KR20020032444A - 응괴 연관된 응고 인자를 억제하는 헤파린 조성물 - Google Patents

응괴 연관된 응고 인자를 억제하는 헤파린 조성물 Download PDF

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KR20020032444A
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웨이츠제프리아이.
허쉬잭
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잭 허쉬
해밀톤 시빅 호스피탈즈 리서치 디벨로프먼트 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 심혈관 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 특히, (1) 유체상 트롬빈 및 응괴 중의 섬유소에 또는 특정한 다른 표면에 결합된 트롬빈을 안티트롬빈을 촉매화시킴으로써 불활성시키고; (2) 인자 Xa 불활성화를 안티트롬빈 III(ATIII)에 의해 촉매화시킴으로써 트롬빈 생성을 억제할 수 있는 제제를 투여하는 혈전 형성의 조절에 관한 것이다. 본 발명 조성물 및 방법은 심장 바이패스 장치의 회로에서 및 신장 투석을 받는 환자에 있어서 혈전증의 예방에, 및 혈전-관련 심혈관 상태, 예를 들어, 불안정형 협심증, 급성 심근 경색(심장 발작), 뇌혈관 발작(뇌졸증), 폐색전증, 심정맥 혈전증, 동맥 혈전증 등으로 고생하거나 고생할 위험이 있는 환자의 치료에 특히 유용하다.

Description

응괴 연관된 응고 인자를 억제하는 헤파린 조성물{Heparin compositions that inhibit clot associated coagulation factors}
발명의 분야
본 발명은 심혈관 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 특히, (1) 유체 상 트롬빈 뿐만 아니라 응괴 중의 섬유소에 또는 특정한 다른 표면에 결합된 트롬빈을 안티트롬빈을 촉매화시킴으로써 불활성화시키고; (2) 안티트롬빈 III(ATIII)에 의해 인자 Xa 불활성화를 촉매화시킴으로써 트롬빈 생성을 억제할 수 있는 중간 분자량의 헤파린(MMWH) 조성물의 투여에 의한 혈전 형성 및 성장의 조절에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 심혈관 질환의 치료에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
발명의 배경
헤파린은 안티트롬빈에 결합되고 활성화 인자 X(인자 Xa) 및 트롬빈을 억제하는 속도를 현저하게 증가시켜 항응고제로서 작용한다. 헤파린과 안티트롬빈의 상호작용은 헤파린 쇄의 약 1/3에 랜덤하게 분포된 독특한 오당류 서열에 의해 매개된다. 안티트롬빈에 의한 트롬빈 억제를 촉매화시키기 위해서, 헤파린은 효소 및 억제제에 동시에 결합해야 한다. 이러한 브릿징(bridging) 작용의 제공은5,400Dalton의 최소 분자량을 갖는 오당류-함유 헤파린 쇄를 필요로 한다. 최소 크기의 헤파린 쇄조차 오당류가 한쪽 말단보다는 헤파린 쇄의 중간에 위치하는 경우, 트롬빈과 안티트롬빈을 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖지 못할 수 있다. 반대로, 더욱 긴 오당류-함유 헤파린 쇄는 헤파린 쇄내의 오당류의 위치와 무관하게 이러한 브릿징 작용을 제공할 수 있다.
헤파린과 마찬가지로, 저분자량 헤파린(LMWH)은 또한 안티트롬빈을 활성화시킴으로써 항응고제로서 작용한다. 그러나 약 4,500 내지 5,000Dalton의 평균 분자량을 갖는 LMWH 쇄는 대부분 트롬빈과 안티트롬빈을 브릿징시키기에 너무 짧다. 결국, 트롬빈에 대한 LMWH의 억제 활성은 헤파린보다 상당히 적다.
헤파린은 유체상 트롬빈의 유효한 억제제이지만, 섬유소에 결합된 트롬빈, 예를 들어, 응괴-결합된 트롬빈을 불활성화시키는 능력이 제한된다. 헤파린-안티트롬빈 복합체에 의한 불활성화에 대한 섬유소-결합된 트롬빈의 내성은 헤파린이 트롬빈을 섬유소에 브릿징시켜 삼원 섬유소-트롬빈-헤파린 복합체를 형성한다는 사실을 반영한다. 이러한 삼원 복합체의 형성은 섬유소에 대한 트롬빈의 친화도를 20배 높인다(3μM의 Kd로부터 150nM의 겉보기 Kd로). 트롬빈에 대한 헤파린 결합 부위를 차지함으로써, 트롬빈을 섬유소에 구속시키는 헤파린 쇄는 헤파린-안티트롬빈 복합체내의 헤파린이 안티트롬빈을 섬유소-결합된 트롬빈에 브릿징시키는 것을 방지한다. 이는 섬유소-결합된 트롬빈이 헤파린-안티트롬빈 복합체에 의한 불활성화로부터 보호되는 이유를 설명한다.
또한, 4,500 내지 5,000Dalton의 평균 분자량을 갖는 LMWH의 쇄는 대부분 또한 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 너무 짧다. 그러나 LMWH 쇄의 대부분은 또한 트롬빈을 안티트롬빈에 브릿징시키기에 너무 짧으므로, LMWH는 유체상 및 섬유소 결합된 트롬빈 둘다에 불충분한 억제제이다.
상기를 고려하여, 예를 들어, 심혈관 질환과 연관된 혈전 생성을 억제하기에 유용한 개선된 헤파린 조성물이 당해 분야에서 여전히 요구된다. 이상적 헤파린 조성물은 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시키고 트롬빈 생성을 차단함으로써 응괴를 진정시킬 수 있는 것이며, 이에 의해 일단 치료가 중지되면 일어나는 응고의 재활성화를 방지할 수 있다. 보다 특히, 이상적 헤파린 조성물은 헤파린 쇄가 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 너무 짧지만, 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖는 것이다. 본 발명은 이들 및 다른 요구를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 너무 짧지만, 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖는 헤파린 쇄를 포함하는 중간 분자량의 헤파린(MMWH) 조성물을 제공한다. 섬유소에 대한 트롬빈의 브릿징은 12,000Dalton보다 큰 헤파린 쇄에 의해서만 수행된다. 따라서, 이러한 브릿징 기능을 제공하는 데에 필요한 헤파린의 최소 분자량은 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키는 데에 필요한 것보다 상당히 더 크다. 그 자체로, 본 발명의 MMWH 조성물은 이러한 범위내에 적합하도록 고안된다. 약 6,000 내지 약 12,000Dalton의 분자량 범위를 갖는 본 발명의 MMWH 조성물은 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 너무 짧은 헤파린 쇄또는 황산화 올리고당류로 이루어진다. 그러나 하한 6,000Dalton은 MMWH 조성물의 헤파린 쇄가 전부, 오당류 서열이 헤파린 쇄내에 위치하는지와 무관하게 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 가짐을 보장하도록 특별히 선택된다. 이들 이유 때문에, 본 발명의 MMWH 조성물은 헤파린과 달리 섬유소-결합된 트롬빈 및 유체상 트롬빈을 동일하게 잘 억제한다.
본 발명의 MMWH 조성물은 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시킴으로써 혈전(또는 바꾸어서, 응괴)을 진정시키고, 이에 의해 일단 치료가 중지된 응고의 재활성화를 방지할 수 있으며, 인자 Xa를 억제함으로써 트롬빈 생성을 차단할 수 있다. 그 자체로, 본 발명은 심혈관 질환을 치료하기 위한 MMWH 조성물의 사용 방법을 제공한다. 위에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 MMWH 조성물은 일반적으로 약 6,000 내지 약 12,000Dalton, 더욱 더 바람직하게는 약 8,000 내지 약 10,000Dalton 범위의 분자량을 갖는 황산화 올리고당류의 혼합물이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 화합물은 약 9,000Dalton의 평균 분자량을 갖는다. 한 양태에서, 적어도 31%의 MMWH 조성물은 7,800Dalton 이상의 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, 적어도 25%의 MMWH 조성물은 10,000Dalton 이상의 분자량을 갖는다. 이러한 MMWH 조성물은 표준 또는 비분획화 헤파린으로부터 용이하게 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 MMWH 조성물은 일반적으로 유사한 항-인자 Xa 및 항-인자 IIa 활성을 갖는다. 바람직한 양태에서, 항-인자 Xa 활성 대 항-인자 IIa 활성의 비는 약 2:1 내지 약 1:1, 더욱 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 1:1의 범위이다. 반대로, LMWH는 예를 들어, 항-인자 IIa 활성보다 상당히 더 큰 항-인자 Xa 활성을갖는다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물의 항-인자 Xa 활성은 약 80 내지 약 155U/mg, 바람직하게는 90 내지 약 150U/mg, 더욱 바람직하게는 약 100 내지 약 125U/mg의 범위이다. 더욱 더 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물은 약 115U/mg의 항-인자 Xa 활성을 갖는다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물의 항-인자 IIa 활성은 약 20 내지 약 150U/mg, 바람직하게는 40 내지 약 100U/mg, 더욱 바람직하게는 약 60 내지 약 75U/mg의 범위이다. 더욱 더 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물은 약 65U/mg의 항-인자 IIa 활성을 갖는다.
위에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 MMWH 조성물은 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 너무 짧지만, 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖는 헤파린 쇄를 포함한다. 결국, 헤파린과는 달리, 본 발명의 MMWH 조성물은 섬유소-결합된 트롬빈 및 유리 트롬빈을 둘다 불활성화시킨다. 또한, 대부분의 저분자량 헤파린(LMWH) 쇄는 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖지 않지만, 이들은 또한 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 너무 짧다. 결국, 본 발명의 MMWH 조성물은 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시키는 데에 LMWH보다 상당히 더 우수하다. 또한, 히루딘은 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시킬 수 있지만, 이는 트롬빈의 선택적 억제제이므로, 트롬빈 생성에 영향을 주지 않는다. 결국, 히루딘과는 반대로, 본 발명의 MMWH 조성물은 인자 Xa 불활성화를 안티트롬빈에 의해 촉매화시킴으로써 트롬빈 생성을 억제한다. 따라서, 트롬빈 생성의 차단에 의해서 뿐만 아니라 섬유소-결합된 트롬빈을 억제함으로써, 본 발명의 MMWH 조성물은 특히 만성 동맥 혈전증의 응고에 있어서 헤파린, LMWH 및 히루딘의 한계를 극복한다.
본 발명의 선택된 MMWH 조성물은 또한, 본원에서 예시된 바와 같은 특히 유리한 특성을 제공하는 최적 분자량 범위를 갖는 올리고당류가 풍부한 것으로 고려된다. 이들 MMWH 조성물은 다음 특징 중의 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 또는 그 이상을 특징으로 하는, 헤파린으로부터 유도된 올리고당류의 혼합물을 포함한다:
(a) 시험관 내에서 안티트롬빈- 및 헤파린 보조인자 II(HCII)-관련 항응고 활성을 갖는다;
(b) 올리고당류가 트롬빈을 섬유소에 브릿징(bridging)시키기에 너무 짧지만, 안티트롬빈 또는 HCII를 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖는다;
(c) 하나 이상의 오당류 서열을 갖는 올리고당류를 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상 갖는다;
(d) 분자량 범위가 약 6,000 내지 약 11,000; 7,000 내지 10,000; 7,500 내지 10,000; 7,800 내지 10,000; 7,800 내지 9,800; 또는 7,800 내지 9,600인 올리고당류가 풍부하다;
(e) 올리고당류가 평균 분자량이 약 7,800 내지 10,000, 바람직하게는 7,800 내지 9,800, 더욱 바람직하게는 8,000 내지 9,800이다;
(f) 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 이상의 올리고당류가 분자량이 6,000Dalton 이상, 바람직하게는 8,000Dalton 이상이다;
(g) 다분산도가 1.1 내지 1.5, 바람직하게는 1.2 내지 1.4, 가장 바람직하게는 1.3이다;
(h) 유사한 항-인자 Xa 및 항-인자 IIa 활성, 바람직하게는 약 2:1 내지 약 1:1, 더욱 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 1:1의 항-인자 Xa 활성 대 항-인자 IIa 활성의 비를 갖는다;
(i) 항-인자 Xa 활성이 약 80 내지 약 155IU/mg, 바람직하게는 90 내지 약 130IU/mg, 더욱 바람직하게는 약 95 내지 약 120IU/mg, 가장 바람직하게는 100 내지 110IU/mg이다;
(j) 항-인자 IIa 활성이 약 20 내지 약 150IU/mg, 바람직하게는 40 내지 약 100IU/mg, 더욱 바람직하게는 약 80 내지 약 100IU/mg, 가장 바람직하게는 약 90 내지 100IU/mg이다.
본 발명의 한 측면에 따라서, 본 발명의 선택된 MMWH 조성물은 (a), (b), (c) 및 (d); (a), (b), (c) 및 (e); (b), (c), (e) 및 (g); (b), (d), (c), (e) 및 (h); (b), (c), (d) 및 (g); (b), (e), (g), (i) 및 (j); (b), (e), (f), (g), (i) 및 (j); 또는 (a) 내지 (j)의 특성을 갖는다.
"올리고당류가 풍부한"이란 특정하거나 제한된 분자량 범위내에(예를 들어, 6,000 내지 11,000; 7,000 내지 10,000; 7,800 내지 10,000; 7,800 내지 9,800; 또는 8,000 내지 9,600) 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상의 올리고당류를 포함하는 MMWH 조성물을 언급한다.
(1) 안티트롬빈을 촉매화시킴으로써 섬유소-결합된 트롬빈 뿐만 아니라 유체상 트롬빈을 억제하고, (2) 안티트롬빈에 의해 인자 Xa 불활성화를 촉매화시킴으로써 트롬빈 생성을 억제하는 능력의 결과로서, 본 발명의 MMWH 조성물을 사용하여 불안정형 협심증, 급성 심근 경색(심장 발작), 뇌혈관 발작(뇌졸증), 폐색전증, 심정맥 혈전증, 동맥 혈전증 등을 포함하여 심혈관 질환을 치료할 수 있다. 그 자체로, 본 발명은 이러한 심혈관 질환을 치료하기 위한 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 투여량의 본 발명의 MMWH 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 혈전증 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 조성물은 약 6,000 내지 약 12,000Dalton, 더욱 더 바람직하게는 약 8,000 내지 약 10,000Dalton 범위의 분자량을 갖는 황산화 올리고당류의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, MMWH 조성물은 약 9,000Dalton의 평균 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, MMWH 조성물은 본원에서 기술된 최적 분자량 범위를 갖는 선택된 MMWH 조성물이다. 이 양태의 바람직한 측면에서, 혈전증 질환은 정맥 혈전증(예: 심정맥 혈전증), 동맥 혈전증 및 관상 동맥 혈전증을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 이 양태에서, MMWH 조성물은, 예를 들어, 섬유소-결합된 트롬빈 및 유체상 트롬빈을 억제함으로써 및 안티트롬빈에 의해 인자 Xa 불활성화를 촉매화시켜 트롬빈 생성을 억제함으로써 혈전 형성 및 성장을 억제한다. 바람직하게는, 화합물의 투여는 비경구 투여로(예: 정맥내, 피하 및 근육내 주사에 의해) 수행한다.
다른 양태에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 투여량의 본 발명의 MMWH 조성물을 혈전증 발생 위험이 있는 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 혈전 형성을 방지하는 방법을 제공한다. 조성물은 약 6,000 내지 약 12,000Dalton, 더욱 더 바람직하게는 약 8,000 내지 약 10,000Dalton 범위의 분자량을 갖는 황산화 올리고당류의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, MMWH 조성물은 약 9,000Dalton의 평균 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, MMWH 조성물은 본원에서 기술된 최적 분자량 범위를 갖는 선택된 MMWH 조성물이다. 이 양태의 한 측면에서, 환자는 지혈을 방해하는 의학적 질환(예: 관상 동맥 질환, 아테롬성 경화증 등)에 기인하여 혈전의 발생이 증가하는 위험에 처한다. 이 양태의 다른 측면에서, 환자는 의학적 과정, 예를 들어, 심장 수술(예: 심폐 바이패스), 카테터법(예: 심카테터법, 경피 경내강 관상 혈관성형술), 아테롬 절제술, 인공삽입물 장치(예: 심혈관 밸브, 혈관 이식편, 스텐트 등)의 배치에 기인하여 혈전의 발생이 증가하는 위험에 처한다. 이 양태에서, MMWH 조성물은 의학적 과정 전에, 의학적 과정 동안에 또는 의학적 과정 후에 투여할 수 있다. 또한, MMWH 조성물의 투여는 바람직하게는 비경구 투여로(예: 정맥내, 피하 및 근육내 주사에 의해) 수행한다.
본 발명은 또한, 혈전 상태 치료용 또는 혈전증 발생 위험이 있는 환자의 혈전 형성 예방용 약제의 제조에서 본 발명의 MMWH 조성물의 용도를; 환자의 섬유소-결합된 트롬빈 및 트롬빈 생성 억제용 약제의 제조에서 본 발명의 MMWH 조성물의 용도를; 심정맥 혈전증 치료용 약제의 제조에서 본 발명의 MMWH 조성물의 용도를; 및 환자의 폐색전증 예방용 약제의 제조에서 본 발명의 MMWH 조성물의 용도를 고려한다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 잇점 및 이의 바람직한 양태는 후속되는 상세한 설명으로부터 명백해진다.
도 1A 및 1B는 섬유소에 결합되는 트롬빈(IIb)에 대한 여러 헤파린 농도의 효과(A) 및 섬유소에 대한 트롬빈의 겉보기 친화도에 대한 여러 헤파린 농도의 효과(B)를 도시한다.
도 2는 헤파린의 부재하에 또는 이의 존재하에 섬유소 단량체-세파로스에 결합된 α-트롬빈(α-IIa), γ-트롬빈(γ-IIa) 또는 RA-트롬빈(RA)의 백분율을 도시한다.
도 3은 250nM 헤파린의 존재하에 또는 이의 부재하에 섬유소 단량체-세파로스에 결합되는 트롬빈(IIa) 상의 외부 부위(exosite) 2에 대한 히루겐(Hg), 프로트롬빈 단편 2(F2) 또는 항체(Wab)의 효과를 도시한다.
도 4는 삼원 섬유소-트롬빈-헤파린 복합체를 도시하며, 여기에서 트롬빈(IIa)은 외부 부위 1을 통해 섬유소(Fn)에 결합되고, 헤파린(Hp)은 Fn 및 IIa 상의 외부 부위 2 둘다에 결합된다.
도 5는 100nM의 헤파린의 존재하에 안티트롬빈( ■) 또는 헤파린 보조인자 II( ●)에 의한 트롬빈 억제 속도에 대한 섬유소 단량체(Fm)의 효과를 도시한다. 각 점은 둘 이상의 별도 실험의 평균을 나타내는 한편, 막대는 SD를 나타낸다.
도 6A 및 6B는 헤파린의 부재하에 또는 이의 존재하에 지시된 농도에서 안티트롬빈(A) 또는 헤파린 보조인자 II(B)에 의한 트롬빈 억제 속도에 대한 4μM 섬유소 단량체( )의 억제 효과를 도시한다. 각 점은 둘 이상의 실험의 평균을 나타내는 한편, 막대는 SD를 나타낸다.
도 7은 헤파린(Hp)의 존재하에 γ-트롬빈(γ-IIa), 퀵 1 디스트롬빈(Q1-IIa) 또는 RA-IIa와 섬유소(Fn)의 상호작용을 도시한다. 비생산성 삼원 복합체가 형성되는데, γ-IIa 및 Q1-IIa가 변경된 외부 부위 1을 갖는 한편, RA-IIa는 Hp에 대해 감소된 친화도를 갖기 때문이다.
도 8은 α-트롬빈(α-IIa), γ-트롬빈(γ-IIa) 또는 RA-트롬빈(RA)에 의한 N-p-Tosyl-Gly-Pro-Arg-p-니트로아닐리드의 가수분해에 대한 Km에 대한 이원 또는 삼원 복합체 형성의 효과를 도시한다. 이원 복합체는 트롬빈-섬유소(IIa-Fn) 및 트롬빈-헤파린(IIa-Hp)을 포함하는 한편, 삼원 복합체는 트롬빈-섬유소-헤파린(IIa-Fn-Hp)이다. 각 막대는 둘 이상의 실험의 평균을 나타내며, 선은 SD를 나타낸다.
도 9는 섬유소에 결합되는 트롬빈(IIa)에 대한 비분획화 헤파린(UFH) 및 6,000 Da 헤파린 분획(MMWH)의 효과를 도시한다.
도 10은 헤파린 또는 본 발명의 MMWH 조성물의 존재하에 안티트롬빈(AT) 또는 헤파린 보조인자 II(HCII)에 의한 트롬빈 억제 속도에 대한 4μM 섬유소 단량체의 억제 효과를 도시한다. 각 막대는 둘 이상의 별도 실험의 평균을 나타내는 한편, 선은 SD를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 모델 연구에서 표준 헤파린(SH), 저분자량 헤파린(LMWH), 본 발명의 MMWH 조성물 및 히루딘(HIR)의 누적 개방성을 %로 도시한다.
도 12는 30분에 누적 혈액 손실에 대한 표준 헤파린(SH), 저분자량 헤파린(LMWH), 본 발명의 MMWH 조성물 및 히루딘(HIR)의 효과를 도시한다.
도 13A 및 13B는 동맥 혈전증 모델에서 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 효능(A), 및 혈액 손실에 대한 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 효과(B)를 도시한다.
도 14는 APTT에 대한 본 발명의 MMWH 조성물 및 LMWH의 비교 효과를 도시한다.
도 15는 항-Xa 수준에 대한 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 비교 효과를 도시한다.
도 16은 당해 과정의 도시적 다이아그램이다.
도 17은 본 발명의 MMWH 조성물을 사용하여 처리한 후, 조절된 웨슬러(Wessler) 모델 응괴 중량(%)을 도시한다.
도 18은 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 비교: 예방 모델을 도시한다.
도 19는 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 비교: 예방 모델을 도시한다.
도 20은 본 발명의 MMWH 조성물을 사용하여 처리한 후, 조절된 웨슬러 모델 응괴 방사능(%)을 도시한다.
도 21은 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 비교: 예방 모델이다.
도 22는 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 비교: 예방 모델이다.
도 23은 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 비교: 치료 모델이다.
도 24는 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 비교: 치료 모델이다.
도 25는 혈전 유착에 대한 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 비교를 도시한다.
도 26은 혈전 유착에 대한 LMWH 및 본 발명의 MMWH 조성물의 비교를 도시한다.
도 27은 만성 래빗 모델 응괴 유착에서 본 발명의 MMWH 조성물을 사용하는 DVT의 치료를 도시한다.
도 28은 만성 래빗 모델 응괴 중량의 변화(%)에서 본 발명의 MMWH 조성물을 사용하는 DVT의 치료를 도시한다.
도 29는 헤파리나제-유도된 중간 분자량(MMW) 헤파린±4μM 섬유소 단량체를 사용하는 트롬빈의 AT 억제 속도를 도시하는 그래프이다.
도 30은 아질산-유도된 중간 분자량(MMW) 헤파린±4μM 섬유소 단량체를 사용하는 트롬빈의 AT 억제 속도를 도시하는 그래프이다.
도 31은 페리오데이트-유도된 중간 분자량(MMW) 헤파린±4μM 섬유소 단량체를 사용하는 트롬빈의 AT 억제 속도를 도시하는 그래프이다.
도 32는 헤파리나제 및 아질산-유도된 MMW 헤파린을 사용하는 경우, AT에 의한 트롬빈 억제 속도의 섬유소 단량체에 의한 억제 배수를 도시하는 그래프이다.
도 33은 페리오데이트-유도된 MMW 헤파린을 사용하는 경우, AT에 의한 트롬빈 억제 속도의 섬유소 단량체에 의한 억제 배수를 도시하는 그래프이다.
도 34는 헤파리나제-유도된 중간 분자량의 헤파린을 사용하는 경우,인자 Xa의 AT 억제 속도를 도시하는 그래프이다.
도 35는 아질산-유도된 중간 분자량의 헤파린을 사용하는 경우, 인자 Xa의 AT 억제 속도를 도시하는 그래프이다.
도 36은 페리오데이트-유도된 중간 분자량의 헤파린을 사용하는 경우, 인자 Xa의 AT 억제 속도를 도시하는 그래프이다.
도 37은 섬유소 응괴에 결합되는 트롬빈에 대한, UFH 및 헤파리나제-유도된 중간 분자량의 헤파린의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 38은 섬유소 응괴에 결합되는 트롬빈에 대한, UFH 및 아질산-유도된 중간 분자량의 헤파린의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 39는 섬유소 응괴에 결합되는 트롬빈에 대한, UFH 및 페리오데이트-유도된 중간 분자량의 헤파린의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 40은 섬유소 응괴에 결합되는 트롬빈에 대한, UFH 및 크기 제한된 헤파리나제-유도된 중간 분자량의 헤파린의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 41은 섬유소 응괴에 결합되는 트롬빈에 대한, UFH 및 크기 제한된 아질산-유도된 중간 분자량의 헤파린의 효과를 도시하는 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 양태
본 발명은 (1) 안티트롬빈을 촉매화시킴으로써 섬유소-결합된 트롬빈 뿐만 아니라 유체상 트롬빈을 억제하고, (2) 인자 Xa 불활성화를 안티트롬빈에 의해 촉매화시킴으로써 트롬빈 생성을 억제하는 중간 분자량의 헤파린(MMWH) 조성물을 제공한다. 이들 MMWH 조성물은 약 6,000 내지 약 12,000Dalton, 더욱 더 바람직하게는 약 8,000 내지 약 10,000Dalton 범위의 분자량을 갖는 황산화 올리고당류의 혼합물이다. 한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물은 약 9,000Dalton의 평균 분자량을 갖는다. 한 양태에서, MMWH 조성물의 31% 이상은 7,800Dalton 이상의 분자량을 갖는다. 다른 양태에서, MMWH 조성물의 25% 이상은 10,000Dalton 이상의 분자량을 갖는다.
특히, 본 발명의 MMWH 조성물은 혈전의 강한 예비혈전 활성을 진정시킬 수 있다. 혈전의 예비혈전 활성은 섬유소-결합된 트롬빈 및 혈소판-결합된 활성화 인자 X(인자 Xa)의 활성에 영향을 주며, 이들은 둘다 헤파린 및 LMWH에 의한 불활성화에 비교적 내성이다. 이는 이들 제제가 동맥 혈전증의 응고에서 제한된 효능을 갖는 이유 및 치료가 중지된 경우에 발생하는 응고의 활성화에 반발하는 이유를 설명한다. 또한, 히루딘은 헤파린과 대조적으로, 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시킬 수 있지만, 혈소판-결합된 인자 Xa에 의해 유발된 트롬빈 생성을 차단하지 못한다. 히루딘이 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시키는 능력은 직접 트롬빈 억제제가 동맥 혈전증의 단기간 치료에 헤파린보다 우수한 이유를 설명한다. 그러나 이들 제제의 유리한 효과는 일단 치료가 중지되면 급속하게 상실되는데, 이들은 혈소판-결합된 인자 Xa에 의해 유발된 트롬빈 생성을 차단하지 못하기 때문이다.
이제 섬유소-결합된 트롬빈은 헤파린에 의한 불활성화에 내성이 있다고 측정되는데, 헤파린은 트롬빈 위의 헤파린-가교 부위 및 섬유소 둘다에 결합시킴으로써 트롬빈을 섬유소에 높은 친화도로 브릿징시키기 때문이며, 헤파린-섬유소 및 헤파린-트롬빈 상호작용 둘다에 대한 Kd는 약 150nM이다. 이러한 삼원 섬유소-트롬빈-헤파린 복합체내의 트롬빈은 안티트롬빈과의 반응성을 마찬가지로 제한하는 이의 활성 부위에서 형태가 변화된다. 또한, 트롬빈에 대한 헤파린-결합 부위를 차지함으로써 트롬빈을 섬유소에 구속시키는 헤파린 쇄가 헤파린-안티트롬빈 복합체내의 헤파린이 안티트롬빈을 섬유소-결합된 트롬빈으로 브릿징시키는 것을 방지한다. 이는 삼원 섬유소-트롬빈-헤파린 복합체내의 트롬빈이 헤파린에 의한 또는 트롬빈을 안티트롬빈으로 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖는 LMWH 쇄에 의한 불활성화로부터 보호되는 이유를 설명한다. 이들 항응고제에 대한 급성 동맥 혈전의 내성 및 치료 중지 후에 응고의 재활성화 둘다에 대한 주요 기여 인자는 헤파린, LMWH 또는 히루딘이 혈전의 강한 예비혈전 활성을 진정시키지 못하는 능력인 것 같다.
헤파린, LMWH 및 히루딘과 대조적으로, 본 발명의 MMWH 조성물은 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시킴으로써 및 인자 Xa 불활성화를 안티트롬빈에 의해 촉매화시켜 트롬빈 생성을 억제함으로써 혈전의 예비혈전 활성을 진정시킬 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 MMWH 조성물의 헤파린 쇄는 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 너무 짧지만, 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 결국, 헤파린과는 달리, 본 발명의 MMWH 조성물은 섬유소-결합된 트롬빈 및 유리 트롬빈 둘다를 불활성화시킨다. 또한, 대부분의 LMWH 쇄는 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖지 않지만, 이들은 또한 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 너무 짧다. 결국, 본 발명의 MMWH 조성물은 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시키는 데에 LMWH보다 상당히 더 좋다. 또한, 히루딘은 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시키지만, 이는 트롬빈의 선택적 억제제이므로 트롬빈 생성에 대한 효과가 없다. 결국, 히루딘과 반대로, 본 발명의 MMWH 조성물은 인자 Xa 불활성화를 안티트롬빈에 의해 촉매화시켜 트롬빈 생성을 억제한다. 따라서, 트롬빈 생성을 차단할 뿐만 아니라 섬유소-결합된 트롬빈을 억제함으로써, 본 발명의 MMWH 조성물은 특히 급성 동맥 혈전증의 응고에서 헤파린, LMWH 및 히루딘의 한계를 극복한다.
본 발명의 MMWH 조성물은 일반적으로 유사한 항-인자 IIa 및 항-인자 Xa 활성을 갖는다. 현재 바람직한 양태에서, 항-인자 Xa 활성 대 항-인자 IIa 활성의 비는 약 2:1 내지 약 1:1, 더욱 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 1:1의 범위이다. 대조적으로, LMWH는 예를 들어, 항-인자 IIa 활성보다 상당히 더 많은 항-인자 Xa 활성을 갖는다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물의 항-인자 Xa 활성은 약 90 내지 약 150U/mg, 더욱 바람직하게는 약 100 내지 약 125U/mg의 범위이다. 더욱 더 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물은 약 115U/mg의 항-인자 Xa 활성을 갖는다. 현재 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물의 항-인자 IIa 활성은 약 40 내지 약 100U/mg, 더욱 바람직하게는 약 60 내지 약 75U/mg의 범위이다. 더욱 더 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물은 약 65U/mg의 항-인자 IIa 활성을 갖는다.
본 발명의 선택된 MMWH 조성물은 또한, 본원에서 예시된 바와 같이 특히 유리한 특성을 제공하는 최적 분자량 범위를 갖는 올리고당류가 풍부한 것으로 고려된다. 이들 MMWH 조성물은 시험관내에서 안티트롬빈- 및 헤파린 보조인자 II(HCII)-관련된 항응고 활성을 가짐을 특징으로 하는 헤파린으로부터 유도된 올리고당류의 혼합물을 포함한다. 조성물은 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 너무 짧지만, 안티트롬빈 또는 HCII를 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖는 헤파린 쇄를 포함한다. 특히, 조성물은 하나 이상의 오당류 서열을 갖는 헤파린 올리고당 쇄를 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상 갖는다. "오당류 서열"이란 세개의 D-글루코스아민 및 두개의 우론산 잔기로 이루어진 헤파린의 주요 구조 단위을 언급한다(아래의 구조를 참고). 중심 D-글루코스아민 잔기는 독특한 3-O-설페이트 잔기를 함유한다.
오당류 서열은 안티트롬빈에 대해 높은 친화도를 갖는 헤파린의 최소 구조를 나타낸다[참조: Choay, J. et al., Biochem Biophys Res Comm 1983; 116: 492-499]. 안티트롬빈에 대한 헤파린의, 오당류 서열을 통한 결합은 안티트롬빈을 느린 억제제로부터 매우 빠른 억제제로 전환시키는 반응성 중심 루프에서 입체배좌를 변화시킨다. 결국, 본 발명의 선택된 MMWH 조성물은 섬유소-결합된 트롬빈 뿐만 아니라 유체상 트롬빈을 안티트롬빈을 촉매화시킴으로써 억제하고, 인자 Xa 불활성화를 안티트롬빈에 의해 촉매화시킴으로써 트롬빈 생성을 억제할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 선택된 MMWH 조성물은 섬유소-결합된 트롬빈 및 유체상 트롬빈을 동일하게 잘 억제하는 것이다.
선택된 MMWH 조성물은 약 6,000 내지 약 11,000의 분자량 범위를 갖는 올리고당류를 포함한다. 본 발명의 한 양태에 따라서, 7,800 내지 8,800, 바람직하게는 7,800 내지 8,600, 더욱 바람직하게는 7,800 내지 8,500, 가장 바람직하게는 8,000 내지 8,500의 분자량 범위를 갖는 올리고당류가 풍부한 MMWH 조성물이 제공된다. 본 발명의 다른 양태에서, 9,000 내지 10,000, 바람직하게는 9,200 내지 9,800, 더욱 바람직하게는 9,300 내지 9,600, 가장 바람직하게는 9,400 내지 9,600의 분자량 범위를 갖는 올리고당류가 풍부한 MMWH 조성물이 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은 평균 분자량이 7,800 내지 8,800, 바람직하게는 7,800 내지 8,600, 더욱 바람직하게는 7,800 내지 8,500, 가장 바람직하게는 8,000 내지 8,500인 올리고당류를 포함하는 본 발명의 MMWH 조성물을 고려한다. 다른 양태에서, 본 발명은 평균 분자량이 9,000 내지 10,000, 바람직하게는 9,200 내지 9,800, 더욱 바람직하게는 9,300 내지 9,600, 가장 바람직하게는 9,400 내지 9,600인 올리고당류를 포함하는 본 발명의 MMWH 조성물을 고려한다.
선택된 MMWH 조성물은 1.1 내지 1.5, 바람직하게는 1.2 내지 1.4, 가장 바람직하게는 1.3의 다분산도를 가질 수 있다.
본 발명의 선택된 MMWH 조성물은 유사한 항-인자 Xa 및 항-인자 IIa 활성을 갖는다. 한 양태에서, 항-인자 Xa 활성 대 항-인자 IIa 활성의 비는 약 2:1 내지 약 1:1, 더욱 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 1:1의 범위이다. 바람직한 양태에서, 항-인자 Xa 활성은 약 80 내지 약 155IU/mg, 바람직하게는 90 내지 약 130IU/mg, 더욱 바람직하게는 약 95 내지 약 120IU/mg, 가장 바람직하게는 100 내지 110IU/mg의 범위이다. 바람직한 양태에서, 항-인자 IIa 활성은 약 20 내지 약 150IU/mg, 더욱 바람직하게는 40 내지 약 100IU/mg, 가장 바람직하게는 약 80 내지 약 100IU/mg의 범위이다. 더욱 더 바람직한 양태에서, 조성물은 약 90 내지 100IU/mg의 항-인자 IIa 활성을 갖는다.
본 발명의 MMWH 조성물은 저 표준 또는 비분획화 헤파린으로부터 또는 대신에 저분자량 헤파린(LMWH)으로부터 제조될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물은 먼저 비분획화 헤파린을 해중합시켜 저분자량 헤파린을 수득한 다음에, 중요한 MMWH 분획을 분리하거나 분리 제거함으로써 비분획화 헤파린으로부터 수득할 수 있다. 비분획화 헤파린은 우론산 잔기(D-글루콘산 또는 L-이두론산) 및 D-글루코스아민산 잔기로 구성된 이당류의 반복으로 이루어진 다당류 쇄의 혼합물이다. 많은 이들 이당류가 우론산 잔기 및/또는 글루코스아민 잔기 상에서 황산화된다. 일반적으로, 비분획화 헤파린은 헤파린의 공급원 및 이를 분리시키는 데에 사용된 방법에 따라서 약 6,000 내지 40,000Dalton 범위의 평균 분자량을 갖는다. 본 발명의 방법에 사용된 비분획화 헤파린은 약제학적 품질을 갖는 상업용 헤파린 제제 또는 조 헤파린 제제, 예를 들어, 포유류 조직 또는 기관으로부터 활성 헤파린을 추출시에 수득되는 것일 수 있다. 상업용 제품(USP 헤파린)은 다수의 공급원(예: 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 SIGMA Chemical Co.)으로부터 일반적으로 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로(가장 일반적으로는 나트륨 헤파린으로) 입수가능하다. 또는, 비분획화 헤파린은 포유류 조직 또는 기관, 특히 예를 들어, 소, 돼지 및 양의 장내 점막 또는 폐로부터 당해 분야의 전문가에게 공지된 다양한 방법을 사용하여 추출할 수 있다[참조: Coyne, Erwin, Chemistry and Biology of Heparin, (Lundblad, R.L., et al. (Eds.), pp. 9-17, Elsevier/North-Holland, New York (1981)]. 현재 바람직한 양태에서, 비분획화 헤파린은 돼지 장내 헤파린이다.
헤파린의 해중합에 대해 많은 방법이 공지되어 있으며, 과학 및 특허 문헌에 둘다 광범위하게 보고되어 있고, 본 발명에 적용가능하다. 이러한 방법은 일반적으로 화학적 또는 효소 반응을 근거로 한다. 예를 들어, 저분자량 헤파린은 표준, 비분획화 헤파린으로부터, 벤질화 후에 알칼리 해중합; 아질산 해중합; 헤파리나제를 사용하는 효소 해중합; 과산화성 해중합 등에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로 조성물에 본 발명의 MMWH 조성물, 특히 최적 분자량 범위를 갖는 본 발명 조성물의 특성을 제공하는 방법이 선택된다. 본 발명 조성물의 바람직한 특성, 즉 분자량 범위, 평균(mean 또는 average) 분자량, 다분산도, 항-인자 Xa 활성, 항-인자 IIa 활성 등은 표준 방법을 사용하여 확인할 수 있다(예를 들어, 본원의 실시예를 참고). 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은 비분획화 헤파린으로부터 아질산 해중합 또는 헤파리나제 해중합을 사용하여 제조한다.
비분획화 헤파린은 비분획화 헤파린을 조절된 조건하에 화학적 시약, 특히 아질산의 작용에 접촉시켜 해중합시킬 수 있다. 아질산은 헤파린에 직접 첨가하거나 또는, 동일 반응계내에서 형성될 수 있다. 아질산을 동일 반응계내에서 생성시키기 위해서, 조절된 양의 산을 아질산의 유도체에 첨가한다. 적합한 산은 유리하게는 생물학적으로 허용되는 음이온(예: 아세트산), 더욱 바람직하게는 염산을 함유하는 것을 포함한다. 아질산의 적합한 유도체는 염, 에테르염 또는 더욱 바람직하게는 알칼리 또는 알칼리 토금속염을 포함한다. 현재 바람직한 양태에서, 아질산의 염, 수용성 염, 더욱 바람직하게는 알칼리 염(예: 아질산나트륨(NaNO2))을 사용한다.
비분획화 헤파린의 해중합은 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 매질에서 수행하고, 이에 의해 고려된 생물학적 적용에 유해할 수 있는 용매의 사용과 연관된 문제를 제거한다. 이러한 생물학적으로 허용되는 매질은 물 및 물/알콜 혼합물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 현재 바람직한 양태에서, 물은 바람직한 반응 매질을 구성한다. 해중합 반응의 수행에서, 화학양론적 양의 시약(예: 아질산)을 사용하는 것이 바람직하다. 화학양론적 양의 아질산의 사용은 바람직한 정도의 해중합에 도달한 경우, 아질산은 전량 소비됨을 보장한다. 일반적으로, 비분획화 헤파린 대 아질산나트륨(NaNO2)의 중량비는 약 100 대 2-4, 더욱 바람직하게는 약 100 대 3의 범위이다. 화학양론적 양의 아질산의 사용은 역학적(진행) 반응물을 예를 들어, 암모늄 설파메이트로 "급냉"시킬 필요를 방지하며, 저분자량 헤파린 중간체의 혼합염(예: 나트륨 및 암모늄 염)의 형성을 방지한다.
또한, 다른 파라미터(예: 온도 및 pH)는 바람직한 생성물을 가장 만족스러운 실험 조건하에 수득하기 위해서 서로에 대해 조절한다. 예를 들어, 해중합 반응은약 0 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행할 수 있다. 사실상, 10℃ 미만의 온도는 바람직한 생성물의 제조에 사용할 수 있다. 그러나 바람직한 양태에서, 해중합 반응은 주위 온도에서, 즉 약 20 내지 28℃ 사이에서 수행한다. 또한, 바람직한 양태에서, 해중합 반응은 반응 혼합물의 pH를 먼저 저하시킨 다음에 상승시켜 개시하고 종결시킨다. 해중합 반응을 개시하기 위해서, 반응 혼합물의 pH는 약 2.5 내지 3.5의 pH로, 더욱 바람직하게는 약 3.0의 pH로 저하시킨다. 유사하게는, 해중합 반응을 종결시키기 위해서, 반응 혼합물의 pH는 약 6.0 내지 7.0의 pH로, 더욱 바람직하게는 약 6.75의 pH로 상승시킨다. 반응의 진행은 반응 혼합물 중의 아질산 이온의 존재 또는 부재를 예를 들어, 전분-요드 페이퍼를 사용하여 검사함으로써 모니터할 수 있음을 주의한다. 반응 혼합물 중의 아질산 이온의 부재는 반응물이 완결됨을 지시한다. 반응이 완결에 도달하는 데에 소요되는 시간은 사용되는 반응물 및 반응 조건에 따라 다르다. 그러나 일반적으로, 반응은 약 1시간 내지 약 3시간의 어느 시점에 완결에 도달한다.
일단 반응이 완결에 도달하면, MMWH 조성물은 당해 분야의 전문가에게 공지되고 이들에 의해 사용된 다수의 상이한 기술을 사용하여 회수할 수 있다. 한 양태에서, MMWH 조성물은 반응 혼합물로부터 침전, 한외여과 또는 크로마토그래피 방법에 의해 회수한다. 목적하는 생성물이 침전에 의해 수득되는 경우, 이는 일반적으로 예를 들어, 알콜(예: 무수 에탄올)을 사용하여 수행한다. 현재 바람직한 양태에서, MMWH 조성물은 반응 혼합물로부터 한외여과 방법을 사용하여 회수한다. 다양한 분자량 절단물의 한외여과 막은 유리하게는 수득된 MMWH 조성물의 분자량특성을 탈염시키고 제한하는 데에 사용할 수 있다. 본 발명에 따라서 사용하기에 적합한 한외여과 시스템은 당해 분야의 전문가에게 공지되고 이들에 의해 사용된다. 시판되는 Millipore Pellicon 한외여과 장치는 본 발명에 따라서 사용할 수 있는 예시적 한외여과 시스템이다. 이 장치에는 다양한 분자량 절단 막을 장치할 수 있다. 현재 바람직한 양태에서, 수득된 MMWH 조성물은 6,000Dalton 분자량 절단 막이 장치된 Millipore Pellicon 한외여과 장치를 사용하여 정제수(즉, 증류수(dH2O))에 대해 투석하거나 한외여과시킨다.
한외여과시킨 후, 보유물을 동결 건조시켜 MMWH 조성물을 수득한다. 수득된 MMWH 조성물의 분자량 특성은 당해 분야에 공지되고 이들에 의해 사용된 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 기술은 예를 들어, GPC-HPLC, 점도 측정, 광 산란, 해중합 공정 동안에 생성된 관능기의 화학적 또는 물리 화학적 측정 등을 포함한다. 바람직한 양태에서, 수득된 MMWH 조성물의 분자량 특성은 고성능 크기 배제 크로마토그래피와 함께 다각도 레이저 광 산란(HPSEC-MALLS)에 의해 측정한다. 일반적으로, 수득된 MMWH 조성물은 약 9,000Dalton의 평균 또는 평균 분자량 평균(Mw)을 갖는다. 본 발명의 선택된 조성물에서, 평균 분자량은 약 7,800 내지 10,000Dalton, 바람직하게는 7,800 내지 9,800Dalton이다.
당해 분야의 전문가는 수득된 MMWH 조성물이 추가 정제 과정에 적용될 수 있음을 쉽게 인식한다. 이러한 과정은 겔 투과 크로마토그래피, 한외여과, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 MMWH 조성물의 분자량 특성은 위에서 기술된 바와 같이 당해 분야에 공지되고 이들에 의해 사용된 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 설명된 바와 같이, 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물의 분자량 특성은 고성능 크기 배제 크로마토그래피와 함께 다각도 레이저 광 산란(HPSEC-MALLS)에 의해 측정한다.
본 발명의 MMWH 조성물은 헤파리나제에 의해 헤파린을 효소성 해중합시켜 제조할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제3,766,167호 및 제4,396,762호를 참고). 본 발명의 한 양태에 따라서, 본 발명의 조성물, 특히 최적 분자량 범위 또는 제한된 분자량 범위를 갖는 선택된 조성물은 EP 제0244236호(Nielsen and Ostergard; 제 87303836.8호, 1987년 4월 11일자로 공개)에 기술된 바와 같이 조절된 헤파리나제 해중합에 의해 제조한다. 이 방법을 사용하여 본 발명의 MMWH 조성물은 헤파리나제를 사용하여 상응하는 수 평균 분자량으로 해중합시켜 목적하는 중량 평균 분자량으로 제조할 수 있다. 당해 방법은 해중합의 과정 동안에 흡광도의 증가(바람직하게는 230 내지 235nm에서, 즉 △A235)를 측정하며, 흡광도가 목적하는 수 평균 분자량에 상응하는 계산치 및 상응하는 목적하는 중량 평균 분자량에 도달한 경우, 해중합은 중단된다.
다른 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물은 헤파린의 제한된 페리오데이트 산화/가수분해에 의해 저분자량 헤파린을 수득한 다음에, 중요한 MMWH 분획을 분리하거나 분리 제거함으로써 수득할 수 있다. 이 방법의 제1 단계에서, 헤파린은 제한된 양의 나트륨 페리오데이트와 접촉시킨다. 현재 바람직한 양태에서, 나트륨 페리오데이트의 농도는 약 1 내지 약 50mM, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 20mM의 범위이다. 이 반응 혼합물의 pH는 약 3 내지 11, 더욱 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5의 범위이다. 제한된 페리오데이트 산화는 일반적으로 약 18시간동안 수행한다. 이 방법의 제2 단계에서, 알칼리 가수분해는 금속 알칼리(예: NaOH)를 사용하는 페리오데이트 산화 후에 수행한다. 바람직한 양태에서, 금속 알칼리(예: NaOH)의 농도는 약 0.1 내지 약 1N, 더욱 바람직하게는 약 0.25N이다. 이 단계는 약 0 내지 약 50℃ 범위의 온도에서, 더욱 바람직하게는 약 25℃의 온도에서, 약 1 내지 약 10시간동안, 더욱 바람직하게는 3시간동안 수행한다. 목적하는 MMWH 조성물은 위에서 기술된 바와 같이 공지된 방법, 예를 들어, 겔 투과, 이온 교환 크로마토그래피, 한외여과, 투석, 4급 암모늄 침전 및 유기 용매 침전을 사용하여 수득한다. 또한, MMWH 조성물은 위에서 기술된 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있다.
제한된 페리오데이트 산화/가수분해 방법을 사용하여, 공지된 LMWH 화합물과 구조적으로 상이한 MMWH 조성물을 제조한다. 위에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 MMWH 조성물은 비분획화 헤파린을 페리오데이트로 간단히 처리하여 특정한 황산화 우론산 잔기에서 산화되는 생성물을 수득함으로써 제조한다. 이들 산화된 부위는 염기를 사용하여 용이하게 분리시킬 수 있다. 결국, MMWH 조성물의 분리는 일반적으로 LMWH을 제조하는 데에 현재 사용되는 방법의 경우에서와 같이 랜덤하지 않을 수 있다. 또한, 페리오데이트에 의한 산화에 민감한 2 내지 0개 황산화 우론산 잔기는 약간 빈번하게는 오당류 서열에 인접하여 위치한다. 결국, 본 발명의 제한된 페리오데이트/가수분해 방법에 의해 트롬빈에 브릿징시키기에 충분히 긴 헤파린 쇄의 나머지를 남길 수 있는 쇄의 말단에 위치한 오당류 서열을 갖는 저분자량 헤파린 쇄를 수득할 수 있다.
본 발명의 MMWH 조성물은 특히, (1) 안티트롬빈을 촉매화시킴으로써 섬유소-결합된 트롬빈 뿐만 아니라 유체상 트롬빈을 억제하고, (2) 인자 Xa 불활성화를 안티트롬빈에 의해 촉매화시킴으로써 트롬빈 생성을 억제할 수 있다. 그 자체로, 본 발명의 MMWH 조성물은 불안정형 협심증, 급성 심근 경색(심장 발작), 뇌혈관 발작(뇌졸중), 폐색전증, 심정맥 혈전증, 동맥 혈전증 등을 포함하여 다수의 중요한 심혈관 합병증을 치료하는 데에 사용할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물은 동맥 혈전증을 치료하는 데에 사용한다. 그 자체로, 다른 양태에서, 본 발명의 MMWH 조성물은 이러한 심혈관 상태의 치료에 유용한 약제학적 조성물에서 성분으로서 혼입될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 통상적 혈전용해 치료(예: 조직 플라스미노젠 활성화제(tRA), 스트렙토키나제 등의 투여)와 함께, 통상적 항혈소판 치료(예: 티클로피딘의 투여)와 함께 뿐만 아니라 혈관내 개입(예: 혈관성형술, 아테롬 절제술 등)과 함께 유용하다.
본 발명의 MMWH 조성물은 치료학적 투여를 위해 많은 제형에 혼입시킬 수 있다. ㄷ욱 특히, 본 발명의 MMWH 조성물은 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 배합함으로써 약제학적 조성물로 제형화시킬 수 있으며, 다양한 제제로, 바람직하게는 액체 형태(예: 슬러리, 액제 및 주사제)로 제형화시킬 수 있다. 본 발명의 MMWH 조성물의 투여는 바람직하게는 비경구 투여로(예: 정맥내, 피하 및 근육내 주사에 의해) 달성한다. 또한, 화합물은 전신 방법으로보다는 국소에, 예를 들어, 피하 부위로 화합물을 직접 주사하여, 빈번하게는 데포(depot) 또는 서방성 제형으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 제형은 문헌에서 발견되며[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th Ed. (1985)], 이의 교시는 본원에서 참조로 인용된다. 또한, 약물 전달에 대한 방법을 간단히 검토하기 위해서, 문헌을 참고하며[참조: Langer, Scinence 249:1527-1533 (1990)], 이의 교시는 본원에서 참조로 인용된다. 본원에서 기술된 약제학적 조성물은 당해 분야의 전문가에게 공지된 방식으로, 즉 통상적 혼합, 용해, 수파, 유화, 트랩핑 또는 동결건조 방법에 의해 제조할 수 있다. 다음 방법 및 부형제는 예시에 불과하며, 어떠한 방식으로든 제한되지 않는다.
본 발명의 MMWH 조성물은 바람직하게는 주사에 의해, 예를 들어, 거환 주사 또는 연속적 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화시킨다. 주사용 제형은 예를 들어, 앰퓰내의 또는 다중 투여량 용기내의 단위 투여량 형태로 방부제를 첨가하여 제공할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 액제 또는 유제와 같은 형태를 취할 수 있으며, 제형화제(예: 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제)를 함유할 수 있다.
일반적으로, 비경구 투여용 약제학적 제형은 수용성 형태 중의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 화합물의 현탁제는 적합한 오일성 주사 현탁제로서 제조할 수 있다. 적합한 지용성 용매 또는 비히클은 지방 오일(예: 참깨 오일 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올리에이트 또는 트리글리세라이드 또는 리포솜)을 포함한다. 수성 주사 현탁제는 현탁제의 점도를 증가시키는 물질(예: 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란)을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁제는 또한 고농도 용액의 제조에 허용되는 화합물의 용해성을 증가시키는 적합한 안정화제 또는 제제를 함유할 수 있다. 또는, 활성 성분은 사용하기 전에, 적합한 비히클(예: 멸균 발열물질을 포함하지 않는 물)로 구성하기 위한 산제 형태로 존재할 수 있다.
더욱 특히, 주사하기 위해서, MMWH 조성물은 수성 또는 비수성 용매, 예를 들어, 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세라이드, 고급 지방산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜에, 필요한 경우, 통상의 첨가제(예: 가용화제, 등장성 제제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 방부제)와 함께 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제제로 제형화시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 수용액에, 바람직하게는 생리학적 혼화성 완충제(예: 행크 용액(Hanks's solution), 링거액 또는 생리학적 염수 완충액)에서 제형화시킬 수 있다.
위에서 기술된 제형 이외에, MMWH 조성물은 또한 데포 제제로서 제형화시킬 수 있다. 이러한 오래 작용하는 제형은 이식에 의해(예를 들어, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예: 허용되는 오일 중의 유제로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화시킬 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분이 치료학적 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. "치료학적 유효량" 또는 바꾸어서 "약리학적으로 허용되는 투여량" 또는 바꾸어서 "항응고 유효량"이란 화합물, 즉 MMWH 조성물의 충분한 양이 목적하는 결과, 예를 들어, 혈전-관련 심혈관 상태(예: 위에서 기술된 것)를, 예를 들어, 응괴-결합된 트롬빈을 불활성화시키고, 인자 Xa 불활성화를 안티트롬빈에 의해 촉매화시킴으로써 트롬빈 생성을 억제하여 치료하는 경우에, 혈전 유착의 억제 등을 달성하기 위해서 존재함을 의미한다. 투여된 조성물의 양은 물론 치료 받는 환자, 환자의 체중, 질병의 중증도, 투여 방식 및 주치의의 판단에 따른다. 유효량의 측정은 특히 본원에서 제공된 상세한 기술에 비추어 능히 당해 분야의 전문가의 능력 범위내에 있다.
본 발명의 치료 또는 조성물은 포유동물, 특히 사람을 포함하는 동물인 환자에게 투여할 수 있다. 동물은 또한 말, 소, 양, 돼지, 개 및 동물원 동물을 포함하여 가축을 포함한다.
일반적으로, 활성 생성물, 즉 MMWH 조성물은 약제학적 조성물에 약 2 내지 200μg/투여량 범위의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 50μg/투여량 범위의 농도로 존재한다. 1일 투여량은 특정 MMWH의 특정 활성에 따라 광범위하게 변할 수 있지만, 일반적으로 약 0.5 내지 약 15μg/체중 kg/일 범위의 농도로, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 약 5μg/체중 kg/일 범위의 농도로 존재한다.
위에서 기술된 심혈관 상태의 치료를 위한 약제학적 조성물에 유용하다는 것 이외에, 당해 분야의 전문가는 활성 생성물, 즉 MMWH 조성물이 시험관내에서 혈액 응고의 메커니즘을 밝히기 위한 시약으로 사용될 수 있음을 쉽게 인식한다.
본 발명은 특정한 실시예에 의해 매우 상세하게 기술된다. 다음 실시예는 예시의 목적으로만 제공되며, 본 발명을 어떠한 방식으로든 제한하려는 것은 아니다. 당해 분야의 전문가는 필수적으로 동일한 결과를 수득하도록 변화시키거나 변형시킬 수 있는 다양한 비임계 파라미터를 쉽게 인식한다.
실시예 1
실험 결과
1.1 현재 입수가능한 항응고제의 임상적 한계
헤파린, LMWH 및 직접적인 트롬빈 억제제는 급성 관상 증후군에 한계가 있다. 불안정형 협심증이 있는 환자에 있어서, 이들 제제를 사용하는 치료를 중지한 후에 클러스터 또는 재발성 허혈 증상이 일어난다[참조: Theroux, P., et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327:141-145; Granger, C.B., et al. (1996) Circulation 93:870-888; Oldgren, J., et al. (1996) Circulation 94 (suppl 1):I-431]. 이는 응고의 재활성화에 기인하는데, 프로트롬빈 단편 F1.2(F1.2) 및 피브리노펩타이드 A(FPA)의 혈장 수준에서 연관된 상승이 있기 때문이며, 각각 증가된 트롬빈 생성 및 트롬빈 활성에 영향을 준다[참조: Granger, C.B., et al. (1995) Circulation 91:1929-1935]. 급성 심근 경색이 있는 환자에 있어서, 조직 플라스미노젠 활성화제(t-PA) 또는 스트렙토키나제를 사용하는 혈전용해 치료는 FPA의 상승된 수준을 특징으로 하는 응혈촉진 상태를 유도하며[참조: Eisenberg, P.R., et al. (1987)J. Am. Coll. Cardiol. 10:527-529; Owen, J., et al. (1988) Blood 72:616-620], 이들은 헤파린에 의해 일부만 감소된다[참조: Galvani, J., et al. (1994) J. Am. Coll. Cardiol. 24:1445-1452; Merlini, P.A., et al. (1995) J. Am. Coll. Cardiol. 25:203-209]. 이는 보조 헤파린이 스트렙토키나제를 수용하는 환자에서 재발성 허혈 사건의 발병을 감소시키지 않고[참조: Collins, R., et al. (1996) BMJ 313:652-659], 주어진 t-PA에서 문제시되는 이익만 갖는[참조: Collins, R., et al. (1996) BMJ 313:652-659] 이유를 설명한다. 히루딘은 혈전용해 치료에 대한 보조제로서 및 혈전용해제를 수용하지 않는 비-Q파 경색이 있는 환자에서 헤파린보다 우수하며, 히루딘의 초기 이익은 30일이내에 상실된다[참조: GUSTO Investigators (1996) N. Engl. J. Med. 335(11):775-782]. 이들 결과는 헤파린 및 히루딘 둘다에 내성이 있는 지속성 혈전 생성 자극이 있음을 암시한다.
유사한 결과가 관상 혈관성형술의 응고에서 관찰된다. 재발성 허혈 사건은 아스피린 및 고투여량 헤파린에도 불구하고 6 내지 8%의 환자에서 발생한다[참조: Popma, J.J., et al. (1995) Chest 108:486-501]. 히루딘은 성공적 관상 혈관성형술 이후에 처음 72시간동안 헤파린보다 우수하지만, 이의 이익은 30일 경에 상실된다[참조: Serruys, P.W., et al. (1995) N. Engl. J. Med. 333:757-763]. 유사하게, 7일에, 히룰로그, 반합성 히루딘 동족체[참조: Bittl. J.A., et al. (1995) J. Med. 333:764-769]는 급성 심근 경색 후에 불안정형 협심증에 대한 혈관성형술을 받은 환자에서 재발성 허혈 사건의 방지시에 헤파린보다 우수하다; 그러나 30일 경에, 히룰로그 및 헤파린 사이에 차이는 없다[참조: Bittl. J.A., et al. (1995) J.Med. 333:764-769]. 헤파린, LMWH 및 히루딘에 대한 급성 동맥 혈전의 내성 및 치료가 중지된 경우에 일어나는 응고의 재활성화는 둘다 이들 항응고제가 혈전의 강한 예비혈전 활성을 진정시키지 못함에 영향을 주는 것 같다.
1.2 급성 동맥 혈전의 예비혈전 활성의 원인이 되는 인자
동맥 혈전증은 혈관 손상에 의해 유발된다. 아테롬성경화증 반점의 자발적 또는 외상성 파열은 VII/VIIa 인자를 복합시키는 조직 인자를 노출시킨다. 다음에, VIIa 인자/조직 인자 복합체는 IX 및 X 인자를 활성화시켜 응고를 개시한다. VIIa 인자/조직 인자 복합체내의 VIIa 인자는 조직 인자 경로 억제제에 의해 급속하게 불활성화되지만[참조: Broze GJ Jr. (1995) Thromb. Haemost. 74:90-93], 동맥 혈전은 혈전 생성 상태로 유지된다.
시험관내 연구는 (a) 섬유소에 결합된 트롬빈[참조: Hogg, P.J., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3619-3623; Weitz, J.I., et al. (1990) J. Clin. Invest. 86:385-391] 또는 (b) 혈전내에서 혈소판에 결합된 인자 Xa(및 아마도 인자 IXa)[참조: Eisenberg, P.R., et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:1877-1883]에 대한 동맥 혈전의 응혈촉진 활성에 기여한다. 섬유소-결합된 트롬빈은 혈소판을 부분적으로 활성화시키고[참조: Kummar, R., et al.. (1995) Thromb. Haemost, 74(3):962-968], 응고를 촉진시키며[참조: Kummar, R., et al.. (1994) Thromb. Haemost, 72:713-721], 이에 의해 강한 응혈촉진 상태를 유도한다. 트롬빈 생성을 유발함으로써, 혈소판-결합된 Xa(및 IXa) 인자는 이러한 응혈촉진 상태를 증대시킨다.
섬유소-결합된 트롬빈 및 혈소판-결합된 인자 Xa는 둘다 헤파린 및 LMWH에 의한 불활성화에 내성이며[참조: Hogg, P.J., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3619-3623; Weitz, J.I., et al. (1990) J. Clin. Invest. 86:385-391; Teitel, J.M., et al. (1983) J. Clin. Invest. 71:1383-1391; Pieters, J., et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:15313-15318], 이에 의해 급성 동맥 혈전의 응혈촉진 활성을 진정시키지 못함을 설명한다. 히루딘은 섬유소-결합된 트롬빈을 불활성화시킬 수 있지만[참조: Weitz, J.I., et al. (1990) J. Clin. Invest. 86:385-391], 혈소판-결합된 응괴 인자에 의해 유발된 트롬빈 생성을 차단하지 못한다. 이러한 개념의 뒷받침으로, 히루딘은 FPA의 수준을 감소시키지만, 불안정형 협심증이 있는 환자에서 F1.2 수준에 대한 효과는 없다[참조: Granger, C.B., et al. (1995) Circulation 91:1929-1935].
섬유소-결합된 트롬빈 및 혈소판-결합된 인자 Xa는 둘다 혈전의 강한 응혈촉진 활성에 기여한다는 증거가 설정되고 있다. 따라서, 세척된 혈장 응괴가 항응고되지 않는 전혈 중에 항온배양되는 경우, 응고를 촉진하는 능력은 히루딘 또는 진드기 항응고제 펩타이드(TAP), 헤파린 및 LMWH과 달리 혈소판-결합된 인자 Xa 뿐만 아니라 유리 인자 Xa를 불활성화시키는 인자 Xa의 직접 억제제에 의해 차단하지 못한다[참조: Waxman, L., et al. (1990) Science 248:593-596]. 대조적으로, 히루딘 및 TAP의 배합물은 혈장 혈변의 응혈촉진 활성을 없애며, 이는 급성 동맥 혈전의 진정이 섬유소-결합된 트롬빈을 억제할 뿐만 아니라 혈소판-결합된 인자 Xa에의해 유발된 트롬빈 생성을 차단하는 제제를 필요로 함을 암시한다. 이들 제제의 개발은 섬유소-결합된 IIa 및 혈소판-결합된 인자 Xa가 헤파린, LMWH 및 히루딘에 의한 불활성화로부터 보호되는 메커니즘의 이해를 필요로 한다.
1.3 섬유소-결합된 트롬빈이 헤파린에 의한 불활성화로부터 보호되는 메커니즘
연구에 의하면 섬유소에 결합되는 트롬빈이 헤파린의 부재하에보다 헤파린의 존재하에 더욱 복잡하며, 트롬빈/섬유소 상호작용의 결과는 본원에서 더욱 잘 개략된다.
1.3.1 헤파린의 부재하의 트롬빈/섬유소 상호작용
헤파린의 부재하에, α-트롬빈은 섬유소에 Kd = 2μM로 결합된다. 결합은 외부 부위 1, 트롬빈 위의 기질-결합 부위에 의해 매개되는데[참조: Fenton, J.W. II, et al. (1988) Biochemistry 27:7106-7112], γ-트롬빈(외부 부위 1이 분리된 트롬빈의 분해된 형태) 및 퀵 1 디스트롬빈(Cys에 의해 대체된 외부 부위 1내 Arg 67과의 천연 트롬빈 돌연변이체)은 결합되지 못하는 반면, RA-트롬빈(Arg 잔기 93, 97 및 101이 Ala에 의해 치환되기 때문에 헤파린에 대한 친화도가 감소된 외부 부위 2 돌연변이체[참조: Ye, J., et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:17965-17970])는 α-트롬빈과 유사한 친화도로 섬유소에 결합된다.
1.3.2 헤파린의 존재하의 트롬빈/섬유소 상호작용
헤파린이 존재하는 경우, 섬유소에 결합된 트롬빈의 양은 섬유소와의 트롬빈 상호작용의 방식이 변하는 대로 변화한다. 250nM 이하의 헤파린 농도에서, 섬유소에 결합되는 트롬빈의 양은 섬유소에 대한 트롬빈의 겉보기 친화도가 일어나는 대로(도 1B) 증가한다(도 1A); 그러나 높은 헤파린 농도에서, 트롬빈 결합(도 1A) 및 섬유소에 대한 트롬빈의 친화도는 점차로 감소한다(도 1B). 이들 데이터는 고정된 농도의 헤파린을 사용하여 섬유소에 대해 증강된 트롬빈 결합을 입증하는 호그(Hogg) 및 잭슨(Jackson)의 결과를 확대시킨다[참조: Hogg, P.J., et al., J. Biol. Chem. 265:241-247 (1990)].
트롬빈 결합의 방식은 또한 헤파린의 존재하에 변화한다. 트롬빈은 섬유소에 외부 부위 1을 통해 헤파린의 부재하에 결합되는 한편, 헤파린의 존재하에 관찰된 증강된 α-트롬빈 결합은 외부 부위 2에 의해 매개되는데, 이는 헤파린이 γ-트롬빈의 결합을 α-트롬빈과 동일한 정도로 증대시키지만, RA-트롬빈의 결합에 대한 효과는 거의 없기 때문이다(도 2). 또한, 헤파린의 존재하에 결합된 과량의 α-트롬빈은 외부 부위 2에 대한 항체에 의해 또는 헤파린과 마찬가지로, 외부 부위 2에 또한 결합되는 프로트롬빈 단편 2(F2)에 의해 대체된다[참조: Arni, R.K., et al. (1993) Biochemistry 32:4727-4737]. 반대로, 히루겐, 히루딘의 C-종말의 합성 동족체[참조: Maraganore, J., et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:8692-8698]는 트롬빈의 헤파린-의존성 결합에 대한 효과가 없다(도 3).
이러한 결과는 삼원 섬유소-트롬빈-헤파린 복합체 형성을 지시하는 것으로 해석되며, 여기에서 트롬빈은 섬유소에 외부 부위 1을 통해 직접 결합되고, 헤파린은 섬유소 및 트롬빈 상의 외부 부위 2에 결합된다(도 4). 이는 섬유소에 대한 헤파린의 친화도(Kd = 180nM)이 α-트롬빈에 대한 이의 친화도(Kd = 120nM)과 유사하기 때문에 일어난다. 섬유소와 헤파린의 상호작용은 오당류-의존성인데, 안티트롬빈에 대한 친화도가 낮은 헤파린 쇄가 고 친화도 쇄만큼 긴밀하게 결합되기 때문이다. 트롬빈 결합에 대한 헤파린의 이상 효과(도 1)는 삼원 복합체 형성의 개념을 지지한다. 따라서, 헤파린은 섬유소에 대한 트롬빈 결합을, 헤파린 결합 부위가 포화될 때까지 촉진한다. 높은 헤파린 농도를 사용하면, 트롬빈 결합은, 비생산성 이원 섬유소-헤파린 및 트롬빈-헤파린 복합체가 형성되면서 감소한다.
1.3.3 트롬빈/섬유소 상호작용의 결과
삼원 섬유소-트롬빈-헤파린 복합체내의 트롬빈은 안티트롬빈 및 헤파린 보조인자 II(HCII) 둘다에 의한 불활성화로부터 보호된다. HCII는 트롬빈의 2차 억제제로서 사용되는 혈장에서 발견되는 천연 안티트롬빈이다. 따라서, 안티트롬빈 또는 HCII에 의한 트롬빈 불활성화의 헤파린-촉매화 속도는 섬유소 단량체의 존재하에 감소한다(도 5). 광범위한 범위의 헤파린 농도에 대해, 섬유소 단량체의 포화량의 존재하에 안티트롬빈 및 HCII에 의한 불활성화의 속도는 이의 부재하에서보다 각각 60배 및 250배까지 느리다(도 6A 및 6B). 발생에 대해 보호하기 위해서, 외부 부위는 둘다 점유되어야 한다: 섬유소에 의한 외부 부위 1 및 헤파린에 의한 외부 부위 2. 따라서, 헤파린이 섬유소에 대한 γ-트롬빈 및 퀵 1 디스트롬빈의 결합을, 이의 긴밀한 외부 부위 2에 결합시키고 이를 섬유소에 브릿징시킴으로써 증강시킨다해도, 어떠한 것도 불활성화로부터 보호되지 않는데, 이의 변경된 외부 부위 1이 섬유소와 상호작용하지 못하기 때문이다(도 7). RA-트롬빈은 불활성화에 민감한데, 이는 α-트롬빈과 유사한 친화도로 섬유소에 결합된다해도, 이는 외부 부위 2에서의 돌연변이에 기인하여 헤파린에 대한 친화도를 감소시키기 때문이다(도 7).
1.3.4 삼원 섬유소-트롬빈-헤파린 복합체내의 트롬빈이 활성 부위에서 알로스테릭(allosteric) 변화한다는 증거
삼원 복합체 형성에 의해 유도된 트롬빈의 활성 부위에서 알로스테릭 변화는 마찬가지로 기질 또는 억제제와의 트롬빈 반응성을 감소시킨다. 이러한 개념의 원조로, 합성 기질의 트롬빈-매개된 분해 속도는, IIa가 삼원 섬유소-트롬빈-헤파린 복합체내에 결합되는 경우에 증가하지만, 이원 트롬빈-헤파린 또는 트롬빈-섬유소 복합체로는 그렇지 않음을 밝혀냈다(도 8).
실시예 2
2.0 중간 분자량의 헤파린의 개발
트롬빈 억제를 촉매화시키기 위해서, 헤파린은 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시킨다[참조: Danielsson, A., et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:15467-15473]. 이러한 브릿징 기능의 제공은 5,400의 최소 분자량을 갖는 헤파린 쇄를 필요로 한다[참조: Jordan, R.E., et al. (1980) J. Biol. Chem. 225:10081-10090]. LMWH분자는 대부분 < 5,400Dalton이므로, LMWH은 트롬빈에 대한 억제 활성이 거의 없다[참조: Jordan, R.E., et al. (1980) J. Biol. Chem. 225:10081-10090]. 헤파린은 트롬빈을 섬유소에 브릿징시켜 삼원 섬유소-트롬빈-헤파린 복합체를 형성하므로, 이러한 기능은 또한 최소 분자량의 헤파린 쇄를 요구함을 가정한다. 또한, 이러한 최소 분자량이 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키는 데에 필요한 것과 상이한 경우, 헤파린 쇄가 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 너무 짧지만, 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖고, 이에 의해 헤파린 내성의 중요한 메커니즘을 극복하는 창구가 존재할 수 있음을 가정한다.
이제 이러한 창구가 존재함이 밝혀졌다. 예를 들어, 본 발명의 MMWH 조성물은 안티트롬빈에 의해 트롬빈 억제를 촉매화시키기에 충분히 길지만, 섬유소에 대한 트롬빈 결합을 촉진하지 않는다(도 9). 따라서 헤파린과 대조적으로, 안티트롬빈 또는 HCII에 의한 MMWH-촉매화 트롬빈 억제 속도는 섬유소의 존재하에 섬유소의 부재하와 거의 동일하다(도 10).
2.1 중간 분자량의 헤파린의 특성
MMWH의 쇄는 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 가지므로, 항-인자 IIa 활성(즉, IIa 인자(트롬빈) 억제를 안티트롬빈에 의해 촉매화시키거나 활성화시키는 MMWH의 능력)은 이의 항-인자 Xa 활성(즉, 인자 Xa 억제를 안티트롬빈에 의해 촉매화시키는 능력)과 동일하다. 반대로, LMWH는 항-인자 IIa 활성보다 큰 항-인자 Xa 활성을 갖는데, LMWH 쇄의 반 이상이 안티트롬빈을 트롬빈에브릿징시키기에 너무 짧기 때문이다. 비분획화 헤파린은 또한 동일한 항-인자 Xa 및 항-인자 IIa 활성을 갖지만, 비분획화 헤파린의 쇄가 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 뿐만 아니라 트롬빈을 섬유소에 브릿징시키기에 충분히 길기 때문에 트롬빈 불활성화를 섬유소의 존재하에 촉매화시키지 못한다는 점에서 본 발명의 MMWH 조성물과는 상이하다.
이의 일반적 구조에서, 본 발명의 MMWH 조성물의 특정 활성은 비분획화 헤파린과 유사하다. 따라서, 이의 항-인자 Xa 및 항-인자 IIa 활성은 각각 90 내지 150U/mg 및 40 내지 100U/mg의 범위일 수 있다. LMWH는 일반적으로 100U/mg의 특정 항-인자 Xa 활성을 갖는 한편, 이의 항-인자 IIa 활성은 특정 LMWH 제제의 분자량 프로필에 따라서 20 내지 50U/mg의 범위이다.
실시예 3
본 발명의 MMWH 조성물과 다른 공지된 항응고제의 효능 및 안전성의 비교
본 실시예는 본 발명의 MMWH 조성물의 효능 및 안전성을 비교하는 연구를 예시하며, 이는 도면에서 래빗 동맥 혈전증 예방 모델에서 V21, LMWH, 헤파린 및 히루딘으로서 표시된다. 결과는 본 발명의 MMWH 조성물이 LMWH 및 헤파린보다 효과적이며 히루딘보다 안전함을 나타낸다. 동맥 혈전증 예방 모델을 변형시켜 효능 및 안전성이 둘다 동일한 동물에서 검정될 수 있도록 한다. 효능은 손상된 래빗 대동맥에서 95% 협착증이 되는 90분간의 원위에 걸친 유량을 측정하여 검정하고, 안전성은 래빗 귀 모델을 사용하여 30분에 걸친 혈액 손실을 측정하여 검정한다.4개의 화합물을 세가지 투여량 수준에서 비교한다. 각 화합물을 거환 및 주입으로 90분동안 투여한다. 다음 도면에서 기재된 투여량은 90분동안 투여된, 거환 및 주입/60분을 나타낸다. 헤파린에 대한 투여량은 U/Kg으로, LMWH 및 V21에 대해 mg/Kg으로 및 히루딘에 대해 mg/Kg으로 나타낸다. V21은 LMWH에 유사한 항-Xa 활성을 갖고, LMWH의 항-IIa 활성의 약 2배를 갖는다. 따라서, LMWH의 특정 활성은 100 항-Xa U/mg 및 30 항-IIa U/mg이다. V21의 특정 활성은 100 항-Xa U/mg 및 60 항-IIa U/mg인 한편, 헤파린의 특정 활성은 약 150 항-Xa U/mg 및 150 항-IIa U/mg이다. 항응고제는 다음 투여량으로 비교한다. 헤파린 50 U/Kg 및 75 U/Kg; LMWH 및 V21 0.5, 1.0 및 1.5mg/Kg; 히루딘 0.1/0.1, 0.1/0.2 및 0.1/0.3mg/Kg.
비교하기 위해서, 헤파린 50단위는 항-Xa 활성에 있어서 0.5mg의 LMWH 또는 V21과 동일하지만, 0.5mg의 V21의 항-IIa 활성의 2배 이상 및 LMWH의 항-IIa 활성의 약 4배이다. 동일한 항-Xa 활성에 대해서, V21은 LMWH의 항-IIa 활성의 약 2배 이다.
이러한 연구 동안에 수득된 결과는 도 11, 12 및 13에 기재되어 있다. 도 11은 대동맥이 효능의 결과 측정으로서 관찰의 90분에 걸쳐 개방된 채로 유지되는 누적 시간을 사용하여 4가지 항응고제의 효능을 비교한다. 100% 누적 개방성은 완전 개방성을 반영하고, 0% 누적 개방성은 즉시 및 유지된 혈전증 폐색을 반영한다. 협착된 대동맥은 즉시 응괴를 형성하고 저 투여량 헤파린(50/50 U/Kg) 및 저 투여량 LMWH(0.5/0.5mg/Kg)로 처리된 래빗에서 대조군 동물에서 전체 90분동안 폐색된 채로 유지된다. 모든 4가지 항응고제를 사용하는 투여량 반응이 있다. 그러나모델은 헤파린 및 LMWH의 안티트롬빈 효과에 대한 내성이 있다. 따라서, 75/75 U/Kg 투여량의 헤파린 및 1.0mg/1.0mg/Kg 투여량의 LMWH은 둘다 무효하며(각각 14% 및 2%의 누적 개방성(%), LMWH 1.5/1.5mg/Kg은 제한된 유효성만 나타낸다(38% 누적 개방성). 반대로, 모델은 V21 및 히루딘의 항혈전증 효과에 매우 반응성이다. 따라서, 0.5/0.5mg/Kg 투여량의 V21은 75/75 U/Kg 투여량의 헤파린보다 유효하며 1.0/1.0mg/Kg 투여량의 LMWH보다 유효하다. 따라서, V21은 LMWH보다 3배 이상 유효하다.
도 12는 30분 혈액 손실에 대한 4가지 항응고제의 효과를 도시한다. 투여량 반응은 LMWH, V21 및 히루딘을 사용하여 관찰한다. 더욱 큰 효능을 나타내는 투여량에서, V21은 LMWH보다 훨씬 더 안전하며, 동일한 효능을 나타내는 투여량에서, V21은 히루딘보다 안전하다. V21은 또한, 동일한 정도의 혈액 손실을 초래하는 투여량에서 헤파린보다 훨씬 더 유효하다.
V21 및 LMWH의 비교 안전성 및 효능은 도 13에 도시되어 있다. 데이터(즉, 각 그룹에서 세가지 동물)를 근거로 하여, V21은 중량을 기준으로 LMWH보다 약 4배 더 유효한 것으로 나타난다. 따라서, 항-Xa 활성에 대해서, V21은 LMWH보다 4배 더 유효하며, 동일한 항-IIa 활성에 대해서, V21은 약 2배 유효하다. 이러한 데이터는 혈전 생성의 촉진에서 섬유소-결합된 트롬빈의 중요성을 지지하는데, V21이 LMWH 또는 헤파린보다 섬유소-결합된 트롬빈에 대해 더 유효하기 때문이다. 0.5mg/Kg 및 1.0mg/Kg의 투여량에서, V21은 LMWH(이는 훨씬 더 유효하지만)만큼 안전한 것으로 나타나지만, 1.5mg/Kg의 투여량에서, LMWH은 V21보다 훨씬 더 많은 출혈을 생성한다. 따라서, V21은 LMWH보다 안전성 프로필에 더욱 유리한 효능을 갖는 것으로 나타난다.
실시예 4
본 발명의 MMWH 조성물(V21)을 LMWH와 비교하는 연구
V21(로트 # D32)의 효능은 래빗의 헤파린-민감성 및 헤파린-내성 혈전증 모델 둘다로 LMWH(에녹사파린)과 비교하였다. 헤파린-민감성 모델은 정맥 혈전증 예방 모델이며, 헤파린-내성 모델은 정맥 혈전증 치료 모델이다. V21 및 LMWH은 항-인자 Xa 수준 및 APTT에 대해 유사한 탈체 효과를 갖는다(도 14 및 15). 따라서, 두가지 항응고제는 중량을 기준으로 비교한다:
1.1 예방 모델
a. 방법: 3 내지 4 kg로 칭량되는 27마리의 수컷 뉴질랜드 화이트 래빗을 3개의 처리 그룹으로 무작위화시킨다.
b. 마취: 마취는 근육내 케타민(50mg/Kg) 및 크실라진(2mg/Kg)의 혼합물로 유도하고, 이소플루란(1-3%) 및 산소(1L/분)에 의해 유지시킨다.
c. 수술 과정: 복측 경부 영역을 면도질하고 두개의 22 게이지 카테터(Becton-Dickinson, Sandy, UT)를 좌측 중심 심이 동맥 및 주변 심이 정맥으로 삽입하여 혈액 샘플을 채취하고, 치료제를 정맥내 투여한다. 우측 안면 및 외부 경정맥을 복측 경부 피부 절개를 통해 노출시킨다. 경정맥의 2cm 분절을 주위 조직으로부터 분리시키고, 측면 가지를 4-0 실크 봉합을 사용하여 연결시킨다. 이때에 대조군 동맥 혈액 샘플을 수집한다(0.2ml의 3.6% 시트르산나트륨으로 1.8ml의 혈액). 혈액 샘플을 회전시키고 혈장은 -70℃에서 혈액 응고 연구를 위해 저장한다(APTT, TCT 및 항-Xa). I-125 표지된 래빗 피브리노겐을 정맥내 거환(10μL, ~1,000,000.00 CPM) 투여한다. 이후에, 래빗은 다음 정맥내 처리 중의 하나로 랜덤화시킨다:
1. 1ml의 염수의 염수(n=9) 정맥내 거환,
2. 0.50mg/kg(n3), 1.00mg/kg(n3), 1.5mg/kg(n=3)의 투여량의 저분자량 헤파린(n=9)(Lovenox, 에녹사파린 나트륨, lot # 923, Rhone-Poulenc Rorer, Montreal, Quebec, Canada),
3. 0.50mg/Kg(n=3), 1.00mg/Kg(n=3) 및 1.5mg/Kg(n=3) 투여량의 V-21(n=9)(D-32, lot # 521982132).
치료 투여한 지 4분 후에 우측 경정맥은 팽창된 벌룬 카테터(#4, Fogarty 혈전절제술 카테터)의 15회 통과에 의해 2cm 길이로 손상된다. 벌룬 카테터는 우측 안면 정맥을 통해 우측 경정맥으로 도입한다. 벌룬 정맥 손상 직후, 카테터를 회수하고 제2 동맥 혈액 샘플을 취한다. 또한, 혈액 1ml를 또한 수집하여 방사능을 측정한다. 다음에, 지혈은 정맥 주위에 두개의 지혈대를 배치함으로써 2cm 우측 경정맥 분절내에서 유도된다. 폐쇄된 지 15분 후에 경정맥 분절을 절개하고 미리 칭량된 정방형 위로 개방하고 칭량한다. 이후에, 제3 동맥 혈액 샘플을 수집하여 혈액 응고 검정 분석한다.
d. 종말점: 응괴 중량(%)은 정맥 분절에 트랩핑된 혈액의 중량%로서 계산한다. 응괴 방사능(%)은 1ml의 전혈 방사능의 백분율로서 계산한다. 혈장 샘플은 APTT, TCT 및 항-Xa에 대해 분석한다.
과정의 개략적 도표가 첨부된 도 16에 도시되어 있다.
e. 결과: 도 16, 17 및 18에 (응괴 중량에 대해) 및 도 19, 20 및 21에 (응괴 방사능에 대해) 도시된 바와 같이, 제제는 둘다 이러한 헤파린-민감성 모델에서 유효하지만, V21은 두가지 높은 투여량에서 LMWH보다 가파른 투여량 반응을 생성하고 유효하다.
1.2 래빗 모델에서 심정맥 혈전증의 치료
a. 24시간 추적 검사
본 연구의 목적은 심정맥 혈전증의 래빗 모델에서 피하 투여된 V-21 및 LMWH의 효능을 비교하는 것이다.
특정 병원체가 없는 24마리의 뉴질랜드 화이트 수컷 래빗(체중 3 내지 4kg)를 케타민(50mg/Kg) 및 크실라진(2mg/Kg)을 근육내 주사하여 마취시킨다. 복측 경부 영역을 면도질하고 알콜 및 요오드 용액으로 준비한다. 정맥 및 동맥 카테터를 좌측 중심 심이 동맥 및 주변 심이 정맥으로 22 게이지 카테터(Anglocath, Becton Dickinson, Vascular Access, Sandy, Utah, USA)를 삽입하여 혈액 샘플을 수집하고, 유체 및 항응고제를 정맥내 투여한다. 래빗을 수술실로 옮기고, 안면 마스크에 의해 전달되는, 이소플루란(1-4%), 산소(1L/분) 및 아산화질소(0.5L/분)의 혼합물로 이루어진 흡입 마취로 유지시킨다.
b. 응괴 형성: 우측 외부 경정맥 및 안면 경정맥을 복측 경부 피부 절개를 통해 노출시킨다. 안면 정맥의 분절 폐쇄는 0.5cm 떨어진 두개의 No 4-0 실크 봉합에 의해 달성한다. 경정맥의 모든 측면 가지를 4cm 길이로 연결시킨다. Fogerty 혈전절제술 카테터(#4 Fr)를 안면 정맥을 통해 경정맥으로 도입하고 팽창시킨다. 4cm의 경정맥은 팽창된 벌룬 카테터의 15회 통과에 의해 손상되고, 다음에, 카테터를 회수한다. 1.5cm의 폐쇄된 경정맥 분절을 손상된 정맥 주위에 배치된 두개의 4-0 실크 봉합을 사용하여 생성시킨 후, 손가락 압축을 사용하여 비운다. 1ml의 동맥 혈액을 중심 경부 동맥으로부터 1ml 주사기로 배출시키고, 멸균 튜브에서 약 1μCi의 요오드-125 표지된 래빗 피브리노겐을 사용하여 혼합한다. 다음에, 0.6ml의 방사능 표지된 혈액을 튜브로부터 1ml 주사기로 배출시키고, 먼저 0.4ml의 표지된 혈액을 두개의 튜브로 동일하게 분리하고 응괴가 형성되도록 방치한다. 다음에, 남아 있는 0.2ml를 자가제 캐뉼러(PB #60에 연결된 23 게이지 바늘)를 통해 폐쇄된 경정맥으로 주사한다. 시험 튜브에서 생성된 응괴는 응괴 중량 및 방사능에 대해 기준 값으로 사용된다. 실험 연구는 튜브에서 및 경정맥에서 생성된 응괴 사이에 응괴 중량 또는 방사능에 있어서 약 5% 차이가 있음을 나타낸다. 경정맥에서 생성된 혈전은 30분동안 화농되도록 방치하며, 안면 정맥은 연결시킨다. 혈전 화농 25분후 래빗은 다음을 수용하도록 무작위화시킨다:
1) 염수 처리(n=4) 1ml의 멸균 염수 BID sc;
2) 1mg/Kg BID, sc(n=4) 및 3mg/Kg BID sc(n=4) 투여량의 저분자량 헤파린(에녹사파린 나트륨, Lovenox lot #923, Rhone-Poulenc Rorer, Montreal, Quibec);및
3) 1mg/Kg BID sc(n=4) 및 3mg/Kg BID sc(n=4) 투여량의 V-21(D-32, lot #521982132).
제1 투여량의 30%는 정맥내 및 70%는 피하 투여하고; 제2 투여량은 피하로만 투여한다. 30분에 지혈대를 제거하기 직전에, 혈전을 정맥 벽에 두개의 실크 봉합에 의해 고정시켜 수술 후 기간 중에 이의 이행을 방지한다. 지혈대 제거 후에 좌측에서 경정맥의 잔류 협착은 없다. 경부 절개부를 통상적인 방법으로 폐쇄한다. 래빗이 100% 산소 호흡을 회복하도록 한 다음에, 회복실로 옮긴다. 래빗은 모두 24시간 간격으로 안락사시킨다.
c. 혈액 수집: 동맥 혈액은 수술 전에(대조군) 및 응괴 화농된 지 5분, 1, 3, 6, 9, 12 및 24시간 후에 수집한다. 각 시간 간격에 2ml의 시트르산화 혈액을 수집하여(9:1 비, 3.8% 시트르산나트륨) APTT, TCT 및 Xa 검정한다. 혈액 손실은 염수의 정맥내 투여에 의해 대치된다.
d. 종말점: mg의 혈전 중량(AG Balances #104, Mettler Toledo, Fisher Scientific Limited, Whitby, Ontario) 및 혈전 방사능(CPM)을 응괴 유도(튜브에서 생성된 응괴)시에 및 24시간에 사용하여 다음 종말점을 계산한다:
응괴 중량의 변화율(%)(PCCW)은 24시간 시점의 응괴 중량으로부터 시험관에서 수술시에 생성된 응괴 중량을 빼고 시험관에서 생성된 응괴 중량으로 나눈 후 100배 한 것을 사용하여 계산한다.
응괴 유착률(CA)(%)은 다음과 같이 계산된다: AC=PCCW-CL
e. 결과: 도 23 내지 28에 도시된 바와 같이, V21은 이러한 헤파린-내성 모델에서 LMWH보다 유효하다.
실시예 5
헤파린의 제한된 페리오데이트 산화/가수분해에 의한 본 발명의 MMWH 조성물의 제조
1.1 헤파린의 제한된 페리오데이트 산화/가수분해의 연구
헤파린을 중수소수에 용해시켜 10% 원액을 제조한다. 나트륨 페리오데이트를 중수소수에 용해시켜 100mM 원액을 제조하고 4℃에서 유지시킨다. 페리오데이트 산화 반응은 2.5% 헤파린 농도에서 나트륨 페리오데이트 농도를 1mM, 2.5mM, 5mM, 8mM, 10mM 및 20mM로 증가시키면서 실온에서 약 18시간동안 수행한다. 50mM에틸렌 글리콜을 첨가하고 3시간동안 배양시켜 반응을 중지시킨다. 다음에, 반응 혼합물을 0.25N NaOH로 만들고, 실온에서 3시간동안 배양시킨다. 반응 후에, pH를 6N HCl에 의해 pH 7로 조절한다. 각 반응 혼합물의 분취액을 HPLC-GPC(G2000 컬럼, 0.5ml/분, 주사 투여량 20μl)에 대해 수행하여 분자량을 분석한다. 5mM, 8mM, 10mM 및 20mM의 나트륨 페리오데이트 농도에서 반응물의 분자량 프로필은 헤파린에 비하여 나트륨 페리오데이트 농도가 증가하면서 감소한다. 결과는 목적하는 분해가 약 5mM 및 약 20mM 사이의 나트륨 페리오데이트 농도를 사용하여 실온에서 약 18시간동안 수행될 수 있음을 지시한다. 연구(기재되어 있지 않음)는 최상의 알칼리 가수분해는 0.25N NaOH를 사용하여 실온에서 3시간동안 수행될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 이 실험에서 사용된 반응 조건은 "제한된 페리오데이트/가수분해" 조건이라 한다.
1.2 제한된 페리오데이트 산화/가수분해에 의한 본 발명의 MMWH 조성물의 제조
100mg의 헤파린을 제한된 페리오데이트/가수분해 조건, 7mM 나트륨 페리오데이트를 사용하여 처리하고, P30 겔 투과 크로마토그래피에 의해 정제시킨다. 30mg의 최종 생성물, 즉 V21-D32를 수득하며, 이는 약 6,000 내지 약 12,000Dalton 범위의 분자량 및 약 9,000Dalton의 최대 분자량을 갖는다.
실시예 6
최적 분자량 범위를 갖는 MMWH 조성물을 선택하고, 이 범위내에서 헤파린 분획을 수득하기까지 용이하게 규모 확장시킬 수 있는 제조 방법을 확인하는 연구를 착수한다.
6,000 내지 10,000 사이의 분자량 범위가 최적 분자량 범위로서 선택된다. 20개의 당류 단위에 상응하는 최소 분자량 6,000을 갖는 조성물은 안티트롬빈을 트롬빈에 브릿징시키기에 충분히 긴 오당류-함유 쇄를 갖는 헤파린 쇄를 제공한다. 33개의 당류 단위에 상응하는 최대 분자량 10,000을 갖는 쇄는 (a) 트롬빈을 섬유소에 브릿징(40개 이상의 당류 단위의 쇄를 필요로 하는 현상)시키기에 너무 짧고, (b) 혈장 단백질에 비특이적 결합(30개 이상의 당류 단위의 쇄가 발생하는 현상)시키기에 너무 짧다.
헤파린 분획:
비분획화 헤파린을 헤파리나제, 아질산 또는 페리오데이트로 해중합시켜 약 6,000, 8,000 및 10,000 Da의 분획을 수득한다. 이들 세가지 방법에 의해 생성된 최초 분획은 다분산되는 한편, 이들 분자량의 더욱 크기-제한된 분획은 헤파리나제 또는 아질산 해중합을 사용하여 제조한다. 이들 분획의 특성은 표 1에 이의 특이적 항-Xa 및 항-IIa 활성과 함께 나타나 있다.
안티트롬빈에 대한 친화도
안티트롬빈에 대한 각 헤파린 분획의 친화도는 이전에 기술된 바와 같이 측정한다[참조: Weitz et al., Circulation 1999:99:682-689]. 간단히, 2ml의 20mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl(TBS) 중의 100mM 안티트롬빈을 함유하는 1 X 1cm 석영 큐빗을 200nm에서 여기시키고(6nm 슬릿 폭), 내부 형광을 340nm에서(6nm 슬릿 폭) Perkin-Elmer LS50B 발광 광도계를 사용하여 적시 구동시켜 계속해서 모니터한다. 큐빗의 내용물을 미량 교반 막대로 교반시키고 25℃에서 수욕을 재순환시키면서 유지시킨다. 고유 형광 강도는 5 내지 10ml의 다양한 헤파린 분획의 10mg/ml 용액을 첨가하기 전에(I O ) 및 후에(I) 측정한다. 적정은I에 변화가 없을 때까지 계속한다. 실험 후에,I값을 시간 구동 프로필로부터 판독하고,I/I O 값을 계산하고 헤파린 농도에 대해 플롯팅한다. 다음에, 데이터를 위에서 기술된 바와 같이분석한다(상기 Weitz 등). 이 분석으로부터, 각 헤파린 분획내에 오당류-함유 쇄의 비율을 나타내는 것으로 해석되는 화학양론을 수득할 수 있다.
친화도는 표 2에 요약되어 있다. 또한, 각 분획내의 오당류-함유 쇄의 대략적인 백분율이 나타나 있다. 헤파린 또는 아질산 해중합에 의해 제조된 분획은 안티트롬빈에 대해 유사한 친화도를 나타낸다. 페리오데이트 해중합에 의해 제조된 10,100 Da 분획은 안티트롬빈에 대해, 헤파리나제 또는 아질산-유도된 분획과 유사한 친화도를 나타내지만, 저분자량 페리오데이트-유도된 분획은 이의 감소된 항-IIa 및 항-Xa 활성과 일치하여 낮은 친화도를 갖는다(표 1). 예상할 수 있는 바와 같이, 해중합에 사용된 방법과 무관하게, 오당류-함유 쇄의 비율은 평균 분자량이 증가하면서 증가한다.
이들 분석에 대한 대조군으로서, 비분획화 헤파린, 친화도 크로마토그래피에 의해 안티트롬빈 컬럼을 사용하여 제조된 헤파린의 고 및 저 친화도 분획, 에녹사파린 및 합성 오당류가 또한 연구된다. 표 3에 나타난 바와 같이, 헤파린의 고 친화도 분획 및 합성 오당류는 안티트롬빈에 대해 최고 친화도를 나타낸다. 이들 두가지 제제만 100% 오당류-함유 쇄를 갖는다.
트롬빈에 대한 친화도:
트롬빈에 대한, 다분산된 헤파린, 아질산 및 페리오데이트-유도된 헤파린 분획의 친화도는 위에 기술된 바와 같이 측정하되, 단 트롬빈을 안티트롬빈 대신에 사용한다[참조: Fredenburgh, JC et al., J.Biol. Chem. 1997:272:25493-25499].표 4에 나타난 바와 같이, 친화도를 μg/ml로 표현하는 경우, 분획은 모두 트롬빈에 대해 유사한 친화도를 나타낸다.
섬유소 단량체의 부재하에 또는 이의 존재하에 안티트롬빈에 의한 트롬빈 억제의 헤파린-촉매화 속도
안티트롬빈에 의한 트롬빈 억제에 대한 2차 속도 상수는 다양한 헤파린 분획의 부재하에 또는 이의 존재하에 0 내지 600μg/ml 범위의 농도에서 측정한다. 안티트롬빈에 의한 트롬빈의 헤파린-촉매화 속도는 4μM 섬유소 단량체의 존재하에 또는 이의 부재하에 측정한다. 섬유소 단량체는 이전에 기술된 바와 같이 제조하고, 데이터는 다른 곳에 기술된 바와 같이 분석한다[참조: Becker DL et al. J.Biol. Chem. 1999:274:6226-6233].
안티트롬빈에 의한 트롬빈의 억제 속도에 대한 섬유소-단량체의 억제 효과가 헤파리나제(도 29), 아질산(도 30) 및 페리오데이트-유도된 헤파린 분획(도 31)과 함께 나타나 있다. 섬유소 단량체를 사용하는 기본 억제는 안티트롬빈에 의한 인자 Xa 불활성화의 헤파린-촉매화 속도에 대한 섬유소 단량체의 억제 효과를 측정함으로써 측정된 바와 같이 6배이다(도 32 및 33). 비분획화 헤파린을 사용하는 경우보다 헤파리나제 또는 아질산-유도된 헤파린 분획을 사용하는 안티트롬빈에 의한 트롬빈 불활성화의 속도가 덜 감소된다(도 31). 크기-제한된 헤파리나제-유도된 분획의 경우, 섬유소-단량체는 기본 이하로 억제된다.
안티트롬빈에 의한 인자 Xa의 헤파린-촉매화된 억제
안티트롬빈에 의한 인자 Xa 억제에 대한 2차 속도 상수는 다양한 헤파린 분획의 존재하에 또는 이의 부재하에 0 내지 1,500μg/ml 범위의 농도에서 다른 곳에 기술된 바와 같이 측정한다(상기 Becker 등). 헤파리나제, 아질산 및 페리오데이트-유도된 분획에 대한 결과는 도 34 내지 36에 도시되어 있다. 중량이 동일한 양으로 첨가되는 경우, 헤파린 분획은 모두 비분획화 헤파린보다 안티트롬빈에 의한 인자 Xa 억제의 촉매작용을 덜 일으킨다.
섬유소에 결합된 트롬빈의 증대
섬유소에 결합된 I125-표지된 트롬빈은 다양한 헤파린 분획의 부재하에 또는 이의 존재하에 위에서 기술된 바와 같이 0 내지 7,500nM 범위의 농도에서 측정한다(상기 Becker 등). 비분획화 헤파린은 이들 실험에서 대조군으로서 사용한다. 헤파리나제, 아질산 및 페리오데이트-유도된 헤파린 분획을 사용한 결과가 도 37 내지 39에 각각 도시되어 있다. 해중합의 방법과 무관하게, 10,000 Da 분획은 섬유소에 결합된 트롬빈을 저분자량 분획보다 큰 정도로 증대시킨다. 이는 더욱 크기-제한된 헤파리나제 또는 아질산-유도된 분획의 경우 가장 잘 설명된다(각각 도 40 및 41).
헤파린 분획의 항혈전 활성
체외 회로를 사용하여 헤파린 분획의 항혈전 활성을 비교한다. 위에서 기술된 바와 같이(상기 Weitz 등), 상이한 농도의 각 헤파린 분획을125I-표지된 사람 피브리노겐으로 첨가되고 37℃에서 수욕 중에 유지된 재석회화 사람 전혈에 첨가한다. 다음에, 연동 펌프를 사용하여 혈액을 40μ 혈액 필터로 재순환시킨다. 필터내의 혈액의 응고는 (a) 필터에 인접한 압력을 인라인 압력계를 사용하여 측정하고, (b) 연속 혈액 샘플을 저장소로부터 제거하고 잔류 방사능을 피브리노겐 소비의 지수로서 계수하여 검출한다. 출발 활성화 응고 시간을 또한 측정한다.
표 5에 나타난 바와 같이, 해중합 방법과 무관하게, 10,000 Da의 분획은 10μg/ml의 농도에서 유효하다. 따라서, 필터 개방성은 90분의 관찰 기간 동안에 유지되며, 피브리노겐 소비는 10% 미만이다. 10μg/ml의 농도에서, 헤파리나제-유도된 8,000 Da 분획이 유효하다. 6,000 Da 헤파리나제 분획은 14μg/ml에서 유효하다. 개방성은 14 또는 16μg/ml의 5,600 Da 아질산-유도된 분획을 사용하여 유지되지만, 피브리노겐 소비는 각각 33% 및 20%이다. 대조군으로서, 에녹사파린을 또한 평가한다. 이 약물은 10 또는 20μg/ml에서 무효하며, 여과는 각각 30분 및 35분에서 일어나지 않는다.
더욱 크기-제한된 헤파리나제 및 아질산-유도된 헤파린 분획의 항혈전 활성은 표 6에 나타나 있다. 모든 분획을 10μg/ml의 농도에서 대조군으로서 사용되는 에녹사파린 10μg/ml와 함께 시험한다. 5,300 Da 헤파리나제-유도된 분획 이외에, 모든 헤파린 분획은 > 90분동안 개방성을 유지하고 피브리노겐 소비를 < 10%로 감소시키는 데에 유효하다. 반대로, 에녹사파린은 무효하며, 여과가 30분에 일어나지 않고, 피브리노겐 소비는 73%이다. 더욱 크기-제한된 헤파리나제, 아질산-유도된 헤파린 및 페리오데이트 분획의 항혈전 활성은 표 7에 나타나 있다. 모든 분획을 10μg/ml의 농도에서 대조군으로서 사용되는 에녹사파린 10μg/ml와 함께 시험한다. 헤파리나제 및 아질산 유도체 분획은 아민화 개방성에 유효하다. 페리오데이트-유도된 분획 및 에녹사파린은 덜 유효하다.
상기 설명은 예시하려는 것이지 제한하려는 것은 아님을 이해해야 한다. 많은 양태가 당해 분야의 전문가에게 상기 설명을 해독시에 명백하다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 기재 내용을 참조하지 않고 결정하지만, 대신에 첨부된 청구의 범위를 참조하여, 이러한 청구의 범위에 권리가 부여된 등가물의 전체 범위를 따라 결정해야 한다. 특허원 및 공보를 포함하여, 모든 논문 및 문헌의 기술은 본원에서 참조로 이의 전체가 모든 목적에 인용된다.

Claims (34)

  1. 분자량 범위가 약 6,000 내지 약 12,000Dalton인 황산화 올리고당류의 혼합물을 포함하는, 중간 분자량의 헤파린(MMWH) 조성물.
  2. 제1항에 있어서, (1) 안티트롬빈을 촉매화시킴으로써 섬유소-결합된 트롬빈과 유체상 트롬빈을 억제하고, (2) 안티트롬빈에 의해 인자 Xa 불활성화를 촉매화시킴으로써 트롬빈 생성을 억제하는 MMWH 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 약 40 내지 약 100U/mg의 항-인자 IIa 활성과 약 90 내지 약 150U/mg의 항-인자 Xa 활성을 갖는 MMWH 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 약 60 내지 약 75U/mg의 항-인자 IIa 활성과 약 100 내지 약 125U/mg의 항-인자 Xa 활성을 갖는 MMWH 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 약 65U/mg의 항-인자 IIa 활성과 약 115U/mg의 항-인자 Xa 활성을 갖는 MMWH 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 분자량 범위가 약 8,000 내지 약 10,000Dalton인 황산화 올리고당류의 혼합물을 포함하는 MMWH 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 평균 분자량이 약 9,000인 MMWH 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 황산화 올리고당류의 31% 이상이 분자량이 약 7,800 이상인 MMWH 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 황산화 올리고당류의 25% 이상이 분자량이 약 10,000Dalton 이상인 MMWH 조성물.
  10. 다음 특성들 중의 하나 이상을 갖는, 헤파린으로부터 유도된 올리고당류의 혼합물을 포함하는 중간 분자량의 헤파린(MMWH) 조성물.
    (a) 시험관 내에서 안티트롬빈- 및 헤파린 보조인자 II(HCII)-관련 항응고 활성을 갖는다;
    (b) 올리고당류가 트롬빈을 섬유소에 브릿징(bridging)시키기에 너무 짧지만, 안티트롬빈 또는 HCII를 트롬빈에 브릿징시키기에 충분한 길이를 갖는다;
    (c) 하나 이상의 오당류 서열을 갖는 올리고당류를 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40% 이상 갖는다;
    (d) 분자량 범위가 약 6,000 내지 약 11,000; 7,000 내지 10,000; 7,500 내지 10,000; 7,800 내지 10,000; 7,800 내지 9,800; 또는 7,800 내지 9,600인 올리고당류가 풍부하다;
    (e) 올리고당류가 평균 분자량이 약 7,800 내지 10,000, 바람직하게는 7,800 내지 9,800, 더욱 바람직하게는 8,000 내지 9,800이다;
    (f) 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 이상의 올리고당류가 분자량이 6,000Dalton 이상, 바람직하게는 8,000Dalton 이상이다;
    (g) 다분산도가 1.1 내지 1.5, 바람직하게는 1.2 내지 1.4, 가장 바람직하게는 1.3이다;
    (h) 유사한 항-인자 Xa 및 항-인자 IIa 활성, 바람직하게는 약 2:1 내지 약 1:1, 더욱 바람직하게는 약 1.5:1 내지 약 1:1의 항-인자 Xa 활성 대 항-인자 IIa 활성의 비를 갖는다;
    (i) 항-인자 Xa 활성이 약 80 내지 약 155IU/mg, 바람직하게는 90 내지 약 130IU/mg, 더욱 바람직하게는 약 95 내지 약 120IU/mg, 가장 바람직하게는 100 내지 110IU/mg이다;
    (j) 항-인자 IIa 활성이 약 20 내지 약 150IU/mg, 바람직하게는 40 내지 약 100IU/mg, 더욱 바람직하게는 약 80 내지 약 100IU/mg, 가장 바람직하게는 약 90 내지 100IU/mg이다.
  11. 제10항에 있어서, (a), (b), (c) 및 (d); (a), (b), (c) 및 (e); (b), (c), (e) 및 (g); (b), (d), (c), (e) 및 (h); (b), (c), (d) 및 (g); (b), (e), (g), (i) 및 (j); (b), (e), (f), (g), (i) 및 (j); 또는 (a) 내지 (j)의 특성을 갖는 MMWH 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 분자량 범위가 7,800 내지 8,800, 바람직하게는 7,800 내지 8,600, 더욱 바람직하게는 7,800 내지 8,500, 가장 바람직하게는 8,000 내지 8,500인 올리고당류가 풍부한 MMWH 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 분자량 범위가 9,000 내지 10,000, 바람직하게는 9,200 내지 9,800, 더욱 바람직하게는 9,300 내지 9,600, 가장 바람직하게는 9,400 내지 9,600인 올리고당류가 풍부한 MMWH 조성물.
  14. 제10항에 있어서, 평균 분자량이 7,800 내지 8,800, 바람직하게는 7,800 내지 8,600, 더욱 바람직하게는 7,800 내지 8,500, 가장 바람직하게는 8,000 내지 8,500인 올리고당류를 포함하는 MMWH 조성물.
  15. 제10항에 있어서, 평균 분자량이 9,000 내지 10,000, 바람직하게는 9,200 내지 9,800, 더욱 바람직하게는 9,300 내지 9,600, 가장 바람직하게는 9,400 내지 9,600인 올리고당류를 포함하는 MMWH 조성물.
  16. 비분획화 헤파린의 헤파리나제 해중합 또는 아질산 해중합으로부터 유도된 제10항 내지 제15항 중의 어느 한 항에서 청구한 MMWH 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 중간 분자량의 헤파린(MMWH) 조성물의 약리학적으로 허용되는 투여량을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 혈전증 질환을 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 혈전증 질환이 동맥 혈전증, 관상 동맥 혈전증, 정맥 혈전증 또는 폐색전증인 방법.
  19. 제17항에 있어서, MMWH 조성물이 주사에 의해 투여되는 방법.
  20. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 중간 분자량의 헤파린(MMWH) 조성물의 약리학적으로 허용되는 투여량을 혈전증 발생 위험이 있는 환자에게 투여함을 특징으로 하여, 혈전증 발생 위험이 있는 환자의 혈전 형성을 예방하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 환자가 지혈을 방해하는 의학적 질환 때문에 혈전증이 발생할 위험이 증가되어 있는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 의학적 질환이 관상 동맥 질환 또는 아테롬성 경화증인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 환자가 의학적 과정 때문에 혈전증이 발생할 위험이 증가되어 있는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 의학적 과정이 심장 수술, 심폐 바이패스, 카테터법 또는 아테롬 절제술(atherectomy)인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 카테터법이 심카테터법인 방법.
  26. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 중간 분자량의 헤파린(MMWH) 조성물의 약리학적으로 허용되는 투여량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 환자의 혈전 형성을 억제하는 방법.
  27. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 MMWH 조성물과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 MMWH 조성물의 치료학적 유효량을 정형외과 수술을 받은 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 심정맥 혈전증을 치료하는 방법.
  29. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 MMWH 조성물의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 폐색전증을 예방하는 방법.
  30. 비분획화 헤파린에 제한된 페리오데이트 산화 반응을 적용하여 비분획화 헤파린의 이두론산만이 산화되도록 하는 단계(a),
    단계 (a)의 산화된 비분획화 헤파린을 알칼리 가수분해시키는 단계(b) 및
    분자량 범위가 약 8,000 내지 약 12,000Dalton인 황산화 올리고당류의 혼합물을 포함하는 MMWH 조성물을 회수하는 단계(c)를 포함하여, 중간 분자량의 헤파린(MMWH) 조성물을 제조하는 방법.
  31. 혈전증 질환 치료용 또는 혈전증 발생 위험이 있는 환자의 혈전 형성 예방용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 MMWH 조성물의 용도.
  32. 환자의 섬유소-결합된 트롬빈 및 트롬빈 생성 억제용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 MMWH 조성물의 용도.
  33. 심정맥 혈전증 치료용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 MMWH 조성물의 용도.
  34. 환자의 폐색전증 예방용 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에서 청구한 MMWH 조성물의 용도.
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