引流 10 5.38胆道空肠吻合 2 1.08肝叶切除术 10 5.38肝动脉DDS置管 16 8.60肝血管瘤捆扎术 2 1.08胃癌根治(全胃) 6 3.23胃痛根治(胃大部) 20 10.75胃大部切除术 8 4.30胃空肠吻合术 4 2.15右半结肠切除 10 5.38左半结肠切除 8 4.30直肠前切除 6 3.23Mile’s手术 8 4.30结肠造口+DDS管 5 2.69阑尾切除术 4 2.15胰十二指肠切除 1 0.54胆囊空肠吻合 1 0.54肠粘连松解术 2 1.08脾切除术 2 1.08脾切+断流术 2 1.08合 计 186 100.00
所有患者用药后未见皮疹、肠麻痹、腹泻等全身或局部之过敏症象。
术后随访1周到6个月，患者均无肠粘连及其它胃肠功能紊乱之征象。2例粘连性梗阻病人术后告痊愈，随访4-5个月效果良好。六.透明质酸钠医用制剂防止术后肌腱粘连临床应用研究
上海医科大学华山医院运用上海建华精细生物制品厂提供的医用透明质酸钠制剂(SHP)，进行防止肌腱粘连的临床应用研究，报告如下：
材料和方法一.一般资料：手部11区肌腱损伤患者6名(8例手指)，男性4名，女性2名，平均年龄24.5岁，其中急症手术1名，择期手术5名；右示指2例，右环指1例，右示中指2例，左拇指1例，左中环指1例，左示指1例，均为11区(无人区)肌腱损伤。术中样查完全离断1名(1例)，肌腱粘连5名(7例)。肌腱粘连5名中有2名为双指肌腱损伤术后粘连(右示中指及中环指各1名)。二.方法：a.1例肌腱完全离断者，得11区内肌腱直接致良K氏修复，切掉部分滑车，局部置SHP1ml，彻底止血闭切口。b.3例肌腱粘连者行肌腱粘连分离后局部置SHP1ml，彻底止血闭切口。c. 另2名患者(4例)因同时双指肌腱损伤术后粘连，给予彻底肌腱粘连分离后单指局部置SHP1ml，另一指作自体对照，彻底止血后闭切口。
所有患者均术后置石膏固定48小时后拆去石膏，作保护下主动伸指、被动屈指功能训练。
以TAM改进差值(ΔTAM＝TAM术后-TAM术前)作比较。进行小样本量Fisher’s统计学分析。
结果1.2名自体对照患者(4指)TMA改进值：
用SHP2指(实验组)： ΔTAM＝188.3
未用SHP2指(对照组)： ΔTAM＝124.2显而易见，两者有一定差异，提示运用SHP者效果较为理想。2.4名(4指)患者，其中3名肌腱粘连，1名为肌腱断损，其中：
肌腱粘连术后平均： ΔTAM＝162.4
肌腱断损直接缝接局部SHP1ml后： ΔTAM＝118.3
未用SHP对照组平均： ΔTAM＝142.4
Fisher’s精确检验统计分析P＜0.01有显著差异，提示运用SHP防止肌腱粘连有临床意义。
讨论1.透明质酸钠因具有可靠的生物相容性，可安全地应用于临床。本组6名患者8倒手指中6例应用SHP，术后均无全身毒性反应及局部严重肿胀、渗出等表现，伤口愈合良好，证实了其安全性。2.透明质酸钠具有可吸收性及亲水性，可附着在肌腱等组织周围，形成一层隔离膜，防止肌腱与周围组织粘连。本研究实验组及对照组术后ΔTAM的比较，实验关节主动活动度比对照组有显著增高，说明SHP在防止肌腱粘连中有实际、有效的意义。七.透明质酸钠医用制剂在鼓室成形术中的应用
上海医科大学华山医院应用上海建华精细生物制品厂制备的透明质酸钠医用制剂，对23例鼓室成形术作临床研究结果如下：
材料及方法
23例均为住院病人，其中男性14例，女性9例。年龄范围20-64岁，平均39岁。其中慢性中耳炎单纯鼓膜修补术6例，一期鼓室成形术(III型)2例；粘连性中耳炎鼓室成形术10例；鼓室成形术后鼓膜萎缩再次修补5例。
8例慢性中耳炎病人于鼓膜穿孔边缘除去鳞状皮移植床，鼓室内填以含1％SHP之明胶海绵，取耳屏软骨膜或乳突骨膜作移植鼓膜，其中2例鼓室成形术均凿取乳突皮质骨修成骨小柱，立于镫骨中板上，以含1％SHP之明胶海绵围绕扶持固定。
10例粘连性中耳炎均做耳道内切口，分离与听骨粘连之鼓膜，分离听小骨之间粘连带，然后于听骨之间及鼓室内填以含1％SHP之明胶海绵，鼓耳道皮办复位。
5例鼓室成形术后时间不等，因鼓膜萎缩致再次出现鼓膜穿孔，经3月以上刺激修补，贴硼酸尿素棉片，穿孔未能愈合。乃于穿孔边缘去鳞状上皮，搔刮刺激后，取1％SHP滴于穿孔边缘及鼓室内，每周1次，至穿孔愈合。
结果
8例慢性中耳炎病人术后2周取出耳道内填塞海绵后，见移植骨膜全部成活，且鼓膜表面大部分已成为鳞状上皮覆盖，术后3-4周则全部覆盖，均较未使用SHP者创面修复快。随访2-4月未发生鼓膜萎缩及穿孔。其中2例鼓室成形术(III型)骨小柱位置固定，未见移动或倒伏，听力提高明显，语言频率平均20-30db。
10例粘连中耳炎病人术后1周取出耳道填塞海绵，见耳道内切口愈合良好，鼓膜完整，无明显内陷粘连，术后随访2-4月未见鼓膜内陷粘连，听力提高稳定，平均20-30db。其中4例系外伤性传导性聋，术中见鼓室内积血已消除，听骨之间、听骨与上鼓室外侧壁之间有广泛粘连形成，镫骨活动差，术后听力提高明显，平均约30db，随访2-4月听力明显下降，未见明显听骨粘连征象。
5例鼓室成形术后鼓膜萎缩病人，原手术时均未用过SHP。经1-3次SHP治疗后，其中4例鼓膜孔愈合。另1例治疗1月后仍未愈合，放弃治疗。
讨论
鼓膜是研究创伤愈合的理想器官。鼓膜有独特的结构，它的内外两侧均存有空气。我们可以通过耳道清楚地看到鼓膜修复情况。证实SHP能明显提高鼓膜穿孔治愈率，且愈合时间相当短，自然愈合也无法相比。有些穿孔病程很长，看上去很稳固，使用SHP后穿孔也能闭合。且愈合过程中没有出现萎缩现象。
本文23例进一步证实鼓室成形术中使用SHP，移植鼓膜成活率明显提高，创面愈合过程加快，愈合后鼓膜再萎缩穿孔的机率下降。SHP还能起到暂时固定骨小柱的作用，减轻术后听骨粘连，从而提高鼓室成形术的疗效。
23例病人治疗过程中没有出现耳鸣、眩晕、耳背症状，也没有引起内耳损伤，且无不良反应、未引起耳内感染，病人易于接受，值得在耳科临床中推广应用。
上述临床结果表明透明质酸钠医用制剂在人体心外科、小儿泌尿外科、椎管外科、妇产科、腹部外科等手术中以及鼓室成形术和防止术后肌腱粘连等方面的应用是可行的，也是安全可靠的，有关这部份的新应用至今未见国内外文献资料报道。
本发明方法比现有方法有创造性的突破，制备的透明质酸钠制剂质量好、收率高，比现有方法的收率提高近5倍，从而极大地降低了成本，宜于规模型工业化生产。另外，本发明公开的透明质酸钠医用制剂在人体临床心外科、小儿泌尿外科、椎管外科、妇产科、腹部外科等手术中以及鼓室成形术和防止术后肌腱粘连等方面的新应用，将给患者带来希望，并且扩大了透明质酸钠医用制剂的用途。
实例一 制备透明质酸钠制剂
取冰冻鸡冠，解冻、剪去冠尖、冠叶及鸡皮，去尽瘀血块，用水洗干，蒸馏水漂洗3次，沥干后称重，取1000克置电动绞肉机内粉碎，用2倍量95％乙醇浸泡，换液3次，将碎组织沥干。然后用2倍量蒸馏水在40℃热萃取6小时后进行酶消化。胃蛋白酶用量20克，PH2.5，反应温度28℃，消化4小时，然后升温至40℃，加胰蛋白酶3克，PH8.0，消化4小时，毕后升温至56℃，保温30分钟，冷却后过滤，滤去未消化的残渣，取消化液加入1倍量蒸馏水，量取总体积后按1％加入硅藻土，搅拌均匀后，用真空抽液法去除硅藻土，上清液中加入氯代十六烷基吡啶8克，搅拌静置，收集沉淀物，用4倍量解离液解离后加入3倍量乙醇静置6小时，收集沉淀，脱水真空干燥。再用水配制成0.05％浓度，0.3um膜除菌过滤，在滤液中加入3倍量乙醇，收集沉淀物4.7克，称重后用常规药用配制液配成1％浓度进行灌装至成品。实例二 制备透明质酸钠制剂
取冰冻鸡冠，解冻、剪去冠尖、冠叶及鸡皮，去尽瘀血块，用水洗干，蒸馏水漂洗3次，沥干后称重，取1000克置电动纹肉机内粉碎，用3倍量丙酮浸泡，换液3次后，将碎组织沥干。然后加2倍量蒸馏水置50℃热萃取6小时后进行酶消化。胃蛋白酶用量40克，PH2.0，反应温度32℃，消化2小时，然后升温至50℃，加胰蛋白酶5克，PH8.8，消化2小时，毕后升温至60℃，保温15分钟，冷却至室温，加入两倍量蒸馏水，量取总体积后按2.5％加入硅藻土，用高速离心法(1600xg)离心去除硅藻土，上清液中加入溴代十六烷基吡啶15克，搅拌静置，收集沉淀物，该沉淀物再用4倍量解离液解离后量取体积量，按2％加入硅藻土，用真空抽滤法去除硅藻土，上清液中再加入溴代十六烷基吡啶12克，搅拌、静置后收集沉淀物，该沉淀物再用解离液解离后，加入2倍量乙醇，静置12小时，收集沉淀物，脱水真空干燥，用蒸馏水配制成0.08％浓度，0.3um膜除菌过滤，在滤液中加入3倍量丙酮，收集沉淀物4.48克，称重后用常规药用配制液配制成1％浓度，进行灌装至成品。实例三 制备透明质酸钠制剂
取冰冻鸡冠，解冻、剪去冠尖、冠叶及鸡皮，去尽瘀血块，用水洗干，蒸馏水漂洗3次，沥干后称重，取1000克置电动绞肉机内粉碎，用3倍量丙酮浸泡，换液3次后，将碎组织沥干。然后加2倍量蒸馏水置48℃热萃取6小时后进行酶消化。胃蛋白酶用量50克，PH2.2，反应温度30℃，消化2小时，然后升温至48℃，加胰蛋白酶10克，PH8.5，消化2小时，毕后升温至58℃，保温20分钟，冷却至室温，量取消化液体积，加入两倍量蒸馏水，依据总体积加2％硅藻土，真空抽滤去除硅藻土，在上清液中加入硫酸铵5克，搅拌静置后收集沉淀物，用解离液溶解解离沉淀物，重复上述过程2次，即加硅藻土吸附，去除硅藻土后用硫酸铵沉淀，收集沉淀用解离液解离。然后用蒸馏水复溶后再用2倍量乙醇沉淀，收集沉淀脱水后真空干燥。透明质酸钠干粉用蒸馏水配制成0.1％度，0.3um醋酸纤维膜除菌过滤，在滤液中加入3倍量丙酮，收集沉淀物3.9克，称重后，用常规配制液配制成1％浓度，然后进行灌装为成品。
Claims (4)
1、一种从鸡冠中提取制备透明质酸钠制剂的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：(1)原料处理
取新鲜鸡冠或冷藏解冻的鸡冠，用水洗净表面污物、剪去冠尖、冠叶以及附带在鸡冠上含鸡毛的鸡皮，同时去除鸡冠中所含的淤血块。用水漂洗数次后用蒸馏水漂洗3次，沥干后，置电动绞肉机中绞碎，粉碎的鸡冠组织用乙醇或丙酮浸渍，换浸渍液3次后将该鸡冠组织沥干备用；(2)鸡冠组织消化
取上述沥干的鸡冠组织，加入2倍量蒸馏水进行热萃取，热萃取的温度30～50℃，萃取时间为2～8小时，然后进入酶消化，I胃蛋白酶消化，消化条件为pH1.0～4.0，反应温度25～45℃，消化时间1～6小时，酶用量每公斤原料为10～50克胃蛋白酶；II胰蛋白酶消化，消化条件为pH6.0～9.0，反应温度30～50℃，消化时间1～6小时，酶用量每公斤原料为1～20克胰蛋白酶，消化完毕后升温60～80℃，保温10～30分钟，自然冷却至室温备用；(3)季铵盐沉淀及解离液分离
取上述消化液，加1～5倍量蒸馏水稀释，依据总体积按重量体积比，加入硅藻土，硅藻土用量为1～5％(w/v)，搅拌均匀后，用真空抽滤法或高速离心法，去除硅藻土，收集澄清上清液，量取体积，加入季铵盐，搅拌、静置，收集沉淀物、废弃上清液；收集的沉淀物称重，用解离液解离，解离后备用；(4)有机溶液分离
取上述解离液，量取体积，按重量体积比加入硅藻土，硅藻土用量为1～5％(w/v)，搅拌1～3小时后，用真空抽滤法或高速离心法，去除硅藻土，收集上清液，量取体积，根据体积加入1～5倍量的乙醇或丙酮，搅拌、静置、过滤，收集沉淀物，脱水干燥后得透明质酸钠干粉备用；(5)除菌过滤
取上述的脱水干燥后的透明质酸钠干粉，用蒸馏水配成0.01～2％(w/v)浓度，用0.3um醋酸纤维膜进行除菌过滤，收集除菌滤液，加入1～5倍量无菌丙酮或乙醇过滤，收集沉淀物，真空干燥后得无菌的透明质酸钠制品备用；(6)配制灌装透明质酸钠医用制剂
取上述无菌的透明质酸钠制品干粉，用无菌配制液将该品配制为0.5～2％(w/v)浓度的液体或胶体制剂，然后进行灌装可以装在瓶内，亦可直接装入注射器中。
2、根据权利要求1所述的从鸡冠中提取制备透明质酸钠制剂的方法，其特征在于其中季铵盐沉淀步骤中使用的季铵盐为氯代十六烷基吡啶、溴代十六烷基吡啶或硫酸铵。
3、根据权利要求1所述的从鸡冠中提取制备透明质酸钠制剂的方法，其特征在于其中解离液分离步骤中的解离液组成为每1000毫升蒸馏水中含0.1～1克分子的氯化钠、10～50％(v/v)浓度的乙醇，pH为6～9。
4、根据权利要求1所述的从鸡冠中提取制备透明质酸钠制剂的方法，其特征在于其中用于制备透明质酸钠医用制剂的无菌配制液为常规的药用生理平衡液、防腐剂、稳定剂和细胞营养液。
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Legal Events
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Effective date of registration: 20030704 Patentee after: Qisheng Biopreparations Co., Ltd., Shanghai Patentee before: Gu Qisheng |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: SHANGHAI QISHENG BIOLOGICAL AGENT CO., LTD.; SHAN Free format text: FORMER OWNER: SHANGHAI QISHENG BIOLOGICAL AGENT CO., LTD. Effective date: 20080926 |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20080926 Address after: No. 2, 139 Anshun Road, Shanghai, building 5, post code: 200052 Co-patentee after: Shanghai Haohai Biological Technology Co., Ltd. Patentee after: Shanghai Qisheng biologics Co., Ltd. Co-patentee after: Shanghai Jianhua Fine Biological Products Co., Ltd. Address before: No 501, Wu Long Road, Shanghai, 200232 Patentee before: Qisheng Biopreparations Co., Ltd., Shanghai |
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