CN1371391A - 抑制凝血相关凝血因子的肝素成分 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗心血管疾病的成分和方法。更具体地说,本发明涉及通过施用特别是能够(1)通过催化抗凝血酶灭活液相凝血酶和或者与凝块中的血纤蛋白结合或者与一些其它表面结合的凝血酶;和(2)通过抗凝血酶III(ATIII)催化因子Xa灭活作用抑制凝血酶产生的物质来改变血栓形成。本发明的成分和方法特别用于预防贲门旁路器循环中和接受肾透析的患者中血栓形成,和用于治疗患有与血栓相关的心血管疾病或者有患与血栓相关的心血管疾病危险的患者,所述与血栓相关的心血管疾病例如不稳定性咽峡炎,急性心肌梗塞(心脏病发作),脑血管意外(中风),肺栓塞,深静脉血栓形成,动脉血栓形成等。

Description

抑制凝血相关凝血因子的肝素成分
发明领域
本发明一般涉及用于治疗心血管疾病的组合物和方法。更具体地说，本发明涉及通过施用特别是能够(1)通过催化抗凝血酶灭活液相凝血酶和或者与凝块中的血纤蛋白结合或者与一些其它表面结合的凝血酶；和(2)通过抗凝血酶III(ATIII)催化因子Xa灭活作用抑制凝血酶产生的中等分子量肝素(MMWH)成分来改变血栓形成和生长。另外，本发明提供了用于治疗心血管疾病的方法和组合物。
发明背景
肝素通过结合抗凝血酶和大大提高其抑制激活的因子X(因子Xa)和凝血酶的比例而作为抗凝剂。肝素与抗凝血酶的相互作用是通过随机分布在大约三分之一的肝素链上的独特的五糖序列介导的。为了通过抗凝血酶催化凝血酶抑制作用，肝素必须同时结合酶和抑制剂。前提是该桥接功能需要最小分子量为5,400道尔顿的含五糖的肝素链。甚至即使五糖位于肝素链的中间而不是两端的任一端，这种最小尺寸的肝素链也可能是长度不足以桥接凝血酶和抗凝血酶。相反，较长的含五糖的肝素链不管五糖在肝素链中的位置在哪里都能提供该桥接功能。
和肝素一样，低分子量肝素(LMWH)通过激活抗凝血酶还起到抗凝剂的作用。但是在平均分子量是大约4500-5000道尔顿时，大多数LMWH链太短不能桥接凝血酶和抗凝血酶。结果，与肝素相比，LMWH抗凝血酶的抑制活性小得多。
尽管肝素是液相凝血酶的有效抑制剂，但是其局限性在于其灭活与血纤蛋白结合的凝血酶例如凝块-结合的凝血酶的能力。与血纤蛋白结合的凝血酶对通过肝素-抗凝血酶复合物的灭活的抗性反映出肝素桥接凝血酶和血纤蛋白形成三元血纤蛋白-凝血酶-肝素复合物的事实。该三元复合物的形成将凝血酶对血纤蛋白的亲和力提高了20倍(从Kd是3μM提高到Kd是150nM)。通过占据凝血酶上肝素结合位点，连接凝血酶和血纤蛋白的肝素链防止肝素-抗凝血酶复合物中的肝素桥接抗凝血酶和血纤蛋白-结合的凝血酶。这解释了为什么血纤蛋白-结合的凝血酶受到保护不被肝素-抗凝血酶复合物灭活。
此外，平均分子量是4,500至5,000道尔顿下，大多数LMWH链太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白。但是，因为大多数LMWH链也太短不能桥接凝血酶和抗凝血酶，所以LMWH是液相和血纤蛋白-结合的凝血酶两者的不好的抑制剂。
从上述来看，本领域还有对于用于例如抑制与血栓形成相关的心血管疾病的改进的肝素成分的需要。所有的理想肝素成分都是通过灭活血纤蛋白-结合的凝血酶和通过阻断凝血酶产生，从而防止一旦停止治疗而出现的凝固作用再次激活，来平定血液凝固的那些肝素成分。更特别地，理想的肝素成分应该是其中肝素链太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白，但是有足够的长度桥接抗凝血酶和凝血酶。本发明满足这些和其它需要。
发明概述
本发明提供了包括肝素链太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白，但是有足够的长度桥接抗凝血酶和凝血酶的肝素链的中等分子量肝素(MMWH)成分。只有大于12,000道尔顿的肝素链对于凝血酶和血纤蛋白的桥接是有效的。因此，提供该桥接功能需要的肝素的最小分子量比桥接抗凝血酶和凝血酶需要的肝素的分子量大得多。因为如此，设计本发明的MMWH成分符合该要求。分子量范围是大约6000至大约12000道尔顿下，本发明的MMWH成分由肝素链或太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白的寡糖硫酸酯组成。但是，具体选择6000道尔顿的下限以保证MMWH成分的所有的肝素链都足够长来桥接抗凝血酶和凝血酶而不管五糖序列位于肝素链的哪里。因为这些原因，和肝素不一样，本发明的MMWH成分同样好地抑制血纤蛋白-结合的凝血酶和液相凝血酶。
本发明的MMWH成分通过灭活血纤蛋白-结合的凝血酶能平定血栓(例如，可互换地，凝块)从而防止一旦中止治疗，凝固再次激活，并且通过抑制因子Xa能阻断凝血酶产生。因为如此，本发明提供了使用MMWH成分治疗心血管疾病的方法。正如上文所解释的，本发明的MMWH成分是一般具有大约6,000道尔顿至大约12,000道尔顿，甚至更优选大约8,000道尔顿至大约10,000道尔顿分子量范围的寡糖硫酸酯的混合物。在优选的实施方案中，本发明的MMWH成分具有大约9,000道尔顿的平均分子量。在一个实施方案中，至少31％的MMWH成分具有大于或等于7,800道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，至少25％的MMWH成分具有大于或等于10,000道尔顿的分子量。从标准的或者未分级的肝素能容易地制备这样的MMWH成分。
此外，本发明的MMWH成分一般具有类似的抗因子Xa和抗因子IIa活性。在优选的实施方案中，抗-因子Xa和抗-因子IIa活性之比范围是大约2∶1至大约1∶1，更优选地，大约1.5∶1至大约1∶1。相反，LMWH，例如，具有比抗-因子IIa活性明显高的抗-因子Xa活性。在优选的实施方案中，本发明的MMWH成分的抗-因子Xa活性范围是大约80U/毫克至大约155U/毫克，优选90U/毫克至大约150U/毫克，更优选地，大约100U/毫克至大约125U/毫克。在更优选的实施方案中，本发明的MMWH成分具有大约115U/毫克的抗-因子Xa活性。在优选的实施方案中，本发明的MMWH成分抗因子IIa活性范围一般是大约20U/毫克至大约150U/毫克，优选40U/毫克至大约100U/毫克，更优选大约60U/毫克至大约75U/毫克。在更优选的实施方案中，本发明的MMWH成分具有大约65U/毫克抗因子IIa活性。
如上所述，本发明的MMWH成分包括太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白，但是有足够的长度桥接抗凝血酶和凝血酶的肝素链。结果，和肝素不一样，本发明的MMWH成分灭活血纤蛋白-结合的凝血酶和游离的凝血酶。此外，尽管大多数低分子量肝素(LMWH)链不具有足够的长度桥接凝血酶和血纤蛋白，但是它们也太短不能桥接抗凝血酶和凝血酶。结果，本发明的MMWH成分在灭活血纤蛋白-结合的凝血酶方面比LMWH好得多。另外，尽管水蛭素能灭活血纤蛋白-结合的凝血酶，但是因为其是凝血酶的选择性抑制剂而对凝血酶产生没有作用。结果，与水蛭素相反，本发明的MMWH成分通过抗凝血酶催化因子Xa灭活抑制凝血酶产生。因此，通过阻断凝血酶产生以及通过抑制血纤蛋白-结合的凝血酶，本发明的MMWH成分克服了肝素，LMWH和水蛭素的局限性，特别是在急性动脉血栓的凝固中。
选择的本发明的MMWH成分还涉及富集具有最佳分子量范围特别提供这里详述的有利性质的寡糖。这些MMWH成分包括在于下面特征的一项，两项，三项，四项，五项，或六项或更多的从肝素衍生的寡糖混合物：
(a)体外具有抗凝血酶-和肝素辅因子II(HCII)-相关的抗凝剂活性；
(b)寡糖太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白，但是有足够的长度桥接抗凝血酶或者HCII和凝血酶；
(c)具有至少15％，20％，25％，30％，35％或40％的具有至少一个或多个五糖序列的寡糖；
(d)富集分子量范围是大约6,000至大约11,000；7,000至10,000；7,500至10,000；7,800至10,000；7,800至9,800；或7,800至9,600；8,000至9,600的寡糖；
(e)寡糖具有大约7,800至10,000，优选7,800至9,800，更优选8,000至9,800的平均分子量；
(f)至少30％，35％，40％，45％或50％的寡糖具有大于或等于6000道尔顿，优选大于或等于8000道尔顿的分子量；
(g)1.1至1.5，优选1.2至1.4，最优选1.3的多分散性；
(h)具有类似的抗-因子Xa和抗-因子IIa活性，优选抗-因子Xa活性和抗-因子IIa活性之比是大约2∶1至大约1∶1，更优选地，大约1.5∶1至大约1∶1；
(i)抗-因子Xa活性是大约80IU/毫克至大约155IU/毫克，优选90IU/毫克至大约130IU/毫克，更优选地，大约95IU/毫克至大约120IU/毫克，最优选100-110IU/毫克；
(j)抗-因子IIa活性是大约20IU/毫克至大约150IU/毫克，优选40IU/毫克至大约100IU/毫克，更优选地，大约80IU/毫克至大约100IU/毫克，最优选大约90-100IU/毫克。
根据本发明的一方面，选择的本发明的MMWH成分具有(a)，(b)，(c)和(d)的特征；(a)，(b)，(c)和(e)的特征；(b)，(c)，(e)和(g)的特征；(b)，(d)，(c)，(e)和(h)的特征；(b)，(c)，(d)和(g)的特征；(b)，(e)，(g)，(i)和(j)的特征；(b)，(e)，(f)，(g)，(i)和(j)的特征；或者(a)至(j)的特征。
“富集寡糖”指包括至少50％，55％，60％，65％，70％，75％或80％具体或限制分子量(例如6,000至11,000；7,000至10,000；7,800至10,000；7,800至9,800；8,000至9,600)的寡糖。
作为它们的(1)通过催化抗凝血酶抑制血纤蛋白-结合的凝血酶以及液相凝血酶，和(2)通过抗凝血酶催化因子Xa灭活抑制凝血酶产生的能力的结果，本发明的MMWH成分能被用来治疗心血管疾病，包括不稳定性咽峡炎，急性心肌梗塞(心脏病发作)，脑血管意外(中风)，肺栓塞，深静脉血栓形成，动脉血栓形成等。因为如此，本发明提供了用于治疗这样的心血管疾病的方法和药物组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者血栓疾病的方法，该方法包括对受试者施用药学可接受剂量的本发明的MMWH成分。该成分可以含有大约6,000道尔顿至大约12,000道尔顿，甚至更优选大约8,000道尔顿至大约10,000道尔顿分子量范围的寡糖硫酸酯的混合物。在优选的实施方案中，本发明的MMWH成分具有大约9,000道尔顿的平均分子量。在另一个实施方案中，本发明的MMWH成分是具有这里描述的最佳分子量范围的选择的MMWH成分。在该实施方案的一个优选方面，血栓疾病包括但不限于静脉血栓形成(例如深静脉血栓形成)，动脉血栓形成和冠状动脉血栓形成。在该实施方案中，本发明的MMWH成分例如通过抑制血纤蛋白-结合的凝血酶以及液相凝血酶，和通过抗凝血酶催化因子Xa灭活抑制凝血酶产生来抑制栓塞形成和生长。优选地，通过肠胃外给药(例如通过静脉内，皮下和肌内注射)实现本发明的化合物的给药。
在另一个实施方案中，本发明提供了有发生血栓形成危险的受试者血栓形成的预防方法，该方法包括对受试者施用药学可接受剂量的本发明的MMWH成分。该成分可以含有大约6,000道尔顿至大约12,000道尔顿，甚至更优选大约8,000道尔顿至大约10,000道尔顿分子量范围的寡糖硫酸酯的混合物。在优选的实施方案中，本发明的MMWH成分具有大约9,000道尔顿的平均分子量。在另一个实施方案中，本发明的MMWH成分是具有这里描述的最佳分子量范围的选择的MMWH成分。在该实施方案的一个方面，受试者由于破坏止血法的医学症状(例如冠状动脉疾病，动脉粥样硬化等)而有增加的形成血栓的危险。在该实施方案的另一个方面，受试者由于医疗方法(例如心脏手术(心肺旁路)，导管插入术(例如心脏导管插入术，经皮经腔冠状血管成形术)，粥样硬化斑切除术，修复装置的替换(例如心血管阀门，血管移植，斯滕特印模等))而有增加的血栓形成的危险。在该实施方案中，本发明的MMWH成分可以在医疗方法之前，期间或之后给药。此外，优选通过肠胃外给药(例如通过静脉内，皮下和肌内注射)实现本发明的MMWH成分的给药。
本发明还涉及本发明的MMWH成分在制备用于治疗血栓疾病，或者对有血栓形成危险的受试者预防血栓形成的药物的用途；本发明的MMWH成分在制备用于抑制受试者血纤蛋白-结合的凝血酶和凝血酶产生的药物的用途；本发明的MMWH成分在制备用于治疗深静脉血栓形成的药物的用途；和本发明的MMWH成分在制备用于预防受试者肺栓塞的药物的用途。
从下面的详细描述，本发明的其它特征，目的和优点及其优选实施方案变得显而易见。
附图的简要说明
图1A和1B说明不同的肝素浓度对凝血酶(IIa)结合血纤蛋白(A)和对凝血酶对血纤蛋白(B)的表现亲和性的影响。
图2说明在不存在和存在肝素下结合血纤蛋白单体-琼脂糖的α-凝血酶(α-IIa)，γ-凝血酶(γ-IIa)，或RA-凝血酶(RA)的百分比。
图3说明在不存在和存在250nM肝素下hirugen(Hg)，凝血酶原片段2(F2)或抗外位点(exosite)2抗体(Wab)对凝血酶(IIa)结合血纤蛋白单体-琼脂糖的影响。
图4说明其中凝血酶(IIa)通过外位点1结合血纤蛋白(Fn)并且肝素(Hp)结合Fn和IIa上的外位点2的三元血纤蛋白-凝血酶-肝素复合体。
图5说明血纤蛋白单体(Fm)对在100nM肝素存在下抗凝血酶(■)或肝素辅因子II(●)对凝血酶的抑制作用的速率的影响。各点代表至少2次独立实验的平均值，而短划线代表SD。
图6A和6B说明4μM血纤蛋白单体(Fm)对在肝素不存在或指定浓度肝素存在下抗凝血酶(A)或肝素辅因子II(B)对凝血酶抑制作用的速率的抑制影响。各点代表至少2次实验的平均值，而短划线代表SD。
图7说明在肝素(Hp)存在下γ-凝血酶(γ-IIa)，Quick1异常凝血酶(dysthrombin)(Q1-IIa)或RA-IIa与血纤蛋白(Fn)的相互作用。形成无效三元复合体是因为γ-IIa和Q1-IIa具有改变的外位点1，而RA-IIa具有减小的对于Hp的亲和性。
图8说明二元或三元复合体形成对α-凝血酶(α-IIa)，γ-凝血酶(γ-IIa)，或RA-凝血酶(RA-IIa)对N-p-甲苯磺酰基-Gly-Pro-Arg-p-硝基N-酰苯胺的水解的Km的影响。二元复合体包括凝血酶-血纤蛋白(IIa-Fn)，和凝血酶-肝素(IIa-Hp)，而三元复合体是凝血酶-血纤蛋白-肝素(IIa-Fn-Hp)。各条框代表至少两次实验的平均值，短划线代表SD。
图9说明没有分级分离的肝素(UFH)和6,000Da肝素级分(MMWH)对凝血酶(IIa)结合血纤蛋白的影响。
图10说明4μM血纤蛋白单体对在肝素或本发明的MMWH成分存在下抗凝血酶(AT)或肝素辅因子II(HCII)对凝血酶抑制作用的速率的抑制影响。各条框代表至少2次独立实验的平均值，而短划线代表SD。
图11说明在预防模型研究中标准肝素(SH)，低分子量肝素(LMWH)，本发明的MMWH成分，和水蛭素(HIR)的累积效力，以％表示。
图12说明标准肝素(SH)，低分子量肝素(LMWH)，本发明的MMWH成分，和水蛭素(HIR)对30分钟累积血液流失的影响。
图13A和13B说明在动脉血栓形成模型中LMWH，本发明的MMWH成分的累积效力(A)，以及LMWH和本发明的MMWH成分对血液流失的影响(B)。
图14给出本发明的MMWH成分和LMWH对APTT的比较影响。
图15给出LMWH和本发明的MMWH成分对抗-Xa水平的比较影响。
图16是该程序的示意图。
图17给出用本发明的MMWH成分治疗之后以百分比表示的修饰的Wessler模型血块重量。
图18给出LMWH和本发明的MMWH成分的比较：预防模型。
图19给出LMWH和本发明的MMWH成分的比较：预防模型。
图20给出用本发明的MMWH成分治疗之后以百分比表示的修饰的Wessler模型血块放射性。
图21给出LMWH和本发明的MMWH成分的比较：预防模型。
图22给出LMWH和本发明的MMWH成分的比较：预防模型。
图23给出LMWH和本发明的MMWH成分的比较：治疗模型。
图24给出LMWH和本发明的MMWH成分的比较：治疗模型。
图25给出LMWH和本发明的MMWH成分对血栓增加的比较。
图26给出LMWH和本发明的MMWH成分对血栓增加的比较。
图27给出对慢性兔模型血块增加中的DVT用本发明的MMWH成分的治疗。
图28给出用本发明的MMWH成分对慢性兔模型DVT的治疗，血块重量的变化百分比。
图29是肝素酶衍生的中等分子量(MMW)肝素±4μM血纤蛋白单体对凝血酶的AT抑制作用的速率的图示。
图30是亚硝酸衍生的中等分子量(MMW)肝素±4μM血纤蛋白单体对凝血酶的AT抑制作用的速率的图示。
图31是高碘酸衍生的中等分子量(MMW)肝素±4μM血纤蛋白单体对凝血酶的AT抑制作用的速率的图示。
图32是用肝素酶和亚硝酸衍生的MMW肝素通过AT对血纤蛋白单体的凝血酶抑制作用的速率的抑制倍数的图示。
图33是用高碘酸衍生的MMW肝素通过AT对血纤蛋白单体的凝血酶抑制作用的速率的抑制倍数的图示。
图34是用肝素酶衍生的中等分子量肝素对因子Xa的AT抑制作用的速率的图示。
图35是用亚硝酸衍生的中等分子量肝素对因子Xa的AT抑制作用的速率的图示。
图36是用高碘酸衍生的中等分子量肝素对因子Xa的AT抑制作用的速率的图示。
图37是UFH和肝素酶衍生的中等分子量肝素对凝血酶结合血纤蛋白血块的影响的图示。
图38是UFH和亚硝酸衍生的中等分子量肝素对凝血酶结合血纤蛋白血块的影响的图示。
图39是UFH和高碘酸衍生的中等分子量肝素对凝血酶结合血纤蛋白血块的影响的图示。
图40是UFH和尺寸受限的肝素酶衍生的中等分子量肝素对凝血酶结合血纤蛋白血块的影响的图示。
图41是UFH和尺寸受限的亚硝酸衍生的中等分子量肝素对凝血酶结合血纤蛋白血块的影响的图示。
本发明的详细描述和优选实施方案
本发明提供了中等分子量肝素(MMWH)化合物，其(1)通过催化抗凝血酶抑制血纤蛋白结合的凝血酶和液相凝血酶；和(2)通过抗凝血酶催化因子Xa灭活抑制凝血酶产生。这些MMWH成分是具有大约6,000道尔顿至大约12,000道尔顿，甚至更优选大约8,000道尔顿至大约10,000道尔顿分子量范围的寡糖硫酸酯的混合物。在优选实施方案中，本发明的MMWH成分具有大约9,000道尔顿的平均分子量。在一个实施方案中，MMWH成分的至少31％具有大于或等于7,800道尔顿的分子量。在另一个实施方案中，MMWH成分的至少25％具有大于或等于10,000道尔顿的分子量。
更特别地，本发明的MMWH成分能平定血栓的强血栓原(prothrombotic)活性。血栓的血栓原活性反映血纤蛋白-结合的凝血酶和血小板-结合的激活因子X(因子Xa)的活性，血纤蛋白-结合的凝血酶和血小板-结合的激活因子X两者相对对通过肝素和LMWH的灭活的抗性。这解释了为什么这些试剂在发生动脉血栓形成中有有限的效力和为什么当停止治疗时发生凝固的再结合激活。此外，尽管与肝素相反，水蛭素能灭活血纤蛋白-结合的凝血酶，但是它不能阻断由血小板-结合的因子Xa触发的凝血酶的产生。水蛭素灭活血纤蛋白-结合的凝血酶的能力解释了为什么定向凝血酶抑制剂用于短期控制动脉血栓形成优于肝素。但是，这些物质的任何有益效果一旦停止治疗会快速丧失，因为它们不能阻断由血小板-结合的因子Xa触发的凝血酶的产生。
现在已经确定血纤蛋白-结合的凝血酶对通过肝素的灭活有抗性，因为肝素通过以高亲和性结合血纤蛋白和凝血酶上的肝素-结合位点来桥接凝血酶和血纤蛋白，肝素-血纤蛋白和肝素-凝血酶二者之间相互作用的Kd大约为150nm。该三元血纤蛋白-凝血酶-肝素复合物中的凝血酶在其活性位点处经历构象变化，这可能限制其与抗凝血酶的反应性。此外，通过占据凝血酶上的肝素-结合位点，连接凝血酶和血纤蛋白的肝素链防止肝素-抗凝血酶复合物中的肝素桥接抗凝血酶和血纤蛋白-结合的凝血酶。这解释了为什么三元血纤蛋白-凝血酶-肝素复合物中的凝血酶受到保护不会被肝素或者被长度足够桥接凝血酶和抗凝血酶的LMWH链灭活。对于急性动脉血栓形成对这些抗凝剂的抗性和中止治疗之后凝固的再结合激活两者的主要致因可能是肝素，LMWH或水蛭素不能平定血栓的强血栓原活性。
与肝素相反，通过灭活血纤蛋白-结合的凝血酶和通过抗凝血酶催化因子Xa灭活作用抑制凝血酶产生，LMWH，水蛭素和本发明的MMWH成分能平定血栓原活性。更特别地，发现本发明的MMWH成分的肝素链太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白，但是足够长来桥接抗凝血酶和凝血酶。结果，和肝素不一样，本发明的MMWH成分灭活血纤蛋白-结合的凝血酶和自由的凝血酶。此外，尽管大多数LMWH链不足够长以桥接凝血酶和血纤蛋白，而且它们也太短不能桥接抗凝血酶和凝血酶。结果，本发明的MMWH成分在灭活血纤蛋白-结合的凝血酶方面比LMWH好得多。另外，尽管水蛭素能灭活血纤蛋白-结合的凝血酶，但是它对凝血酶产生没有作用，因为它是凝血酶的选择性抑制剂。结果，与肝素相反，本发明的MMWH成分通过抗凝血酶催化因子Xa灭活来抑制凝血酶产生。因此，通过阻断凝血酶产生以及通过抑制血纤蛋白-结合的凝血酶，本发明的MMWH成分特别是在调理急性动脉血栓形成方面克服了肝素，LMWH和水蛭素的局限性。
本发明的MMWH成分一般具有类似的抗因子IIa和抗因子Xa活性。在优选的实施方案中，抗-因子Xa活性和抗-因子IIa活性之比范围是大约2∶1至大约1∶1，更优选地，大约1.5∶1至大约1∶1。相反，LMWH，例如，具有比抗-因子IIa活性明显高的抗-因子Xa活性。在优选的实施方案中，本发明的MMWH成分的抗-因子Xa活性范围是大约90U/毫克至大约150U/毫克，更优选地，大约100U/毫克至大约125U/毫克。在更优选的实施方案中，本发明的MMWH成分具有大约115U/毫克的抗-因子Xa活性。在本发明优选的实施方案中，本发明的MMWH成分抗因子IIa活性范围一般是大约40U/毫克至大约100U/毫克，更优选大约60U/毫克至大约75U/毫克。在更优选的实施方案中，本发明的MMWH成分具有大约65U/毫克抗因子IIa活性。
选择的本发明的MMWH成分还涉及富集具有最佳分子量范围特别提供这里详述的有利性质的寡糖。这些MMWH成分包括特征在于体外具有抗凝血酶-和肝素辅因子II(HCII)-相关的抗凝剂活性的肝素衍生的寡糖的混合物。组合物包括太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白，但是有足够的长度桥接抗凝血酶或者HCII和凝血酶的肝素链。特别地，组合物具有至少15％，20％，25％，30％，35％或40％的具有至少一个或多个五糖序列的肝素寡糖链。“五糖序列”指由三个D-葡糖胺和两个糖醛酸残基组成的关键结构单元(参见下面的结构)。中心D-葡糖胺残基包含独特的3-O-硫酸根部分。
该五糖序列代表对抗凝血酶具有高亲和性的肝素的最小结构(Choay，J.等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem Biophys ResComm)1983：116：492-499)。肝素通过该五糖序列与抗凝血酶桥接导致反应中心环中构象变化，这将抗凝血酶从慢抑制剂转化为非常快的抑制剂。结果，本发明选择的MMWH成分能通过催化抗凝血酶抑制血纤蛋白-结合的凝血酶以及液相凝血酶和通过抗凝血酶催化因子Xa灭活抑制凝血酶的产生。优选地，本发明选择的MMWH成分是同样好地抑制血纤蛋白-结合的凝血酶和液相凝血酶的那些MMWH成分。
选择的MMWH成分包括具有大约6,000至大约11,000分子量范围的寡糖。本发明的一个方面提供了一种MMWH成分，其富集分子量范围是7,800至8,800；优选7,800至8,600；更优选7,800至8,500；最优选8,000至8,500的寡糖。根据本发明的另一方面，提供了一种MMWH成分，其富集分子量范围是9,000至10,000；优选9,200至9,800；更优选9,300至9,600；最优选9,400至9,600的寡糖。
本发明的一个实施方案还涉及包括平均分子量是7,800至8,800；优选7,800至8,600；更优选7,800至8,500；最优选8,000至8,500的寡糖的本发明的MMWH成分。在另一个实施方案中，本发明涉及包括平均分子量是9,000至10,000；优选9,200至9,800；更优选9,300至9,600；最优选9,400至9,600的寡糖的本发明的MMWH成分。
选择的MMWH成分可以具有1.1-1.5，优选1.2-1.4，最优选1.3的多分散性。
本发明选择的MMWH成分可以具有类似的抗因子Xa和抗因子IIa活性。在优选的实施方案中，抗-因子Xa活性和抗-因子IIa活性之比范围是大约2∶1至大约1∶1，更优选地，大约1.5∶1至大约1∶1。在优选的实施方案中，抗-因子Xa活性范围是大约80IU/毫克至大约155IU/毫克，优选90IU/毫克至大约130IU/毫克，更优选地，大约95IU/毫克至大约120IU/毫克，最优选地，100-110IU/毫克。在本发明优选的实施方案中，抗因子IIa活性范围是大约20IU/毫克至大约150IU/毫克，更优选40IU/毫克至大约100IU/毫克，最优选大约80IU/毫克至大约100IU/毫克。在更优选的实施方案中，本发明的组合物具有大约90-100IU/毫克抗因子IIa活性。
可以从低标准物或者没有分级的肝素或者从低分子量肝素(LMWH)制备本发明的MMWH成分。
在一个实施方案中，通过首先将没有分级的肝素解聚得到低分子量肝素然后分离或分开感兴趣的MMWH级分，可以从没有分级的肝素获得本发明的MMWH成分。没有分级的肝素是由糖醛酸残基(D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸)和D-葡糖胺酸残基制成的重复二糖组成的多糖链的混合物。这些二糖的很多在糖醛酸残基和/或葡糖胺残基上被硫酸化。一般来说，没有分级的肝素根据肝素来源和用来分离它的方法而具有大约6,000道尔顿至40,000道尔顿的平均分子量。本发明方法中使用的没有分级的肝素可以是制药质量的商售肝素制剂或粗肝素制剂，例如从哺乳动物组织或器官提取活性肝素获得的那些。商售产品(USP肝素)可以从几个来源得到(例如SIGMA化学品公司，圣.路易丝，孟山都)，一般作为碱金属盐或碱土金属盐(最通常作为肝素钠)。或者利用本领域技术人员公知的各种方法，可以从哺乳动物组织或器官特别是从例如来自牛，猪和绵羊的肠粘膜或肺提取没有分级的肝素(参见例如Coyne Erwir.，肝素的化学和生物学(Chemistry and Biology of Heparin)(Lundblad，R.L.等(编著)，pp.9-17，Elsevier/North-Holland，纽约(1981))。在本发明优选实施方案中，没有分级的肝素是猪肠肝素。
将肝素解聚的多种方法是已知的并且在科技文献和专利文献中都有大量报道，并且都可应用于本发明。这样的方法一般以化学反应或酶促反应为基础。例如，通过苄基化后碱解聚；亚硝酸解聚；用肝素酶酶促解聚；过氧化解聚等，可以从标准的没有分级的肝素制备低分子量肝素。一般地，选择提供具有本发明的MMWH成分特别是具有最佳分子量范围的本发明组合物的特征的组合物的方法。本发明组合物的期望的特征，即分子量范围，平均分子量，多分散性，抗-因子Xa活性，抗-因子IIa活性等等，可以用标准方法证实(例如参见这里的实施例)。在优选的实施方案中，利用亚硝酸解聚或肝素酶解聚从没有分级的肝素制备本发明的组合物。
通过在控制的条件下，使没有分级的肝素与化学试剂更特别地亚硝酸的作用接触，可以解聚没有分级的肝素。可以直接向肝素加入亚硝酸，或者，其可以就地生成。为了就地产生亚硝酸，向一种亚硝酸的衍生物加入控制量的一种酸。合适的酸包括有利地包含生物学可接受阴离子的那些酸，例如乙酸，更优选地，盐酸。合适的亚硝酸的衍生物包括盐，醚-盐，或者更优选地，碱金属盐或碱土金属盐。在本发明优选的实施方案中，使用亚硝酸的盐，水溶性盐，更优选地使用碱金属盐，例如亚硝酸钠(NaNO2)。
优选在生理可接受介质中进行没有分级的肝素的解聚，从而消除与使用对涉及的生物应用可能是不利的溶剂相关的问题。这样的生理可接受介质包括但不限于水和水/醇混合物。在本发明优选的实施方案中，水构成优选的反应介质。在进行解聚反应中，使用化学计量的试剂(例如亚硝酸)是所需的。使用化学计量的亚硝酸将保证当达到期望的解聚程度时，亚硝酸被完全消耗。一般地，没有分级的肝素与亚硝酸钠(NaNO2)的重量比范围从大约100至2-4，并且更优选地，从大约100至3。使用化学计量的亚硝酸避免“淬灭”与例如氨基磺酸铵的动力学(正在进行的)反应的需要，并且反之，防止混合的盐(例如低分子量肝素中间体的钠盐和铵盐)的形成。
另外，为了在最令人满意的实验条件下获得期望的产物，彼此调节其它参数，例如温度和pH。例如，在大约0℃至30℃的温度范围下进行解聚反应。事实上，低于10℃的温度能够用于制备期望的产物。但是，在优选的实施方案中，在环境温度下，即在大约20℃和28℃中间，进行解聚反应。此外，在优选的实施方案中，通过首先降低然后提高反应混合物的pH来起始和中止解聚反应。为了引发解聚反应，将反应混合物的pH降低至大约2.5-3.5的pH值，并且更优选地，降低至大约3.0。类似地，为了中止解聚反应，将反应混合物的pH升高至大约6.0-7.0的pH值，并且更优选地，升高至大约6.75。应该注意，通过利用例如淀粉-碘试纸检查反应混合物中是否存在亚硝离子，能监测反应的进程。反应混合物中不存在亚硝离子指示反应完全。反应完全需要的时间随着使用的反应物和反应条件而不同。但是，一般情况下，大约1小时至大约3小时内反应将达到完全。
一旦反应达到完全，利用本领域技术人员公知且使用的多种不同的技术能回收本发明MMWH成分。在一个实施方案中，通过沉淀，超滤或色谱方法从反应混合物回收本发明MMWH成分。如果通过沉淀获得期望的产物，则一般使用例如一种醇(例如无水乙醇)进行沉淀。在本发明的优选实施方案中，利用超滤方法从反应混合物回收本发明MMWH成分。可以有利地使用各种截留分子量的超滤膜来脱盐并且确定得到的MMWH成分的分子量特征。适合本发明使用的超滤系统是本领域技术人员公知且使用的。商业上可获得的Millipore Pellicon超滤装置是例示的可以在本发明中使用的超滤系统。该装置可以装有各种截留分子量的膜。在本发明的优选实施方案中，用装有6,000道尔顿截留分子量的膜的Millipore Pellicon超滤装置对纯水(即蒸馏水(dH2O))将得到的MMWH成分透析或超滤。
超滤之后，然后将保留液冻干，即冷冻-干燥，得到MMWH成分。利用本领域技术人员公知且使用的标准技术测定得到的MMWH成分的分子量特征。这样的技术包括，例如，GPC-HPLC，粘度测定，光散射，解聚过程中产生的官能团的化学或物理化学测定等等。在优选实施方案中，通过高效尺寸排阻色谱结合多角激光散射(HPSEC-MALLS)测定得到的MMWH成分的分子量特征。典型地，得到的MMWH成分具有大约9,000道尔顿的平均分子量(Mw)。在本发明选择的组合物中，平均分子量是大约7,800至10,000道尔顿，优选7,800至9,800道尔顿。
本领域技术人员容易理解可以使得到的MMWH成分进行进一步的纯化程序。这样的程序包括但不限于凝胶渗透色谱，超滤，疏水相互作用色谱，亲和色谱，离子交换色谱等。此外，如上所述，利用本领域技术人员公知且使用的标准技术测定本发明的MMWH成分的分子量特征。正如所解释的，在优选实施方案中，通过高效尺寸排阻色谱结合多角激光散射(HPSEC-MALLS)测定本发明的MMWH成分的分子量特征。
通过用肝素酶对肝素的酶促解聚可以制备本发明的MMWH成分(参见例如U.S.3,766,167和U.S.4,396,762)。根据本发明的一个方面，通过根据EP 0224236所述控制的肝素酶解聚来制备本发明的组合物，特别是具有最佳分子量范围或者限制的分子量范围的选择的组合物(Nielsen和Ostergard；1987年4月11日公开的No.87303836.8)。利用该方法，通过用肝素酶解聚至相应的数均分子量，可以制备具有期望的重均分子量的本发明的MMWH成分。该方法测定解聚过程中光吸收度的增加(优选230-235nm，即ΔA235)，并且当光吸收度达到相应于期望的数均分子量和相应的期望的重均分子量的计算值时中止解聚作用。
在另一个实施方案中，通过肝素的有限的高碘酸氧化/水解得到低分子量肝素，然后分离或分出感兴趣的MMWH级分，可以获得本发明的MMWH成分。在该方法的第一步骤中，肝素与有限量的高碘酸钠接触。在本发明优选的实施方案中，高碘酸钠的浓度范围是大约1mM至大约50mM，更优选大约5mM至大约20mM。该反应混合物的pH范围是大约3-11，更优选大约6.5至大约7.5。有限的高碘酸盐氧化作用一般进行大约18小时。在该方法的第二步骤中，在高碘酸盐氧化作用之后用金属强碱例如NaOH进行碱解。在优选的实施方案中，金属强碱例如NaOH的浓度范围是大约0.1N至大约1N，更优选地，是大约0.25N。该步骤在大约0℃至大约50℃范围，更优选大约25℃的温度下进行大约1小时至大约10小时的时间，更优选进行3小时。用公知方法例如上述的凝胶过滤，离子交换色谱，超滤，透析，季铵盐沉淀和有机溶剂沉淀获得期望的MMWH成分。而且，该MMWH成分还可以用上述方法进一步纯化。
利用有限高碘酸盐氧化作用/水解方法，制备结构与已知的LMWH成分完全不同的MMWH成分。如上所述，在一个实施方案中，通过用高碘酸盐短时处理没有分级的肝素得到在一些硫酸化糖醛酸残基处被氧化的产物来制备本发明的MMWH成分。这些被氧化位点可以容易地被碱裂解。结果，本发明的MMWH成分的裂解不象用来制备LMWH的常规方法的一般情况下那样有随机性。此外，易于被高碘酸盐氧化的2-0个硫酸化糖醛酸残基以一定概率位于五糖序列相邻处。结果，本发明的有限高碘酸盐/水解方法可能产生该链的末端具有五糖序列的低分子量肝素链，这可以使得肝素链的剩余部分足够长来桥接凝血酶。
本发明的MMWH成分特别是能够(1)通过催化抗凝血酶抑制血纤蛋白-结合的凝血酶以及液相凝血酶；和(2)通过抗凝血酶催化因子Xa灭活作用抑制凝血酶产生。因为如此，本发明的MMWH成分能够用于治疗多种重要的心血管疾病，包括不稳定性咽峡炎，急性心肌梗塞(心脏病发作)，脑血管意外(中风)，肺栓塞，深静脉血栓形成，动脉血栓形成等。在优选的实施方案中，本发明的MMWH成分可用于治疗动脉血栓形成。正因为如此，在另一个实施方案中，本发明的MMWH成分可以被掺入到用于治疗这样的心血管疾病的药物组合物中作为有效成分。本发明的药物组合物单独使用或者与常规的血栓治疗例如施用组织纤溶酶原激活物(tPA)，链激酶等，与常规的抗血小板治疗例如施用噻氯匹定等，以及与血管内治疗例如血管成形术，动脉粥样硬化斑消除术等相结合。
本发明的MMWH成分可以掺入到用于治疗给药的各种制剂中。更特别地，通过与合适的药学可接受载体或稀释剂混合可以将本发明的MMWH成分配制成药物组合物，并且可以配制成各种制剂，优选液体形式，例如浆液，溶液和注射剂。优选通过肠胃外给药(例如通过静脉内，皮下和肌内注射)实现本发明的MMWH成分的给药。此外，所述混合物可以局部而不是全身给药，例如通过直接将混合物注射到皮下位点，经常是在贮存或缓释制剂中。
在“Remington’s制药科学”(Remington’s PharmaceuticalScience)(Mack出版公司，Philadelpha，PA，17版(1985))可以查到适用本发明的合适的剂型，其中的教诲在这里引作参考。此外，药物送递方法的简要综述参见Langer，科学(Science)249：1527-1533(1990)，其中的教诲在这里引作参考。可以用本领域技术人员公知的方法制备这里描述的药物组合物，例如利用常规的混合，溶解，研磨，乳化，截留或冻干方法。下述方法和赋形剂仅是例子，绝非限制本发明。
优选配制本发明的MMWH成分用于肠胃外给药，例如通过注射，例如通过大丸剂注射或连续输液。用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在安瓿中或者在多剂量容器中，并加有防腐剂。所述组合物可以是这样的形式，例如油性或含水赋形剂中的悬浮液，溶液或乳状液，也可以含有配制试剂，例如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂试剂。
一般情况下，用于肠胃外给药的药物制剂包括活性成分在水溶性形式中的水溶液。另外，活性成分的悬浮液可以制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油例如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。含水注射悬浮液可以含有提高悬浮液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，或葡聚糖。任选地，所述悬浮液还可以含有合适的稳定剂或者提高混合物的溶解度使制备高浓缩的溶液的试剂。或者，活性成分可以是用于在使用之前用合适的赋形剂例如灭菌无致热原水允兑的粉末形式。
更特别地，对于注射剂，通过将其溶解于，悬浮于含水或不含水溶剂例如植物油或者其它类似的油，合成的脂肪酸甘油酯，高级脂肪酸或丙二醇的酯中，或者在其中乳化；并且如果期望，添加常规添加剂，例如增溶剂，等张剂，悬浮剂，乳化剂，稳定剂和防腐剂，可以将所述MMWH成分配制成制剂。优选地，可以在水溶液，优选在生理相容缓冲液例如Hanks’s溶液，Ringer’s溶液，或者生理盐水缓冲液中配制本发明的组合物。
除了上面描述的剂型之外，本发明的MMWH成分还可以配制成贮存制剂。通过包埋(例如皮下或肌肉)或者通过肌内注射可以施用这样的长时间起作用的制剂。这样，例如，所述成分可以与合适的聚合物或疏水性材料(例如作为在可接受油中的乳状液)或离子交换树脂，或微溶衍生物，例如作为微溶盐一起配制。
适用于本发明的药物组合物包括其中含有治疗有效量的活性成分的组合物。“治疗有效量”，或者可互换使用的“药学可接受剂量”，或者可互换使用的“抗凝剂有效量”指当通过例如灭活血块-结合的凝血酶，抗凝血酶催化因子Xa灭活抑制凝血酶产生等来治疗例如上述的那些与血栓相关的心血管疾病时，为了实现期望的结果，例如抑制血栓增加，而存在的混合物，即MMWH成分的足够量。施用的成分的量当然将取决于要治疗的患者，患者的体重，疾病的严重程度，给药方式和临床医生的判断。有效量的确定在本领域技术人员能力范围内，特别是着眼这里提供的详细描述的公开内容。
可以对动物，包括哺乳动物，特别是人患者施用本发明的治疗或组合物。所述动物也包括家畜，包括马，牛，绵羊，猪，猫，狗和动物园动物。
典型地，活性产物，即所述MMWH成分在药物组合物中存在的浓度范围是大约2微克/剂量至200微克/剂量，更优选浓度范围是大约5微克/剂量至50微克/剂量。日剂量根据具体MMWH的特异活性可以有大范围的变化，但是通常以大约0.5微克/千克体重/天至大约15微克/千克体重/天的浓度范围存在，更优选地，以大约1微克/千克体重/天至大约5微克/千克体重/天的浓度范围存在。
除了用于治疗上述心血管疾病的药物组合物中之外，本领域技术人员容易理解活性产物即所述MMWH成分可以用作体外解释血液凝固机理的试剂。
通过具体的实施例更详细描述本发明。提供下面的实施例是为了详细说明目的，而不是要以任何方式限制本发明。本领域技术人员容易认识到可以变化或改变得到基本上相同的结果的各种非关键性参数。
实施例
实施例1
实验观察
1.1当前可获得的抗凝剂的临床局限性：
肝素，LMWH和定向凝血酶抑制剂在急性冠状综合症中有局限性。对于患有不稳定性咽峡炎的患者，当停止用这些药物治疗之后会集中复发局部缺血作用(Theroux，P.，等(1992)N.Engl.J.Med.327：141-145；Granger，C.B.，等(1996)，循环(Circulation)93：870-888；Oldgren，J.，等(1996)，循环(Circulation)94(增刊1)：I-431)。这是由于凝固的再次激活，因为有相关的凝血酶原片段F1.2(F1.2)和血纤肽A(FPA)的血浆水平升高，分别反映出增加的凝血酶产生和凝血酶活性(Granger，C.B.，等(1995)，循环(Circulation)91：1929-1935).对于急性心肌梗塞患者，用组织纤溶酶原激活物(tPA)，链激酶的血栓治疗诱导特征在于提高水平的FPA的前凝血酶状态(Eisenberg，P.R.，等(1987)J.Am.Coll.Cardiol.10：527-529；Owen，J.，等(1988)血液(Blood)72：616-620)，其只是被肝素部分还原(Galvani，J.，等(1994)J.Am.Coll.Cardiol.24：1445-1452；Merlim，P.A.，等(1995)J.Am.Coll.Cardiol.25：203-209)。这解释了为什么辅助肝素不减少接受链激酶的患者复发局部缺血作用的发生(Collins，R.，等(1996)BMJ313：652-659)，并且对给药t-PA的那些只有可怀疑的好处(Collins，R.，等(1996)BMJ313：652-659)。尽管水蛭素比作为血栓治疗和对没有接受血栓治疗药物的非-Q波梗塞的患者的辅助治疗的肝素好，但是水蛭素的早期利益在30天内就消耗掉了(GUSTO研究者(Investigator)(1996)N.Engl.J.Med.335(11：775-782)。这些发现提示有持久的形成血栓的刺激物，其对肝素和水蛭素有抗性。
在冠状血管成形术设立中可以看到类似的结果，尽管阿司匹林和高剂量肝素的6-8％的患者复发局部缺血作用。尽管在成功的冠状血管成形术之后的头72小时水蛭素优于肝素，但是其好处30天即耗尽(Serruys，P.W.，等(1995)N.Engl.J.Med.333：757-763)。类似地，在第7天，类水蛭素(hirulog)，一种半合成水蛭素类似物(Bittl，J.A.，等(1995)药物杂志(J.Med.)333：764-769)，在对急性心肌梗塞之后的不稳定性咽峡炎接受血管成形术的患者预防复发性局部缺血作用方面比肝素更好；但是30天后，类水蛭素(hirulog)和肝素之间没有差别(Bittl，J.A.，等(1995)药物杂志(J.Med.)333：764-769)。很可能急性动脉血栓对肝素，LMWH和水蛭素的抗性以及当中止治疗时发生的凝固的再激活两方面反映这些抗凝剂不能平定血栓的强血栓原活性。
1.2负责急性动脉血栓的血栓原活性的因子
血管损伤触发动脉血栓形成。动脉粥样斑的自发性或创伤性破裂暴露复合因子VII/VIIa的组织因子。然后因子VIIa/组织因子复合物通过激活因子IX和X而引发凝固作用。尽管因子VIIa/组织因子复合物中的因子VIIa被组织因子途径抑制剂快速灭活(Broze GJ Jr(1995)Thromb.Haemost，74：90-93)，动脉血栓保留了血栓原性。
体外研究把动脉血栓的前凝血剂活性归因于(a)与血纤蛋白结合的凝血酶(Hogg.P.J.，等(1989)美国国家科学院院刊86：3619-3623；Weitz，J.I.，等(1990)，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)86：385-391)，或(b)与血栓中的血小板结合的因子Xa(和可能因子IXa)(Eisenberg.P.R.，等(1993)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)91：1877-1883)。血纤蛋白-结合的凝血酶能局部激活血小板(Kumar.R.，等(1995)Thromb.Haemost.74(3)：962-968)并且促进凝固(Kumar.R.，等(1994)Thromb.Haemost.72：713-721)，从而诱导强前凝血剂状态。通过触发凝血酶产生，血小板-结合的因子Xa(和IXa)增强该前凝血剂状态。
血纤蛋白-结合的凝血酶和血小板-结合的因子Xa(和IXa)都对肝素和LMWH引起的灭活作用有抗性(Hogg.P.J.，等(1989)美国国家科学院院刊86：3619-3623；Weitz，J.I.，等(1990)，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)86：385-391；Teitel，J.M.，等(1983)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)71：1383-1391；Pieter，J.，等(1988)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：15313-15318)，从而解释了它们不能平定急性动脉血栓的前凝血剂活性。水蛭素能灭活血纤蛋白-结合的凝血酶(Weitz，J.I.，等(1990)，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)86：385-391)，但是不能阻断血小板-结合的凝固因子触发的凝血酶产生。在该概念的支持下，水蛭素降低FPA的水平，但是对患有不稳定性咽峡炎患者的F1.2水平没有影响(Granger，C.B.，等(1995)，循环(Circulation)91：1929-1935)。
大量证据证明血纤蛋白-结合的凝血酶和血小板-结合的因子Xa对血栓的强前凝血剂有作用。因此，水蛭素或者壁虱抗凝肽(TAP)(和肝素及LMWH不一样灭活血小板-结合的因子Xa和自由因子Xa的因子Xa的定向抑制剂(Waxman.L.，等(1990)科学(Science)248：593-596))不能阻断当在没有抗凝的全血中培养时洗涤过的血浆块促进凝固的能力。相反，水蛭素和TAP的组合破坏血浆块的前凝血剂活性，提示急性动脉血栓的平定需要不仅仅抑制血纤蛋白-结合的凝血酶而且还阻断血小板-结合的因子Xa触发的凝血酶产生的试剂。开发这些试剂需要理解血纤蛋白-结合的IIa和血小板-结合的因子Xa受到保护不被肝素，LMWH和水蛭素灭活的机理。
1.3血纤蛋白-结合的凝血酶受到保护不被肝素灭活的机理：
研究表明与血纤蛋白结合的凝血酶在肝素存在下比其不存在下更复杂，凝血酶/血纤蛋白相互作用的结果现在更加明确了。
1.3.1不存在肝素下凝血酶/血纤蛋白的相互作用
不存在肝素下，α-凝血酶结合血纤蛋白，其Kd＝2μM。凝血酶上的底物结合位点外位点1介导结合(Fenton，J.W.II.等(1988)生物化学(Biochemistry)27：7106-7112)，因为γ-凝血酶(一种其中外位点1被切割的凝血酶的降解形式)和Quick1异常凝血酶(一种天然存在的凝血酶突变体，其中Cys置换了外位点1中的Arg67)不能结合，而RA-凝血酶(一种外位点2突变体(Ye，J.，等(1994)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269：17965-17970)，由于Ala置换了93，97和101位的Arg残基而有对肝素的降低的亲和性)结合血纤蛋白，其亲合力类似于α-凝血酶。
1.3.2肝素存在下凝血酶/血纤蛋白的相互作用
当存在肝素时，和凝血酶与血纤蛋白相互作用模式一样，与血纤蛋白结合的凝血酶的量发生变化。肝素浓度达到250nM时，和凝血酶对血纤蛋白的表观亲和力所作用(图1B)的一样，结合血纤蛋白的凝血酶的量增加(图1A)；但是在更高肝素浓度时，凝血酶结合(图1A)和凝血酶对血纤蛋白的亲和力逐渐降低(图1B)。这些数据扩展了证明固定浓度的肝素增强凝血酶与血纤蛋白结合的Hogg和Jackson的结果(参见Hogg，P.J.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265：241-247(1990))。
在肝素存在下，凝血酶结合的模式也改变。而不存在肝素下凝血酶通过外位点1结合血纤蛋白，肝素存在下见到的增强的α-凝血酶结合由外位点2介导，因为肝素将γ-凝血酶的结合增强到和α-凝血酶相同的程度，但是对RA-凝血酶的结合有极少影响(图2)。此外，肝素存在下的过量的结合的α-凝血酶被抗外位点2的抗体或被凝血酶原片段2(F2)置换，凝血酶原片段2(F2)和肝素一样也结合外位点2(Arni，R.K.，等，生物化学(Biochemistry)32：4727-4737)。相反，水蛭素原(hirugen)，一种合成的水蛭素C-末端类似物(Maraganore，J.，等(1989)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264：8692-8698)，对凝血酶的肝素-依赖性结合没有影响(图3)。
这些发现解释为表明三元血纤蛋白-凝血酶-肝素复合物形成，其中凝血酶直接通过外位点1结合血纤蛋白，并且肝素结合凝血酶上的血纤蛋白和外位点2两者(图4)。因为肝素对于血纤蛋白的亲和力(Kd＝180nM)类似于对α-凝血酶的亲和力(Kd＝120nM)，所以才发生这种现象。肝素与血纤蛋白的相互作用是与五糖-无关的，因为低亲和性的肝素链对抗凝血酶和高亲和性链一样紧密结合。肝素对凝血酶结合的双相作用(图1)支持三元复合体形成的概念。因此，在肝素结合位点饱和之前肝素促进凝血酶与血纤蛋白结合。较高肝素浓度下，随着无效二元血纤蛋白-肝素和凝血酶-肝素复合物形成，凝血酶结合降低。
1.3.3凝血酶/血纤蛋白相互作用的结果
抗凝血酶和肝素辅因子II(HCII)保护三元血纤蛋白-凝血酶-肝素复合物中的凝血酶不被灭活。HCII是血浆中发现的作为第二凝血酶抑制剂的天然存在的抗凝血酶。因此，在血纤蛋白单体存在下抗凝血酶或HCII对凝血酶灭活的肝素-催化率降低(图5)。在很宽的肝素浓度范围内，在饱和量的血纤蛋白单体存在下抗凝血酶和HCII引起的灭活率与不存在情况下相比分别慢至多60-和250-倍(图6A和6B)。为了保护.必须占据两个外位点：血纤蛋白占据外位点1且肝素占据外位点2。因此，即使肝素通过与它们完整的外位点2结合并且将它们与血纤蛋白桥接而增强γ-凝血酶和Quick1异常凝血酶与血纤蛋白的结合，也不会受到保护不被灭活，因为，它们的改变的外位点1不能与血纤蛋白相互作用(图7)。RA-凝血酶易于失活，因为，即使其以类似于α-凝血酶的亲和性结合血纤蛋白，其也由于外位点2处的突变而具有对肝素的降低的亲和力(图7)。
1.3.4三元血纤蛋白-凝血酶-肝素复合物中的凝血酶经历活性位点处的别构变化所证据
三元复合物形成诱导的凝血酶活性位点中别构变化可能降低凝血酶与其底物或抑制剂的反应性。在该概念的支持下，证明当IIa在三元血纤蛋白-凝血酶-肝素复合物中被结合，但是不与二元凝血酶-肝素或凝血酶-血纤蛋白复合物结合时，合成底物的凝血酶介导的解离速率提高(图8)。
实施例2
2.0中等分子量肝素的产生：
为了催化凝血酶抑制作用，肝素桥接抗凝血酶和凝血酶(Danielsson，A.，等(1986)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)261：15467-15473)。前提是该桥接功能要求具有最小分子量为5，400的肝素链(Jordan，R.E.，等(1980)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)225：10081-10090)。因为大多数LMWH分子小于5,400道尔顿，所以LMWH具有极小的抗凝血酶的抑制活性(Jordan，R.E.，等(1980)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)  225：10081-10090)。因为肝素桥接凝血酶和血纤蛋白形成三元血纤蛋白-凝血酶-肝素复合物，假设该功能也要求最小分子质量的肝素链。此外，假设如果该最小分子质量与桥接抗凝血酶和凝血酶所需要的不一样，就有可能有其中肝素链太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白但是足够长桥接抗凝血酶和凝血酶，从而克服肝素抗性的重要的机理这样的窗口。
已经发现存在这样的窗口。例如，本发明的MMWH成分足够长来催化抗凝血酶对凝血酶的抑制作用，但是不促进凝血酶结合血纤蛋白(图9)。因此，与肝素相反，在血纤蛋白存在时抗凝血酶或HCII对MMWH-催化的凝血酶抑制作用的速度几乎和血纤蛋白不存在时一样(图10)。
2.1中等分子量肝素的表征：
因为MMWH的链足够长来桥接抗凝血酶和凝血酶，所以抗-因子IIa活性(即MMWH催化或激活抗凝血酶对因子IIa(凝血酶)抑制的能力)与其抗-因子Xa活性(即催化抗凝血酶对因子Xa抑制的能力)相同。相反，LMWH具有比抗-因子IIa活性更大的抗-因子Xa活性，因为，多于一半的LMWH链太短不能桥接抗凝血酶和凝血酶。尽管没有分级的肝素也具有同等的抗-因子Xa和抗-因子IIa活性，但它不同于本发明的MMWH成分之处在于，存在血纤蛋白时，由于没有分级的肝素链足够长，不仅桥接抗凝血酶和凝血酶而且还桥接凝血酶和血纤蛋白，所以它不能催化凝血酶失活。
在其典型构象中，本发明的MMWH成分的特异活性类似于没有分级的肝素。因此，其抗-因子Xa和抗-因子IIa活性范围可以分别是90-150U/毫克和40-100U/毫克。LMWH一般具有100U/毫克的特异抗-因子Xa活性，而其抗-因子IIa活性范围根据具体LMWH制备的分子量分布范围是20-50U/毫克。
实施例3
本发明的MMWH成分与其它已知抗凝剂的药效和安全性比较
该实施例说明比较兔动脉血栓形成预防模型中本发明的MMWH成分(图中指示为V21)，LMWH，肝素和水蛭素的药效和安全性的研究。结果表明本发明的MMWH比LMWH和肝素更有效并且比水蛭素更安全。改变动脉血栓形成预防模型使得对相同动物可以评价药效和安全性两方面。通过测定受伤兔主动脉中经90分钟远侧达到95％狭窄时的流量来评价药效，通过使用兔耳模型测定经30分钟血液流失来评价安全性。以三个剂量水平比较四种混合物。以大丸剂和灌输剂施用各混合物90分钟。下面图中列出的剂量代表大丸剂和灌输剂/60分钟，施用90分钟。肝素剂量以单位/千克表示，LMWH和V21剂量以毫克/千克表示，水蛭素以毫克/千克表示。V21具有与LMWH类似的抗-Xa活性，并且是LMWH的抗-IIa活性的大约两倍。因此，LMWH的特异活性是100抗-Xa单位/毫克和30抗-IIa单位/毫克。V21的特异活性是100抗-Xa单位/毫克和60抗-IIa单位/毫克，而肝素的特异活性是大约150抗-Xa单位/毫克和150抗-IIa单位/毫克。以下面的剂量比较抗凝剂。肝素50单位/千克和75单位/千克；LMWH和V210.5，1.0和1.5毫克/千克；水蛭素0.1/0.1，0.1/0.2和0.1/0.3毫克/千克。
为了比较的目的，就抗-Xa活性来说，50单位的肝素相当于0.5毫克的LMWH或V21，但是是0.5毫克V21的抗-IIa活性的两倍以上并且是LMWH的抗-IIa活性的大约4倍。对于相当的抗-Xa活性，V21具有LMWH的抗-IIa活性的大约2倍。
该项研究中获得的结果在图11，12，和13中给出。图11比较了使用经90分钟观察患者保留的主动脉累积时间的四种抗凝剂的药效作为药效的测出结果。100％累计效力反映完全有效，0％累计效力反映立即和持续的血栓闭塞。在对照动物，在用低剂量肝素(50/50单位/千克)和低剂量LMWH(0.5/0.5毫克/千克)治疗的兔中，立即发生狭窄的主动脉凝结化并且在全部90分钟内保持闭塞。用所有的四种抗凝剂都有剂量响应。但是，该模型对肝素和LMWH的抗血栓作用有抗性。因此，75/75单位/千克剂量的肝素和1.0毫克/1.0毫克/千克剂量的LMWH没有效果(累计效力百分比分别是14％和2％)，并且LMWH1.5/1.5毫克/千克只表现出有限的效力(38％累计效力)。相反，该模型对V21和水蛭素的抗血栓作用非常有响应。因此，0.5/0.5毫克/千克剂量的V21比75/75单位/千克剂量的肝素更有效，并且比1.0/1.0毫克/千克和1.5/1.5毫克/千克剂量的LMWH更有效。因此，V21至少比LMWH更有效三倍。
图12说明四种抗凝剂对30分钟血液流失的影响。用LMWH，V21和水蛭素观察剂量响应。表现更有效剂量下，V21比LMWH安全得多，表现出相等药效剂量下，V21比水蛭素更安全。在产生相等程度血液流失剂量下，V21还比肝素有效得多。
图13说明V21和LMWH的安全性和药效的比较。以该数据为基础(即每组中三只动物)，在重量基础上，V21表现出比LMWH更有效大约4倍。因此，对于相等抗-Xa活性，V21比LMWH更有效4倍，而对于相等抗-IIa活性，V21效力大约是2倍。这样的数据支持血纤蛋白-结合的凝血酶促进血栓形成的重要性，因为V21抗血纤蛋白-结合的凝血酶比LMWH或肝素更有效。在0.5毫克/千克和1.0毫克/千克剂量下，V21表现出与LMWH一样安全(尽管它有效得多)，但是在1.5毫克/千克剂量下，LMWH比V21产生更多流血。因此，V21表现出比LMWH更有有益药效与安全性曲线。
实施例4
本发明的MMWH成分(V21)与LMWH比较研究
在兔肝素-敏感性和肝素-抗性血栓形成模型中比较V21(lot#D32)与LMWH(依诺肝素)的药效。肝素-敏感性模型是静脉血栓形成预防模型，肝素-抗性模型是静脉血栓形成治疗模型。V21和LMWH对抗-因子Xa水平和对APTT具有类似的离体效果(图14和15)。因此，在重量基础上比较这两种抗凝剂。
1.1预防模型
a.模型：将体重3千克和4千克之间的27只雄性新西兰白兔随机分成3个治疗组。
b.麻醉：用肌内氯胺酮(50毫克/千克)和噻拉嗪(2毫克/千克)的混合物诱发的麻醉并且用异氟烷(1-3％)和氧(1L/分钟)保持。
c.外科手术：腹侧颈区被刮去并且将两个22-计量器导管(Becton-Dickinson，Sandy，UT)插入左中心冠状动脉和缘冠状静脉用于取血样和用于静脉内给药治疗。通过腹侧颈皮肤切开暴露右面静脉和颈外静脉。从周围组织分离2毫米切片颈静脉并且使用4-0丝线缝合连接分支。这时收集对照动脉血液样品(将1.8毫升血液收集到0.2毫升3.6％柠檬酸钠中)。将血样离心并且将血浆贮存于-70℃用于血液凝固研究(A.PTT.TCT和抗-Xa)。施用I-126标记的兔血纤蛋白原静脉大丸剂(10微升至1,000,000,00CPM)。然后对兔随机进行下面的静脉内治疗之一：
1. 1毫升盐水的盐水(n＝9)静脉内大丸剂
2. 0.50亳克/千克(n3)，1.00毫克/千克(n3)，1.5毫克/千克(n＝3)剂量的低分子量肝素(n＝9)(Lovenox，依诺肝素钠，lot#923，Rhone-Poulenc Rorer，Montreal，魁北克，加拿大)。
3. 0.50毫克/千克(n＝3)，1.00毫克/千克(n＝3)，和1.5毫克/千克(n＝3)剂量的V-21(n＝9)(D-32，lot#521982132)。
给药治疗之后4分钟通过15个管的充气气球导管(#4，Fogarty血小板切除术导管)将右颈静脉破坏2厘米长。通过右面静脉将气球导管插入右颈静脉。气球静脉伤害之后立即拔下导管并且取第二份动脉血样。另外，还采集1毫升血液用于测定放射性。然后通过在静脉周围放置两条止血带在2厘米右颈静脉切片中诱导血液停滞。闭塞15分钟之后切除颈静脉切片并且放到预先称重的棉团上称重。然后，采集第三个动脉血样用于血液凝固测试分析。
d.终点：
以静脉片段中截留的血液的重量百分比计算血块重量(％)。以1毫升全血放射性的百分比计算血块放射性(％)。对血浆样品分析APTT，TCT和抗-Xa。
附图16给出了该程序的示意图。
e.结果：
如图16，17，和18(对于血块重量)和图19，20和21(血块放射性)所示，在该肝素-敏感性模型中两种物质都有效，但是y21产生更大的剂量反应并且在两个更高剂量时比LMWH更有效。
1.2兔模型深静脉血栓形成的治疗
a.24小时跟踪
该项研究的目的是比较对兔深静脉血栓形成模型皮下施用V21和LMWH的效果。
通过肌内注射氯胺酮(50毫克/千克)和噻拉嗪(2毫克/千克)麻醉24只没有特殊病原体的雄性新西兰白兔(体重3千克和4千克)。刮去腹侧颈区并且用醇和碘溶液进行准备处理。用一个22-计量器静脉导管(Angiocath，Becton-Dickinson Vascular Access，Sandy，Utah，USA)将静脉导管和动脉导管插入左中心冠状动脉和缘冠状静脉用于取血样和用于静脉内给与液体和抗凝剂。将兔转移到操作室并且保持吸入麻醉剂，所述麻醉剂由异氟烷(1-4％)，氧(1L/分钟)和一氧化二氮(0.5L/分钟)组成，用面罩送入。
b.血块形成：通过腹侧皮肤切开暴露右颈外静脉和面静脉。通过0.5厘米距离两处4-0丝线缝合实现面静脉片段闭塞。在4厘米长度中连接颈静脉所有的分支。将Fogarty血小板切除术导管(#4Fr)通过面静脉插入颈静脉并且充气。通过15个管的充气气球导管将颈静脉破坏4厘米长后拔下导管。受伤静脉周围两处用4-0丝线缝合制造1.5厘米闭塞颈静脉片段，然后用手指压迫排空。从心房主动脉排出1毫升动脉血到1毫升针管中并且在灭菌试管中与大约1μCi碘-125标记的兔血纤蛋白原混合。然后将0.6毫升放射性标记的血液从试管排到1毫升针管中，并且首先将0.4毫升标记血液平均分到两个试管中并且使其凝固。然后通过家用插管(与PB#60连接的23计量针头)将剩下的0.2毫升注射到闭塞的颈静脉片段中。在试管中产生的血块用作血块称重和放射性的基础值。试验研究证明试管中产生的血块和颈静脉中产生的血块的血块重量或放射性有大约5％的差异。使颈静脉中产生的血栓化脓30分钟并且连接面静脉。血栓形化脓兔随机接受下面的处理25分钟：
1)盐水处理(n＝4)皮下注射无菌盐水BID；
2)1毫克/千克BID剂量，皮下(n＝4)，和3毫克/千克BID剂量，皮下(n＝4)，低分子量肝素(依诺肝素钠，Lovenox lot#923，Rhone-Poulenc Rorer，Montreal，魁北克)。
3)1毫克/千克BID皮下(n＝4)剂量，和3毫克/千克BID剂量皮下(n＝4)，V-21(D-32，lot#521982132)。
第一剂量的30％是静脉给药，70％皮下给药；第二剂量只是皮下给药。在去除止血带之前30分钟，用两处丝线缝合将血栓固定在静脉壁上防止其在手术后期间移动。去除止血带之后颈静脉中没有残留狭窄。以常规方式缝合颈切口。使兔恢复呼吸100％氧气并且转移到恢复室。以24小时间隔使所有的兔安乐死。
c.血液收集：在手术之前(对照)和血块化脓之后5分钟，1，3，6，9，12和24小时采集动脉血。在各时间间隔采集2毫升柠檬酸化血液(9∶1比例，3.8％柠檬酸钠)用于APTT.TCT和Xa测试。通过静脉内注射盐水补偿血液流失。
d.终点：
计算诱导凝固(在试管中产生血块)时和终点后24小时时以毫克表示的血栓重量(AG Balances#104，Mettler Toledo，FisherScientific Limited，Whitby，Ontario)和血栓放射性(CPM)。
利用24小时血块重量减去手术时试管中产生的血块重量除以试管中产生的血块重量乘以100计算血块重量变化百分比(PCCW)。
以％表示的血块(CA)增重计算如下：AC＝PCCW-CL
e.结果：
如图23-28所示，在该肝素-抗性模型中，V21比LMWH更有效。
实施例5
通过肝素的有限高碘酸氧化作用/水解制备本发明的MMWH成分
1.1肝素的有限高碘酸氧化作用/水解研究
将肝素溶解于重水中制成10％贮存液。将高碘酸钠溶解于重水中制成100mM贮备溶液并且保持在4℃。室温下，在2.5％肝素浓度下，在递增高碘酸盐浓度1mM，2.5mM，5mM，8mM，10mM和20mM下，高碘酸盐氧化反应进行大约18小时。通过加入50mM乙二醇中止反应并且温育30分钟。然后，向该反应混合物加入0.25N NaOH，并且室温下温育3小时。反应之后，用6N HCl将pH调节到pH7。使等分的各反应混合物通过HPLC-GPC(G2000柱，0.5函数/分钟，注入体积20微升)进行分子量分析。与高碘酸钠浓度渐增的肝素相比，5mM，8mM，10mM和20mM高碘酸钠浓度下反应的分子量分布减小。结果表明使用大约5mM和大约20mM之间的高碘酸钠浓度并且在室温下大约18小时能够实现期望的裂解。研究(没有给出)表明，室温下用0.25N NaOH室温下用3小时能够实现最好的碱解。因此，该项实验中使用的反应条件称之为“有限高碘酸盐/水解”条件。
1.2通过有限高碘酸盐氧化作用/水解制备本发明的MMWH成分
用有限高碘酸盐/水解条件，7mM高碘酸钠，处理100毫克肝素，并且通过P30凝胶-过滤色谱纯化肝素。获得分子量范围大约6,000道尔顿至大约12,000道尔顿并且具有大约9,000道尔顿最高分子量的30毫克终产物，即V21-D32。
实施例6
进行研究来选择具有最佳分子量范围的MMWH成分并且鉴定容易按比例增加来获得该范围内的肝素级分的制备方法。
选择6,000和10,000之间的分子量范围作为最佳分子量范围。相当于20个糖单元的6,000最小分子量的成分应该提供具有足够长来桥接抗凝血酶和凝血酶的含有五糖链的肝素链。具有相当于33个糖单元的最大分子量10,000，该链将(1)太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白，一种需要40个糖单元或更多糖单元的现象，和(b)太短不能表现出对血浆蛋白质的非特异性结合，一种30个糖单元或更多糖单元发生的现象。
肝素级分：
用肝素酶，亚硝酸或高碘酸盐将没有分级的肝素解聚得到大约6,000，8,000和10,000道尔顿的级分。通过这三种方法将产生的最初的级分多分散化，利用肝素酶或亚硝酸解聚制备这些分子量的尺寸更限制的级分。表1中说明这些级分的特征和它们的特异抗-Xa和抗-IIa活性。
对抗凝血酶的亲合力
如上所述测定各肝素级分对抗凝血酶的亲合力(Weitz等，循环(Ciruculation)1999：99：682-689)。简要地说，使用Perkin-ElmerLS50B发光光谱仪，200nm(6-nm狭缝宽)下激发含有2毫升20mMTris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl(TBS)中的100nM抗凝血酶的石英管，并且在340nm(6-nm狭缝宽)驱动下及时连续检测固有荧光。用微搅棒搅拌试管内含物，并且用再循环水浴保持在25℃。在加入各种肝素级分的10毫克/毫升溶液5-10毫升之前(I0)和之后(I)测定固有荧光强度。连续滴定直到I没有变化。实验之后，从时间驱动曲线读出I值并且计算I/I0值，并且对肝素浓度作图。然后如前所述(Weits等，上文)分析数据。从该分析，能够获得化学计量，其说明为指示各肝素链中包含的五糖链的比例。
表2中总结了亲合力。所有的说明都是估算的各级分中包含的五糖链的百分比。通过肝素酶或亚硝酸解聚制备的级分表现出类似的对抗凝血酶的亲合力。尽管通过高碘酸盐解聚制备的10,100Da级分表现出的对抗凝血酶的亲合力类似于肝素酶或亚硝酸解聚得到的级分，但是高碘酸盐衍生的低分子量级分具有与它们的降低的抗-IIa和抗-Xa活性相吻合的更低的亲合力(表I)。可以解释为，不考虑用于解聚的方法，随着平均分子量增加，包含五糖链的百分比增加。
作为这些分析的对照，也研究了没有分级的肝素，使用抗凝血酶柱通过亲和色谱制备的高和低亲合力级分的肝素，依诺肝素和合成的五糖。如表3所述，高亲合力级分的肝素和合成的五糖表现出对抗凝血酶最高的亲合力。只有这两个制剂具有100％含五糖链。
对凝血酶的亲合力
如上所述测定多分散肝素酶，亚硝酸和高碘酸盐-衍生的肝素级分对凝血酶的亲合力，除了使用凝血酶代替抗凝血酶(Fredenburgh，JC等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)  1997：272：25493-25499).如表4所述，当以微克/毫升表示亲合力时，所有的级分表现出类似的对凝血酶的亲合力。
在血纤蛋白单体不存在或存在下抗凝血酶对凝血酶抑制作用的肝素-催化的速率
在没有或有0-600微克/毫升浓度范围的各种肝素级分存在下，测定抗凝血酶对凝血酶抑制作用的二级速率常数。在没有或有4μM血纤蛋白单体存在下测定抗凝血酶对凝血酶抑制作用的肝素-催化的速率。如上所述制备血纤蛋白单体，如文献所述分析数据(Becker DL等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，1999：274：6226-6233)。
给出了用肝素酶(图29)，亚硝酸(图30)和高碘酸盐-衍生的肝素级分(图31)通过抗凝血酶血纤蛋白-单体对凝血酶的抑制速率的抑制作用。用血纤蛋白单体的背景抑制作用是通过测定血纤蛋白单体通过抗凝血酶对因子Xa灭活的肝素-催化的速率的抑制作用6倍(图32和33)。用肝素酶或亚硝酸-衍生的肝素级分的凝血酶灭活速率的减小比用没有分级的肝素的小。相反，用高碘酸盐-衍生的肝素级分见到用血纤蛋白单体更大的抑制作用(图31)。用尺寸-限制的肝素酶-衍生的级分，血纤蛋白单体产生不高于背景抑制作用的抑制作用。
抗凝血酶对因子Xa的肝素-催化的抑制作用：
如文献所述(Becker等，上文)，在没有或有0-1,500微克/毫升浓度范围的各种肝素级分存在下，测定抗凝血酶对因子Xa抑制作用的二级速率常数。图34-36分别详细说明了用肝素酶，亚硝酸，和高碘酸盐-衍生的级分的结果。当以重量测定等量加入时，所有的肝素级分比没有分级的肝素级分产生更小的抗凝血酶对因子Xa抑制作用的催化作用。
凝血酶结合血纤蛋白的增强
如上文所述(Becker等，上文)，在没有或有0-7500nM浓度范围的各种肝素级分存在下，测定I125-标记的凝血酶与血纤蛋白的结合。在这些实验中使用没有分级的肝素作为对照。图37-39分别详细说明了用肝素酶，亚硝酸，和高碘酸盐-衍生的肝素级分的结果。不考虑解聚方法，与低分子量级分相比，10,000Da级分将凝血酶与血纤蛋白的结合增强到更大的程度。这用尺寸更加限制的肝素酶或亚硝酸-衍生的级分最好地详细说明(分别见图40和41)。
肝素级分的抗凝血酶活性
用体外循环来比较肝素级分的抗血栓活性。如上文所述(Becker等，上文)，向再钙化的用125I-标记的人血纤蛋白原增强效果的人全血加入不同浓度的各肝素级分，并且保持在37℃水浴中。然后使用蠕动泵使血液通过40μ血液过滤器循环。通过(a)用一体化压力计量器测定靠近过滤器的压力，和(b)从血库中连续取出血样并且计量作为血纤蛋白原消耗指数的残留放射性，来测定过滤器中血块。也测定起始激活凝固时间。
如表5所示，不考虑解聚方法，10,000Da级分在10微克/毫升下有效。因此，在90分钟的观察时间里过滤器效力保持，并且血纤蛋白原消耗小于10％。在10微克/毫升浓度下，肝素酶-衍生的8,000Da级分有效。6,000Da肝素酶级分在14微克/毫升下有效。尽管14或16微克/毫升的5,600Da亚硝酸-衍生的级分效力保持，但是血纤蛋白原消耗分别是33％和20％。作为对照，也评价了依诺肝素。该药物在10或20微克/毫升下无效，分别在30和55分钟不能过滤。
表6详细说明尺寸更加限制的肝素酶和亚硝酸-衍生的肝素级分的抗凝血酶活性。在10微克/毫升依诺肝素作为对照下，对所有的级分在10微克/毫升浓度下测试。除了5,300Da肝素酶-衍生的级分，所有的肝素级分有效保持效力90分钟以上，并且将血纤蛋白原消耗减小至低于10％。相反，依诺肝素则无效，30分钟时不能过滤，并且血纤蛋白原消耗73％。表7详细说明尺寸更加限制的肝素酶和亚硝酸-衍生的肝素和高碘酸盐级分的抗凝血酶活性。在10微克/毫升依诺肝素作为对照下，对所有的级分在10微克/毫升浓度下测试。肝素酶和亚硝酸衍生的级分氨基化效力有效。高碘酸盐-衍生的级分和依诺肝素效力较低。
要明白上面的说明是为了详细描述而不是限制性的。通过阅读上面的说明，很多实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。因此，本发明的范围不应该参照上述描述来确定，而应该参照后面的权利要求书以及要求的权利要求等同全范围来确定。所有文章和参考文献的公开内容，包括专利申请和专利公开，在这里对于所有目的全文引作参考。
                          表1
                 LEO提供的肝素级分的表征解聚方法             分子量    多分散性    抗-IIa    抗-Xa肝素酶               6,000       1.5        72        106
                 8,500       1.5        100       134
                 10,350      1.5        152       111HNO2                5,600       1.5        59        118
                 8,200       1.4        100       152
                 10,300      1.4        119       180IO4 -               6,700       1.5        11        30
                 7,900       1.5        19        43
                 10,100      1.5        43        88
                 10,300      1.5        42        84肝素酶               5,300       1.2        22        81
                 8,450       1.2        67        116
                 9,750       1.3        87        155HNO2                5,900       1.2        32        95
                 7,700       1.3        84        123
                 9,300       1.2        106       162
                           表2
    肝素级分对抗凝血酶的亲合力和各级分中含五糖链的百分比葡萄糖胺聚糖                       Kd           含五糖
                               nM              ％肝素酶  6,000                  91.2±15.9         14.8
    8,050                  61.7±4.2          20.8
    10,350                 48.0±7.8          27.0HNO2   5,600                  55.6±0.2          16.0
    8,200                  42.5±9.1          25.2
    10,300                 37.5±2.9          31.5IO4 -  6,700                  170.1±27.4        6.8
    8,200                  140.3±4.5         10.5
    10,300                 57.0±28.3         25.6肝素酶  5,300                  421.6±72.3        15.9
    8,450                  167.0±17.0        29.4
    9,750                  138.4±2.2         32.2HNO2   5,900                  32.8±0.3          21.1
    7,700                  23.1±4.1          26.9
    9,300                  17.0±0.3          36.6
                             表3
   没有分级的肝素，对抗凝血酶有高或低亲合力的肝素，
        依诺肝素和合成五糖对抗凝血酶的亲合力和
              各制剂中含五糖链的百分比葡萄糖胺聚糖               Kd             含五糖
                       nM                 ％没有分级的肝素            31.7               43.1高亲和性肝素              10.7               114低亲和性肝素              6670.0             1.0依诺肝素                  46.8               14.4五糖                      31.0               102
                         表4
    肝素酶和亚硝酸-衍生的肝素级分对凝血酶的亲合力葡萄糖胺聚糖                Kd               Kd
                        nM              μg/ml肝素酶  6,000          1517±196            9.1±1.2
    8.050          872±9               7.0±0.1
    10,350         699±97              7.2±1.0HNO2   5,600          1288±92             7.2±0.5
    8,200          695±37              5.7±0.3
    10,300         632±51              6.5±0.5IO4    6,700          731±159             4.9±1.1
    7,900          587±8               4.6±0.1
    10,100         285±5               2.9±0.5
                          表5体外循环中肝素酶，亚硝酸和高磺酸盐-衍生的肝素级分
          和依诺肝素的抗血栓活性葡萄糖胺聚糖      浓度      不能过滤时    血纤蛋白    起始
                          的时间       消耗        ACT
             μg/ml         min         ％         sec肝素酶  6kDa        8            75         82         271
                10         ＞90         68         248
                12         ＞90         31         226
                14         ＞90         7          335
    8kDa        5            40         70         241
                6            45         70         230
                8          ＞90         54         256
                10         ＞90         6          282
    10kDa       5            45         72         231
                6          ＞90         36         299
                8          ＞90         29         300
                10         ＞90         4          327HNO2   5.6kDa      10         ＞90         29         238
                12         ＞90         57         235
                14         ＞90         33         238
                16         ＞90         20         264
    8.2kDa      10           60         81         239
                11         ＞90         28         313
                12         ＞90         10         301
                16         ＞90         8          428
    10.3kDa     8          ＞90         14         303
                10         ＞90         28         287
                11         ＞90         7          341
                12         ＞90         7          359IO4 -  6.7kDa      10           45         68         -
    7.9kDa      10           90         73         299
    10.1kDa     10         ＞90         6          318依诺肝素            10           30         73         202
                20           55         64         231
                          表6
          体外循环中10微克/毫升肝素酶亚硝酸-衍生的
            肝素级分和依诺肝素的活性比较葡萄糖胺聚糖        不能过滤时      血纤蛋白      起始
                   的时间        原消耗        ACT
                     min         ％            sec肝素酶  5,300             30         80            205
    8,450           ＞90         9             283
    9,750           ＞90         8             312HNO2   5,900           ＞90         11            278
    7,700           ＞90         5             314
    9,300           ＞90         8             557依诺肝素                  30         73            202
                        表7
    体外循环中10微克/毫升肝素酶、亚硝酸衍生的和高磺酸
             衍生的肝素级分和依诺肝素的活性比较葡萄糖胺聚糖         不能过滤时       血纤蛋白       起始
                   的时间          原消耗        ACT
                     min            ％           sec肝素酶    8,450          ＞90           7.1          289HNO2     7,700          ＞90           5.6          296IO4       7,900          30             77           242依诺肝素                 30             80           232

Claims (34)

1.一种中等分子量肝素(MMWH)成分，其中包含分子量范围大约6,000道尔顿至大约12,000道尔顿的寡糖硫酸酯的混合物。
2.根据权利要求1的MMWH成分，其中所述MMWH成分(1)通过催化抗凝血酶抑制血纤蛋白-结合的凝血酶和液相凝血酶，和(2)通过抗凝血酶催化因子Xa失活来抑制凝血酶产生。
3.根据权利要求1的MMWH成分，其中所述MMWH成分具有大约40U/毫克至大约100U/毫克的抗因子IIa活性，和大约90U/毫克至大约150U/毫克的抗因子Xa活性。
4.根据权利要求3的MMWH成分，其中所述MMWH成分具有大约60U/毫克至大约75U/毫克的抗因子IIa活性，和大约100U/毫克至大约125U/毫克的抗因子Xa活性。
5.根据权利要求4的MMWH成分，其中所述MMWH成分具有大约65U/毫克的抗因子IIa活性，和大约115U/毫克的抗因子Xa活性。
6.根据权利要求1的MMWH成分，其中所述MMWH成分包含分子量范围大约8,000道尔顿至大约10,000道尔顿的寡糖硫酸酯的混合物。
7.根据权利要求1的MMWH成分，其中所述MMWH成分具有大约9,000平均分子量。
8.根据权利要求1的MMWH成分，其中所述寡糖硫酸酯的至少31％具有大于或等于大约7,800的分子量。
9.根据权利要求1的MMWH成分，其中所述寡糖硫酸酯的至少25％具有大于或等于大约10,000道尔顿的分子量。
10.一种中等分子量肝素(MMWH)成分，特征在于下面特征的一项或多项的包含肝素衍生的寡糖的混合物：
(a)体外具有抗凝血酶-和肝素辅因子II(HCII)-相关的抗凝剂活性；
(b)寡糖太短不能桥接凝血酶和血纤蛋白，但是有足够的长度桥接抗凝血酶或者HCII和凝血酶；
(c)具有至少15％，20％，25％，30％，35％或40％的具有至少一个或多个五糖序列的寡糖；
(d)富集分子量范围是大约6,000至大约11,000；7,000至10,000；7,500至10,000；7,800至10,000；7,800至9,800；或7,800至9,600；8,000至9,600的寡糖；
(e)寡糖具有大约7,800至10,000，优选7,800至9,800，更优选8,000至9,800的平均分子量；
(f)至少30％，35％，40％，45％或50％的寡糖具有大于或等于6000道尔顿，优选大于或等于8000道尔顿的分子量；
(g)1.1至1.5，优选1.2至1.4，最优选1.3的多分散性；
(h)具有类似的抗-因子Xa和抗-因子IIa活性，优选抗-因子Xa活性和抗-因子IIa活性之比是大约2∶1至大约1∶1，更优选地，大约1.5∶1至大约1∶1；
(i)抗-因子Xa活性是大约80IU/毫克至大约155IU/毫克，优选90IU/毫克至大约130IU/毫克，更优选地，大约95IU/毫克至大约120IU/毫克，最优选100-110IU/毫克；和
(j)抗-因子IIa活性是大约20IU/毫克至大约150IU/毫克，优选40IU/毫克至大约100IU/毫克，更优选地，大约80IU/毫克至大约100IU/毫克，最优选大约90-100IU/毫克。
11.根据权利要求10的MMWH成分，其具有(a)，(b)，(c)和(d)的特征；(a)，(b)，(c)和(e)的特征；(b)，(c)，(e)和(g)的特征；(b)，(d)，(c)，(e)和(h)的特征；(b)，(c)，(d)和(g)的特征；(b)，(e)，(g)，(i)和(j)的特征；(b)，(e)，(f)，(g)，(i)和(j)的特征；或者(a)至(j)的特征。
12.根据权利要求10的MMWH成分，其富集具有7,800至8,800，优选7,800至8,600，更优选7,800至8,500，最优选8,000至8,500分子量范围的寡糖。
13.根据权利要求10的MMWH成分，其富集具有9,000至10,000，优选9,200至9,800，更优选9,300至9,600，最优选9,400至9,600分子量范围的寡糖。
14.根据权利要求10的MMWH成分，其包含具有7,800至8,800，优选7,800至8,600，更优选7,800至8,500，最优选8,000至8,500平均分子量的寡糖。
15.根据权利要求10的MMWH成分，其包含具有9,000至10,000，优选9,200至9,800，更优选9,300至9,600，最优选9,400至9,600平均分子量的寡糖。
16.从没有分级的肝素的肝素酶解聚或亚硝酸解聚衍生的权利要求10，11，12，13，14，或15中要求的MMWH成分。
17.治疗患者血栓疾病的方法，包括对患者施用药学可接受剂量的前面权利要求任一项中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分。
18.根据权利要求17的方法，其中所述血栓疾病是动脉血栓形成，冠状动脉血栓形成，静脉血栓形成或肺栓塞。
19.根据权利要求17的方法，其中所述MMWH成分通过注射给药。
20.预防有发生血栓形成危险的患者形成血栓的方法，包括对患者施用药学可接受剂量的前面权利要求任一项中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分。
21.根据权利要求20的方法，其中所述患者由于破坏止血的医学症状而有增加的发生血栓形成的危险。
22.根据权利要求21的方法，其中所述医学症状是冠状动脉疾病或动脉粥样硬化。
23.根据权利要求20的方法，其中所述患者由于医疗过程而有增加的发生血栓形成的危险。
24.根据权利要求23的方法，其中所述医疗过程是心脏手术，心肺旁路术，导管插入术，或动脉粥样硬化斑切除术。
25.根据权利要求24的方法，其中所述导管插入术是心脏导管插入术。
26.抑制患者血栓形成的方法，包括对患者施用药学可接受剂量的前面权利要求任一项中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分步骤。
27.含有前面权利要求任一项中要求的MMWH成分和药学可接受载体的药物组合物。
28.治疗患者深静脉血栓形成的方法，包括对接受矫形外科手术的患者施用药学可接受剂量的前面权利要求任一项中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分。
29.预防患者肺栓塞的方法，包括对患者施用药学可接受剂量的前面权利要求任一项中要求的中等分子量肝素(MMWH)成分。
30.一种制备中等分子量肝素(MMWH)成分的方法，包括：
(a)使没有分级的肝素进行有限高碘酸盐氧化反应使得只氧化没有分级的肝素的艾杜亚硝酸；
(b)将步骤(a)的氧化的没有分级的肝素进行碱解；和
(c)回收所述MMWH成分，其中所述MMWH成分包含分子量范围大约8,000道尔顿至大约12,000道尔顿的寡糖硫酸酯的混合物。
31.前面权利要求任一项中要求的MMWH成分在制备用于治疗血栓疾病或者预防有发生血栓形成危险的患者形成血栓的药物的用途。
32.前面权利要求任一项中要求的MMWH成分在制备用于抑制患者血纤蛋白-结合的凝血酶或凝血酶产生的药物的用途。
33.前面权利要求任一项中要求的MMWH成分在制备用于治疗深静脉血栓形成的药物的用途。
34.前面权利要求任一项中要求的MMWH成分在制备用于预防患者肺栓塞的药物的用途。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102585202A (zh) * 2006-08-03 2012-07-18 柏林自由大学 树形聚甘油硫酸酯和磺酸酯及其对炎性疾病的用途
CN108424474A (zh) * 2017-02-15 2018-08-21 清华大学 去抗凝肝素衍生物及其用于炎症性肠病的治疗
CN110381958A (zh) * 2017-01-11 2019-10-25 费塔格拉斯有限公司 中等分子量肝素
CN114096259A (zh) * 2018-06-14 2022-02-25 菲塔哥拉斯有限公司 用于缺血性中风的治疗和二级预防的ld肝素

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES512091A0 (es) * 1981-05-12 1984-07-16 Common Sense Products Pty Ltd Perfeccionamientos introducidos en recintos resistentes a la intemperie para aparatos electricos utilizados en aparcamientos puertos, viviendas y similares.
RU2322245C2 (ru) * 2000-01-10 2008-04-20 Дитер ВЕЛЬЦЕЛЬ Гепарин со средней молекулярной массой
JP2005505537A (ja) * 2001-08-28 2005-02-24 レオ・ファーマ・アクティーゼルスカブ 低分子量ヘパリンと低分子量デルマタン硫酸とを含む抗血栓組成物
AU2003303301B2 (en) 2002-05-03 2008-08-07 Massachusetts Institute Of Technology Delta4,5 glycuronidase and uses thereof
US20040171819A1 (en) 2002-10-10 2004-09-02 Aventis Pharma S.A. Mixtures of polysaccharides derived from heparin, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
GB0327723D0 (en) * 2003-09-15 2003-12-31 Vectura Ltd Pharmaceutical compositions
RU2451515C2 (ru) * 2006-05-25 2012-05-27 Момента Фармасьютикал, Инк. Композиции гепарина низкой молекулярной массы и их применение
CA2652205A1 (en) * 2006-05-25 2007-12-06 Mallik Sundaram Low molecular weight heparin composition and uses thereof
EP2256137A1 (en) * 2009-05-05 2010-12-01 Sanofi-Aventis Novel sulfated octasaccharide and its use as antithrombotic agent
EP2256136A1 (en) * 2009-05-05 2010-12-01 Sanofi-Aventis Novel acylated decasaccharides and their use as antithrombotic agents
KR100971551B1 (ko) * 2010-04-29 2010-07-21 (주)안세기술 항공 및 해상 교통관제시스템 운용에 최적화된 다용도 스트립 프린터
CN104144950B (zh) * 2011-12-19 2017-09-05 迪乐方有限责任公司 含有重复的二糖单元的非抗凝的葡糖胺聚糖及其医药用途
WO2013095215A1 (en) * 2011-12-19 2013-06-27 Dilaforette Ab Low anticoagulant heparins
GB202106972D0 (en) * 2021-05-14 2021-06-30 Bhogal Pervinder Singh Medium molecular weight heparin

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3766167A (en) * 1971-03-26 1973-10-16 Research Corp Orally active anticoagulant
US4500519A (en) * 1978-11-06 1985-02-19 Choay S.A. Mucopolysaccharides having biological properties, preparation and method of use
US4692435A (en) * 1978-11-06 1987-09-08 Choay, S.A. Mucopolysaccharide composition having a regulatory action on coagulation, medicament containing same and process of preparation
SE449753B (sv) * 1978-11-06 1987-05-18 Choay Sa Mukopolysackaridkomposition med reglerande verkan pa koagulation, lekemedel innehallande densamma samt forfarande for framstellning derav
CA1136620A (en) * 1979-01-08 1982-11-30 Ulf P.F. Lindahl Heparin fragments having selective anticoagulation activity
IL61201A (en) * 1979-10-05 1984-09-30 Choay Sa Oligosaccharides having no more than 8 saccharide moieties,their obtention from heparin and pharmaceutical compositions containing them
US4826827A (en) * 1979-10-05 1989-05-02 Choay S.A. Short chained oligosaccharides having biological properties, a process for making the same and the use thereof as drugs
FR2504535B1 (fr) * 1981-04-28 1987-08-14 Choay Sa Disaccharides derives d'un acide uronique et d'une glucosamine et compositions pharmaceutiques les contenant pour le controle de la coagulation sanguine
DE3265781D1 (en) * 1981-05-21 1985-10-03 Akzo Nv New anti-thromboticum based on polysacharides, method for its preparation and pharmaceutical compositions
US4396762A (en) * 1981-08-24 1983-08-02 Massachusetts Institute Of Technology Heparinase derived anticoagulants
CA1195322A (en) * 1982-07-19 1985-10-15 Eduardo Amaya Process for manufacturing low molecular weight heparins by depolymerization of normal heparin
FR2538404B1 (zh) * 1982-12-28 1985-08-23 Anic Spa
US4948881A (en) * 1982-12-28 1990-08-14 Sanofi Process for the depolymerization and sulfation of polysaccharides
IT1195497B (it) * 1983-03-08 1988-10-19 Opocrin Spa Procedimento per la preparazione di frazioni oligosaccaridiche dotate di proprieta' farmacologiche per degradazione chimica di eparina
US4687765A (en) * 1983-07-25 1987-08-18 Choay S.A. Method and composition for thrombolytic treatment
FR2568774B2 (fr) * 1984-05-30 1989-05-19 Choay Sa Medicaments favorisant les proprietes d'ecoulement du sang et leur utilisation en therapeutique
IT1208509B (it) * 1985-03-13 1989-07-10 Mediolanum Farmaceutici Srl Processo per la produzione di eparan solfato e dermatan solfato naturali sostanzialmente puri eloro impiego farmaceutico.
US4916219A (en) * 1985-03-28 1990-04-10 University Of Iowa Research Foundation Oligosaccharide heparin fragments as inhibitors of complement cascade
IT1214609B (it) * 1985-05-17 1990-01-18 Opocrin Spa Esosaminoglicani solfati depolimerizzati ad attivita'antitrombotica, fibrinolitica, antinfiammatoria, loro procedimento di preparazione e composizioni farmaceutiche che li contengono.
FR2584728B1 (fr) * 1985-07-12 1987-11-20 Choay Sa Procede de sulfatation de glycosaminoglycanes et de leurs fragments
US5106734A (en) * 1986-04-30 1992-04-21 Novo Nordisk A/S Process of using light absorption to control enzymatic depolymerization of heparin to produce low molecular weight heparin
DK196886D0 (da) * 1986-04-30 1986-04-30 Novo Industri As Fremstilling af polysaccharider
US4745107A (en) * 1986-08-20 1988-05-17 Foley Kevin M Heparin derivatives with improved permeability
US4745106A (en) * 1986-08-20 1988-05-17 Griffin Charles C Heparin derivatives having improved anti-Xa specificity
US4745105A (en) * 1986-08-20 1988-05-17 Griffin Charles C Low molecular weight heparin derivatives with improved permeability
FR2614026B1 (fr) * 1987-04-16 1992-04-17 Sanofi Sa Heparines de bas poids moleculaire, a structure reguliere, leur preparation et leurs applications biologiques
EP0300099A1 (en) * 1987-07-20 1989-01-25 Akzo N.V. New pentasaccharides
EP0337327A1 (en) * 1988-04-09 1989-10-18 Bioiberica, S.A. Process for the preparation of new oligosaccharide fractions by controlled chemical depolimerization of heparin
IT1234508B (it) * 1988-06-10 1992-05-19 Alfa Wassermann Spa Derivati eparinici e procedimento per la loro preparazione
US4981955A (en) * 1988-06-28 1991-01-01 Lopez Lorenzo L Depolymerization method of heparin
GB8826448D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Thrombosis Res Inst Improvements in/relating to organic compounds
US5380716A (en) * 1988-12-15 1995-01-10 Glycomed, Inc. Sulfated polysaccharides as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
US5382570A (en) * 1990-04-23 1995-01-17 Akzo, N.V. Sulfated glycosaminoglycanoid derivatives of the dermatan sulfate and chondroitin sulfate type
US5378829A (en) * 1990-04-23 1995-01-03 Akzo N.V. Sulfated glycosaminoglycanoid derivatives of the heparin and heparan sulfate type
FR2663639B1 (fr) * 1990-06-26 1994-03-18 Rhone Poulenc Sante Melanges de polysaccharides de bas poids moleculaires procede de preparation et utilisation.
IT1245761B (it) * 1991-01-30 1994-10-14 Alfa Wassermann Spa Formulazioni farmaceutiche contenenti glicosaminoglicani assorbibili per via orale.
US5280016A (en) * 1991-03-29 1994-01-18 Glycomed Incorporated Non-anticoagulant heparin derivatives
US5250519A (en) * 1991-03-29 1993-10-05 Glycomed Incorporated Non-anticoagulant heparin derivatives
SE9101155D0 (sv) * 1991-04-18 1991-04-18 Kabi Pharmacia Ab Novel heparin derivatives
US5707973A (en) * 1991-04-23 1998-01-13 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Sulfated polysaccharids for treatment or prevention of thromboses
SK120193A3 (en) * 1991-05-02 1994-07-06 Yeda Res & Dev Pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of pathological processes
IT1245907B (it) * 1991-05-17 1994-10-25 Alfa Wassermann Spa Uso dei glicosaminoglicani nel trattamento della nefropatia diabetica e della neuropatia diabetica.
US5849721A (en) * 1992-02-07 1998-12-15 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Sulfated polysaccharides obtained from heparin, preparation process, pharmaceutical composition and use thereof
IT1260136B (it) * 1992-04-17 1996-03-28 Alfa Wassermann Spa Glicosaminoglicani semisintetici contenenti acido alfa-l-galatturonicosostituito con radicali nucleofili in posizione 3
IT1260137B (it) * 1992-04-17 1996-03-28 Alfa Wassermann Spa Glicosaminoglicani semisintetici a struttura eparinica od eparanica modificati nella posizione 2 dell'acido alfa-l-iduronico-2-0-solfato
IT1264530B (it) * 1992-07-31 1996-10-02 Crinos Industria Farmaco Impiego dei polisaccaridi nelle neuropatie atrofico degenerative
SE9302135D0 (sv) * 1993-06-18 1993-06-18 Kabi Pharmacia Ab New pharmaceutical composition
IT1264709B1 (it) * 1993-07-12 1996-10-04 Italfarmaco Spa Derivati eparinici ad attivita' antimetastatica
US5583121A (en) * 1994-01-12 1996-12-10 Michigan State University Non-anticoagulant chemically modified heparinoids for treating hypovolemic shock and related shock syndromes
US6127347A (en) * 1994-01-12 2000-10-03 Univ Michigan Non-anticoagulant chemically modified heparinoids for treating hypovolemic shock and related shock syndromes
FR2718849B1 (fr) * 1994-04-14 1996-06-14 Pasteur Sanofi Diagnostics Procédé d'immunodosage de l'antithrombine III activée par un glycosaminoglycane, anticorps monoclonaux correspondants et leur procédé d'obtention.
US5681733A (en) * 1994-06-10 1997-10-28 Ibex Technologies Nucleic acid sequences and expression systems for heparinase II and heparinase III derived from Flavobacterium heparinum
US5639469A (en) * 1994-06-15 1997-06-17 Minnesota Mining And Manufacturing Company Transmucosal delivery system
IL114955A (en) * 1994-08-17 1999-12-22 Novo Nordisk As N-substituted naphthofused lactams and pharmaceutical compositions containing them
IT1274351B (it) * 1994-10-06 1997-07-17 Alfa Wassermann Spa Uso di alcuni glicosaminoglicani nella dialisi peritoneale.
US5763427A (en) * 1995-03-31 1998-06-09 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis
US5744457A (en) * 1995-03-31 1998-04-28 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Compositions and methods for inhibiting thrombogenesis
US5922690A (en) * 1996-04-25 1999-07-13 Van Gorp; Cornelius L. Dermatan disulfate, an inhibitor of thrombin generation and activation
IL120722A (en) * 1996-05-08 1999-07-14 Akzo Nobel Nv Polysulfated tetrasaccharide derivatives and pharmaceutical compositions containing them
US5767269A (en) * 1996-10-01 1998-06-16 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Processes for the preparation of low-affinity, low molecular weight heparins useful as antithrombotics
US5741881A (en) * 1996-11-25 1998-04-21 Meadox Medicals, Inc. Process for preparing covalently bound-heparin containing polyurethane-peo-heparin coating compositions
HUP9903496A3 (en) * 1996-11-27 2001-03-28 Aventis Pharmaceuticals Inc Co Pharmaceutical composition comprising a compound having anti-xa activity and a platelet aggregation antagonist compound
US6075013A (en) * 1997-06-06 2000-06-13 Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc. Modified low molecular weight heparin that inhibits clot associated coagulation factors

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102585202A (zh) * 2006-08-03 2012-07-18 柏林自由大学 树形聚甘油硫酸酯和磺酸酯及其对炎性疾病的用途
CN110381958A (zh) * 2017-01-11 2019-10-25 费塔格拉斯有限公司 中等分子量肝素
CN108424474A (zh) * 2017-02-15 2018-08-21 清华大学 去抗凝肝素衍生物及其用于炎症性肠病的治疗
CN114096259A (zh) * 2018-06-14 2022-02-25 菲塔哥拉斯有限公司 用于缺血性中风的治疗和二级预防的ld肝素

Also Published As

Publication number Publication date
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US20080119438A1 (en) 2008-05-22

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