SE449753B - Mukopolysackaridkomposition med reglerande verkan pa koagulation, lekemedel innehallande densamma samt forfarande for framstellning derav - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 40 449 753 mellan desamma: - tromboplastinbildning, fasen med protrombinas- (eller aktiv tromboplastin-) bildning, - trombinbildning, vilken fas kan summeras som omvandling av protrombinet till trombin under inverkan av protrombinas i närvaro av joniserat kalcium, och slutligen - fibrinbildning, som är den fas under vilken blodfibro- genet under inverkan av trombinet omvandlas till fibrin, vilket protein tenderar att bli olösligt.

Bildningen av protrombinaset sker under loppet av trombo- plastinbildningssteget i huvudsak enligt två olika vägar: den inre eller endogena vägen och den yttre eller exogena vägen, vilka slutar i att det bildas protrombinaser av plasmatiska re- spektive vävnadsursprung, som båda uppvisar förmåga att aktivera protrombin till aktivt trombin.- Ien inre eller endogena vägen (eller systemet) innefattar ett stort antal faktorer eller plasmatiska proenzymer med för- måga att successivt aktiveras (faktorerna XII, XI, IX, VIII och X), där varje aktiverad produkt (faktorerna XIIa, XIa, IXa, VIIIa och XA) fungerar som ett enzym med förmåga att aktivera följande proenzym, varvid den aktiverade X-faktorn (Xa) därefter deltar, speciellt genom reaktion med V-faktorn och en fosfolipid av blodplättursprung i framställningen av aktivt endogent plasma- tiskt protrombinas. Det yttre eller exogena systemet, som speci- ellt kan vara direkt beroende av en vävnadsskada, inkluderar ett mera begränsat antal faktorer och speciellt produktion av väv- nadstromboplastin, som i kombination med VII-faktorn kan, precis som faktorn VIIIa, omvandla den inaktiva X-faktorn till Xa-fak- torn. Aktiveringssekvensen för protrombinet till trombin är se- dan i huvudsak densamma som för det inre systemet, men fosfo- lipiden är här av vävnadsursprung och inte av plasmatiskt ur- sprung.

Det är sålunda möjligt att i begränsad omfattning uttrycka idén att den inre och den yttre vägen förenas med varandra vid nivån för aktivering av x-rakeorn (även kallad Stuart-faktorn), varvid de båda efterföljande faserna för koagulation-trombinbild- ning och fibrinbildning därefter inte längre ger upphov till någon skillnad mellan inre och yttre väg.

Resultatet av koagulationsprocessen består i att det bil- das en olöslig fibrinpropp, som speciellt är avsedd att fylla 10 15 20 25 50 35 40 449 753 3 upp skadan när denna process startar, t.ex. vid nivån för ett blodkärl.

Dessa koagulationsprocesser ger därefter normalt upphov till en process, kallad fibrinolys, som är avsedd att ge upphov till lysis av proppen, speciellt under inverkan av plasmin, vilket enzym normalt endast existerar 1 det cirkulerande blodet 1 form av en inaktiv prekursor, plasminogen, varvid fibrinet i sig självt icke desto mindre utgör en av faktorerna med förmåga att initiera omvandlingen av det inaktiva plasminogenet till fibrinolytiskt aktivt plasmin. Även om det tidigare har presenterats.system för koagula- tion och för fibrinolys som två processer som sker efter varandra i tiden, är det fortfarande normalt inte så i realiteten. I prak- tiken förekommer balanserade mekanismer, enligt extremt komplexa processer, som är beroende av harmoniskt motsatta aktivator- och inhibitorfaktorer. Obalansen i dessa mekanismer, i betydelsen hyperkoagulerbarhet, kan sen resultera i tromboser. Å andra sidan utsätter en icke-jämvikt i betydelsen hypokoagulerbarhet värden för hemorragiska risker.

Syftet har utan tvekan varit att lindra effekterna av hyperkoagulerbarhet, när man hittills har utnyttjat de effektiva antikoaguleringsegenskaperna hos heparin, i syfte att återföra koagulations-fibrinolysmekanismen till ett jämviktsläge, varje gång nämnda mekanism utsättes för en svårartad störning, t.ex. vid ett kirurgiskt ingrepp pa väraajuret. Det är emellertid väl- känt att dessa försök att återföra jämvikten är synnerligen delikata och att följaktligen administrationen av alltför hög dos av antikoaguleringsläkemedel - eller otillräcklig selektivi- tet för sistnämnda läkemedel - i syfte att eliminera riskerna för hyperkoagulation, t.ex. uppträdandet av postoperativa trombo- ser, slutligen kan ge upphov till allvarliga hemorragier: följ- aktligen föreligger behov av konstant övervakning av de behand- lade patienterna samt nödvändiga justeringar av de administrerade doserna - kontinuerligt eller diskontinuerligt - enligt resulta- ten av försök, speciellt beträffande total koagulerbarhet, såsom Howell-tiden, vilket måste ske med regelbundna intervall.

Det är sålunda ett syfte med uppfinningen att åstadkomma aktiva beståndsdelar i mediciner (och medicinerna 1 sig själva) med förmåga att åtminstone delvis eliminera dessa svårigheter, speciellt komponenter som uppvisar förmåga att återföra jämvikten 10 15 20 25 30 35 40 4 och/eller som ger enklare kontrollmöjligheter, vilket leder till minskat behov av klinisk övervakning av koagulations-fibrinolys- systemet hos patienter med benägenhet för koagulation, vilka pa- tienter har undergätt någon behandling, såsom en kirurgisk opera- tion, som utsätter den för risker för hyperkoagulation.

Uppfinningen hänför sig mera speciellt till en mukopoly- sackaridkomposition som utövar reglerande effekt med avseende på koagulation, speciellt genom att den gör att koagulationen fördröjs, samtidigt som den ändock frambringar inhibitoriska effekter, som är mera selektiva än de som gäller för heparin med avseende på ett mindre antal koagulationsfaktorer, mera speciellt med avseen- de på den aktiverade X-faktorn. ' Uppfinningen hänför sig sålunda till en mukopolysackaridkom- position som består av en blandning av heparinmukopolysackarider med molekylvikter lägre än 10 000 uppvisande samtliga följande egenskaper: - denna blandning är löslig i ett vattenbaserat alkoholiskt medium (vatten-etanol) med en koncentration av 55-610 GL, men olöslig i ren alkohol; - den innehåller fraktioner med molekylvikter lägre än U 000 och fraktioner med molekylvikter av storleksord- ningen från 14 ooo till 10 ooo; I - dess Yin-Wessler-koncentration är minst H0 enheter/mg; - förhållandet mellan Yin-wessler-koncentrationen och USP-koncentrationen (YW/USP-förhållandet) i blandningen är åtminstone av storleksordningen 3, med en USP-koncentra- tion som ej är noll, eller farmaceutiskt acceptabla salter därav.

Dessa mukopolysackaridkompositioner ger upphov till komplet- terande fraktioneringar, vilka gör det möjligt att framställa mukopolysackaridfraktioner med hög specifik aktivitet, vid nivån för Yin-Wessler-titern och som har ett förhållande Yin-Wess1er- -titer till USP-titer överstigande 10, t.o.m. 16.

Yin-Wessler-titern eller -koncentrationen uppmätes medelst den teknik som har utvecklats av nämnda författare och som be- skrivs i "J. Lab. Clin. Med.", 1976, 81, 298-500.

USP-titern eller -koncentrationen, som ger ett mått, på i och för sig känt sätt, pá en total koagulationsintensitet under väl fastlagda betingelser, är välkänd. Det kan nämnas att den 10 15 20 25 30 35 HO 449 755 bestämmes på det sätt, som beskrivs i "Pharmacopea of the United States" XIX, sid 229-230, (se även "Second Supplement USP-NF", sid 62, och "Fourth Supplement USP-NF", sid 90, med titeln "Drug Substances and Doage Forms".

Enligt uppfinningen åstadkommes en speciellt intressant ak- -tiv beståndsdel tack vare den förmåga uppfinningen visar att inhibera Xa-faktorn på ett sätt som kan vara mycket selektivt, vilken förmåga står i motsatsförhållande till dess aktivitet på den totala koagulationen, vilken kan hållas på mycket låg nivå.

Denna mukopolysackaridkomposition utgör sålunda en synner- ligen fördelaktig aktiv beståndsdel i ett antikoagulatíonsläkeme- del, därigenom att man i dag anser att en föredragen inhibering av en aktiverad faktor, som uppträder i ett skede närmare trombin- bildning, praktiskt taget vid skärningen mellan den inre och den yttre vägen och nedströms dessa, ger skydd mot risken för hyper- koagulerbarhet, motsvarande det skydd som ges av heparin, som för närvarande användes i läkemedel, utan att det därför, uppträder samma hemorragiska risker som för konventionellt heparin, vilket beror på den selektiva effekten av fraktionerna enligt uppfin- ningen. Heparinet är i realiteten avpassat att inte enbart inhi- bera Xa-faktorn utan även andra faktorer som uppträder såväl upp- ströms som nedströms om denna, i andra skeden av koagulerings- vägarna, t.ex. faktorn IIa. Det antas att återföringen till jäm- vikt in vivo för koagulations- och fibrinolyssystemet, när det sistnämda tenderar att bli obalanserat på grund av patologiska orsaker eller på grund av en yttre operation, t.ex. ett kirurgiskt ingrepp, är lättare att uppnå med ett läkemedel som verkar selek- tivt på en specifik faktor, faktorn X, mera speciellt vid nivån för inhibering av faktorn Xa, än med ett läkemedel med förmåga att verka på odifferentierat sätt på ett flertal koagulations- faktorer samtidigt.

Uppfinningen hänför sig vidare till ett förfarande för framställning av en sådan mukopolysackaridkomposition, vilket för- farande innebär att man: - suspenderar, i ett vattenbaserat alkoholiskt medium av vatten-etanoltyp, med en koncentration av mellan ca 55 och ca 610 GL, företrädesvis av storleksordningen 58° GL, en substans baserad på heparin eller heparinbeståndsdelar och vars molekyl- vikt speciellt ligger inom området från 2000 till 50 000, vilken 10 15 20 25 30 35 #0 449 753 substans har låg halt av mineralsalter, företrädesvis mindre än 1 viktprocent, - separerar den olösliga fraktionen och utvinner lösningen innehållande den upplösta mukopolysackarídfraktíonen, från vilken den i sin tur kan avskiljas, speciellt genom alkoholisk utfäll- ning, från ovannämnda vattenbaserade alkoholmedium.

Utgångsmaterialet, från vilket mukopolysackariden enligt uppfinningen kan extraheras, kan utgöras av ett heparin av kon- ventionell, injicerbar farmaceutisk kvalitet eller av ett rå- heparin, såsom det erhålles vid slutet av extraktionsoperationer för erhållande av denna aktiva beståndsdel från vävnader eller organ från däggdjur, speciellt från intestinalmukosa eller från lungor, t.ex. av svin eller oxe. Det kan också utgöras av frak- tioner som normalt kastas (spill) vid rening av sådant råheparin, för framställning av ett heparin i initierbar kvalitet och av högre specifik aktivitet, förutsatt naturligtvis att spillmate- rialen med lägre specifik aktivitet fortfarande innehåller hepa- rinbeståndsdelar.

Det är sedan möjligt att från råmaterial av denna typ, i huvudsak fria från proteiner, från nukleinsyror och från oorga- niska salter, företrädesvis när viktinnehållet av de sistnämnda är mindre än 1% genom extraktion med alkohol av koncentrationen 55-610 GL erhålla en mukopolysackaridfraktion, som innehåller beståndsdelar med låg molekylvikt, för vilka Yin-Wessler-kon- centrationen och USP-koncentrationen föreligger i ett förhål- lande av från ca 2 till ca 5, speciellt från 3 till 5.

Det kan tilläggas att extraktionsutbytet blir praktiskt taget lika med noll när man använder vatten-etanolblandningar av högre koncentration än 6l° GL. Å andra sidan resulterar använd- ning av ett vattenbaserat-alkoholiskt medium med en koncentra- tion mindre än 55° GL i solubilisering av beståndsdelar, vars närvaro leder till att förhållandet Yin-Wessler/USP-koncentra- tion sjunker.

Det torde observeras, att det är möjligt att fortsätta med ytterligare fraktioneringar av den mukopolysackaridfraktion som erhålles vid slutet av ovanstående process, vilket kan ske med olika metoder, såsom gelfiltrering eller på nytt selektiv utfäll- ning i ett vattenbaserat-alkoholiskt medium av förutbestämd kon? centration, i närvaro av likaså förutbestämda proportioner av 10 15 20 25 30 35 H0 449 753 ett oorganiskt salt, såsom natriumklorid.

En ytterligare fraktionering kan åstadkommas genom ett kompletterande steg, som appliceras på varje mukopolysackarid- fraktion, vilken i förväg har återupplösts i vatten, vilket steg innebär att man till denna vattenbaserade lösning sätter från ' 1 till 2 volymer etanol och från 10 till 100 g natriumklorid per liter samt i att man uppsamlar å ena sidan den lika aktiva fällning, som har bildats, och à andra sidan det innehàllsom finns kvar upplöst i supernatantvätskan, i synnerhet genom en ytterligare alkoholisk utfällning, och som utgör en fraktione- ringsprodukt, vars Yin-wessler-koncentration och USP-koncentra- tion föreligger 1 ännu högre förhållande, av storleksordningen 6 till 8, än det som gäller för den ursprungliga fraktionen, spe- ciellt av storleksordningen 3.

Mukopolysackaridfraktioner med högre förhållande Yin-Wessler/ USP-koncentration kan också erhållas genom gelfiltrering av frak- tionerna från den första extraktionen med det vattenbaserade al- koholiska mediet av koncentrationen 55-610 GL, efter det att man först har àterupplöst sistnämnda fraktioner i ett vattenbaserat lösningsmedel, såsom en lösning av 0,5 M NaCl; 0,1 M tris-HCl vid pH 7,5. En sådan lösning kan bringas att passera genom en gel av ' polyakrylamid och agaros, i pärlform, vilken går under Varube- teckningen "ULTROGEL AcA 44", vars effektiva fraktioneringszon är belägen mellan effektiva molekylvikter av från 4000 tillï 60 000 (för linjära molekyler).

Mukopolysackaridfraktioner enligt uppfinningen, vilka har högre förhållanden Yin-Wessler/USP-titer, är sådana som flyter eller rinner efter eluering av en volym av 2,5 1, dödvolym ej inkluderad (dödvolymen är den volymvätska som inneslutes i gel- kolonnen, speciellt i mellanrummen mellan gelkornenL när gel- filtreringen utföres, med en flödeshastighet av 200 ml/timme i en kolonn med en diameter av 100 mm och en höjd av l m, och när koncentrationen av mukopolysackarid och volymen av den lösning som har applicerats på kolonnen har varit 50 mg/ml respektive 37,5 ml. De aktivaste fraktionerna ingår därefter i de 1,5 1 som rinner ut därefter. Innehållet i först erhållna 2,5 l utgöres 1 stor utsträckning av heparansulfater eller heparitinsulfater, som är produkter med hög molekylvikt och hög viskositet och som inte har antikoaguleringsaktivitet. ..- 10 15 20 25 30 35 UC 449 753 Passagen från en kolonn till en annan kolonn av samma längd men av olika tvärsnitt innebär modifikation av den lösningsvolym (av samma koncentration) som skall appliceras på den andra ko- lonnen, 1 förhållande till den volym som appliceras på den före- gående kolonnen, med ett förhållande som är lika med kvadraten för tvärsnittet (eller diametern) för dessa kolonner, så att samma fraktioner kan erhållas i en elueringsvolym från den andra kolonnen som i sig också uppträder i ett förhållande, i förhål- lande till motsvarande elueringsvolym för den föregående kolon- nen, som är i huvudsak lika med kvadraten på förhållandet för nämnda tvärsnitt. -- .

Gelfiltreringar av denna typ har också den ytterligare för- delen, förutom att det bildas fraktioner vari förhållandet Yin-wessler/USP-koncentration är gynnsammare, att de ger produk- ter, vars lösningar har låg viskositet.

I detta avseende bör det även noteras att förfarandet enligt uppfinningen för extraktion av mukopolysackaridfraktioner med hjälp av en alkohollösning av 55-610 GL, företrädesvis 580 GL, från ett kommersiellt eller renat heparin, företrädesvis av inji- cerbar kvalitet, som fortfarande innehåller betydande andelar heparansulfater eller liknande produkter med hög molekylvikt, 1 sig själv också utgör ett förfarande, som gör det möjligt att väsentligt reducera viskositeten för de vattenbaserade lösningar som sedan kan bildas av dessa hepariner, vilka då är 1 huvudsak fria från dessa mukopolysaokaridfraktioner.

Denna reduktion av viskositeten ger en viss fördel, vad be- träffar den efterföljande användningen av sådana hepariner inom antikoaguleringsterapin, vid parenteral, speciellt subkutan, injektion.

Från fraktioner med ett förhållande Yin-wessler/USP-kon- centration av storleksordningen 6 till 8 är det möjligt att er- hålla, genom ytterligare fraktioneringar, speciellt genom gel- filtrering eller liknande, mukopolysackaridfraktioner som utmär- kes av förhållanden Yin-Wessler/USP-koncentration överstigande 10, speciellt av storleksordningen 13-16, och med Yin-Wessler- -koncentrationer högre än 130, speciellt från 135 till 160 en- heter/mg.

Det kan tilläggas att ovanstående angivelser av molekyl- vikter (vilket även gäller de anglveleer' som kommer ett följe 10 15 20 25 30 35 Ä0 9 449 753 nedan, speciellt 1 exemplen) är härledda från mätningar av uppe- hàllstiden för lösningar med en förutbestämd halt av den stude- rade substansen vid försök med gelpermeation genom en gelkolonn under lika så förutbestämda elueringsbetingelser, varvid logarit- merna för dessa molekylviktsangivelser är proportionella mot ovanstående mätningar av uppehållstiden på samma sätt som gäller för molekylvikterna på 4000, 6500, 16 000 respektive 31 000 för polystyren-natriumsulfonatstandardprover, speciellt de som saluförs under varubeteckningen "CHROMPACK" (0rsay-les-Ulis, Frankrike), med avseende på deras respektive uppehållstider, uppmätta i ett system och under gelpermeationsbetingelser som är identiska. ' I den mån de behandlade fraktionerna, oberoende av uppnådd reningsgrad, föreligger i form av fysiologiskt acceptabla metall- salter, såsom natriumsalter, kan de sedan omvandlas till blandade eller enkla salter innehållande en annan fysiologisk acceptabel metall, såsom kalcium, medelst någon process som är tillämpbar på salterna av heparin. Företrädesvis är det möjligt att utnyttja processen beskriven i den franska patentskriften 73 l3580. Nämnda process består i huvudsak i att man t.ek. utgår från ett natrium- salt av heparin och bringar detta i kontakt med ett annat salt av en annan fysiologiskt acceptabel metall, t.ex. kalciumklorid, i lösning, att man därefter separerar de metalljoner som icke är bundna till heparinet (t.ex. genom alkoholisk utfällning eller dialys) och att man, i den mån det uppnådda substitutionsförhål- landet inte är tillräckligt, på nytt bringar det blandade heparin- salt, som har erhållits vid slutet av den första kontakten, i kontakt, i lösning, med en ytterligare mängd av ett annat salt, speciellt kalciumklorid, alltefter det önskade slutgiltiga sub- stitutionsförhállandet.

En ytterligare föredragen MPS-fraktion enligt föreliggande uppfinning kan vidare erhållas från den ena eller den andra av de ovan beskrivna fraktionerna, vilken ytterligare fraktion ut- märkes av: - att den vid en gelfiltreringsoperation på en gelkolonn av polyakrylamid och agaros, i pärlform, av den typ som saluförs under varubeteckningen "ULTROGEL AcA 44", rinner igenom efter eluering av en volym av 2,5 1, dödvolym ej inkluderad, när gel- filtreringen utföres, vid en flödeshastighet av 200 ml/timme, i 10 15 20 25 30 35 ÄO 449 753 10 en kolonn med en diameter av 100 mm och en höjd av 1 m och när koncentrationen av mukopolysackariden och volymen av den pá ko- lonnen applicerade lösningen har blivit 50 mg/ml respektive 37,5 ml, varvid huvuddelen av denna fraktion speciellt ingår i de 1,5 1 eluat som därefter strömmar igenom, - en uppehàllstid av storleksordningen från 5,7 till 7,5, speciellt från 6,6 till 7,0, minuter i ett gelpermeationssystem pá en kolonn fylld med kiseldioxid med en partikelstorlek av från 10 till 100/um samt med en höjd av 250 mm och en diameter av 9 mm, när 50 ul av en lösning av 1,3 mg/ml av denna frak- tion i en 0,02 M Na2S04-buffert har applicerats på denna kolonn, varpå eluering av nämnda fraktion med en flödeshastighet av 3 ml/minut följer.

Föredragna fraktioner enligt föreliggande uppfinning utmär- kes mera speciellt av att de ånyo á ena sidan uppvisar en speci- ell affinitet gentemot antitrombin III, vilket manifesteras av deras kapacitet att fixeras på sistnämnda substans, speciellt i ett system som innebär att man bringar fraktionerna i kontakt med ett antitrombin III fixerat på en bärare, såsom agaros, i en buffert av 0,2 M Naci, o,o5 M tris-Hcl vid ett pH-värde av 7,5, och à andra sidan av Yin-Wessler- och USP-koncentrationer, vars förhållande (YW/USP-förhållande) är åtminstone lika med 6, var- vid Yin-Wessler-koncentrationen i sig själv är åtminstone lika med 300 U/mg. I Föredragna fraktioner och föreningar enligt uppfinningen utmärkes av högre YW/USP-förhållanden än 18 och av en Yin-Wess1er- -aktivitet som är högre än 900 U/mg.

Fraktionerna och föreningarna enligt föreliggande uppfin- ning uppvisar ännu hellre YW/USP-förhållanden högre än 50.

De mest föredragna föreningarna enligt uppfinningen ut- märkes av YW/USP-förhållanden högre än 65 och en Yin-Wessler- -aktivitet högre än 1300 U/mg.

Den speciella affiniteten hos fraktionerna enligt uppfin- ningen för antitrombin III är en väsentlig egenskap, som man kan förlita sig på för framställning av sådana starkt anrikade fraktioner, speciellt från de föregående fraktionerna, vilket förfarande består i att man utför selektiv fixering av de ytter- ligare anrikade fraktionerna eller produkterna enligt förelig- gande uppfinning på antitrombin III, speciellt genom att man 10 15 20 25 30 35 U0 449 753 11 bringar de ursprungliga fraktionerna i kontakt med immobiliserat antitrombin III, i synnerhet på en bärare, speciellt agaros, i en buffert, såsom 0,2 M NaCl, 0,05 M tris-HCl vid pH 7,5, Och där- efter eluerar den fixerade fraktionen med en buffert av högre Jonstyrka, vilken är tillräcklig för att desorption skall erhål- las, speciellt en buffert av 2 M NaC1, 0,05 M tris-HCl.

Naturligtvis är utgångsmaterialet, från vilket sistnämnda fraktioner eller föreningar kan erhållas, inte begränsat till de första fraktionerna enligt uppfinningen, vilka har definierats ovan. I synnerhet kan de erhållas på vilket som helst annat lämpligt sätt, speciellt från råutgångsmaterialet, vars samman- sättning har omtalats ovan och från vilket nämnda första frak- tioner erhölls.

Uppfinningen hänför sig mera speciellt även till de i huvud- sak homogena föreningarna, vilka i huvudsak föreligger i rent tillstånd och vilka tycks utgöra den väsentliga aktiva bestånds- delen i de föregående fraktionerna.

Dessa föreningar krakteriseras av de kärnmagnetiska reso- nansspektra (NMR) som har utförts under_de nedan angivna beting- elserna och som visas i Fig. ll, 12, 14 och 15.

Om man närmare bestämt studerar NMR-spektrumet för före- ningarna enligt uppfinningen för protonen (IH) erhållet på lös- ningar av dessa föreningar upplösta i deutererat vatten vid 55°C med en strålning av 270 megahertz (MHz), kan man som karak- teristiska element i spektrumet observera resonanssignaler, som för en kemisk förskjutning av storleksordningen 4,8 och 5,2 ppm är väsentligt svagare än den resonanssignal, som också observe- ras för en kemisk förskjutning av storleksordningen 5,4 ppm (referens för mätningen av förskjutningarna: TSP (natrium-3- -trimetylsilylpropionat 2,2, 5,5-d¿)).

Signalerna observerade vid följande nivåer för kemisk för- skjutning: 5,4; 5,2 och 4,8 ppm motsvarar de signaler som för fallet konventionellt heparin studerat medelst NMR under samma betingelser är karakteristiska för respektive: - anomer proton, i l-position, för de N-sulfaterade glukos- aminenheterna i heparin (signal G1); - anomer proton 1 l-position för 2-0-sulfaterade iduron- syraenheter (signal Il) och 10 15 20 25 30 35 H0 449 753 - proton i 5-position för 2-0-sulfaterade iduronsyraenhe- ter (signal I ).

I konventionella hepariner har samtliga tre signaler (Gl), (Il) och (I5) intensiteter av samma storleksordning.

För enkelhets skull kommer även vad beträffar fraktionerna eller föreningarna enligt uppfinningen nedan att hänvisas till signalerna (Gl), (Il) och (I5) för angivande av de signaler som observeras i samband med motsvarande kemiska förskjutningar (vare sig detta gäller för protonen eller för IBC).

Denna terminologi kommer också att gälla för NMR-spektra tagna under olika betingelser och med olika referenser.

Under mera speciell hänvisning till ÉM-spektrumet för föreningarna enligt uppfinningen för kol 13 (130), vilket spek- trum har tagits pà lösningar av dessa föreningar upplösta 1 deutererat vatten med en strålning av 20 MHz, kan man som karak- teristiska element för spektrumet observera (referens för mät- ningen är TMS (tetrametylsilan)): - praktiskt taget fullständig frånvaro av den resonans- signal som är karakteristisk för närvaron av OH-grupper på den primära kolatomen (i 6-position) hos glukosaminenheterna ingående 1 mukopolysackaridfraktionerna enligt uppfinningen, - ytterligare signa1er,i området för (Il)- och (Gl)-signa- lerna, i områden svarande mot kemiska förskjutningar av storleks- ordningen 100 ppm, - en ytterligare (G2)-signal intill GEN-sulfatsignalen i trakten av 60 ppm, - närvaro av en resonanssignal i trakten 75 Ppm (där nor- malt praktiskt taget ingen resonanssignal uppträder i NMR-spektra erhållna under motsvarande betingelser med ett konventionellt heparin), (de ovan angivna kemiska förskjutningarna är beräknade med avse- ende pà CH3 i N-acetylglukosamingrupperna i MPS enligt uppfin- ningen (25 ppm-området i på ritningarna visade spektra)).

De homogena föreningarna enligt uppfinningen, i praktiskt taget rent tillstànd, vilka alla har ovan beskrivna karakteris- tika vad beträffar deras USP- och Yin-Wessler-aktivitet och deras specifika affinitet för antitrombin III, utmärkes också av att de är bildade av en homogen oligosackarid, som uppvisar följande 10 15 20 25 30 35 H0 449 753 ytterligare karakteristika: - den omfattar från 8 till 12, speciellt 10, monosackarid- enheter; - samtliga primära positioner i glukosaminenheterna i denna oligosackarid är sulfateradeg - denna oligosackarid innefattar en N-acetylglukosaminenhet per två 2-0-sulfatiduronsyraenheter och per två N-sulfat-glukos- aminenheter, varvid de övriga sackariderna är av annan art och innefattar separata substituenter.

Molekylvikterna för åtminstone vissa av oligosackariderna enligt uppfinningen är belägna inom ett område från ca 2000 till ca 3ooo, speciellt från ca 2500 vad beträffar deåasackarideè.

Uppfinningen hänför sig även till polysackarider med de ovan angivna allmänna egenskaperna, mera speciellt å ena sidan USP- och Yin-Wessler-aktivitet och å andra sidan affinitet för antitrombin III, varvid gäller att dessa fraktioner har högre molekylvikt men även innehåller i sin struktur en oligo- sackariddel med ovannämnda struktur.

Andra kännetecken hos uppfinningen kommer att framgå av nedanstående beskrivning av föredragna exempel på hur uppfin- ningen-kan utövas, speciellt i samband med ritningarna, på vilka: Fig. l visar ett karakteristiskt elueringsdiagram av en föredragen mukopolysackaridfraktion enligt uppfinningen, Fig. 2-7 visar jämförande biologiska egenskaper hos muko- polysackaridfraktioner enligt uppfinningen och för ett konven- tionellt heparin med hög antikoaguleringsaktivitet (i USP-kon- centration), Fig. 8 är ett schematiskt elueringsdiagram för en frak- tion enligt uppfinningen, vid utövandet av förfarandet enligt uppfinningen, vid selektiv separation av nämnda fraktion fràn en fraktion som också innehåller andra beståndsdelar, Fig. 9 visar ett elueringsdiagram som är karakteristiskt för en annan föredragen mukopolysackaridfraktion enligt uppfin- ningen, Fig. 10 är ett NMR-spektrum för ett konventionellt hepa- rin för lflßprotonen, Fig. ll och 12 är NMR-spektra för IH-protonen för olika fraktioner enligt uppfinningen, Fig. 13 är ett NMR-spektrum för kol-13 i ett konventionellt 10 15 20 25 30 35 H0 449 755 M heparin använt som jämförelse, Fig. 14 är ett NMR-spektrum för kol-13 i en fraktion enligt uppfinningen, och Pig. 15 är en förstoring av en del av NMR-spektrumet från fig. 14.

Exempel 1 Råmaterialet utgjordes av 100 g av ett injicerbart heparin med en koncentration av 170 IU/mg (USP-enheter).

Till dessa 100 g heparin sättes 2500 ml alkohol av 58°GL.

Efter mycket kraftig omröring i 15 minuter upprätthålles den kraftiga omröringen i 15 timmar. Suspensionen centrifugeras_där- efter vid 7000 rpm i 1 timme, och supernatantvätskan utvinnes: 2400 ml.

Till denna supernatantvätska sättes sedan 80 ml mättad natriumkloridlösning och därefter 2400 ml alkohol av lO0° GL.

Den utfällda produkten utvinnes, tvättas med alkohol och torkas. Den väger 2,1 g. Dess karakteristika är följande: - USP-koncentration: 45 IU/mg - Anti-Xa-koncentration: 160 U/mg.

Förnailanaet' anti-xa/Usr var sålunda 3,55.

Exempel 2 Det använda råmaterialet var härlett från subfraktioner, såsom erhålles vid rening av kommersiellt heparin, för framställ- ning av injicerbart heparin. Det erhålles i synnerhet från den supernatantvätska som erhålles genom tillsats av 0,6 till 0,7 volymer alkohol av 1000 GL till en vattenbaserad lösning av hepa- rin innehållande 10-20 g natriumklorid per l, varefter det ut- fällda renade heparinet utvinnes för rening. Det använda råmate- rialet innehöll här alltså olika heparinreningsåterstoder, speci- ellt de som erhålles genom alkoholutfällningar, för att befria injicerbart heparin från spår av oorganiska salter.

Till 10 kg av detta råmaterial sättes 50 volymer alkohol av 58° GL (500 1). Suspensionen utsättes för kraftig dispersion och omröring i 15 minuter, varefter den kraftiga omröringen upprätt- hålles i 12 timmar. Den lämnas därefter att stå i 48 timmar för att det skall bildas en fällning av det icke solubiliserade rå- materialet. Den svagt grumliga supernatantvätskan bearbetas igen och klaras genom centrifugering.

Till supernatantvätskan (volym 280 l) sättes 10 1 av en 10 15 20 25 BO 35 H0 449 755 p; UI mättad lösning av natriumklorid och därefter l volym (280 l) alkohol av lO0° GL. Den erhållna fällningen, som innehåller muko- polysackaridfraktionen, tvättas med alkohol av 1000 GL och torkas därefter.

Härvid erhålles 660 g av en fraktion, vars Yin-Wessler- respektive USP-koncentration redan föreligger i ett förhållande som är högre än 2 (fraktion P194Hn(A)).

En kompletterande fraktionering utföres därefter på denna fraktion genom upplösning av nämnda 660 g 1 13 200 ml vatten.

Till den bildade lösningen sättes 264 g natriumklorid och därefter 1,5 volymer alkohol av loo° GL (l9,8 1). nan ucfallaa produkten uppsamlas, tvättas med alkohol och torkas därefter. 640 g av Pl94HM(C)-fraktionen erhålls, vilken fraktion uppvisar följande karakteristika: - USP-titer 51 IU/mg - Yin-Wessler-titer: 100 U/mg.

Supernatantvätskan innehöll även aktiva mukopolysackarid- fraktioner (deras utvinning beskrivs i Exempel 4).

Fraktíonen P19ÄHH(C) innehåller också en relativt stor mängd substanser med hög molekylvikt, vilka till övervägande delen utgöres av heparitinsulfater utan antikoaguleringsaktivi- tet, såväl vid USP-testet som vid Yin-Wessler-testet.

Efter áterupplösning i en buffert av 0,5 M NaCl, 0,1 M trla-Hcl vid pH 7,5 1 en andel av 5o mg/ml utföras gelflltrèrlng av en volym av 150 ml av lösningen på "AcA44" i en kolonn med en diameter av 215 mm och en höjd av l m, varvid flödeshastigheten är 800 ml/timme. Substansen med hög molekylvikt, av vilken huvuddelen utgöres av heparitinsulfater, passerar under de 10 första literna av eluerad lösning, dödvolym ej inkluderad.

En mukopolysackaridfraktion med högre Yin-Wessler-koncen- tration och med ett förhållande Yin-Wessler/USP-koncentration av storleksordningen 4-8 kan erhållas från nästa 6 l eluat.

Exempel § Detta exempel beskriver en modifikation av bearbetnngen av P194HH(C)-fraktionen från Exempel 2. Efter att den på nytt har upplösts 1 en buffert av 0,5 M NaCl, 0,1 M tris-HCl vid pH 7,5 i en andel av 50 mg/ml, utsattes den för gelfiltrering på "ULTROGEL AcA 44" i en kolonn med 10 cm diameter och l00 cm höjd. Flödeshastigheten för elueringen var 200 ml/timme. 10 15 20 25 30 35 #0 449 755 w Eluatet uppsamlades 1 successiva fraktioner om 50 ml.

Mukopolysackaridhalten i varje fraktion utvärderades på följande sätt: till 1 ml av fraktionen sattes 2 ml alkohol av 1000 GL.

När blandningen hade lämnats att stå 1 2 minuter, uppmättes grumligheten för blandningen vid 660 nanometer på en spektro- meter (optisk densitetsmätning). Denna grumlighet var direkt proportionell mot mukopolysackaridhalten i den testade lös- ningen.

C10-fraktionen, som ingick i den sista tredjedelen av den fjärde litern eluat, dödvolym ej inkluderad, uppsamlades. För- hållandet Yin-Wessler/USP-koncentration för C10-fraktionen var 50/6. _ Exempel 4 Den slutliga supernatantvätskan från Exempel 2 komplette- ras med 19,8 l alkohol av l0O° GL, och den bildade suspensionen tillàtes stå i 24 timmar.

Den bildade fällningen uppsamlades, tvättades med alkohol av loo° GL och tel-mass. 6 g erhölls av en fraktion kallad Pl94HH(P) med följande karakteristika: - USP-koncentration: - Yin-Wessler-koncentration: 7 IU/ms 46 U/mg.

Exempel 5 Fraktionen Pl9ÄHH(P) löstes på nytt i en buffert av 0,5 M tris-H01, 30 g/l NaCl vid pH 7,5 i en andel av 50 mg/ml.

Lösningen utsattes för gelfiltrering på en "ULTROGEL AcA 44"-kolonn (Pharmacia K 100/100, volym: 7 1; höjd 100 cm; diameter 10 cm) med en strömningshastighet av 200 ml/timme.

Det erhållna elueringsdiagrammet visas i fig. 1, som vi- sar variationerna i materialinnehàll (optisk densitet DO uppmätt vid 660 nanometer) som en funktion av den eluerade volymen i liter (l).

När en volym wfixma motsvarande kolonnens dödvolym hade passerat, uppsamlades successiva fraktioner K, J, I, G, F, E, D, C, B och A, vars volymer framgår av längden av motsvarande abskissasegment i fig. 1.

Var och en av dessa fraktioner uppvisar analytiska karak- teristika, som framgår av följande tabell. 10 15 20 25 50 L 35 449 753 17 Tabell I Ägrakteristika för de erhållna fraktionerna.

Fraktion vikt Us?-kone. Ant1-xa- “FÉr%ff§a“de nr (mg) (IU) konc. (U) -2--ä USP A 120 3,7 44,4 12 B 120 4,5 72 16 C 250 6 54 9 D 150 9 l§5 15 E 300 9 144 16 F 400 11 143 13 G 300 11,5 161 14 H 200 lj 145 " 11 I 50 13 91 7 J 200 7 14 2 K 3500 O 0 / Man ser att fraktionerna kan indelas i fyra grupper:p a) Fraktionerna A, B och C, vars elueringsvolymer vid den ovan beskrivna proceduren i huvudsak motsvarar den fjärde elue- rade litern och vars USP-koncentration är mindre än 10 och Yin-Wessler-koncentrationen är mindre än 80; deras molekylvikter är högst av storleksordningen 4000; b) Fraktionerna D, E, F, G och H, vars USP-koncentration är mindre än 10 och Yin-Wessler-koncentration är mycket hög: från 135 till 161 enheter; dessa fraktioner har också de gynnsammaste förhållandena Yin-wessler/USP-koncentration, nämligen från 15 till 16; de ingår i huvudsak i den tredje litern av eluatet; deras molekylvikter är av storleksordningen 4000-10 000, speci- ellt fràn 4000 till 8000; c) Fraktionerna I och J, vars förhållande Yin-wess1er/USP- -koncentration tenderar att bli ogynnsamt och vilka förmodligen redan är förorenade av K-fraktionen nedan, samt d) K-fraktionen, som återigen innehåller i huvudsak heparan- sulfater, vilka ej uppvisar antikoaguleringsaktivitet.

I Tabell II redovisas molekylvikterna för vissa av frak- tionerna, vilka vikter är bestämda med hjälp av uppehållstiden uppmätt vid gelpermeation, genom jämförelse med molekylvikterna för ovannämnda polystyrensulfonater med känd molekylvikt. Frak- tionen F utmärkes av en huvudtopp motsvarande en uppehållstid av 6,6 minuter och av en skuldra motsvarande en uppehållstid av 6,1 minuter, vilket visar på närvaro av en beståndsdel, vars 10 15 20 25 30 35 H0 449 753 18 molekylvikt ligger 1 närheten av 7200 av det använda referens- systemet.

Mätningarna utfördes medelst gelpermeation (med hjälp av en kromatograf av märket "SPECIHAPHYSICS }500") på kolonner (250 x 9 mm) fyllda med kiseldioxid med en partikelstorlek av 10-100/um, speciellt de som saluförs under varubeteckningen “LICHROPHOSPHER", av lösningar av dessa fraktioner 1 en buffert av 0,02 M Na2S04 1 en mängd av 1,3 mg mukopolysackaridmaterial per ml (volym ursprungligen applicerad på kolonnen: 50/ul) och med en flödeshastighet för elueringen av 3 ml/minut. Detekte- ringen av materialet utfördes med hjälp av UV>spektrofotometri (200 nm).

Tabell II Molekylvikt 1 för- Produm; Uppehåustïd hållande un poly- (minuter) styrener Pl94HH(A) 7,0 2 600 P194HH(B) 6,9 2 9oo Plglmflw) 6,8 3 300 Pl94HH(F) 6,6 4 100 “ 6,1* 7 zoo* Polystyren- sulfonat (1) 6,6 4 000 " (2) 6,2 6 500 " (3) 5,4 16 ooo " (14) 4,7 31 ooo *sxumra Exempel 6 Bâmaterial Det utgöres av biprodukter härledda från framställning av ett injicerbart kalciumheparinat från ráhepariner, såsom de som extraheras från djurvävnader (speciellt intestinalmukosa eller lungor från oxe eller svin), med följande karakteristika: Vikt: 252 kg USP-koncentration: 82 IU/mg Yin-Wessler-koncentration: 100 U/mg.

De nedan heskrivna processtegen utfördes därefter. 10 15 20 25 50 35 H0 w 449 755 Excraxtion med a1xono1 av 58° GL Erhållna 252 kg råmaterial dispergerades i 6000 l alkohol av 580 GL under kraftig omröring.

Den olösliga fasen separerades genom dekantering och centri- fugering.

Den lösliga fraktionen utvanns genom tillsats av NaCl och a1k°ho1 av 1oo° GL.

Härvid erhölls: Olöslig fraktion: 230 kg recirkulerad till tillverkning Löslig fraktion: 20,6 kg (USP-koncentration = 21 IU/mg Yin-wessler-koncentration = 90 0/mg).

Extraktion av fraktionen med låg molekvlvikt från ovannämnda fraktion Fraktionen löslig i alkohol av 580 GL löstes i 512 l vat- ten (20 volymer).

Därefter tillsattes l0;24 kg NaCl och 1,5 volymer alkohol av 1000 GL, nämligen 768 1. Den utfällda fraktionen uppsamlades, dehydratiserades med alkohol och torkades.

Vikt: 19 kg USP-koncentration: 22 IU/mg Yin-Wessler-koncentration: 89 U/mg.

Denna fraktion ställdes åt sidan och renades senare för om- vandling till ett injicerbarc xaleiumsait. ' Supernatantvätskan från fällningen vid l,5 volymer komplet- terades med 1,5 volymer alkohol, dvs. 768 l. Den utfällda frak- tionen uppsamlades, dehydratiserades med alkohol och torkades.

Vikt: 700 g USP-koncentration: 6 IU/mg Yin-Wessler-konoentration:7 40 U/mg.

Denna fraktion i en mängd av 700 g var en blandning av MPS med låg molekylvíkt, något sulfatiserad MPS med hög molekyl- vikt samt mer eller mindre nedbrutna nukleinsyror.

Avlägsnande av nukleinsyrorna från fraktionen med låg molekylvikt Huvuddelen av nukleinsyrorna avlägsnades genom fällning med manganklorid på följande sätt: A Fraktionen omfattande 700 g löstes i 7 1 vatten. 1 l 10%-ig MnCl2 tillsattes under omröring. Den kraftiga fällning, som bil- dades, (utgjordes av olösliga mangansalter av RNA och DNA) avlägs- nades genom eentrifugering. MPS utvanns ur den klara supernatant- 10 15 20 25 30 35 1:00 449 753 20 vätskan genom fällning med alkohol.

Vikt: 480 g USP-koncentration: 8 IU/mg Yin-Wessler-koncentration: 54 U/mg.

Isolering av fraktionerna med mycket låg molekylvikt medelst gel- filtrering De mycket låga molekylvikterna separerades medelst gelfilt- rering på “ULTROGEL AcA 44".

En kolonn med en diameter av 200 mm och en höjd av 1 m möj- liggjorde behandling av 25 g.

Elueringsdiagrammet är av den typ som visas 1 fig. 8.

Tre fraktioner (numrerade från (1) till (jà) uppsamlades.

De hade följande karakteristika (för 25 g applicerat från början): (1) vikt; 16 g UsP-konen 12 IU/mg Y.w.-konc.= 30 U/mg (2) vikt: 7 g USP-konc.: 6,5 IU/mg Y.W.-konc.: 70 U/mg (3) vikt: 2 g USP-kono.: 2,1 IU/mg Y.w.-konc.: 60 U/mg.

Kromatografi på icke solubiliserat antitrombin III Den föregående fraktionen (5) utsattes för kromatografi på antitrombin III fixerat på agaros.

En kolonn om 100 ml möjliggjorde behandling av 700 mg av fraktionen (5).

Absorptionen utfördes i en buffert av 0,2 M NaCl, 0,05 M tris-H01 vid pH 7,5.

Elueringen utfördes med en buffert av 2 M NaCl, 0,05 M tris-HCl.

Den icke fixerade delen (600 till 650 mg) hade en USP-kon- centration i närheten av l till 2 IU/mg och en Yin-Wessler-kon- centration från 10 till 20 U/mg.

Den fixerade delen (10 till 50 mg) hade en USP-koncentra- tion av från 10 till 20 IU/mg och en Yin-Wessler-koncentration av från 1000 till 1400 U/mg.

Exempel I Fraktionerna A, B och C från Exempel 5 ovan förenades till en enda fraktion, som sedan utsattes för ytterligare fraktione- ring genom selektiv fixering pà en agaros-antitrombin III-kolonn under de i Exempel 6 angivna betingelserna.

Den fixerade fraktionen eluerades. Den fraktion, som nedan går under benämningen Pl94HPA, erhölls. Den uppvisade en Yin- -Wessler-koncentration av 510 U/mg och en USP-koncentration av 40 IU/mg. 10 15 20 25 30 35 U0 449 755 PJ D- Pà samma sätt förenades ovannämnda fraktioner E och F från Exempel 5. Separationsproceduren för de mest aktiva frak- tionerna medelst den ovan beskrivna tekniken med fixering-elue- ring, under användning av en agaros-antitrombin III-kolonn, ut- nyttjades även i detta fall. Som slutresultat erhölls en fraktion Pl94HPF med en Yin-Wessler-koncentration av 900 U/mg och en USP- -koncentration av 82 IU/mg.

Nämnda fraktioner PIQÄHHPA och Pl94HPF utsattes för NMR- -analys för IH-protonen. Samma sak utfördes med ett konventionellt heparin (702lHH).

Analysen utfördes på var och en av nämnda-produkter, som i förväg hade upplösts 1 deutererat vatten 1 en mängd av 14 till 62 mg/0,35 ml, med en "BRUKER"-apparat, 270 MHz, utrustad med ett "FOURIER"-omvandlingssystem och med förmåga att lagra ackumulerade spektra. De kemiska förskjutningarna uppmättes med avseende på TSP, såsom omtalats ovan.

Fig. 10 är representativ för det NMR-spektrum som erhålles för konventionellt heparin. Fig. ll och 12 är på samma sätt re- presentativa för NMR~spektra för fraktipnerna P l94HHPF och P l94HHPA.

Genom att jämföra erhållna NMR-spektra kan man konstatera att (I1)- och (15)-signalerna för fraktionerna enligt uppfin- ningen är avsevärt mindre markerade än signalen (Gl), under det att dessa signaler har i huvudsak samma intensitet i heparin- -referensspektrumet. ' Exempel 8 Under användning av den i Exempel 6 och 7 beskrivna tekni- ken på andra utgàngsmaterial erhölls på motsvarande sätt följande fraktioner: P 219 HH: USP-konc. = 14 IU/mg Yin-Wessler-konc. = 1550 U/mg P 225 HH: USP-kOn0. = 17 IU/mg Yin-Wessler-konc. = 1520 U/mg P 231 HH: USP-KODC. = 16,2 IU/mg Yin-Wessler-konc. = 1400 U/mg P 194 HH A: 'USP-konc. = 82 IU/mg Yin-Wessler-kono. = 900 U/mg P 242 HH A: USP-kønc. = l6 IU/mg Yin-Wessler-konc. = 1800 U/mg 10 15 20 25 50 35 40 449 753 22 P 255 HH A: UsP-kønc. = 36 IU/mg Yin-Wessler-konc. = 2145 U/mg.

Fraktionen P 242HHA utsattes för NM-analys för kol 15 (130) (fig. 14 och 15). Samma sak utfördes med konventionellt heparin med beteckningen 707lHH (fig. 13). Analysen utfördes på var och en av fraktionerna (1 lösning i deutererat vatten i en andel av 100 mg i 1 ml D20 med en apparat av märket "VARIAN CFT-20", 20 MHz, utrustad med ett omvandlingssystem av typ "FOURIER"; referens för mätningen av de kemiska förskjutningarna: TMS). - praktiskt taget fullständig frånvaro av en resonanssig- nal som är karakteristisk för närvaron av OH-grupper på den pri- mära kolatomen (i 6-position i glukosaminenheterna ingående i Man observerar följande; _mukopolysackaridfraktionerna enligt uppfinningen), - ytterligare signaler, som inte förekommer i NMR-spektru- met för referensheparinet inom området för (I1)- och (Gl)-signa- lerna, i områden motsvarande kemiska förskjutningar av storleks- ordningen lOO ppm, . ': - en kompletterande signal inom omradet 60 ppm 1 närheten av (G2)-signalen, - närvaro av en resonanssignal i området 75 ppm (där nor- malt ingen resonanssignal uppträder i ett NMR-spektrum taget under motsvarande betingelser med konventionellt heparin), (de ovan angivna kemiska förskjutningarna utvärderas med avse- ende på CH i N-acetylglukosamingrupperna ingående 1 MPS enligt uppfinningen; området 25 ppm i erhållna spektra enligt fig. 14 och 15).

Signaler som är speciella för fraktionerna eller förening- arna enligt uppfinningen är markerade med en asterisk i fig. 14 och 15.

Fig. 15 innehåller också CI-integreringskurvan, ur vilken man kan utläsa att: '- den studerade föreningen var homogen, dvs. praktiskt taget ren, - den har de karakteristika som gäller för en dekasackarid, - den innefattar en N-acetylglukosaminenhet per två enheter av 2-O-sulfatiduronsyra och per två enheter av N-sulfat-glukosamin. 10 15 20 25 30 35 H0 449 755 Uppfinningen möjliggör sålunda framställning av mukopoly- sackaridfraktioner med hög anti-Xa-aktivitet och vilka med avse- ende på Xa-faktorn uppvisar anmärkningsvärd selektivitet inom ra- men för de suocessiva enzymatiska reaktioner som utmärker koagula- tionsprocessen.

Denna anmärkningsvärda aktivitet och selektivitet framgår också av resultaten av de farmakologiska försök som beskrivs ne- dan, vilka försök utfördes med fraktionen Pl88CH, vilken erhölls efter omvandling av fraktionen Pl94HHC från Exempel 2, som före- låg i natriumsaltform, till kalciumsaltformen, genom den ovan beskrivna processen. u _ Dessa resultat illustreras av kurvorna i fig. 2 till 7, vilka alla är avsedda att visa antikoaguleringseffekten för mukopolysackaridfraktionen enligt uppfinningen jämfört med mot- svarande effekt för ett konventionellt heparin (170 USP-enheter/ mg). _ Kurvorna i fig. 2 till 5 illustrerar den variation som observeras in vitro av koaguleringstider inducerade i humant blodplasma genom att man ökar dosen för á ena sidan ett konven- tionen: heparin och a andra sidan för fraktioner; P188cH (för- söken motsvarande fig. 4 och 5 har utförts pâ plasma fritt från blodplättar och följaktligen utarmat på faktor XI.

Fig. 6 och 7 hänför sig till jämförande resultat erhallna in vivo på kanin med samma fraktion Pl88CH (fig. 6) och referens- heparinet (fig. 7) (medelvärden för resultat erhållna på grupper om fem kaniner). Varje kanin hade mottagit 500 Yin-Wessler-enheter per kg testad komposition.

För fig. 2 till 5 gäller att de visar variationerna i tider (i sekunder): - för trombin (fig. 2), - för cefalin-kaolin (fig. 3), - för koagulering i närvaro av koncentrerat tromboplastin (fig. 4) och av utspätt tromboplastin (fig. 5), f förorsakade av respektive studerade preparat, nämligen mukopoly- sackaridfraktionen (kurvorna al, aa, añ och a¿) och referenshepa- rinet (kurvorna bl, bg, ba och b¿) som en funktion av respektive använda doser, samtliga uttryckta i USP-enheter/ml.

Trombintiden och oefalin-kaolintiden utgör båda typer av mätningar som snarast visar effekten av respektive studerade pre- m... v... ... 10 15 20 25 30 35 30 449 753 2ü parat på inhiberingen av den aktiverade faktorn II och den totala koagulationen. Kurvorna enligt fig. 2 och 3 visar i detta avseen- de tydligt att mukopolysackaridfraktionen enligt uppfinningen ut- övar en klart mindre effekt än jämförelseheparinet på inhiberingen av inaktiveringen av ett protrombin och vid nivån för den totala koagulationen. I motsats härtill visar fig. 4 och 5, som är repre- sentativa för de fenomen som mera direkt är knutna till sekvensen av enzymatiska reaktioner vilka är karakteristiska för yttre koagulation (speciellt i den relativa frånvaron av faktorn IIa), en tydlig fördel för mukopolysackaridfraktionen enligt uppfin- ningen i förhållande till referensheparinet. MPS-fraktionen-för- orsakar under dessa betingelser långsammare koagulation av blod- provet.

I fig. 6 visas variationer av de aktiviteter som uppmättes på en kanin, vilken hade erhållit 500 Yin-Wessler-enheter av en mukopolysackaridfraktion enligt uppfinningen, som en funktion av tiden uttryckt i timmar. För att utvärdera dessa aktiviteter utnyttjar man sig av variationen av Yin-Wessler-koncentrationen (kurva YW ) och cefalin-kaolin-koncentrationen (kurva CKT5) (IU/ml plasma) som en funktion av tiden i timmar (H).

Samma mätningar utfördes på referensheparinet. Motsvarande variationer i de studerade aktiviteterna visas med hjälp av kurvorna YW6 och CKT6 i fig. 7.

Om man undersöker fig. 6, ser man att administrationen av 500 Yin-wessler-enheter av mukopolysackariden enligt uppfinningen förorsakar en avsevärd anti-Xa-aktivitet jämfört med den totala koaguleringseffekten, uttryckti CKT-enheter, som förblir relativt liten. Man kan t.ex. se att Yin-Wessler-aktiviteten efter 2 tim- mar är 0,85 U/ml, medan CKT-aktiviteten endast är 0,15 IU/ml.

I motsats därtill ger 500 Yin-Wessler-enheter per ml referens- heparin en effekt, uttryckt med hjälp av CKT-koncentrationen, som är markant mycket större än den anti-Xa-aktivitet som kan mätas genom Yin-Wessler-koncentrationen. Speciellt ser man att vid den andra timmen anti-Xa-aktiviteten motsvarar 0,55 U/ml och att den totala antikoaguleringsaktiviteten, CKT, är 0,38 IU/ml. Skillnaden mellan de båda koncentrationerna är sålunda mycket mindre än vad som gäller för mukopolysaokaridem enligt uppfinningen. Förhållandet Yin-Wessler-koncentration till CKT- -koncentration ökar sålunda från ett värde som är mindre än 2 -;_ 10 15 20 25 30 35 H0 449 753 25 för referensheparinet till ett värde som är större än 5 för mukopolysackaridfraktionen enligt uppfinningen.

In vitro- och in vivo-försök visar sålunda på en avsevärt mera selektiv effekt för mukopolysaokaridfraktionen enligt upp- finningen, speciellt vid nivån för inhibering av Xa-faktorn, än vad som gäller för referensheparinet.

Mukopolysackaridfraktionerna enligt uppfinningen är fria från toxicitet. Administrationen av 10 000 U/kg (Yin-Wessler- -koncentration) av vilken som helst av fraktionerna enligt upp- finningen förorsakar på kaniner varken någon toxisk reaktion el- ler någon pyrogen effekt vid pyrogenicitetstestet på kanin en- ligt den franska farmakopén. ' Uppfinningen hänför sig sålunda mera speciellt till muko- polysackaridfraktioner av den ovan beskrivna typen, vilka speci- ellt har en aktivitet av minst 40, företrädesvis minst 50, och ännu hellre minst 100 U/mg (Yin-wessler-koncentration). Frak- tioner innehållande mera än 500, speciellt mera än 900, U/mg (Yin-Wessler-koncentration) är ännu mera föredragna.

Den hänför sig även till farmaceutiska preparat med lik- nande aktiviteter, vilka är fria från pvrogena substanser, och vilka även innehåller farmaceutiska excipienter. Uppfinningen hänför sig speciellt till de injicerbara, sterila, koncentrerade lösningarna av dessa fraktioner, vilka är användbara i tera- peutika för reglering eller kontroll av blodkoagulation, vilka lösningar innehåller från l000till 100 000 U (Yin-Wessler)/ml av mukopolysackaridfraktionen, företrädesvis från 5000 till 50 000, t.ex. 25 000, U/ml, när dessa lösningar är avsedda för subkutan injektion, eller vilka innehåller t.ex. från 500 till 10 000, exempelvis 5000, U/ml av mukopolysackaridfraktionen, när de är avsedda för intravenös injektion eller för perfusion.

Mukopolysackaridfraktionen enligt uppfinningen föreligger företrädesvis i form av ett salt av minst en fysiologiskt accep- tabel metall, såsom natrium och/eller kalcium. Företrädesvis an- vändes dessa farmaceutiska preparat i form av sprutor, som är användbara endast en gång och som är färdiga för användning vid någon lämplig tidpunkt . _ ' Kompositionerna enligt uppfinningen är speciellt lämpade för kontroll eller reglering (preventiv eller kurativ) av blod- koagulationen hos människor eller djur, speciellt i de fall då 10 15 20 25 30 35 H0 449 753 26 värddjuret utsättes för risker för hyperkoagulation, i synnerhet vid störning av ovannämnda yttre fas, t.ex. som en följd av att organismen frigör tromboplastin, t.ex. av vävnadstromboplastin (kirurgiska operationer, ateromatiska processer, tumörbildning, störningar av koagulationsmekanismen genom bakteriella eller enzymatiska aktivatorer, etc.). Enbart i illustrerande syfte och utan att uppfinningen för den skull är begränsad därtill anges nedan som ett exempel en dosering som kan användas på människa: den innebär t.ex. administration på patienten av från 1000 till 25 000 U den subkutana vägen, två till tre gånger dagligen enligt nivån för hyperkoagulationsrisken eller det trombotiska tillstån- det hos patienten, eller från iooo till 25_ooo U per 24 timmer den intravenösa vägen, i diskontinuerlig administration med regel- bundna intervall eller kontinuerligt genom perfusion, eller från 1000 till 25 000 U (tre gånger per vecka) den intramuskulära vä- gen (koncentrationerna uttryckta som Yin-Wessler-U). Doserna måste naturligtvis justeras för varje enskild patient enligt resultaten av tidigare utförda blodanalyser, arten av den störning som pati- enten har utsatts för samt generellt patientens hälsotillstånd, vilket naturligtvis är välkänt.

Uppfinningen hänför sig vidare till användning av muko- polysackariderna enligt uppfinningen som beståndsdel i en bio- logisk reaktant för användning på laboratoriet, speciellt som jämförelsereferens för att studera andra substanser, för vilka 1 antikoaguleringsaktiviteten skall testas, speciellt vid nivån A för inhibering av faktorn Xa.

Av ovanstående framgår naturligtvis att uppfinningen inte på något sätt är begränsad till de användningar eller de utfö- ringsformer som har beskrivits mera i detalj. Uppfinningen inne- fattar i stället alla modifikationer, speciellt sådana där det ovan definierade vattenbaserade-alkoholiska extraktionsmediet bildas av en blandning av vatten och någon annan alkohol än etanol, t.ex. en alifatisk eller aromatisk alkohol, företrädes- vis en cyklisk eller acyklisk mättad alifatisk alkohol, såsom primära alkoholer innehållande l-6 kolatomer, varvid det natur- ligtvis är underförstått att man i varje enskilt fall bör be- stämma, genom enkla rutinförsök, det förhållande vatten/alkohol i mediet som leder till en extraktion av en mukopolysackarid- ~ 0»- 449 755 27 fraktion, som är ekvivalent med den som erhålles för en blandning av vatten-etanol av 55-600 GL.

Claims (36)

10 15 20 25 30 35 449 753 EAIEHIKBBE

1. Mukopolyaackaridkomposition, kinnøtecknad av att den består av en blandning av heparinmukopolysackarider med molekyl- vikter lägre än 10 000 uppvisande samtliga följande egenskaper: - denna blandning är löalig i ett vattenbaserat alko- holiekt medium (vatten-etanol) med en koncentration av 55-61° GL, men olöslig i ren alkohol; - den innehåller fraktioner med molekylvikter lägre än 4 000 och fraktioner med molekylvikter av ator- lekßordningan fran 4 ooo till 10 ooof " - dese Yin-Weeeler-koncentration är minst 40 enheter/mg; - förhållandet mellan Yin-Wessler-koncentrationen och USP-koncentrationen (YW/USP-förhållandet) i bland- ningen är åtminstone av storleksordningen 3, med en USP-koncentration som ej är noll, eller farmaceutiskt acceptabla salter därav.

2. Mukopolyeackaridkompoaition enligt krav 1, kinnetecknad av att blandningene Yin-Weasler-koncentration är minst 100 enheter/mg.

3. Mukopolyeackaridkompoaition enligt nagot av kraven 1-2, kinnetecknad av att blandningens Yin-Wasaler-koncentration är minst 130 enheter/mg. š_

4. Hukopolyeackaridkompoaition enligt nagot av kraven 1-3, kínnetecknad av att YW/USP-förhållandet i blandningen är åtminstone av storleksordningen 3-5.

5. S. Mukopolysackaridkompoeition enligt nagot av kraven 1-3, kinnetecknad av att YW/USP-förhållandet i blandningen är åtminstone av storleksordningen fran 4 till 8. 'xinnezecxnaa av att blandningen vid ett gelfiltreringeexperiment,

6. komposition enligt något av kraven 1-5, som utföres på en kolonn av polyakrylamidgel och agaros, i pärlform, av den f typ som saluföree under varubeteckningen "ULTROGEL® Acà 44", elueras i en volym av 2,5 1, dödvolym ej inkluderad, när gel- filtreringen utföres, vid en strömningehaetighet av 200 ml/timme pa en kolonn med en diameter av 100 mm och en höjd av 1 m, och när koncentrationen av mukopolysackarid och volymen för den lösning 10 15 20 25 30 35 449 753 som appliceras pà kolonnen är 50 mg/ml respektive 37,5 ml, varvid denna blandnings massa särskilt innefattas i de företa 1,5 1 av eluatet.

7. Kompoeition enligt något av kraven 1-6, kínnetecknld av att den är sammansatt av en blandning som, i ett gelpermea- tionesyetem pa kolonner fyllda med kiseldioxid med en partikel- storlek 10-100 m, med en höjd av 250 mm och en diameter av 9 mm, utmärkea av en uppehàllstid av storleksordningen 5,7 -7,5, speciellt 6,6 - 7,0, minuter pa en sådan kolonn, när 50 pl av en lösning av 1,3 mg/ml av denna blandning i en 0,02"M Na2S04-buffert appliceras pa denna kolonn och därefter eluerae med en haetighet av 3 ml/minut.

8. Kompoeition enligt nagot av kraven 1-7, kännetecknad av att molekylvikterna för mukopolysackariderna i blandningen år fran ca 2 000 till 8 000.

9. Kompoeition enligt nagot ev kraven 1-8, 'tínnetecknad av att blandningen_är löslig i ett vattenbaserat alkoholiekt medium (vatten-etanol).med en koncentration av storleksordningen 58° GL. I I

10. av att fraktionerna med molekylvikter lägre än 4 000 har en USP- Kompoeition enligt något av kraven 1-9, kinnøtecknad koncentration.eom är lägre än den för fraktionerna med molekyl- vikter högre än 4 000.

11. kännetecknad av att fraktionberna med molekylvikter lägre än 4 000 innehåller beetandadelar med molekylvikt 2 600, 2 900 och 3 300.

12. Kompoeition enligt nagot av kraven 1-11, Kompositien enligt nagot av de föregaende kraven, kännetecknad av att den är fri från heparinbeatandedelar, eom är löeliga i en battenbaserad alkoholiek lösning med en koncentration mindre än 55° GL.

13. kännetecknad av att den helt eller delvis innehåller bestånds- Kompoeition enligt något av de föregående kraven, delar med molekylvikt lägre än 4 000, vilka binder till antitrombin III.

14. tionerna med molekylvikt lägre än 4 000 har beståndsdelar, som Kompoeition enligt krav 13, kännetecknad av att frak- uppviear en affinitet för antítrombin III och har en Yin-wese1er- koncentration av atminetone 300 enheter/mg. 10 115 20 25 30 35 449 753

15. Komposition enligt krav 14, tinnetecknad av att frak- tionerna med molekylvikt lägre än 4 000 har bestandsdelar, som uppvisar en affinitet för antitrombin III och har en Yin-Wassler-koncentration av atminstone 900 enheter/mg.

16. tionerna med molekylvikt lägre än 4 000 har bestandsdelar, som Xomposition enligt krav 15, kínnetecknad av att frak- uppvisar en affinitet för antitrombin III och har en Yin-Wessler-koncentration lika med eller större än 2 000 enheter/mg.

17. Komposition enligt nagot av kraven 13-IG, av ett YW/USP-förhållande överstigande kännetacknad 50, med en US?-koncentra- tion eom ej är noll.

18. Komposition enligt nagot av kraven 13-17, av ett YW/USP-förhållande överstigande 65, tration som är högre än 1300 enheter/mg och en US?-koncentration kínnetecknad en Yin-Wessler-koncen- som ej är noll.

19. Komposition enligt nagot av kraven 1-18, innehållande fraktioner med glukoeaminenheter, som är.sulfaterade i en primär position, varvid en N-acetyl-glukosamin finns närvarande per tva enheter av 2~0-aulfatiduronsyra och per tva N-sulfat-glukosamin- enheter.

20. NKR-spektrum för kol 13, bestämt pà en lösning av föreningen Komposition enligt krav 19, linnetecknad av att ett upplöst i deutererat vatten med en etralning av 20 MHz, visar att glukoeaminenheterna är praktiskt taget fria fran nydroxylgrupper i 6-position och uppvisar reaonanssignaler i det omrade, eom motsvarar kemiska förskjutningar av ca 100 ppm, en ytterligare signal i närheten av den i omradet 60 ppm aàväl eom en resonans- signal i omradet 75 ppm (referens för mätningen av förekjutningarna :

21. tetrametyleilan). Kompoeition enligt krav 19, kännetecknad av att ett NHR-spektrum för (18)-protonen bestämt på en lösning av föreningen upplöst i deutererat vatten vid 35°C med en strålning av 270 MHz, uppvisar reaonanesignaler i omradet 4,8, 5,2 och 5,4 ppm, varvid signalerna vid 4,8 och 5,2 ppm är svagare än signalen vid 5,4 ppm (referens för mätningen av förakjutningarna :

22. av ett NHR-spektrum enligt atminetone en av figurerna 11, 12, 14 och 15. tetrametyleilan). Komposition enligt nagot av kraven 13-18, kinnetecknad 10 15 20 25 30 35 449 755 31

23. Kompoeition enligt krav 21, kinneteckned av att frak- tionerna med molekylvikt lägre än 4 000 beetar av en homogen oligoaackarid, som uppvisar följande kännetecken: - den innehaller fran 8 till 12, speciellt 10, mono- sackaridenheter. - samtliga primära positioner i glykoeaminenheter i oligo- sackariden är sulfaterade, ~ denna oligoeackarid innehåller en N-acetylglukoaamin- enhet per tva enheter av 2-0-sulfatiduroneyra och per tva N-eulfatglukosaminenheter, varvid de övriga mono- aackaridenheterna är av en annan art och innehåller distinkta eubstituenter.

24. Kompoeition enligt krav 23, kinnetecknld av en molekylvikt av fran ca 2 000 till ca 3 000, speciellt ca 2 500.

25. komposition enligt nagot av kraven 1-24, kännetecknad av att dess beståndsdelar föreligger i form av salter av minst en fyeiologiekt acceptabel metall, eàsom natrium eller kalcium.

26. erhållas ur heparin eller fraktioner innehållande heparin- Aktiv beståndsdel i medicin, vilken beetandsdel kan beståndsdelar med molekylvikt fran och med 2 000 till och med 50 000, heparinmukopolyeackarider med molekylvikter lägre än 10 000, vilken aktiv bestandadel är sammansatt av en blandning av varvid denna blandning uppviear samtliga följande egenskaper: - denna blandning är löelig i ett vattenbaserat alkoholiskt medium (vatten-etanol) med en koncentration av 55-51° GL, men olöelig i ren alkohol; - den innehåller fraktioner med molekylvikter lägre in 4 000 och fraktioner med molekylvikter av storleksordningen fran 4 000 till 10 000; - dess Yin-Weseler-koncentration är minet 40 enheter/mg; - förhållandet mellan Yin-Weesler-koncentrationen och US?-koncentrationen (YW/USP-förhållandet) i blandningen är åtminstone av storleksordningen 3, med en USP-koncentration som ej är noll, eller farmaceutiskt acceptabla ealter därav.

27. komposition innehållande bestandsdelar med molekylvikter lägre än Förfarande för framställning av en mukopolyeackarid- 4 000 och beetandedelar med molekylvikter av storleksordningen från 4 000 till 10 000, en Yin-Wesaler-koncentration av minst 40 10 15 20 25 30 35 449 753 UI IJ enheter/mg, ett YW/USP-förhållande atminstone av storleksordningen 3 med en USP-koncentration som ej är noll, kinnetecknst av att man: - suspenderar, i ett vattenbaserat alkoholiekt medium av typ vatten-etanol och med en koncentration av mellan ca 55 och 61° GL, företrädesvis av storleksordningen S8° GL, ett heparinbaserat material eller heparinbestands- delar, vars molekylvikter speciellt ligger inom omradet från 2 000 till 50 000, varvid detta material har låg halt mineralsalter, företrädesvis mindre än 1.yiktprocent, - separerar den olösliga fraktionen öch utvinner lösningen innehållande den upplösta mukopolysackaridfraktionen, från vilken mukopolysackariden i sin tur kan avskiljas, speciellt genom alkoholisk utfällning.

28. Förfarande enligt krav 27, kínnetecknat av ett ytterligare fraktioneringssteg för den tidigare ur ovannämnda vattenbaserade alkoholiska medium utvunna och i vatten åter- upplösta mukopolysackariden, vilket steg består av att man till denna vattenbaserade lösning sätter från 1 till 2 volymer etanol och fran 10 till 100 g/l natriumklorid och a ena sidan uppsamlar den bildade och aktiva fâllningen och a andra sidan de(t) upplösta ämne(n), som aterstar i supernatantvätskan, speciellt genom ytter- ligare alkoholisk utfâllning, och som utgör sn fraktionerings- produkt, vars YW/US?-förhållande är större än det för den ursprungliga fraktionen, vilket särskilt kan ändras fran ett värde av storleksordningen 3 till ett av storleksordningen från 6 till 8.

29. Förfarande enligt krav 27 eller 28, kínnstecknst av att de medelst alkohol utfällda mukopolysackariderna utvinnes och en vattenbaserad lösning av dessa mukopclysackarider underkastas ett gelfiltreringssteg.

30. Förfarande enligt nagot av kraven 27-29, kinnetecknst av att de föregående mukopolysackaridfraktionerna bringas i kontakt med antitrombin III, som är fäst på en bärare, och att en selektiv separation av de mukopolyeackarider, som har en Yin-Wessler-koncentration större än den för mukopolysackariderna före separationen, utföres och att de avskilda mukopolysacka- riderna utvinnes ur eluenten. 10 15 20 25 30 35 049 753 UI UI

31. Förfarande enligt nagot av kraven 25-30, tännetecknat av att man bringar de föregaende mukopolyeackaridfraktionerna i kontakt med antitrombin, i en buffert av 0,2 H NaCl, 0,05 H tris-HCl. med en buffert av högre jonstyrka, som är fäst pa agaroe, pH 7,5, vilken är tillräcklig för att och sedan eluerar fraktionen eluera de bundna produkterna, speciellt en buffert av ZH NaCl, 0,05 M trie-HCI.

32. Parmaceutiekt preparat, kännetecknet av att det inne- haller en effektiv mängd av kompositionen enligt nagot av kraven 1-25, vari kompoeitionen består av en blandning av heparinmuko- | polysackarider med molekylvikter lägre än fb 000 uppvisande samt- liga följande egenskaper: - denna blandning är löslig i ett vattenbaserat alkoholiekt medium (vatten-etanol) med en koncentration av 55-61° GL, men olöslig i ren alkohol, I - den innehåller fraktioner med molekylvikter lägre än 4 000 och fraktioner med molekylvikter av storleksord- ningen fran 4 000 till 10 000, - dess Yin-Wessler-koncentration är minst 40 enheter/mg, I - förhållandet mellan Yin-Wassler-koncentrationen och USP-koncentrationen (YW/USP-förhållandet) i blandningen är atminstone av storleksordningen 3, med en USP-koncentration som ej är noll, eller farmaceutiskt acceptabla salter därav, samt en farmaceutiskt acceptabel excipient. kínnetectnat föreligger i form av en injicerbar, steril, koncentrerad lösning

33. Preparat enligt krav 32, av att det av mukopolyeackarider innehållande fran 1 000 till 100 000 enheter (Yin-Weseler)/ml, när denna lösning är avsedd för subkutan in- jektion, eller från 500 till 10 000 enheter (Yin-Wessler>/ml, när den är avsedd för intravenös injektion eller perfusion.

34. Preparat enligt krav 33, kännetecknat av att det innehåller från 5 000 till 50 000, särskilt 25 000, (Yin-Wessler)/ml, när det är avsett för subkutan injektion eller enheter ca 5 000 enheter (Yin-Wessler)/ml för intravenös injektion eller perfusion.

35. innehåller en aktiv beståndsdel enligt krav 26, Farmaceutiskt preparat, kännetecknar av att det vari den aktiva 10 15 20 25 30 449 753 34 beståndsdelen ir en aktiv bestandsdel i medicin, vilken beståndsdel kan erhållas ur heparin eller fraktioner innehållande heparinbeståndsdelar med molekylvikt från och med 2 000 till och med 50 000, vilken aktiv beståndsdel är sammansatt av en blandning av heparinmukopolysackarider med molekylvikter lägre än 10 000, varvid denna blandning uppvisar samtliga följande egenskaper:

36. denna blandning är löslig i ett vattenbaserat alkoholiskt medium (vatten-etanol) med en koncentration av 55-61° GL, men olöslig i ren alkohol; den innehåller fraktioner med molekylvikter lägre än 4 000 och fraktioner med molekylvikter av storleksord- ningen frán 4 000 till 10 000; dess Yin-Wassler-koncentration är minst 40 enheter/mg, förhållandet mellan Yin-Wessler-koncentrationen och USP-koncentrationen (YW/USP-förhållandet) i blandningen är atminstone av storleksordningen 3, med en USP-kon- centration som ej är noll, eller acceptabla salter därav. Biologiskt reagens, kännetecknat av att det är sammansatt av en mukopolysackaridkomposition enligt något av kraven 1-25, vari kompoeitionen består av en blandning av heparinmukopolysackarider med molekylvikter lägre än 10 000 uppvisande samtliga följande egenskaper: denna blandning är löslig i ett vattenbaserat alkoholiskt medium (vatten-etanol) med en koncentration av SS-6l° GL, men olöslig i ren alkohol; den innehåller fraktioner med molekylvikter lägre än 4 000 och fraktioner med molekylvikter av storleksordningen från 4 000 till 10 000; dess Yin-Wessler-koncentration är minst 40 enheter/mg, förhållandet mellan Yin-Wessler-koncentrationen och US?-koncentrationen (YW/USP-förhållandet) i blandningen är atminstone av storleksordningen 3, med en USP-kon- centration som ej är noll, eller farmaceutiskt acceptabla salter därav.