JPS58500485A - ヘパリンの調節解重合による生物学的活性の高純度ムコ多糖類の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘパリンの調節解重合による生物学的活性の高純度ムコ多糖類の製法 本発明は、ヘパリンの調節解重合（ｄｅｐｏ４ｙｒｎｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｃｏ ｎｔｒａ６ｅｅ）による生物学的に活性の高純度ムコ多糖類組成物の新規な製法 に係る。

より詳細には本発明は、％にある種の凝血段階を高度に特異的に調節することが でき、特により少数の凝血因子特に血液の活性Ｘ因子即ちｘ１因子に対してヘノ リンよりも高度の選択的活性を有する高度に均質なムコ多糖類混合物（本文中で はムコ多糖類を以後ＭＰＳなる略号で示す）を製造し得る前記のタイプの方法に 係る。

前記の如きＭＰＳは、貴重な薬剤ｑＩＩＶＣ抗血栓症ＩＩを構成し得る特性を有 する。従って、所望の治療に使用するために高純度ＭＰＳ特に反応媒体から混入 する可能性のおる全ての汚染物が実質的に完全に除去され一＊ＭＰ８を得ること が重畳であり、しかも、その製法は、実施し易い処理段階のみを用いて前記の如 きＭＰＳを安価に量産できる方法でなければならない。

発明者等は、この種の化合物を製造するために、特に、ヘノリンの構成鎖を分画 し得る化学薬品特に亜硝酸の作用下でへ／Ｑリンの調整解重合を生起せしめる方 法に着目した。

本文中及び請求の範囲の記載に於いてへ、ｅｌＪンなる用語は最も広義に使用さ れており、薬剤品質の市販へＩＱ　ＩＪン製剤又は生物材料特に哺乳類組織から 抽出して得られたような粗へ、ｅ　ＩＪンのいずれで４よいことに留意されたい 。

概して、今日までに提案された解重合方法では、多重数の汚染物特に未反応の亜 硝酸より生じた亜硝酸塩及び硝酸塩を含有する解重合混合物が生成される。従っ て、治療に使用する前に補助段階を付加し、これらの混合物のＭＰ８組成物を慎 重に精製する必要があることは明らかである。

更に、所望の解重合度まで反応させるためには、解重合の進行を厳密に調節し過 度の解重合を阻止するために解重合を停止させる必要がある。

発明者等は、所望ＯＭＰＳがより満足な状態で得られる方法を開発する九めに、 へ、ｅ　ＩＪンの調節解重合の種々の実施条件を検討した。

前記の如き検討の結果、反応ノ３ラメータの１つを別の使用ノラメータの関数と して選択すると、概して２００　ｕより高＜２５０にも達する高い抗Ｘ畠活性（ ＹＷ）を有しており亜硝酸塩−硝酸塩型の汚染物を実質的に含有しない解重合混 合物を高収率で生成することが可能でありしかも所望の解重合度に到達したとき に解重合を停止するために反応中に解重合を調節する必要がないことが判明した 。

従って本発明の目的は、所望の生物学的特性から見て特に重要であり亜硝酸塩及 び硝酸塩の如き全ての汚染物を実質的に含有せず従って治療用に特に適し良形状 で得らｎるＭＰＳの新規な製法を提供することである。

本発明の目的は更に、解重合度を任意に調整できるので、所望の解重合度に到達 したときに直ちに反応を停止するために反応持続時間を厳密に調節すること無く 前記の如きＭＰＳを製造し得る方法を提供することである。

本発明の目的は更に、ヘパリンの調節解重合条件が特別に選択されているために 工業的規模で極めて容易に実施し得る方法を提供することである。

本発明による生物学的活性ＭＰＳ組成物の製法の特徴は、へ、Ｑ　１７７と亜硝 酸、又は好ましくは亜硝酸を用時（ｉｎ　５ｉｔｕ　）生成させるための反応体 とを夫々、所望の解重合度に到達したときに亜硝酸又は前記の如き反応体が完全 に消費される濃度で使用し、このときに出発へＩＱリンの鉤部解重合の結果とし て所望ＭＰＳが得られるように前記反応体のＩＩｋ度と濃度以外の反応条件とを 互いの関数として有利に調整しておき、反応がひとりでに停止した後にアルコー ル溶媒により沈殿可能なタイプの生成物を反応媒体から分離し、回収することで ある。

生成物の所望の生物学的用途から考えれば、前記の如き処理が％に有利であるこ とは明らかである。即ち、解重合混合物から回収されたＭＰＳ組成物は有毒物質 を実質的に全く含まない。

特に、これらの組成物は亜硝酸塩及び硝酸塩のいずれをも含まない。亜硝酸が完 全に消費され窒素含有生成物が気体として除去されるので前記の如き誘導体が形 成され得る。このため反応後に、得られた組成物の有害な硝酸塩化合物による汚 染が完全に阻止され得る。

更に本発明方法は、実施技術に関してもかなりの利点を有する。

即ち、前記の如き処理によれば解重合反応は所謂ゝ自己調節”反応であり所望の 解重今度に到達したときにひとりでに停止する。

従って、ヘパリン鎖の過度の解重合を阻止するために従来技術で必要であった反 応持続時間の調節という制約が無くなる。

本発明によれば、従来の如く使用パラメータ特に反応体の濃度に左右される反応 速度論に従うこと無く、亜硝酸を生成する物質の濃度を、所望の生成物が得られ たときに反応体の１つが完全に消費されて消失するため解重合が停止して所望の 解重合が得られるように選択し得る。

亜硝酸、又は亜硝酸を用時生成させるための物質の使用１は、所望の品質の解重 合生成物を満足すべき収率で得るために十分な量であ抄、同時に、使用へ７３リ ンの品質を考慮に入れて完全に消費される量よ妙多い亜硝酸を生成しないための 上限を越えてはならない。

従って、本発明の好ましい実施態様によれば、約８乃至１０重量−のべＩＱリン 溶液と共に約０．０２Ｍ乃至０−１Ｍ％に約０．０３Ｍ乃至０．０５ＭのＮａＮ ０．を使用する。

前記の如き処理は、反応体の濃度以外の反応条件が特に、抗）（ａ活性（イン− ウニスラーＹｉｎ　−ＶｅＳａｌｅｒ　）が少くとも約２００　ｕ／ｑ好ましく は２５０　ｕ／１ｒｑより大でありＵＳＰ活性又はＡＰＴＴ活性が約３０ｕｉ未 満好ましくは約２０ｕｉ未満又は約１０ｕｉ未滴にもなりＹＷ力価／ＵＳＰ力価 又はＹＷ力価／ＡＰＴＴ力価の比が少くとも約３好ましくは約６以上又は１０以 上にも達しており且つ大部分が分子量約２０００乃至８０００ダルトン（ＨＰＬ Ｃ法で測定）の種から構成されているＭＰＳを生成せしめるように選択されてい るへ、Ｑ　リンの調節解重合力法により有利に実施される。

イン−ウニスラーカ価とは、対応するテストに於いて抗トロ／ビン■に血液のＸ ａ因子を阻害せしめる能力を有する活性分画の活量（ｃａｐａｅｉｔｅ　）　１ ！を示す値であり、”　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ−１３ｉｎ、　Ｍｅｄ、”。

１９７６、８１．２９８−３００に記載されたイン−ウニスラーの方法で測定さ れる。

規定の条件下でのグローバルな凝血度を測定し得るＵＳＰ力価もよく知られてい る。仁の値は米国薬局方ＸＩＸ、　２２９〜２３０ページ（第２４遺ＵＳＰ−Ｎ Ｆ、６２ページ及び第４補遺ＵＳＰ−ＮＦ９０ページ、表題＠Ｄｒｕｇ　５ｕｂ ａｔａｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｄｏｓａｇｅ　Ｆｏｒｍｓ″（薬物及び剤形）なるＪ ＪＩをも参照のこと）に記載の如く測定される。

ＡＰＴＴ力価（英語”　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐａｒｔｉＬ１３ｔｈｒｏｍｂｏ ｐＪａｓｔｉｎｔｉｍｅ”活性部分トロンボプラスチン時間）も同様にグローバ ルな凝血活性を測定する。この力価は、コーエンＪ、　（：：ｏｅｎ他による１ ヘモスタ一ゼＡ’ｈ６ｍｏｓｔａｓｓｅ”学術増補版≦ｄｉｔｉｏｎ　ｅｘｔｅ ｎｓｉｏｎｓｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ、　１９７６　、１６９−１７０ページに よって測定されたセファリン−カオリン時間と等価である。

好ましくは、本発明方法で使用される出発物質は、分子量約２０００乃至５００ ００を有するヘパリンから構成されたものである。

これは、注射可能な従来の薬剤品質のヘパリンでもよく、又は、哺乳類の組織も しくは器官特に例えば豚もしくは牛の腸もしくけ肺の粘液から活性成分たるへ、 Ｑ　ＩＪンを抽出すべく処理して得られるような粗へ／Ｑリンであってもよい。

更に出発物質は、より高度な特異的活性を有する注射可能な品質のヘパリンを得 るためのヘパリンの精製によって普通には除去される物質を含むものであっても よい。

使用へ、Ｑ　１７ンに調節条件下で化学栗品特に亜硝酸を作用させる。亜硝酸は 、亜硝酸の形状でへ／（リンに添加されてもよく、又は、亜硝酸の誘導体特に塩 、エーテル塩、より特定的にはアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩に調節量 に従って酸を添加して用時調製されてもよい。

本発明の有利な実施態様においては、亜硝酸塩として水溶性塩、よ１特定的には アルカリ金属塩特に亜硝酸ナトリウムＮａＮ０１を使用する。

亜硝酸を用時調製するために、好ましくは生物学的に許容され得るアニオンを含 む酸例えば酢酸、よ妙好ましくは塩酸を調節量だけ添加する。

ヘパリンと亜硝酸との反応は生理的に許容され得る媒体中で生起され、これによ り所望の生物学的用途に有害な溶媒の除去に付随する全ての問題を回避し得る。

この点から好ましい反応媒体は水である。

本発明によれば、溶液中のヘパリン及び亜硝酸の濃度は、所望の解重合度に到達 したときに亜硝酸が完全に消費されるように選択され、この反応に於ける別の作 用ノラメータ特に温度及びｐＨもまた、最も満足すべき実験条件に於いて所望の 生成物が得られるように互いに調整される。

発明者等はこれらの実験条件を検討し、へ、Ｑｌ）ンと亜硝酸生成物質とについ て、ヘノリンの終濃度（目的濃度）が溶液の少くとも８重量−好ましくは約８乃 至１２％特に約ｌＯ−になるような使用量が有利であり従って亜硝酸ナトリウム の終濃度が約０．０２Ｍ乃至０．１Ｍ好ましくは０．０５　Ｍ更に好ましくは０ ．０５５Ｍである仁とを知見した。本発明方法によれば使用へ／ｌリンの濃度が 高いので反応容量を、従来の化学技術を用いるときの容量のＶ５というかなりの 比率で減量し得る。

実験によれば温度約０乃至３０℃に於いて処理するのが適当であった。１０℃未 満の温度を使用しても所望の生成物を得ることができる。周囲温度（室温）での 処理が有利である。所望のｐＨ１好ましく紘約２乃至３より好ましくは約２．５ のｐＨが得られる量の酸を使用する。

既に指摘した如く、これらの条件によって反応持続時間の厳密な調節が不要にな る。即ち前記の如き条件によって公知方法で使用した原理とは明らかに異なる原 理に従う調節解重合反応の自己調節が可能となり、このことは結果に於ける相違 として現われる。即ち形成される窒素化化合物が揮発性であるため反応終了時に 反応媒体中に亜硝酸塩又は硝酸塩が存在しない。

更に前記の如き条件によって、以後に詳述する如き所定の性状を有する生成物を 特定的に製造し得る。

使用亜硝酸が消耗すると所望の解重合度に到達しており、アルコールによ抄沈殿 し得るタイプの生成物を解重合媒体から沈殿させる。その前にｐＨをほぼ中性の 値に再調整するのが有利である。

沈殿処理には無水エタールを使用するのが有利である。実験によればほぼ倍容の エタノールを使用すると生物学的活性ＭＰＳを所望通りに沈殿させ得ることが判 明した。沈殿のために使用される溶媒の量が少なく従って操作に関して多数の利 点が与えられることが理解されよう。

形成された沈殿物を回収し、使用の九めに洗浄乾燥する。

前記の如き処理を行うことにより、特に以下の如き特徴を有する生成物を得るこ とができる。

これらの生成物は、出願人による１９７８年１１月６日付の７ランス特許出願第 ７８３１３５７号に記載のＭＰＳ同様、濃度５５−６１゜ＧＬ好ましくは５８° ＧＬの水アルコール媒質（水−メタノール）に可溶である。水−エタノール媒体 のアルコール濃度が高くなると溶解度が低下し純アルコールに不溶である。更に これらのｕ／ｑより大であり、ＵＳＰ力価又はＡＰＴＴ力価は少くとも５０ｕｉ 未満好ましくは３０ｕｉ未満特に好ましくは２０ｕｉ未満であり、ＵＳＰ力価又 はＡＰＴＴ力価に対するＵ−Ｗ力価の比は少くとも３好ましくは少くとも約６よ り大特に約１０より大である。

生成物は、基本構造２，５−無水−Ｄ−マンノを有する末端基本単位（ｍｏｔｉ ｆ）を有してお秒、６位の第一アルコール官能基は基−８Ｏｓ−によ抄置換され るか又は未置換である。

前記の末端基本単位は式 〔式中、Ｒｘｔ；ｊ特にアルデヒド基、アルコール基、カルボン酸エーテル、エ ステル又は塩から選択された官能基を示してお０ す、Ｒ，は水素原子又は基ＳＯ３〜を示す〕を有する。アルデヒド基以外の官能 基Ｒ１は１９７８年、１１月６日付のフランス特許出願第７８３１３５７号に対 する第２追加出願たる１９８０年３月２０日付の本出願人によるフランス特許出 願第８００６２８２号に記載の方法で導入されるのが有利である。

本発明の１つの有利な態様によればＲ１がアルデヒド基から構成される。別の態 様によればＲ１がカルボン酸基又はアルコール基から構成される。これらの基は 特に安定度が高いという利点を有する。

更に好ましいことに、本発明により得られる生成物は大部分が分子量約２０００ 乃至８０００ダルトンの種から構成されてお抄、これは約８乃至４０個の単糖を 有する構造に対応する（分子量は前出の如く例えば０．５Ｍの硫酸す）　ＩＪウ ム緩衝液を用いてＨＰＬＣ法により測定された）。

前記の如く生成されるため生成物は硝酸塩−亜硝酸塩型の汚染物を含まない。

概してこれらの生成物は、極めて有利な薬理学的特性を有するので特に重要であ る。即ち生成物は、出発ヘノｔりンよりも十分に高い抗Ｘａ活性（ＹＷ）を有し ておりしかも（抗凝血活性総量を示す）ＵＳＰ力価又はＡＰＴＴ力価はへ、Ｑ　 １７ンよりも極め１ て小さい。これにより、使用し易く出血事故の危険が少ない。

従って、これらの生成物を薬剤特に抗血栓病薬剤として有利に使用し得る。

更に、出発へ／Ｑリンに比較して分子量が小さめので薬効が持続する。このこと は治療上極めて有利である。本発明の生成物は更に、経口的にも有利に使用され 得る。

前記の如き本発明方法の実施条件により、正常ヘノリン鎖即ち出発へ、ｅ　１７ ンの鎖を実質的にもはや含まない組成物が有利に得られる。即ち、方法の効率が 高い。

前記の如き方法に工って、前出の範囲内の分子量を有する高度に均質なＭＰＳ組 成物を得ることが可能であり、有利な場合には該組成物は前記の如きＭＰＳを少 くとも約９８チ含有している。

しかし乍らこの組成物の均質性は出発化合物に従って種々変化し得る。

本発明の別の実施態様、特に反応媒体がよに希釈された条件で処理すると分子量 １００００ダルトンより大のヘパリン鎖ｔ５１量−迄更に約１０重量−迄も含有 するＭＰＳ組成物が得られる。

これは、出発鎖の解重合が低下していることを示す。

例えば、前記の条件に比較して約５倍に希釈されたへ、ｐＱ　＋）ンル 溶液と約１０倍に希釈された亜硝酸溶液、特に亜硝酸を用時調製するための誘導 体溶液とを使用すると、分子量が約１００００以上もの重さを有する鎖を約５乃 至１０％含有し得る約３０００乃至６０００ダルトンのＭＰＳ組成物が得られる 。このような組成物のＹＷ力価は約１００乃至２００ｕ／ｑであり、ＵＳＰ力価 は約５０ｕｉ未満、よ口普通には約４０乃至５０であり、ＹＷ力価ＺＵＳＰ力価 の比は約５乃至６である。

本発明の種々の特徴及び利点紘以下の実施例より＃４らかにされるであろう。

一２０℃の蒸留水１５遍にＹＷ／ＵＳＰ比が約１でありＵＳＰ力価が１６０ｕｉ である市販ヘパリン１５００　ｔを溶解する。蒸留水３００−に溶解した亜硝酸 す）　ＩＪウム５１．８ｆを添加し、直ちに純塩酸によりｐＨを２．５に下げる 。

これにエリ反応が生起する。亜硝酸イオンが失くなるまで反応の進行を確認する 。４０分経過後、一定の時間毎に反応媒体中の亜硝酸イオンの有無を測定する。

例えばヨードデンプン紙を用い５分毎に測定する。約６０分間の反応後に亜硝酸 が完全３ に消費され、反応媒体中にＮＯ□−イオンが残存しない。ここで、純粋な水酸化 ナトリウムでｐＨｔ−７に調整し、３１ぶ（倍容）の純エタノールを添加して反 応生成物を回収する。

形成された沈殿物を遠心によ炒収集し、エタノールで洗浄し、真空下６０℃で乾 燥する。

以下の特性値を有する１２００　ｔの生成物が得られる。

ＵＳＰ力価　・・・・・・・・・・・・・・・・−・・・・・・・・・・　１９ ｕｔ／ｗｇＡＰＴＴ力価　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・　１３ｕｉ／ＩＩＦイン一ウエスラーカ価　・・・・・・・・・・・・・ −・・−・　２０２　ｕ／１９亜硝酸塩／硝酸塩濃度・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・　＜４ｐｐｍ実施例２ １０慢ヘパリン溶液（１００ｔ／Ｊ　）　ｔ−出発物質とし実施例１と同様に処 理して、種々のＮａＮ０．の使用量に従う種々のＹＷ／ＵＳＰ比ｔ−有するＭＰ Ｓを製造する。

ＭＰ８０ＹＷ力価対ＵＳＰ力価　ＹＷ／　Ｕ　Ｓ　Ｐ　１７）比の値４ 好ましいＭＳ　Ｐ　ＦｉＯ，０３乃至０．０７Ｍ特に０．０３乃至０．０５Ｍｔ ”使用して得られ九ＭＰＳであり、特に好ましいＭＰＳは０．０５Ｍを使用して 得られたＭＰＳである。

実施例３ 周囲温度（１５乃至２０℃）の蒸留水１０Ｊに、ＵＳＰ力価１７０ｕｉ／ｉｖ及 びＹＷ力価１６０　ｕ／岬を有する市販の注射可能ヘノリン１０００　ｆを溶解 し、２０Ｇ−の水に溶解した３８１の亜硝酸ナトリウム（終モル濃度０．０５５ Ｍ）を添加する。直ちに純塩酸でｐＨを２．５に下げる。実施例１と同様に一定 の時間毎（５乃至１０分毎）Ｋ反応を検査する。約３０分後に反応媒体中のＮＯ ，−イオンが検出されなくなる。ここで５Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを７に調整 する。２１Ｊ（倍容）の純エタノールを添加して反応生成物を回収する。形成さ れた沈殿物を遠心分離で収集し、エタノール洗浄し、真空下６０℃で乾燥する。

最終的には、以下の特性値を有する７８０　ｆの白色粉末が得られる。

ＵＳＰ力価　：　２２　ｕｉ／） インーウエスラーカ価　：　２６０ｕ／１９ＡＰＴＴ力価　：　１０ｕｉ／ａｔ ５ 亜硝酸塩／硝酸塩濃度　：（５ｐｐｍ 平均分子量　：　６０００未満 １ｏｏｏｏを越える分子量を有する 種の割合　：１−未満 ６ 国際調査報告

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．へ／Ｑリンと、亜硝酸、又は好ましくは亜硝酸を用時生成させる丸めの反応 体とを、所望重合度に到達すると亜硝酸、又は場合Ｘ′よっては亜硝酸を用時生 成させるための反応屏が完全に消費されるような濃度で使用し、このときに反応 体の濃度以外の反応条件を、出発ヘノリンの調節解重合が達成され所望のＭＰＳ が得られるように互いの関数として具合よく調。 整しておき、反応がひとりでに停止した後にアルコール溶媒によシ沈殿し得るタ イプの生成物を分離し、回収すること貴特徴とする生物学的活性の高純度ムコ多 糖類即ちＭＰＳ組成物の製法。 １　約０．０２　Ｍ乃至０．１Ｍ％に約０−０３Ｍ乃至０．０５　ＭＯＮａＮＯ ｍを約８乃至１２重量−のへＡリン溶液と共に使用することを特徴とする請求の 範囲ＩＫ記載の方法。 ３、水性媒体中でヘノＱ９ンに亜硝酸を作用させ、前記亜硝酸が。 亜硝酸の誘導体％に塩、エーテル塩、よシ特定的にはアルカリ金属塩又はアルカ リ土類金属塩に、好ましくは生物学的に許容し得るアニオンを含む酸を調節量で 添加することによって用時調製されることを特徴とする請求の範囲１又は２に記 ７ 載の方法。 ４、亜硝酸が、亜硝酸ナトリウムに酢酸又は塩酸を添加することによって用時調 製されることを特徴とする請求の範囲３に記載の方法。 ５、約０乃至３０Ｃ好ましくは周囲温度に近い温度及び約２乃至３好ましくＦｉ
2. ２．ｓ付近のｐＨにて処理を行なうことを特徴とする請求の範囲１乃至４のいず れかに記載の方法。 ＆　所望の解重合皮に到達すると、好ましくはｐＨを中性に近い値に予め調整し た後に、アルコールによシ沈殿し得るタイプの生成物を反応媒体から沈殿させる ことを特徴とする請求の範囲１乃至５のいずれかに記載の方法。 Ｌ　エタノールを用いる沈殿操作を行うことを特徴とする請求の範囲６に記載の 方法。 ８、汚染物特に亜硝酸塩及び硝酸塩のタイプの汚染物が実質的に完全に除去され ているＭＰＳ組成物であり、約９８−より多い割合のＭＰＳが１分子量約２００ ０乃至８０００ダルトン、抗Ｘａ活性（ｙｗ）少くとも約２００ｕ／ｓｙ好まし く蝶２５０ｕ／＝より大・ＵＳＰ又はＡＰＴＴ活性約３０・ｉ未満好ましくは２ ０ｕｉ未満特に好ましくは１０　ｕｉｉ未満ｙｗ力価対ＵＳＰ又はＡＰＴＴ力価 の比が少くとも３好ましくは少くと４６よシ大８ ％に好ましくは約１０より大であるという特性を有することを特徴とする請求の 範囲１乃至７のいずれかの方法を用すて得られるタイプのＭＰＳ組成物。 ９