CN1062537A - 新的肝素衍生物 - Google Patents

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Abstract

低分子量肝素衍生物及其盐通过溶于杂环有机 溶剂或非质子传递溶剂中的肝素季铵盐与具有6到 30个碳原子的烷基化剂在20℃到60℃温度下反应 足够长时间，并在5到120℃温度下，将反应生成物 与无机或有机碱如碱性氢氧化物水溶液反应，再分离 所得肝素衍生物为其游离态或其碱盐。本发明制得 的肝素衍生物包括绝大多数为具有狭窄分子量范围 的解聚产物的混合物。这些产物作为抗血栓形成剂 使用。

Description

本发明涉及新的具有药理学性质的肝素衍生物，改良了普遍有利于销售市场的肝素制剂及应用于抗凝血治疗。新衍生物抗凝血酶活性和Xa因子活性和血小板因子4（PF4）的活性之间关系不同于肝素的这类关系。也就是说，它们的重要的对PF4亲和性伴有抗凝血酶Ⅲ和凝血酶之间的反应活性的减小，这些反应活性可被肝素催化。
同样，抗凝血酶Ⅲ和Xa因子在肝素自身催化下的反应对新衍生物来说更为敏感。由于它们对PF4及在对凝血酶和Xa因子的活性和肝素相比具有不同比例，新衍生物能避免血栓形成并可阻止血栓出血。这种现象可伴随肝素对抗血栓形成而产生的，必须注意过量的凝血酶抑制剂作用能引起出血的活性。新衍生物的性能结合PF4，在低浓度的能催化被Xa因子活化的反应，及在高浓度下只能被凝血酶活化的反应，使得这些组合物可作为药物应用于动脉和静脉血栓。
该新的肝素衍生物及其盐可通过将从大于6个碳原子的碳氢化合物衍生的醚化剂处理得到，在室温或略高于室温下与肝素的季铵盐反应。将该季铵盐溶于杂环有机溶剂中并经长时间反应，该杂环有机溶剂选自于N-烷基-吡咯烷基-2-酮，N-烷基-哌啶基-2-酮之类的化合物。可以取代或未取代的碳烷基取代，它们的衍生物可在杂环中被其他杂原子或杂基团选自于所基团-O-，-S，和-NH-的杂原子或杂基团所隔断，或在存在于非质子传递溶剂中的这种化合物的浓溶液中，再在高温下用一种有机或无机盐水溶液处理，并分离在肝素衍生物得到游离化态产物或其碱盐，且如果需要，可将化合物互相转化成游离态，或碱性盐或其它金属以及或有机碱的盐。
这种新的肝素衍生物，其上述的药理性能不同于肝素，它改良了其化学结构和不同的分子量;其化学结构未完全确定，然而已经被查明如下：
a）由绝大多数的解聚产物的混合物组成，因而与原产物相比具有中等-低的分子量，丰富的分子量在相似窄小范围的相似片段，以及具有比平均段偏小的最小片段。
b）与原产物相比，还显著的地减少了艾杜糖醛酸型糖单元和葡糖醛酸型单元间的比例。
另一种肝素的化学结构修筛，可在新肝素衍生物中找到，这部分已经在一些由肝素酯的碱处理得到的肝素片段中描述，例如在不饱和单糖体存在下的脱硫酸根作用。
对新的肝素衍生物的鉴定可通过所述的化学测试完成，除了所述化学测试之外应用光谱，特别是核磁共振法（NMR），尤其能从本文描述的肝素片断中区分出新衍生物。
用一种醚化剂处理肝素季铵盐，该醚化剂选自于通常所用试剂，也就是说，可衍生于一种低碳碳氢化合物，如低碳烷基，卤化物，如乙基溴化物，并在习惯应用试剂中，如二甲亚砜或二甲基甲酰胺，引用肝素酯，如英国专利No.1501095中描述的。如在碱处理这些酯，那么可在本发明步骤第二步中使用，得到不同的肝素片断，并可用NMR分析验证。
实施例中所述的新的低分子量肝素衍生物包括一种有机产物，可主要根据NMR光谱数据高频处数据体现（对质子用为400-500MHZ对C-13用为100-125MHz，它采用传统的FT中一因次法，用至少二因次法（H-H和C-H关联使用）证实，在可能情况下采用更先进方法（例TOCSY二全关联光谱法），在研究这些复杂产物中这些研究都是必要的。
对于所用方法所得结果的全面检测，这是可能的得到下述结论：
1）该新“低分子量肝素”是一种复杂的寡糖混合物，在N及O位上硫酸化，反应出原肝素的多相性。其基本组成包括IdoA及Glc-nAc，不同地被硫酸化，且进一步包括次级结构（尤其是GlcA）相互连结在一起，提供了不同的顺序关系。
2）对于起始原料的肝素来说，本发明目的是产物显示了低的I-doA/GlcN率的比例，该减少可用NMR检测出来。进一步说，典型的IdoA程序的异头基部位的信号（2SO3）-ClcNSO3）（6SO3）（102和99.5为碳，5.18和5.32为质子）证实了强烈的降低作用。而这种变化在已知的低分子量肝素中不能察觉的，即使可能，也是在颇低程度。同时，显著的强信号显示了一种新的未取代的单糖单体（见第4点）。
3）另一种特征是新信号的显示（在54.2和53.3ppm处为碳，相关联的质子分别在3.73和3.68ppm处），它们是相配伍的与本文中只在2位上具有GlcN残余物，而在N原子上没有SO3H基。这种特征经2-D核磁共振检测证实在已知的低分子量肝素样品中是实际上不存在的。
4）特别是，大多数的寡糖末端带有不饱和的单糖单体、在1-2位三取代的上述低聚糖可通过NMR表示（信号在147和172ppm为C-13，在6ppm处双峰为质子）：这些信号在其他已知的低分子量肝素是不显示的或极其衰弱。
因而必须尽可能明确指出，本发明步骤的第一步反应不是简单的酯化反应，而更复杂的化学反应。
因而从这些发现中可假定为本发明的肝素类产物是新的且不同于资料中已记载的肝素片断：例如，不同与欧洲专利NO.03020304中记载的片断，通过肝素酯碱化处理得到，片断适合于形成带铜离子的复合物它具有生成血管的作用物的形成。同样，在U.S专利NO4，440，926中记载的已经确实的肝素片断通过原料严格限制的肝素酯经NaOH 0.1-0.5N在20到60℃间处理得到，不能确定为本发明的产物上述的本发明新的肝素衍生物性能可通过下列实验鉴定，其所往事的方法记载于实施例中并且已知标号名称为PE，在该实验中，未分级的肝素（UFH）与低分子量肝素衍生物（CY216＝Frax-ipsrineR）为对比产物。这些产物是商业上可供应酸并能同样适用于治疗血栓形成。
示图简述
下列实验中的参考图
图1表示：与UFH和CY216相比的PE体外试验中的抗凝血活性，所得的凝血酶时间（秒）数据表明每一测试物7-10次的重复所得的平均值。
图2表示：
UFH和CY216相比的PE体内试验抗凝活性：经静脉注射后对凝血酶时间影响，用于第一试验产品用5个免子实验所得平均值的数据。
图3表示：
与UFH和CY216相比的PE体内抗凝活性：
抗FXa活性（皮下注射后未显示的动力学）数据来于用于每一测试物的5只兔子试验的平均数值。
图4表示静注后对PF4的体内活性，与UFH及CY 216相比对PE的亲和性，
1.在体外重建中的抗凝活性
HUMAN  PLASMA
材料和方法
产物测试（溶解度和浓度）
测试下列产物：
-肝素衍生物PE
-未分解肝素（UFH）
-低分子量肝素衍生物（CY216-FraxiparineR）
这些测试产物溶于无菌盐水，并在浓度为0.5到12.5μg/ml范围间测试。
参数
1.凝血酶时间（作为抗凝活性的指示）
2.抗FXa活性（作为抗凝活性的指示）
结果
1.凝血酶时间
结果列于图1，表明：
-PE在浓度1.25μg/ml开始具有抗凝活性。
-PE的抗凝活性可认为是明显地小于未分极肝素UFH。（与UFH相比，其所须凝血酶时间的浓度可比UFH大4-5倍。
并观察到与CY216无重大不同。
2.抗FXa活性
结果列于表1，初步数据表明：
-PE在浓度3μg/ml开始具有抗FXa活性。
-该抗FXa活性可清楚地比肝素为差。然而，也必须注意该活性也比CY216为差的这项性能：但是与在UFH比较观察中得到的结果相等，区别较UFH为小。
表1：
与未分级肝素和CY216相比PE在体外试验中的抗FXa活性
浓度  UFH  CY216  PE
（μg/ml）
0.5  0.336  -  -
1  -  0.331  0.342
1.5  0.281  -  -
2.5  0.212  -  -
3  -  0.261  0.296
3.5  0.179  -  -
5  -  0.200  0.245
7  -  0.158  0.201
数据在每一测试产物每个浓度测三次。
2.于体内试验中经静脉注射及皮下注射之后在兔子血浆中抗凝活性。
新的肝素衍生物PE的抗凝活性通过体内试验法在兔子血浆上显示。我们测试了尤其是：
a）凝血酶时间，用经静脉中急性注入（i.v.）大丸剂测试用产物后的动脉血;
b）抗FXa活性，急性皮下注射（s.c.）后的动脉血测试。
这种方法具有高度的敏感性，表示了测试物的生物利用度，经皮下注射给药后表示了监测产物消失的动力学产物。
将测试产物溶于无菌盐水溶液且注射急性为静脉注射0.86mg/kg的剂量和皮下注射1-2mg/kg剂量。
测试的叙述
a）凝血酶时间
本测试表明了经静脉注射后注射大丸剂测试物后的在各种时间隔隙（2-5-10-20-30-40分钟）下，取兔子动脉血实测凝血酶时间。
b）抗FXa活性
通过测量抗FXa活性（用对极低浓度化合物敏感的染色体基因测验）可以监测该测试物在循环很长时间内存在。动脉血的样品（从耳朵的中枢动脉）发生在皮下注射后各种间隔内取样，（1-2-3-4-5-6-7-8小时）。
结果
a）凝血酶时间
结果列于图2，表示：
-PE在静注中0.86mg/kg时具有低抗凝活性，确定了体外试验数据。
-PE的抗凝活性也明确比UFH为差，但与CY216无明显不同。
b）抗FXa活性
图3表示
-PE（皮下注射1mg/kg后）UFH能在长时间内保持存在于循环中，当增加到2倍量时，即2mg/kg皮下注射。
因此肝素衍生物PE的消失动力学比UFH为慢但和CY216相似。
3.体内试验中对血小板因子4（PF4）的亲和力
通过下述的实验描述，我们可测得新的肝素衍生物PE对人体PF4的亲和力，即，这些产物对PF4的结合性能。
在体内试验中监测在不存在肝素及存在肝素下PF4在循环中消失的动力学。
我们已经知道肝素或葡糖胺基聚糖（GAGS），先于PF4给药，则明显增加其动力学（G.Cella et al：人体血小板因子4和兔子中含有葡萄胺基聚糖和硫酸鱼精蛋白的相互作用物。Eur.J.ctin，Invest.17：548-554;1987）。
结合PF4的化合物也因此能延长其在循环中的存在。这种效应与GAG注入量及其对PF4亲和性成正比。
测试物溶于无菌盐水溶液及其注入量静注0.8mg/kg。
测试的叙述
测试物的给药是急性的（静脉大丸剂注射），剂量0.86mg/kg。注射后2-3分钟后从耳朵的中心动脉取血样在第一大丸剂给药用后5分钟，再给药含纯人体PF4的第二次给药（30μg/kg）。
实验在PF4给药后1.5-2.5-5-10-20-30分钟取样。取来后经离心分离储存这些可用RIA试验法（一般适用于小动物）测试人体PFA。
结果
列于图4，得到的数据表明：
-PE对血小板因子PF4具有亲和性，并逐渐从循环中消失直到给药后30分钟到达低值。
-PE对PF4的亲和性比UFH低（约低60%），且和PF4的复合物的消失动力学远比UFH快得多，但其与CY216相同。
4.兔子血栓模型中在体内试验中抗血栓的形成活性。
下述的实验确定了新肝素衍生物PE的体内抗血栓形成的活性。其目的是测验产物效应以避免在兔子颈动脉中的动脉血栓的急性模型中的动脉血栓的形成的效果，以及内皮损伤和血管直径的减小。
测试物溶于无菌盐水，且静注法给药浓度在1.2-6mg/kg内。
模型的叙述
实验在用Nembutal（30mg/kg大丸剂静注）麻醉的兔子上进行并切开气管以强制呼吸。将一根管子植入股动脉及动脉以连续注射麻醉剂和药物。监测全身血压以及将颈动脉用流速计和圈套器固定。当系统稳定后，在一定时间间隔内进行动脉狭窄的测量。（不少于20分钟后，可用外科手术钳进行机械损伤，且在损伤的血管上形成动脉狭窄。
监测流量减少程度直到0值，相当地关闭血管。以同样方法控制颈动脉。然后总计在8分钟内，将测试物用静脉输，输注后两分钟进行机械损伤。
流量经监测成保持恒量直到给药后至少一小时，实验结束后用可用过量麻醉剂杀死动物。
结果
列于表2，数据表明：
-PE能彻底避免闭合血栓的形成：其效应在静注6mg/kg较显著。
-PE的抗血栓形成效应比未分级肝素UFH差（约差5倍），可观察到低至mg/kg时形成闭合血栓，PE的药物效应与CY216相同。
表2
在兔子动脉狭窄模型中的与未分级肝素（UFH和CY216）相比较，PE的抗血所形成的活性。
产物  静注用量  NO.闭合的动物数
NO.处理过的动
物数
UFH  1.2mg/kg  2/12
PE  6mg/kg  2/12
3mg/kg  6/8
CY216  6mg/kg  2/12
3mg/kg  5/9
5.在体内试验中静脉血栓中抗血栓形成的活性。
下述实验确定大鼠静脉血栓模型中PE的静注抗血栓形成活性。
通过阻止腔静脉下位应用静脉停滞技术，由于血流在连在左肾静脉的腔静脉分支的变化，该方法能导致主要纤维蛋白血栓的形成。
因而实验模型证实了通过给药及停滞作用对抗凝血素药物的活性敏感度，特别是对肝素的抗血栓形成可得到证明是灵敏的（在闭塞作用及停滞使用后）。
将测试物溶于无菌盐水，静脉内注射剂量静脉注射0.5-3mg/kg（在停滞发生前15分钟）。
测试描述
实验在重175-200克的CD-COBS雄性大鼠身上进行。动物先用戊巴比妥钠麻醉（40mg/kg腹腔注射），其下侧用乙醇消毒。在大鼠身上在腹部中央从肋骨开始切开4-cm口子。将沿股动脉的中部从共同骼骨动脉上，分离出腔并立即用棉线在连有左肾静脉的分叉处束紧。并立即双重闭塞在夹叉下面的左肾并必须保持恒定压力约5秒钟。然后缝合腹部。2小时后，再打开腹部以确证血栓形成情况。隔断股动脉后，相当与共同骼骨动脉，循环中具有止血药，闭塞后的血管用针纵向切开，取出血栓，浸入蒸馏水中，用纸吸干然后放入干燥箱内干燥24小时，测定干燥产物重量用克表示。
结果
涉及静脉停滞后2小时的血栓重量（mg）（表3）数据和血栓发生率1%（表4）的数据表明。
-PE具有抗血栓形成效应;其保护性效应（预处理）在1.5mg/kg静注时显露。
-PE的这个效应比未分级肝素UFH（其在0.5mg/kg静注，即表现出这种效应）为差。
表3
与UFH相比，静脉停滞模型中PE在体内的抗血栓形成效应：静脉停滞2小时后得到的血栓重量（mg）（静注测试物后15分钟，所得到的效应）。
用量（mg/kg  i.v）
产物  0  0.5  1.0  1.8  2.0  3.0
n＝15  n＝14  n＝24  n＝20  n＝14  n＝14
PE 2.2 1.4 1.5 0.8＊0.0＊＊0.0＊＊
UFH 2.2 0.7＊0.5＊＊0.02＊＊- -
＊P＜0.05，＊＊＜0.01 Dunnett的测试
n＝动物个数
表4
与UFH相比在静脉停滞模型中PE体内的抗血栓形成效应：静脉停滞2小时后得到的血栓发生率（%）（在静注给药测试物后15分钟所产生的效应）。
用量（mg/kg  i.v）
产物  0  0.5  1.0  1.8  2.0  3.0
n＝15  n＝14  n＝24  n＝20  n＝14  n＝14
PE  93.3  85.7  62.5  60.0  0.0  0.0
UFH  93.3  57.1  50.0  14.3  -  -
n＝动物个数
6.对大鼠出血时间的影响
下述实验确定的静脉注入测试物15分钟后PE对出血时间效应。
测试物溶于无菌盐水，其静脉给药浓度在1-3mg/kg范围间。
测验描述
该实验在CD-COBS雄鼠（175-200gr）身上进行，测试实体经静脉急性给药。
在切割、尾部的标准模板法15分钟后观察出血时间（用秒计）（Dejana  et  al：大鼠出血时间：不同实验条件的比较。Thromb  Haemo-stat  48：108-111;1982）
结果
所得数据（表5）表明
-PE对“出血时间”的影响在2.0mg/kg  i.v.时显著增加。
-PE的效应明显比未分级肝素低（后者出血值在1mg/kg静注时即显著增加），但与CY216相近（数据未报导）。
令人感兴趣的是要得到出血时间相同值PE的给药量必须至少比UFH大三倍。
表5：静注测试物15分钟后，PE与UFH对出血时间（秒）影响的比较。
用量（mg/kg  e.v.）
产物  0  1.0  1.5  2.0  3.0
n＝14  n＝14  n＝14  n＝14  n＝14
PE 130 146 147 250＊389＊＊
UFH 130 413＊＊487＊＊- -
＊P＜0.05;＊＊P＜0.01 Dunnett的测试
n＝动物个数
7.在小鼠内用静注及皮下注射体内法后的耐受性
本实验是观察在鼠体内经静注及皮下给药化合物DE后的最大耐受性。
测试物溶于无菌盐水，测试浓度为125-2000mg/kg之间用静注及皮下注射。
测试描述
实验在CD-1雄鼠和雌鼠（C.River（25-35gr）身上时间，包括两步。
1）筛选组：省经下列之一的剂量治疗的一个雄鼠和一个雌鼠：125，250，500，1000和2000mg/kg。观察治疗七天内的死亡率。
2）组包括5只雄小鼠和5只雌小鼠用（每一化合物及每一种给药途径）治疗，在筛选组基础在具有最大耐受剂量。观察14天，期间可观察动脉活动的死亡率及存在，和一般中毒症状。在死亡率实例中从最小剂量开始，直到发现最大耐受剂量。如可能，可在所述动物身上进行尸体解剖。
结果
1.静注耐受量
如表6和表7的本测试化合物最大耐受量值证实如下：
-PE1000mg/kg静注
-未分级肝素UFH：125mg/kg静注
-CY216  1000mg/kg静注
因此可注意到PE耐性未分级肝素UFH大。解剖在治疗后死亡的动物经未分级肝素UFH在500和250mg/kg治疗后死亡的动物，肉眼未发现可见物，除在某些动物中，可能在肠中存有内出血残留物。
2.皮下注射耐受性
所得结果列于表8和表9，表示测试和产物的最大耐性如下：
-PE：2000mg/kg  s.c.
-未分级肝素UFH：125mg/kg  s.c.
-CY216：2000mg/kg  s.c.
似静脉给药途径，PE的耐性远比未分馏肝素（UFH）大，与CY216相似。
较重要地指出：
-在所有用CY216  2000mg/kg治疗的动物（10/10）中可在背部观察到皮肤表面有坏死的圆形面积，相应于注射部位，其大小在各动物上不同（最大直径约1cm）。解剖发现坏死只限于表皮，因此并不影响其下层肌肉。
-在用PE2000mg/kg  s.c.治疗的动物中观察到无异常现象。
-经UFH250mg/kg治疗后死亡的动物在背部皮下存在过敏性伤痕，当其部位是经治疗时。
因而皮下耐性受数据表明了化合物PE与CY216的不同：进一步说，尽管他们最大耐受性用量相同，但是CY216皮肤坏死区域出现在注射位置，表明CY216的局部耐受性比PE小（后其未出现异常现象）。
表6：
经单次静脉注射后，化合物PE，CY216及未分级肝素的致死率（筛选）
治疗  死亡动物  治疗动物
（mg/kg静注）  雄性  雌性
PE2000  0/1  0/1
PE1000  0/1  0/1
PE500  0/1  0/1
PE250  0/1  0/1
PE125  0/1  0/1
CY216  2000  1/1  0/1
CY216  1000  0/1  0/1
CY216  500  0/1  0/1
肝素UFH  2000  1/1  1/1
肝素UFH  1000  1/1  1/1
肝素UFH  500  0/1  0/1
肝素UFH  250  0/1  0/1
肝素UFH  125  0/1  0/1
表7
经单次静脉注射药物后PE，CY216及未分级肝素的致死率
治疗  死亡动物/治疗动物  死亡时间
（mg/kg静注）  雄性  雌性  治疗后天数
立刻  1  2  3  4
PE2000  3/7  1/5  2  -  1  -  1
PE1000  0/5  0/5  -  -  -  -  -
CY216  1000  0/5  0/5  -  -  -  -  -
肝素500  0/5  2/5  -  2  -  -  -
UFH250  3/5  0/5  -  3  -  -  -
125  0/5  0/5  -  -  -  -  -
＊在治疗分钟内
表8：
单次皮下注射药物后的化合物PE，CY216及未分级肝素UFH的致死率（筛选）
治疗  死亡动物  治疗动物
（mg/kg  s.c.）  雄性  雌性
PE2000  0/1  0/1
PE1000  0/1  0/1
PE500  0/1  0/1
PE250  0/1  0/1
PE125  0/1  0/1
CY216  2000  0/1  0/1
CY216  1000  0/1  0/1
CY216  500  0/1  0/1
肝素UFH  2000  1/1  1/1
肝素UFH  1000  1/1  0/1
肝素UFH  500  1/1  0/1
肝素UFH  250  0/1  0/1
肝素UFH  125  0/1  0/1
表9
单次皮下注射用药物后的化合物PE，CY216及未分级肝素（UFH）的致死率
治疗  死亡动物/治疗动物  死亡时间
（mg/kg静注）  雄性  雌性  治疗后天数
立刻  1  2  3  4
PE2000  0/5  0/5  -  -  -  -  -
CY216  2000  0/5  0/5  -  -  -  -  -
肝素250  1/5  2/5  -  2  1  -  -
UFH125  0/5  0/5  -  -  -  -  -
结论
前面的体外及体内结果描述出肝素衍生物PE的令人感兴趣药理性能全貌，并与未分级肝素（UFH）区分，使它的药理结果更有价值。
PE的活性略不同于CY216，后者是法国市场上普遍使用的最好的低分子量肝素之一，并表明尤其是在鼠身上进行皮下注射后的较佳局部耐受性：进而言之，尽量其最大耐受性用量相同，所用经CY216（2000mg/kg  s.c.）治疗的动物在其皮肤注射部位存有明显坏死，而经PE治疗的动物皮肤无反应。
药物体内及体外活性例中，可发现PE具有：
-抗凝血活远比UFH低;
-皮下注射药物后的生物利用度远比UFH大，对于相同药理效应，每天只需给予少量药物;
-与UFH相比，有其较小的出血时间及在注射部位不存在皮肤坏死表明其副作用较小，与CY216相比（法国市场上最好的小分子量肝素），CY216能引起所有径其治疗的动物的局部不能耐受现象（坏死）;
-体内抗血栓形成活性表现在大鼠静脉停滞模型及兔子动脉血栓模型中。产物在1.5和6mg/kg之间的静注剂量间能有效地防止这些疾病发生，更佳地，不引起任何显著变化的副作用。
特别是，对于静脉部位的抗血栓活性，用量为1.5mg/kg静注的衍生物PE不会引起出血时间变化，与UFH不同。
本发明的新的，低分子量肝素衍生物可作为抗凝血和血小板凝结抑制剂以取代未分级肝素所有特征应用。其用量适用每一特殊例子，用静注途径，正规量为1-7mg/kg每天。
在本发明操作中所述的前面步骤中所用的肝素可为任何类型或各种起始原料，例如肝素可取于猪、牛、羊的肠和牛心脏，尤其是任何种类在商业上可提供的普遍适用或文献中记载的各一产物具有较宽范围分子量，例如2，000和30，000D之间，特别是未分级肝素UFH，也可以用从标准肝素中分级（2000-10，000D）的低分子量肝素。以及，分子量为500-10，000D的肝素片断可用化学或酶方法从部分解聚肝素得到。用于所述步骤的原材料季铵盐可用已知方法制备，例如通过肝素钠盐或钾盐的水溶液，如带有季铵基的磺酸型树酯处理。出来的季铵盐可通过冷冻干燥流出液得到。作为季铵盐，主要应用衍生于低碳烷基的四烷基铵盐，特别是带有最大值为6个碳原子的烷基，也有可能力烷基芳基铵盐，如带有长支链烷基基团。在四烷基铵中，四丁基铵盐特别通用本发明步骤中原材料季铵盐可通过上述方法运用碱盐从离子交换液中得到，例如常用类型的肝素的钠或钾盐，即将中性盐：与过量季铵盐离子反应以得到相应的中性盐。
季铵盐是溶解性的可溶于上述的杂环溶剂，和对质子有惰性的极性有机溶剂，如二甲亚砜放二甲基甲酰胺。按工艺的第一步反应，与醚化剂的反应可在上述的杂环溶剂或与对质子有惰性的有机溶剂之一的溶液中进行，较佳在浓溶液中。上述杂环溶剂中，较佳为上述所有环结构未取代的溶剂，即，N-烷基-O-芳基-2-吡咯烷酮，或其环结构上含杂环原子的衍生物，如相应的咪唑、哌嗪或吗啉衍生物。
杂环溶剂的N-烷基基团较佳衍生于带最大值六个碳原子的低碳烷基，芳基主要为苯基，可能被1到3低碳烷基取代，特别是甲基。较佳为N-甲基-2-吡咯烷酮。
衍生于具有大于6个碳原子碳氢化合物的醚化剂为一种带相应碳氢基的化合物，如含相应碳个数的醇和有相应数量、酸反应成酯基，可为脂肪族或芳脂族醇，较佳地带有最大值为18个碳原子，如己醇，庚醇，辛醇，壬醇。酯试剂可衍生物无机或有酸，如氢酸，硫酸或亚硫酸，烷基或芳基磺基，如甲基磺酸或邻甲苯磺酸。氢酸酯可为氯化物，溴化物和碘化物。
季铵盐与上述醚化剂的反应在室温或略高于室温下进行，如不超过60℃，保持反应若干小时，如16小时。
反应产物经分离后进入工艺的第二步反应，即碱化处理。或直接转化成最终产物，可直接在溶液中进行碱化处理，可能的话，浓缩第一步反应产物：第一步反应后在温和条件下蒸发溶剂且在残留物中进行碱化处理。因而可能成为本发明步骤的“-锅煮”方法。
肝素季铵盐与醚化剂的反应产物的碱处理次在高温下进行，较佳为50℃到120℃，最佳为约70℃，反应约2小时。使用碱金属水合物，如NaOH或KOH，或其他无机和/或有机碱，较佳浓度为0.1到1M间。所用碱存在于水或乙醇溶液中，而其他溶剂可用水或水-酒精混合物混和，如，用于上述“-锅煮”方法例子中的第一步残留溶剂。
也可选择分离第一步产生产物，通过加入有机极性溶剂沉淀完成，较佳为脂肪族醇，如甲醇或乙醇，较佳地可加入碱缓冲剂，尤其是羧酸碱金属盐，如乙酸或丙酸的钠或钾盐。还可用其他碱缓冲剂，如碱性硫酸氢盐或碱性磷酸盐。沉淀产物较佳地用沉淀作用中使用的极性溶剂洗涤，如甲醇。再经重沉淀一次以上或多次以进一步提纯沉淀产物，也就是，将产物溶解在水中并用乙醇沉淀之。
由低分子量肝素衍生物组成具具有上述性质的反应产物可按常规以金属盐或有机碱游离形式生成。要得到碱盐可在第二步反应中使用碱水合物，溶液并用酸中和，如氯化氢2M，溶液用不混有水的机有溶剂萃取纯化，如二氯甲烷，复重操作多次，用蒸馏水及氯化钠透析并冷冻干燥。
所用新产物主要形式为其金属盐或有机碱盐。宁可得到金属盐而不用碱式盐可在上述碱化反应中存在相应的碱性水合物离子，可能的话可采用已知技术即应用离子交换法。同样，还分离肝素产物的酸型，加入由一定计算量的释强酸至得到的碱盐，如盐酸或硫酸，并用适当有机溶剂提取产物，分离出肝素游离态产物且将其转化成所述盐。
根据本发明所用的金属或有机碱盐中，尤其重要的是药物在治疗上的接受能力，例如碱性或碱土金属，如钠、钾、钙、镁盐，或可能用金属盐，如铜或铁盐;有机碱盐可衍生物伯，仲或叔，脂肪族，芳族或杂环胺，如甲基胺，乙胺，丙胺，哌啶，吗啉，麻黄素，糠醛胺，胆碱乙烯二胺，胺乙醇。
本发明还包括所述的不能直接用于治疗的盐可用于提纯新产物，如一些重金属盐。
本发明的一部分还包括含通过所述方法制得的低分子量肝素衍生物活性组分的药物制剂，尤其是其所述的药物可接受盐。可用于非肠道，如皮下或静脉内服用，或局部使用，如乳膏状或油膏状，或栓剂，或喷鼻剂。因而可作活性化合物溶液或活性化合物冷冻干燥粉末存在，用一种或多种药物上可接受的适用于上述应用的赋形剂或稀释剂混和且具有渗透性它是能和生物流体配伍使用。
本发明除了新的低分子量肝素衍生物外，还包括上述其制备方法。也包括制备方法的单步的实施，即肝素季铵盐与上述限定醚化剂在所述溶剂之一中进行反应及反应产物的碱化处理。本发明实施例如下。
1）注射药物配方
1.1
PE  mg  10  20  30  40
注射用水加至  ml  0.1  0.2  0.3  0.4
装有含用于皮下注射的无菌溶液的待用注射器。
1.2
-PE mg 150 300
其他组份：
注射用水加至  ml  4  8
将有含用于静脉内注射的无菌溶液的小瓶。
1.3
PE  mg  10  20  30  40
其他组份：
氯化钠  mg  0.3  0.6  0.9  1.2
注射用水加至  ml  0.1  0.2  0.3  0.4
装有含用于皮下注射的无菌溶液的待用注射器。
1.4
PE  mg  150  300
其他组份：
氯化钠  mg  35  70
注射用水加至  ml  5  10
装有含用于皮下注射的无菌溶液的小瓶。
1.5
PE  mg  150  300
其他组份：
氯化钠  mg  35  70
焦亚硫酸钠  mg  5  10
氯丁醇（＊） mg 25 50
注射用水加至  ml  5  10
装有含用于各种剂量静脉内注射的无菌溶液的小瓶。
（＊）1.5实施例中存有杀菌剂氯丁醇可用下列取代：
苄醇  mg  50  100
或：
氯甲酚  mg  5  10
2）口服用制剂配方
2.1（丸剂或胶囊剂）
PE  mg  30  60  120
其他组份
磷脂酰胆碱+
磷脂酰丝氨酸（＊） mg 80 160 320
乳糖  mg  50  100  200
微晶纤维素  mg  10  20  40
滑石  mg  3  6  12
胶状硅胶  mg  3  6  12
（＊）配方中磷脂酰胆碱与磷脂酰丝氨酸的比率可以不同。
2.2（丸剂或胶囊剂）
PE  mg  30  60  120
其他组份
磷脂酰胆碱+
磷脂酰丝氨酸（＊） mg 80 160 320
胆甾醇  mg  2  4  8
乳糖  mg  50  100  200
微晶纤维素  mg  10  20  40
滑石  mg  3  6  12
胶状硅胶  mg  3  6  12
（＊）配方中磷脂酰胆碱与磷脂酰丝氨酸的比率可以不同。
2.3（粉末的急救包）
PE  mg  60  120  180
其他组份：
磷脂酰胆碱+
磷脂酰丝氨酸（＊） mg 250 500 750
胆甾醇  mg  5  10  15
乳糖  mg  100  200  300
气味及如果需要
加甜味剂
蔗糖（＊＊）至 mg 2000 4000 6000
（＊）配方中磷脂酰胆碱与磷脂酰丝氨酸的比率可不同
（＊＊）蔗糖可用果糖取代
2.4（延长效果的片剂）
PE  mg  30  60  120
其他组份：
磷脂酰胆碱+
磷脂酰丝氨酸（＊） mg 80 160 320
乳糖  mg  30  60  120
微晶纤维素  mg  5  10  20
羟丙基甲基纤维素  mg  10  20  40
滑石  mg  3  6  12
胶状硅胶  mg  3  6  12
（＊）配方中磷脂酰胆碱与磷脂酰丝氨酸的比率可以不同。
2.5（耐胃液的片剂）
PE  mg  30  60  120
其他组份
磷脂酰胆碱+
磷脂酰丝氨酸（＊） mg 80 160 320
乳糖  mg  50  100  200
微晶纤维素  mg  10  20  40
滑石  mg  30  60  120
胶状硅胶  mg  3  6  12
甲基丙烯酸共聚物  mg  15  30  60
（＊）配方中磷脂酰胆碱与磷脂酰丝氨酸的比率可以不同。
2.6（耐胃液延长效果的片剂）
PE  mg  30  60  120
其他组份：
磷酸酰胆碱+
磷脂酰丝氨酸（＊） mg 80 160 320
乳糖  mg  50  100  200
微晶纤维素  mg  10  20  40
羧丙基甲基纤维素  mg  5  10  20
滑石  mg  30  60  120
胶状硅胶  mg  3  6  12
甲基丙烯酸共聚物  mg  15  30  60
（＊）配方中磷酰酸胆碱与磷脂酰丝氨酸的比率可以不同。
2.7（用于头服用滴剂）
PE  mg  30  60  120
其他组份：
柠檬酸  mg  7.5  15  30
纯水  ml  0.25  0.5  1
2.8（颗粒剂＊）
PE  mg  30  60  120
其他组份：
柠檬酸  mg  7.5  15  30
蔗糖  mg  30  60  60
五味淀粉  mg  12.5  25  25
滑石  mg  5  10  10
聚乙烯基  mg  4  8  8
吡咯烷酮
（＊）每一硬胶丸中含3粒颗剂
2.9（耐胃液颗粒剂＊）
PE  mg  30  60  120
其他组份：
柠檬酸  mg  7.5  15  30
蔗糖  mg  30  60  60
谷物淀粉  mg  12.5  25  25
滑石  mg  5  10  10
聚乙烯基  mg  4  8  8
吡咯烷酮
甲基丙烯酸  mg  10  15  15
共聚物
（＊）每一明胶丸中含3粒颗剂
3.用于鼻或肺的配方
3.1
PE白细粉末  mg  20  40
作为细的白色粉末，其活性细份包含在明胶胶囊中当准备服用时，打开并装入适当器皿中以吸入。
3.2（用以吸入的粉末）
PE细白粉末  mg  20  40
磷酸酰胆碱+
磷脂酰丝氨酸＊mg 30 60
作为细的白色粉末，其活性组份包含在明胶胶囊中，当准备服用时，打开并装入适当器皿中以吸入。
（＊）配方中磷酸酰胆碱与磷脂酰丝氨酸的比率可不同。
4.施用于直肠结存的配方
4.1
PE  mg  30  120
半合成甘油脂  mg  1940  1880
4.2
PE  mg  30  120
磷酸酰丝氨酸+  mg  30  120
磷酸酰胆碱  mg  100  200
半合成甘油酯  mg  1840  1680
概况地说，本发明的低分子量肝素衍生物及其盐通过溶于杂环有机溶剂的的肝素的季铵盐，该杂环有机溶剂选用于N-烷基-吡咯烷基-2-酮，N-烷基-哌啶基-2-酮，可未取代或被低磺烷基取代，反应被其他杂原子或其他杂基团如选自基团-O-，-S-和-NH-隔断的衍生物，或存在于非质子传递溶剂中的所述化合物的浓溶液中，与衍生于具有6到30个碳原子，较佳为8到18个碳原子的碳氢化合物的烷基化剂（醚化剂）在约20℃（室温）到60℃温度下反应较长时间，例如，约5到20小时。然后在5°-120℃温度间，较佳约70℃下，将反应产物与无机或有机碱性水溶液反应。然后，将碱化反应后的产物分离或游离态或其碱金属或碱土金属盐。也可通过互相转化得到其其他金属盐或有机碱式盐。较佳地，在第二步反应步骤中，反应产物与碱性氢氧化物水溶液反应。产物低分子量肝素衍生物及其盐用于药物治疗方面，如，作为抗血栓形成剂。

Claims (25)

1、一种制备低分子量肝素衍生物和/或其盐的方法，其特征在于，
(1)将溶于杂环有机溶剂的肝素的季铵盐，杂环有机溶剂选自于N-烷基-吡咯烷基-2-酮，N-烷基-哌啶基-2-酮，可未取代或被低碳烷基取代，或反应被其他杂原子或其他杂基团如选自基团-O-，-S-或-NH-隔断的衍生物，或存在于非质子传递溶剂中的所述化合物的浓溶液中，与一种衍生于具有6到30个碳原子的碳氢化合物的烷基化剂，在室温或略高于室温的温度下反应，
(2)将反应产物与一种无机或有机碱性水溶液在5°到120℃温度间反应，和
(3)分离肝素衍生物得到其游离态或其碱金属或碱土金属盐。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括转化所述肝素衍生物或盐得到其他金属盐或有机碱式盐。
3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括转化所述的游离态肝素衍生物为药物上可接受的盐或转化所述盐为游离态肝素衍生物。
4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应（2）中所述的反应产物与一种碱性氢氧化物水溶液反应。
5、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，烷基化剂与肝素的季铵盐反应的反应产物是在与无机或有机碱反应前分离出。
6、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的具有分子量变化范围2，000到30，000道尔顿的肝素的季铵盐作为原材料使用。
7、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，未分级肝素的季铵盐作为原材料使用。
8、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，经具有分子量2，000到10，000道尔顿的肝素分级得到的低分子量肝素的季铵盐和经肝素不完全化学或酶促解聚得到分子量为500到10，000道尔顿的肝素片断作为原材料使用。
9、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的季铵盐为其中烷基具有1到6个碳原子的四烷基铵盐。
10、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的季铵盐为四丁基铵盐。
11、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述杂环有机溶剂中的N-烷基为一种具有1到6个碳原子的低碳烷基。
12、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的杂环有机溶剂为N-甲基-吡咯烷酮。
13、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的烷基化剂为一种带6到30碳原子的脂肪族或芳族醇的酸式烷基化剂。
14、如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的烷基化剂具有8到18个碳原子。
15、如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的烷基化剂为碘化物，溴化物或氯化烷基或烷基或芳基磺酸的酯。
16、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，烷基化剂与溶于所述杂环有机溶剂中的季铵盐在20°到60℃温度下反应。
17、如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，烷基化剂与肝素的季铵盐反应的反应产物加入极性有机溶剂沉淀后分离得到。
18、如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的极性有机溶剂为一种脂肪族醇。
19、如权利要求18所述的方法，其特征在于，将碱性缓冲剂加入于所述的脂肪族醇。
20、如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的碱性缓冲剂为一种羧酸碱盐。
21、如权利要求17所述的方法，其特征在于，沉淀产物用相同的有机溶剂反复沉淀多次。
22、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应（2）的反应产物是与碱性氢氧化物或另一种无机和有机碱在浓度为0.1到1M水溶液或醇水溶液中，5°到120℃温度间反应。
23、如权利要求22所述的方法，其特征在于，碱反应步骤是通过用0.1-1M氢氧化钠水溶液在约70℃温度下，足够长时间分离后完成以得到所述的低分子量肝素衍生物和/或其盐。
24、如上述权利要求之一所述的方法，其特征在于，从反应（2）得到的反应产物用碱性水溶液中和，再用不溶水混和的有溶剂萃取，和用蒸馏水及氯化钠透析分离得到。
25、一种制备低分子量肝素衍生物和/或其盐的方法，其特征在于，
（1）将具有分子量为15，000道尔顿溶于N-甲基-吡咯烷酮的肝素的季铵盐与1-碘辛烷在室温下反应约16小时，
（2）将反应溶液倒入加有乙酸钠的甲醇中沉淀出反应产物，
（3）通过从加有乙酸钠的甲醇中重沉淀多次而提纯产物，
（4）将干产物与0，5N氢氧化钠水溶液在近似70℃温度下反应约2小时，
（5）用2M盐酸中和反应溶液，
（6）用二氯甲烷萃取溶液多次，
（7）用蒸馏水和0.1M氯化钠透析溶液，和
（8）冻干所得溶液。
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