CN1039441A

CN1039441A - 毒蛇毒液多肽及基因表达

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Publication number: CN1039441A
Application number: CN89104408A
Authority: CN
Inventors: 保罗·A·弗里德曼; 罗伯特·J·古尔德; 约翰·W·雅各斯; 马克·A·波洛科夫; 杰拉德·H·宾森; 维克托·M·加斯基; 甘忠如
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1988-04-22
Filing date: 1989-04-22
Publication date: 1990-02-07
Also published as: PT90321B; FI891916A; DE68914316D1; EP0338634A3; FI891916A0; DE68914316T2; ATE103931T1; AU3329989A; JPH02138298A; DK192189A; EP0338634A2; NO891662L; NZ228710A; IL89938A0; ES2063113T3; PT90321A; KR900016261A; EP0338634B1; AU627724B2; NO891662D0

Abstract

一种具有下列氨基酸顺序的血小板聚集抑制性多肽：

X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y

其中X是H或至少一个氨基酸；Y是OH或至少一个氨基酸；且各R无论是相同或不同的，均代表任何一种氨基酸。描述了基因工程方法构建的多肽基因及其使用PJC264表达载体在大肠杆菌内作为融合蛋白质的表达。还描述了合成的多肽及合成方法。

Description

本发明涉及抑制血小板聚集作用的多肽。

总地说来，本发明涉及控制细胞粘连、抑制血纤维蛋白原和其他蛋白质与血小板结合，以及抑制血小板的聚集。血纤维蛋白原是一种存在于血浆中的糖蛋白，它参予血小板聚集和血纤维蛋白的生成。血小板是见于所有哺乳动物血液中的细胞无核片段，这些片段参予血液的凝固。已知血纤维蛋白原与受体（血小板膜糖蛋白复合物Ⅱb/Ⅲa）之间的相互作用对于正常的血小板功能是不可少的。

血管损伤时，血小板粘附在破裂的血管内皮下表面上。这种粘附的血小板随后释放出具有生物学活性的成分并导致聚集。凝集作用是因凝血酶、肾上腺素或ADP等激动剂结合于血小板膜受体上而引发的。激动剂引起的刺激作用导致潜在的血纤维蛋白原受体暴露于血小板表面上，并使血纤维蛋白原与糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物相结合。

为了探讨血小板之聚集和粘连作用的机理，已使用天然产物和合成的肽进行过许多实验研究。已由各种蛇毒液中分离出血小板聚集抑制剂蛋白质。但是，在进行血小板聚集作用受这些蛋白质抑制之机理的研究中，多因缺乏结构方面的知识而受到阻碍。

最近，文献详细介绍了一种称为trigramin的毒液肽（见Huang等，J.of Biol Chem.，262;16157-16163，1987及1987年11月16日提交的美国专利申请121972号）。据报导，这种肽可竟争性地抑制血纤维蛋白原与血小板膜上糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物的结合。据信，这种肽含有靠近COOH末端残基的Arg-Gly-Asp顺序。

Rouslahti和Pierschbacher（Science，238：491-497，1987）描述了某些粘连蛋白质，如粘连蛋白、Vitronectin，Osteopontin、胶原、thrombospondin、血纤维蛋白原及存在于细胞外基质和血液中的Von Willebrand因子。这些蛋白质均含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽作为其细胞识别位点。该三肽可被一族结构上相关的受体（integrin）中至少一个成员识别，所说的受体是具有两个跨膜亚单位的异源二聚体蛋白质。作者认为个别蛋白质中三肽顺序的构象可能是产生识别特异性的关键。

Chersh（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：6471-6475，1987）介绍了一种由人内皮细胞表达的Arg-Gly-Asp定向粘连的受体，该受体在结构上与血小板上的Ⅱb/Ⅲa复合物相似，但在抗原性和功能上则有所不同。这种受体直接参予血纤维蛋白原、Von Willebrand因子和Vitronectin在内皮细胞上的结合过程。

Pierschbacher和Rouslahti（J.of Biol.Chem.262，36：17294-17298，1987）描述了Arg-Gly-Asp-Xaa顺序的立体化学对含有三肽顺序Arg-Gly-Asp肽之结合特异性的影响。他们还描述了（Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：5985-5988，1987）保留连接促进活性之粘连蛋白细胞识别位点的变体。四肽Arg-Gly-Asp-Ser被描述为细胞识别的大的、粘连糖蛋白-粘连蛋白中的最小结构。美国专利4，589，881和4，614，517中介绍了某些包含-Arg-Gly-Asp--Ser一部分的肽。美国专利4，578，079中公开了一些包含-Arg-Gly-Asp-R部分的肽，其中R选自苏氨酸、半胱氨酸或其他具有如粘连蛋白样细胞粘连活性的氨基酸。

Ruggeri等（Proc，Natl.Acad.Sci.USA，88：5708-5712，1986）介绍了一系列设计长度达16个氨基，且含有抑制血纤维蛋白原与血小板结合顺序Arg-Gly-Asp-Val的合成肽。

Gold等（Circulation，77，3：670-677，1988年3月）描述了大剂量注射重组单链组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂和抗人血小板GPⅡb/Ⅲa受体之小鼠单克隆抗体（7E3）F（ab′）₂片段对冠状动脉血栓溶解和再阻塞的影响。Gold等人发现，与重组单链组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂一起注射抗血小板受体GPⅡb/Ⅲa之单克隆抗体7E3的F（ab′）₂片段可加速血栓溶解并防止再阻塞。

虽然人们知道三肽Arg-Gly-Asp顺序存在于某些能复制或抑制粘连蛋白及Vitronectin之细胞粘接促进作用的多肽中，但对于多肽中其他氨基酸之结合特异性的影响却所知甚少。申请人鉴定并提纯了一些包含三肽顺序Arg-Gly-Asp的多肽，这些多肽是血小板聚集抑制剂并在与三肽相联系的特定的位置上含有半胱氨酸残基。半胱氨酸的特殊定位，对于这些多肽抑制血小板聚集作用的能力似乎具有很重要的影响。

由于化学合成长链寡聚脱氧核苷酸之可靠方法和仪器的出现，现已能够方便地进行基因合成，而无须分离表达天然基因（Caruthers，Science，230：281-285，1985;Ferretti等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：599-603，1986;Wosnick等，Gene，60：115-127，1987;Nassal，Gene，66：279-294，1988;Bell等，Gene，63：155-161，1988）。这一技术特别适用于表达并以遗传工程方法制备小的天然蛋白质。但是在细菌寄主中表达的许多真核生物蛋白质均不稳定（Taniguchi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5230-5233，1980;Davis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：5376-5380，1981;Shen，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：4627-4631，1984;Lennick等，Gene，61：103：112，1987）。为避免所说的不稳定问题，常用的手段是使所需的基因与编码细菌蛋白的核苷酸顺序相结合，以产生融合的蛋白质，从而保护真核生物蛋白质。

据报导，已将许多化学试剂和蛋白酶用于裂解融合蛋白质上的许多氨基酸位点。如使用溴化氰在蛋氨酸处有效并选择性地切断融合蛋白质（Savige等，Methods in Enzymology，Hirs和Timashelff编，Academic Press，New York，47：459-469，1977;Nagai等，Nature，309：810-812，1984;Szoka等，DNA，5：11-20，1986;Haffey等，DNA，6：565-571，1987）。

本发明包括了血纤维蛋白原-受体拮抗物多肽，其特征在于能够抑制血纤维蛋白原-血小板结合并具有下列结构通式：

X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y （Ⅰ）

其中X是H或至少一个氨基酸;Y是OH或至少一个氨基酸;且R无论是相同的或不同的，均是任何一种氨基酸。

式Ⅰ中的多肽包括了式Ⅰa的多肽：

H₂N-（Ch）-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-

（Cx）-H （Ⅰa）

其中Ch代表至少一个氨基酸;Cx代表至少一个氨基酸;且R无论是相同的或不同的，均代表一种氨基酸。

已从各种毒蛇如Trimeresurus gramineus、Echis Carinatus、Agkistrodon piscivorus、Bitis arietans反Eristocophis macmahonii的毒液中纯化了本发明的多肽。这些多肽可用于抑制血纤维蛋白原与人血小板结合并抑制血纤维蛋白原诱导的人血小板的聚集作用。

可按下述纯化方法由蛇毒液中纯化这些多肽。这些多肽均富含半胱氨酸，并含有共同顺序-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-，其中R不论相同或不同，均代表任何一种氨基酸。

虽然本申请人不希望被束缚于与结合机理有关任何具体理论问题上，但申请人相信半胱氨酸的定位在决定多肽的三维空间构象、刚性程度及结合特异性上起着重要作用。

本发明还包括编码下列结构通式之血小板聚集抑制剂的基因或简并等同物：

X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-Cys-Y

其中X是H或至少一个氨基酸，Y是OH或至少一个氨基酸;且R是任何一个相同的或不同的氨基酸。

本发明的优选基因编码经修饰的小蝰蛇毒素（echistatin）。小蝰蛇毒素被限定为：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

天然蛋白质第28位上的蛋氨酸被重组小蝰蛇毒素中的亮氨酸取代。合成基因是使用表达载体pJC264在大肠杆菌（MB-5385，ATCC贮存登记号为67873，寄存于American Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 U.S.A.），其中载体pJC264是将大肠杆菌Che B和Che Y基因复合物的某些部分插入质粒pUC13中构建的（1988年11月5日提交的145，800号专利申请）。菌株微生物已按布达佩斯条约规定寄存，一旦授予专利后公众即可不受限制地获得该已贮存的微生物。通过在表达载体中与大肠杆菌Che Y基因融合而达到r-leu 28-小蝰蛇毒素基团的高水平表达。用溴化氰在插入到Che Y蛋白和小蝰蛇毒素之间的蛋氨酸处裂解融合蛋白，释放出重组leu 28-小蝰蛇毒素，用反相HPLC法纯化为均一性并使之重新折迭。重新折迭的r-leu28-小蝰蛇毒素在抑制血小板聚集作用上与天然小蝰蛇毒素没有区别，这一点提示28位上的蛋氨酸对于这种血小板聚集抑制剂的生物学活性并不是必不可少的。

本发明还包括借助本发明的蛋白质发挥抑制血小板之凝集作用的组合物，以及用于生产本发明之重组蛋白质的表达载体。

本发明还包括式Ⅰ的合成的多肽及其合成方法。

附图1-重组leu 28-小蝰蛇毒素的核苷酸及氨基酸顺序

用实线标示单个合成的寡聚脱氧核苷酸并在括号内给出核苷酸序号。蛋白顺序之N末端第一个氨基酸-蛋氨酸为溴化氰裂解位点。星号标示蛋白质C末端的终止密码子。Eco RI位点位于向表达载体内插入的5′和3′端。

附图2-pJC264表达载体的结构

下文中将详细讨论pJC264表达载体的构建及r-leu 28-小蝰蛇毒素基团向载体内的插入问题。A.pJC264的结构。箭头标示得自pUC13的顺序。pUC13中的大肠杆菌lac启动子-操纵子位于CheB基因的前面并用箭头指示转录的方向。CheB基因（450bp）和CheY基因（263bp）分别用双线和阴影框标示。其中显示了向其中插入r-leu28-小蝰蛇毒素基因的EcoRI位点。B.Che Y P_stI位点和EcoRI克隆位点之间的DNA顺序，显示了被编码的氨基酸。

附图3-细菌产生之重组leu28-小蝰蛇毒素融合蛋白的SDS-PAGE分析

使含有pJC264-小蝰蛇毒素表达载体的大肠杆菌JM109生长于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。当细胞密度达到OD260读数为0.2时，向培养基内加入IPTG（终浓度为1mM）以开始诱导表达。于诱导后不同时间取培养物的等分样品在Eppendorf离心机内离心。将细胞沉淀团块悬浮于含有50mMTris-HCI（pH6.8）、0.2%SDS、75mM二硫苏糖醇、10%甘油和0.05%溴酚兰的SDS PAGE样品缓冲液中。样品于100℃下加热15分钟并在Eppendorf离心机中离心，然后加到14%SDS聚丙烯酰胺梯度凝胶上。在凝胶上分析相当于100μl饱和培养物（OD₆₀₀＝1.8）的溶胞产物。用考马斯亮兰染色法检测蛋白质。泳道F-J：分别诱导了0、2、4、6和16小时之培养物的溶胞产物;泳道E：经超声处理的细胞团块150μl，得自诱导16小时后的培养物，泳道D：得自100μl用缺少r-leu28-小蝰蛇毒素基因对照pJC264表达载体转化细胞饱和培养物的溶胞产物;泳道B：8μg天然小蝰蛇毒素;泳道C：8μg纯化的重组leu28-小蝰蛇毒素;泳道A：Pharmacia低分子量标志物（图中示出了分子量）;泳道K：Bio-Rad低分子量标准品，从上到下分子量分别相当于92.5、66.2、45.0、31.0、21.0和14.4KDa。

附图4-纯化重组-leu28-小蝰蛇毒素中记录的HPLC图形并与天然小蝰毒素相比较

下文对发明的细节描述中述及纯化和HPLC条件。A：还原的溴化氰裂解混合物;B：在用于溴化氰裂解混合物的同样条件下还原的天然小蝰蛇毒素;C：得自A的纯化之重组-leu28-小蝰蛇毒素的复性混合物;D：天然小蝰蛇毒素。图A和B中箭头分别指示还原的重组-leu-28-小蝰蛇毒素和天然小蝰蛇毒素。图C和D中箭头分别指示复性重组-leu 28-小蝰蛇毒素和天然小蝰蛇毒素的位置。

附图5-重组体（r-leu 28-echistatir）和天然（n-echistatin）小蝰蛇毒素对血小板聚集作用的抑制

在发明的细节描述部分说明了血小板聚集作用的检测条件。A：存在和不存在1.5μM重组体-leu 28-小蝰蛇毒素或天然小蝰蛇毒素时监测到的聚集作用。注意：作为血小板形状改变之指征的透光率的初始降低未受影响。B：存在纯化的重组体（leu28）小蝰蛇毒素（方形）和天然小蝰蛇毒素（园形）时加入ADP后测定聚集的初始速率。

本文中所说的天然蛋白质是指由相应基因产生的全长度蛋白质。重组蛋白质是指分离表达所需蛋白质的基因或cDNA并使用该纯化的基因或cDNA去构建将过量产生所需蛋白质的细胞。文中所说的微观不均一形式是指一种单一基因产物，即由DNA的单一基因单位产生的蛋白质，其在转译后经受结构上的修饰。但这些结构修饰并未导致蛋白质活性的明显改变。修饰作用可发生在体内或分离及纯化过程中。体内修饰可导致（但不局限于）N末端的酰化、蛋白水解、糖基化或磷酸化等作用。蛋白水解作用可包括外切蛋白水解（exoproteolysis），其中一个或多个被连续地酶促裂解产生比原始基因产物有较少氨基酸的微观不均一产物。蛋白水解作用也可包括蛋白内切水解修饰作用（endoproteolytic modification），此作用是由于在蛋白质顺序内特定位点裂解肽的作用。可导致微观不均一形式的纯化过程中亦能够发生类似的修饰作用。纯化期间发生的最常见的修饰作用是蛋白水解作用。

本文所说的重组DNA技术是指这样一种技术：即该技术可使来源于不同细胞（通常是来源于不同生物体）的遗传信息（即DNA）片段，在获得DNA的生物体外端对端地连接，并使该杂交DNA掺入可产生由原始DNA编码之蛋白质的细胞内。分离遗传信息（即DNA或mRNA）并掺入适当的克隆载体中，然后用以转导适当的宿主细胞。

文中所说的克隆载体定义为一种DNA顺序，其可允许特定的实验性外源DNA掺入，同时使结合的DNA被引入能以稳定方式存在并表达由实验性DNA支配之蛋白质的宿主细胞内。与载体DNA结合的外来DNA构成了由DNA重组技术得到的重组DNA分子。克隆载体可包括质粒、噬菌体、病毒和装配型质粒（cosmids）。本文中将表达载体限定为转录已克隆的基因拷贝并在适当宿主内转译其mRNA所需要的DNA顺序。这类载体可用于在各种细胞如细菌、酵母、昆虫及哺乳动物细胞中表达原核或真核生物基因。亦可在许多病毒系统中表达蛋白质。一个以适当方法构建的表达载体应包含：在宿主细胞中自主复制的复制原点、选择标志、一定数目的有用的限制性酶切位点、高拷贝数和强有力的启动子。启动子被定义为指导RNA聚合酶与DNA结合并启动RNA合成的DNA顺序。强启动子是可使mRNA以高频率发挥功能的启动子。表达载体可包括（但不只限于）克隆载体、经修饰的克隆载体、特殊设计的质粒和病毒。

本发明的蛋白质可作为（但不只限于）由限定的天然蛋白质的基因编码的完整蛋白质或其片段及亚单位、或完整蛋白质的杂合体或其片段及亚单位，条件是它们能够保留血小板聚集抑制活性。文中所说的完整蛋白质是指由适当基因产生的全长度多肽。完整蛋白质可以是通过纯化适当的蛇毒液或在适当表达载体中表达相应的重组体的基因产物而得到的。蛋白质片段或亚单位是指蛋白质的任何部分，其含有比完整蛋白质较少些的氨基酸并能在使用天然蛋白质的同样条件下保留抑制血小板聚集的能力。杂合蛋白质包括（但不仅限于）融合蛋白质或表达存在于表达载体中的多个基因而得到的蛋白质。融合蛋白质被限定为这样一种蛋白质，即其中有限数目的氨基酸是由被表达的表达载体编码的，且表达过程可使这些氨基酸连接到特定的血小板聚集抑制性多肽上。由多基因产生的蛋白质可包括通过肽键连接到第二个多肽或肽上的、能增进血小板聚集之抑制作用的特定多肽。

已由Trimeresurus gramineus、Echis carinatus和Agkistrodon piscivorus、Bitis arietans和Eristocophis macmahonii等毒蛇的毒液中分离了本发明范围内的多肽。所有这些多肽都是强有力的血小板聚集抑制剂。

由Echis carinatus毒液中分离的抑制剂具有下示顺序：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

下文中将该抑制剂称为小蝰蛇毒素（Echistatin）。

由Agkistrodon piscivorus毒液中分离的抑制剂具有下示顺序：

Val-Gln-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-

Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Ala-Glu-Gly-

Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Ile-Lys-Ala-Gly-

？？？-Ile-Cys-？？？-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn...

目前还没有鉴定出某些氨基酸，也不知道第46个氨基酸以后的确切顺序。但申请人确信该抑制剂落入本发明的范围之内，并在下文称之为蝮蛇毒素（Agkistrostatin）。

由Bitis arietans毒液中分离的抑制剂具有下示顺序：

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-

Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-

Gln-Asp-Arg-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-

Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-

Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-

Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-

Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His

该抑制剂在下文中称之为巨蝰蛇毒素1（Bitistatin）。

由Bitis arietans毒液中分离出的抑制剂还具有下列的另一顺序：

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-Gln-

Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-

Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-

Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-

Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-

Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-

Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His.

该抑制剂在下文中被称为巨蝰蛇毒素2（Bitistatin 2）。

由Bitis arietans毒液中分离的抑制剂还具有下示的第3种顺序：

Val-Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-

Gln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-

Cys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-

Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-

Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-

Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-

Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His.

该抑制剂在下文中称之为巨蝰蛇毒素3（Bitistatin 3）。

由Eristocophis macmahonii毒素中分离出的抑制剂的顺序是：

Gln-Glu-Glu-Pro-Cys-Ala-Thr-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-

Arg-Cys-Lys-Phe-Lys-Arg-Ala-Gly-Lys-Val-Cys-Arg-

Val-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-

Gly-Lys-Ser-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Trp-Asn-

His.

该抑制剂在下文中称为Eristostatin。

由Bitis arietans毒液中分离的抑制剂还可具有下列顺序：

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Ile-Leu-Glu-Gln-

Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-...

尚未测知其中第20个氨基酸以后的顺序。因为该顺序（下文称之为巨蝰蛇毒素4〔Bitistatin 4〕）与由Bitis arietans毒液中分离的其他多肽结构相似，故确信巨蝰蛇毒素也在式Ⅰ多肽的范围之内。

上文中鉴定的顺序均为式Ⅰ所限定之顺序内的特定实例，这些顺序不应看作是对本发明范围的限制。借助氨基酸顺序测定已对其作出限定。应明确的是，其中存在着天然等位基因的变异。这些变异可通过整个顺序中氨基酸的差异或所说顺序中的缺失、取代、插入、颠换或加入一个或多个氨基酸得以证明。

实施例1

方法

材料

Echis carinatus毒液购自Miami Serpentarium Laboratories，Salt Lake City，UT。低分子量肽标准品、Sephadex G-50和Mono S FPLC柱得自Pharmacia有限公司。Servalyt precote等电聚焦凝胶购自Serva Fine Biochemicals有限公司，等电聚集标志蛋白购自BDH Chemicals有限公司。C18 HPLC则是Vydac公司的产品。

血小板的制备

由新西兰白兔体内收集兔全血并以200g离心10分钟。在腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase，20μg/ml）和PGE₁（5ng/ml）存在下，将富含血小板的上清液以800g离心15分钟。将血小板重新悬浮在10ml洗涤缓冲液（138mM NaCl、2.9mM KCl、0.31mM Na₂HPO₄、1mM MgCl₂、5mM HEPES，pH6.5、5mM葡萄糖、0.1%NaHCO₃、1mM EGTA和0.35%牛血清白蛋白）中。加入腺苷三磷酸双磷酸酶达终浓度20μg/ml。将已悬浮的血小板于800g离心15分钟，然后在相同缓冲液中作第二次洗涤。再将洗过的血小板悬浮在不含EGTA的洗涤缓冲液中，浓度为2-5×10⁸细胞/ml。

血小板聚集试验

于37℃下用细胞聚集测定仪检测血小板聚集作用。反应混合物中含有洗过的血小板（2-5×10⁸细胞/ml）、血纤维蛋白原（100μg/ml）、Ca²⁺（1mM）、ADP（10μM）、肾上腺素（2μg/ml）以及待测的血小板聚集抑制剂。在加入其他成分之后，再加入ADP和肾上腺素以引发聚集作用。反应至少应进行2分钟。以没有抑制剂时观察到的聚集作用的百分数来表示抑制聚集的程度。

小蝰蛇毒素的提纯

用兔血小板聚集检测法监测纯化过程中的活性。将冻干的Echis carinatus毒液（1g）溶解在12ml含有20mM DTT的10mM碳酸氢铵（pH7.7）中。室温放置15分钟后，以45，000g离心45分钟。弃去沉淀物，将上清液加于平衡过的2.5×125cm Sephadex G-50柱上并用10mM MES（pH5.3）4℃洗脱。合并含有血小板聚集抑制活性的部分并于真空下浓缩之。在Sephadex G-15柱上脱盐后，将10-13mg蛋白质装添于已用10mM MES（pH5.3）平衡过的Mono SFPLC柱上。于4℃下用0至0.3M NaCl至10mM MES（pH5.3）的线性梯度分级分离结合的蛋白质。洗脱流速为0.6ml/分。在大约0.17M NaCl时有一呈现抑制活性的单一峰。将合并的活性洗脱物直接加于已用0.1%（V/V）三氟乙酸（在水中）平衡过的C18反相HPLC柱上。室温下用溶于0.1%TFA水溶液中的多相乙腈梯度洗柱，流速为0.7ml/分。乙腈浓度为17%时洗脱的含抑制活性部分为单一峰。真空离心除去挥发性物质，然后冷冻干燥。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚集、反相高效液相层析及N末端顺序测定，判定所得蛋白质是均质的。由1g原料中制得2.2mg我们称之为小蝰蛇毒素（Echistatin）纯化蛋白质。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

我们使用了改良的Laemmli系统（Nature，227：680-685，1970，已列为本文参照文献）。堆集和分离凝胶1.5mm分别含80%和20%聚丙烯酰胺。向分离凝胶内加入尿素（8M）。使凝胶在85伏电压下电泳1.5小时，然后于90伏下电泳17小时。经考马斯亮兰R-250染色检出蛋白质。

等电聚集

使用Servalyt Precote等电聚焦凝胶。样品在LKB Ultraphore装置中以1W的恒定功率电泳。凝胶用Serva兰W染料染色。

经还原并羧甲基化的小蝰蛇毒素

在0.28M Tris和6.7M盐酸胍存在下，用20mM DTT将小蝰蛇毒素（0.75mg蛋白质）室温下还原1小时（反应体积为0.6ml）。然后加入碘乙酸（0.06ml）达到终浓度0.136M，室温下使烷基化反应进行20分钟。用C18反相HPLC法由试剂中分离出经过还原并羧甲基化的小蝰蛇毒素。

小蝰蛇毒素的胰凝乳蛋白酶裂解

以底物对蛋白酶40∶1（W/W）的比例用胰凝乳蛋白酶消化小蝰蛇毒素。在0.2M碳酸氢铵（pH7.8）中使蛋白水解反应于37℃进行4小时。然后冷冻干燥反应混合物，用反相HPLC法分离胰凝乳蛋白酶裂解肽。

氨基酸顺序测定

使用厂商提供的顺序分析仪操作程序和试剂，在Applied Biosystems 470A顺序分析仪中，对纯化的小蝰蛇毒素和经选择的胰凝乳蛋白酶水解片段进行自动的蛋白质顺序分析。借助线上（on-line）HPLC系统鉴定其中释放的氨基酸衍生物。

蛋白质测定

依照Lowry等人（J.of Biol Chem.193：265-275，1951，该文献列为参考文献）的方法，使用牛血清白蛋白作标准品测定蛋白质含量。

结果

提纯

通过三个层析步骤将冻干的Echis carinatus毒液中的可溶性部分纯化为均一物质。由于毒液粗品中存在血小板聚集刺激活性，故不能可靠地测得该部分中的抑制剂。但在Sephadex G-50柱上凝胶过滤后，则可观察到单一的抑制活性峰。可进一步在Mono S柱上进行阳离子交换FPLC层析，最后经C18反相HPLC纯化该活性部分。

1克毒液冻干品可制得2.2mg纯化的小蝰蛇毒素。该物质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（在8M尿素存在下）及等电聚焦电泳中均出现单一带。如用反相HPLC法再次层析，则产生与血小板聚集抑制活性物完全相符的单一对称吸收峰。测定天然蛋白质或经还原并羧甲基化的蛋白质的氨基酸顺序，可进一步证实小蝰蛇毒素的均质性。在进行第一次氨基酸顺序仪分析时观察到的仅存的氨基酸残基是谷氨酸。

分子量和等电点

在8M尿素存在下进行20% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可见还原的小蝰蛇毒素的表观分子量为5，800道尔顿。这与根据氨基酸顺序计算的分子量相似（见下述）。在非还原条件下，蛋白质迁移速度稍慢，相当于表观分子量为7，000道尔顿。令人惊奇的是，当用羟乙基二硫化物处理天然小蝰蛇毒素时，表观分子量只有大约4，000道尔顿。在经羟乙基二硫化物处理的小蝰蛇毒素中见有一小带，其可能是由不完全的衍生化作用产生的。

天然的和经二硫化物处理的小蝰蛇毒素均显示等电点为8.3。用二硫苏糖醇处理后，除等电点为8.3的主带外，还测出一个等电点7.5的小带。

氨基酸组成

还原的、羧甲基化的蛋白质经20小时水解之后，得到如表1所示的小蝰蛇毒素氨基酸组成。将经这一分析获得的组成与根据顺序推算的组成相比较（见下述）。用这两种方法得到数值大多都十分接近。经氨基酸组成分析测得的半胱氨酸残基含量（6.7）要比根据顺序计算的含量（8）低。这可能是由于小蝰蛇毒素的不完全羧甲基化所致。

表1

水解后测定的小蝰蛇毒素氨基酸组成

与根据顺序计算的结果的比较

氨基酸	每分子的残基数
			酸水解	顺序计算
	半胱氨酸天冬氨酸1苏氨酸丝氨酸谷氨酸2脯氨酸甘氨酸丙氨酸蛋氨酸异亮氨酸亮氨酸酪氨酸苯丙酸组氨酸赖氨酸精氨酸	6.58.42.81.23.34.25.31.80.61.01.11.01.01.25.24.1			8831345211111154
总计			48.7	49

注：1.该值包括天冬酰胺

2.该值包括谷氨酸酰胺

小蝰蛇毒素对体外血小板聚集作用的影响

血小板聚集研究结果表明，在抑制0.1mg/ml血纤维蛋白原存在下由ADP诱导的人凝胶过滤的血小板聚集作用上，Echistatin比trigramin的效力更强（IC₅₀＝30nM对150nm）。

剂量为30-300nM的小蝰蛇毒素可抑制由ADP胶原、血小板激活因子或肾上腺素诱导的人血小板聚集作用。

富含人血小板的血浆

从正常志愿者体内静脉穿刺抽取血液，加入0.1倍体积的3.8%柠檬酸钠中。以400g离心12分钟，得到富含血小板血浆（PRP）。加入ADP胶原、血小板激活因子或肾上腺素使之发生聚集，并用Sienco聚集检测仪进行检测。

经凝胶过滤的人血小板

静脉穿刺由正常志愿者体内抽取血液注入0.1体积的酸-柠檬酸盐-葡萄糖（85mM柠檬酸钠、64mM柠檬酸、110mM葡萄糖）中。以400g离心12分钟制得富含血小板血浆。加入PGE₁（5μg/ml）并以800g离心12分钟收集血小板。将血小板沉淀饼再悬浮于人血小板缓冲液（140mM NaCl、7.9mM KCl、3.2mM Na₂HPO₄、6mM HEPES、2%牛血清白蛋白、0.1%右旋糖、pH7.2）中，并用预先在人血小板缓冲液中平衡过的Sepharose 2B过滤之。计数血小板并用人血小板缓冲液将细胞浓度调至10⁸个/ml。

氨基酸顺序

对还原的、羧甲基化的蛋白质进行自动Edman降解，测得小蝰蛇毒素的氨基酸顺序。如上所示，该蛋白质有49个氨基酸，其N末端为谷氨酸，C末端为苏氨酸。其中包含8个半胱氨残基，即占小蝰蛇毒素中总氨基酸数的16%以上。两次重复测定，均获得同样结果。当测定天然小蝰蛇毒素的顺序时，在预期有半胱氨酸残基的顺序分析仪工作周期内未见有PTH-氨基酸峰，从而进一步证实了这些残基的分配。尚不清楚这些半胱氨酸残基的二硫化物状态。

对分离自还原并羧甲基片之蛋白质的胰凝乳蛋白酶解肽进行分析，结果进一步证实了上述顺序测定的结果。

表Ⅱ

小蝰蛇毒素胰凝乳蛋白酶解肽的氨基酸组成

（括号内数值为根据顺序确定的氨基酸数）

C1 C2 C3 C4 C3+C4

Cys（CM） 2.6（4） 0.7（1） 1.3（3） 1.5（3）

Asx 1.3（1） 2.7（3） 2.9（3）

Thr 1.0（1） 1.0（1） 1.0（1） 1.4（2）

Ser 1.1（1）

Glu 2.0（2） 1.1（1）

Gly 1.2（1） 1.4（1） 1.9（1） 1.2（1） 2.2（2）

Ala 1.0（1） 0.8（1）

Ile 0.6（1）

Leu 0.9（1）

His 1.2（1） 1.3（1）

Phe 0.9（1）

Lys 1.1（1） 1.9（2） 1.7（1） 1.0（1） 2.2（2）

Arg 1.2（1） 0.7（1） 1.1（1） 1.1（1）

Pro 1.3（1） 1.4（2） 1.0（1） 2.5（3）

小蝰蛇毒素在残基24-26处含有顺序Arg-Gly-Asp，其为某些可与血小板表面上糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物结合之蛋白质的共有顺序。该顺序是血纤维蛋白原分子上推定之血小板结合位点的一部分。

在8M尿素存在下进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，小蝰蛇毒素表现有不寻常的行为。具有表观分子量7，000道尔顿的天然蛋白质迁移可与根据顺序分析测得分子量为5，400道尔顿者相比。在非还原条件下，具有链内二硫键的蛋白质结合SDS的量一般比预期的量少些，而还原前SDS结合可增加到见于缺少链内二硫键之蛋白质的水平（Pitt-Rivers等，Biochem.J.，109：825-830，1968）。因此，在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳期间还原之小蝰蛇毒素的迁移率增加，说明这种蛋白质的天然构象中包含一个或多个链内二硫键。

室温下用80mM二硫苏糖醇处理小蝰蛇毒素20分钟，即可完全破坏其对血小板聚集作用的抑制活性。在相似条件下，用80mM羟乙基二硫化物处理，可使抑制活性丢失50%。与SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳研究的结果一样，这些结果也说明一个或多个链内二硫键在保留小蝰蛇毒素之抑制活性必需的构象中起着重要作用。

实施例2

使用实施例1中所述的蛋白质纯化和检测方法，分离和鉴定存在于Agkistrodon piscivorus毒液中的血小板聚集抑制物。该蛋白质（其具有上面给出的氨基酸顺序）表现有血小板聚集抑制物的特征。

实施例3

使用实施例1中所述的蛋白质提纯和检测方法，分离和鉴定存在于Bitis arietans毒液中的血小板聚集抑制物。该蛋白质（其具有如上鉴定的氨基酸顺序）表现了血小板聚集抑制物的特征。

实施例4

使用实施例1中所述的蛋白质提纯和检测方法，分离并鉴定存在于Bitis arietans毒液中的第二种血小板聚集抑制物。该蛋白质（其具有如上鉴定的氨基酸顺序）表现了血小板聚集抑制物的特征。

实施例5

使用实施例1中所述的蛋白质提纯和检测方法，分离并鉴定存在于Bitis arietans毒液中的第三种血小板聚集抑制物。该蛋白质（其具有如上鉴定的氨基酸顺序）表现了血小板聚集抑制物的特征。

实施例6

使用实施例1中所述的蛋白质提纯和检测方法，分离并鉴定存在于Eristocophis macmahonii毒液中的血小板聚集抑制物。该蛋白（其具有如上鉴定的氨基酸顺序）表现有血小板聚集抑制物的特征。

纯化具有Ⅰ式之顺序的各种多肽，使之成为本发明的化学均一物质，然后即可测定分子的氨基酸顺序。基于式Ⅰ中所示的氨基酸顺序，人们便可以制备相应于已公开之氨基酸顺序的合成基因，并借助适当的克隆载体将该基因导入适当宿主内。或者，可从产生毒液的细胞中得到天然基因，然后重组并克隆之，以制得纯的多肽。因此，本发明的范围不只限于本文中公开的以层析方法分离的多肽（或落入式Ⅰ所示顺序内的多肽），而且还包括用遗传工程技术制备的这些多肽。

实施例7

DNA和质粒构建及对重组-leu28-小蝰蛇毒素的蛋白质表达

所有酶和DNA分子量标志物均得自New England Biolabs。二脱氧DNA顺序测定试剂盒购自United States Biochemical Corporation Inc.感受态大肠杆菌Jm109购自Stratagene公司。所有其他试剂都是分析纯或电泳纯的。

使用氨基磷酸甲酯，在Applied Biosystems 380BDNA合成仪中合成所有的寡脱氧核苷酸。用浓氨水去保护后，将寡脱氧核苷酸加于Pharmacia NAP-10凝胶过滤柱上脱盐。

除了两个在两条链的5′端有突出部分的寡脱氧核苷酸外，所有寡脱氧核苷酸均用ATP和T4多核苷酸激酶处理使之磷酸化。将激酶活化的互补寡脱氧核苷酸加热到95℃，然后与经缓慢冷却到室温以退火。在总体积为130μl，含有各0.5nmol双股片段（duplex）、50mM Tris-HCl（pH7.8）、10mM MgCl₂、20mM二硫苏糖醇、1mM ATP、50μg/ml牛血清白蛋白和4，000单位T4连接酶的反应混合物中，于14℃下使3个双股片段连接15小时。用10%固有聚丙烯酰胺凝胶电泳法分级分离连接混合物。由聚丙烯酰胺凝胶中切掉含leu 28-小蝰蛇毒素基因部分并进行电洗脱。用激酶活化被洗脱的leu 28-小蝰蛇毒素基因、用苯酚/氯仿抽提、用乙醇沉淀，然后插入表达载体中。

pJC 264表达载体的构建

将含有3′-436bp CheB基因和5′-263bp CheY基因（Matsumura等，J.Bact.160：36-41，1984）的pLCl-28（得自B.Bachmann，E.Coli Genetic Stock Center）中的714bp HindⅢ-PstⅠ片段克隆到pUC13 HindⅢ和pstⅠ位点中。为了除去pUC13之多接头顺序中靠近CheY基因的唯一EcoRⅠ位点，而删除pstⅠ和EcoRⅠ位点间的多接头顺序。所得表达载体pJC264含有可使有用基因与CheY基因相融合的唯一EcoRⅠ位点（图2）。为此目的，通过用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段充填并与合成的BamHI接头连接，而使连接pUC13和CheB基因的HindⅢ位点转变为BamHI位点。

在下述条件下，使三分之一按上述方法制得的合成之leu-28-小蝰蛇毒素基因与0.1μg FcoRI切割的pJC264相连接，从而使合成的重组体leu 28-小蝰蛇毒素基因（图1）插入到pJC264的FcoRI位点中：在总体积为20μl含50mM Tris-HCl，pH7.8、10mM MgCl₂、20mM二硫苏糖醇、1mM ATP、50μg/ml牛血清白蛋白和800单位T4DNA连接酶的反应混合物中，于14℃下连接15小时。

受体细菌的转化及阳性克隆的鉴定

在标准条件下，用三分之一含有已插入之r-leu 28-小蝰蛇毒素基因的pJC264表达载体（7μl）转化50ml感受态JM109细胞。经限制性酶切分析选择含有r-leu 28-小蝰蛇毒素基因的克隆。根据二脱氧顺序分析的结果验证小蝰蛇毒素之编码顺序的存在。

细胞生长和融合蛋白沉淀物的制备

用过夜种菌培养物接种培养物（1% V/V），并使之生长于含100μg氨苄青霉素/ml的LB培养基中。当细胞密度达到OD₆₀₀读数为0.2-0.3时加入IPTG至终浓度为1mM。继续培养10小时后离心收集细胞。将得自3，000ml培养物的细胞团块悬浮在水中至终体积50ml，并使用带有大管头的300型Fisher Sonic Dismembrator以最大功率4℃下超声处理10分钟。将超声处理后的混合物以20，000g离心15分钟，再将细胞团块重新悬浮于8ml水中并在含有50%蔗糖的15mM Tris-HCl（pH7.4）和0.15M NaCl上展层。在SW28 Beckman转子中以13，000rpm6℃离心30分钟后，将含有不溶性CheY-Leu28-小蝰蛇毒素融合蛋白的沉淀物重新悬浮于6ml水中。

融合蛋白的裂解

在13ml总反应体积中，用溶于70%甲酸内的60mM溴化氰裂解得自1000ml培养物的含融合蛋白的沉淀物。使反应在室温下进行15小时。经广泛透析除去试剂并冻干。

重组-leu28-小蝰蛇毒素的提纯与重新折迭

首先在60℃下用8M盐酸胍使裂解的融合蛋白变性（5分钟），然后在0.35M Tris-碱和6M盐酸胍存在下，用0.15M二硫苏糖醇使之于室温下还原（10分钟）。在0.1%三氟乙酸存在下用0-65%乙腈经C18反相HPLC纯化还原的leu28-小蝰蛇毒素。使HPLC纯化的r-leu28-小蝰蛇毒素（蛋白浓度为0.2mg/ml）在0.1M乙酸铵中氧化重新折迭。重新折迭反应在室温下进行72小时，期间约每12小时涡动混合一次。

血小板聚集试验

根据透光率的增加来检测血小板聚集作用。简单地说，将r-leu28-小蝰蛇毒素加至含有凝胶过滤之人血小板（2×10⁸）细胞/ml）、血纤维蛋白原（100μg/ml）和Ca⁺⁺（1mM）的反应混合物中。在加入其他成分后1分钟，加入ADP（终浓度为10μM）以引发血小板聚集。血小板聚集的速率或程度，以不加小蝰蛇毒素情况下测得之最大透光率的百分数表示。

生产重组leu28-小蝰蛇毒素的流程

大肠杆菌（其中包含质粒pJC264-小蝰蛇毒素）

诱导W/IPTG

细胞收获

细胞溶解

离心

融合蛋白沉淀物

溴化氰

CNBr裂解的融合蛋白沉淀物

变性（盐酸胍）

还原（二硫苏糖醇）

充分还原并裂解的融合蛋白沉淀物

C18反相HPLC

充分还原的r-leu28-小蝰蛇毒素

再次氧化/重新折迭

C18反相HPLC

纯化的、氧化的r-leu28-小蝰蛇毒素

合成基因的设计和构建

天然小蝰蛇毒素是有49个氨基酸残基的单链多肽，等电点为8.3。设计一合成的r-leu28-小蝰蛇毒素基因并与大肠杆菌cheY基因融合。由其他蛇毒液来源分离之血小板聚集抑制剂的一级结构揭示：蛋氨酸28并不是该族抑制物中被保留的氨基酸（Huang等，J.Biol.Chem.262：16157-16163，1987）。因此，小蝰蛇毒素的蛋氨酸28被亮氨酸取代，且蛋氨酸插入cheY蛋白和重组-leu28-小喹蛇毒素之间，而造成一个溴化氰裂解位点（图1）。在侧翼端设计两个EcoRI粘性末端以与表达载体相接合。紧接着3′侧翼EcoRI位点插入一终止密码子。由三个在接合位点处含KpnI和AvaI限制性酶切点的双股片段组装成合成的r-leu28-小蝰蛇毒素基因。除有目的地产生的限制性位点外，结构基因中均使用优选的大肠杆菌密码子。可经限制性酶切和DNA顺序分析进一步检证构建好的基因。

表达载体的构建

为在大肠杆菌中表达r-leu28-小蝰蛇毒素，使用了表达载体pJC264。该载体（图2）含有编码大肠杆菌cheY蛋白之氨基末端88个氨基酸的基因，且前已证明该基因可在大肠杆菌中获得大量而稳定的表达（Matsumura等，J.Bact.160：36-41，1984）。cheY基因在该载体中的表达须受来自pUC13之大肠杆菌lac启动子-操纵子的控制（Messing，Methods in Enzymology，Wu et al.eds，Academic Press，New York，101：20-78，1983）。pJC264中CheY基因之后，特有的pstI和EcoRI位点有利于克隆新的开放读码及其作为cheY融合蛋白的可诱导的表达。将合成的r-leu28-小蝰蛇毒素基因插入pJC264的EcoRI位点中，图2中显示了chY-小蝰蛇毒素表达载体的结构。

该载体与现有的表达系统相比，其具有几个优点。cheY融合常常可得以高水平表达（详见下文及Bailey等，J.Indust.Micro.2：47-52，1987）。该载体衍生于高拷贝数质粒pUC13（Messing，Methods in Enzymology，Wu et al.eds，Academic press，New York，101：20-78，1983），并且其有效地复制可能有利于所观察到的高表达水平。cheY融合蛋白常常是作为不溶性包涵体被发现的。这种不溶性可在融合蛋白质的纯化过程中得以利用。蛋白质的不溶性也可以阻止其被细胞内蛋白酶降解。因为cheY部分较小，所以有用蛋白质的质量比例要比融合到大的、最常用的β-半乳糖苷酶上所达到的比例要高。最后，由于cheY蛋白中没有半胱氨酸残基，从而避开了融合蛋白中形成不正确二硫键的潜在问题。

重组-leu28-小蝰蛇毒素的表达

按前述方法用IPTG诱导重组-leu28-小蝰蛇毒素在大肠杆菌JM109中的表达。诱导后在不同时间用14%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析表达产物。诱导2小时后，在总细胞溶胞产物中检测到有cheY-小蝰蛇毒素融合蛋白之预期分子量（14.5KD_a）的多肽（图3）。诱导6小时后，该蛋白质的积聚量达到最高水平，至少占总细胞蛋白的20%。细胞经超声处理后，所表达的蛋白质是不溶的，这说明表达期间形成了包涵体。用溴化氰裂解超声处理的细胞沉淀物，以分离重组-leu28-小蝰蛇毒素。

重组-leu28-小蝰蛇毒素的纯化和复性

纯化前，在6M盐酸胍存在下用过量二硫苏糖醇还原溴化氰裂解的蛋白质。用反相HPLC法分离还原的蛋白质，层析结果显示出一滞留时间与还原的天然小蝰蛇毒素相似的峰（图4A、B）。对该峰的蛋白质进行氨基酸顺序分析，显示它含有纯度大于90%的重组-leu28-小蝰蛇毒素。因为HPLC期间还原的小蝰蛇毒素是在0.1%三氟乙酸（pH2左右）中，所以预计重组-leu28小蝰蛇毒素内硫醇-二硫化物交换反应是很慢的。因此，可在0.1M乙酸铵存在下使冻干的小蝰蛇毒素重新折迭，而不必进一步复性和还原。有人提出，向复性溶液内加入硫醇/二硫化物混合物可有利于无活性蛋白质的复性（Tam等，Nature，309：376-378，1984）。我们已用0.5mM二硫苏糖醇和1mM氧化态二硫苏糖醇在6M盐酸胍存在下复性了重组-leu28-小蝰蛇毒素。但在此条件下重新折迭的小蝰蛇毒素的产率并没有增加。正确折迭的小蝰蛇毒素是通过反相HPLC法由未折迭的产物中分离的。图4C中显示的HPLC图形表明，在给定的条件下有30%以上还原的小蝰蛇毒素是正确地折迭的。估计用此纯化方法得到的正确折迭的纯小蝰蛇毒素的量约为每升细胞培养物1.5mg。用比分离天然小蝰蛇毒素时稍高浓度的乙腈由C18柱上洗脱重组-leu28-小蝰蛇毒素（图4C和4D）。这可能是重组-leu28-小蝰蛇毒素中亮氨酸取代了天然小蝰蛇毒素中蛋氨酸28的结果。用自动Edman降解法测定重组-leu28-小蝰蛇毒素的N末端氨基酸顺序。发现N末端顺序中多达32个残留与天然小蝰蛇毒素相同，只是28位以亮氨酸取代了蛋氨酸。

重组-leu28-小蝰蛇毒素的生物学活性

图5显示了重组-leu28-小蝰蛇毒素与天然小蝰蛇毒素之生物学活性的比较。在人血纤维蛋白原和CaCl₂存在下，加入ADP后检测小蝰蛇毒素对血小板聚集的抑制作用。如天然小蝰蛇毒素一样，在加入ADP后重组蛋白并不影响透光率的初始减小（图5A），这提示抑制物没有影响血小板的激活作用。根据聚集的速率和程度，证明重组-leu28-小蝰蛇毒素和天然小蝰蛇毒素均可抑制血小板聚集，并有相同的IC₅₀值（图5B）。因此，重组-leu28-小蝰蛇毒素在其影响血小板聚集的能力上似乎与天然小蝰蛇毒素完全相同。结果表明，天然小蝰蛇毒素中28位蛋氨酸的存在对于这种血小板聚集抑制剂的正确折迭和生物学活性不是必要的。

有可能使用DNA重组技术，如通过对特定DNA的位点特异性诱变，使单个或多个氨基酸发生取代、缺失、加入或置换，以制备各种衍生多肽。所有这些可产生衍生多肽的等位基因变异和修饰作用，只要保留其基本的、特征性的血小板聚集抑制活性，便都包括在本发明的范围之内。可以通过（1）使之具有作为其第一个氨基酸的蛋氨酸（凭借插入到结构基因前面的ATG起始信号密码子给出），或（2）当蛋氨酸在细胞内或细胞外被裂解时，仍有其正常的第一个氨基酸，或（3）与其信号多肽或结合蛋白质而不是常规信号多肽结合在一起，其中信号多肽或连结体是可在细胞内或细胞外环境中被裂解的（参见英国专利申请2，007，676A号），或（4）通过以成熟形式直接表达，而不必裂解掉任何外加的、多余的多肽等方式来制备该多肽。后一方式在给定宿主可能没有或不能有效地除去信号肽时特别重要，此时便可设计表达载体以连同信号肽一起表达蛋白质。总之要回收如此产生的以其各种形式存在的血小板聚集抑制剂，并将其纯化到适用于治疗各种血管病变的纯度水平。

合成的结构式Ⅰ的多肽

可使用固相合成法，如Merrifield（J.Am.Chem.Soc.，85：2149，1964）所述的方法制备本发明的多肽，但也可以使用本领域中已知的等同的化学合成法，如Houghten（Proc.Natl.Acad.Sci.，82：5132，1985）所述的合成方法。通过将被保护的氨基酸偶联到适当树脂上从肽的C末端开始固相合成（如参见1982年1月21日公告的美国专利4，244，946号，其内容列为本文参考文献）。美国专利4305872和4，316，891号中给出了这种通用合成方法的实例。Vale等人（Science 213：1394-1397，1981年9月）讨论了-41残基多肽及其固相合成法，其中所提到的合成方法更为详尽的讨论则可见于Marke等（J.Am.Chem.Soc.103：3178，1981）的文章中。

合成多肽时，将具有其被适当保护之α-氨基基团的羧基末端氨基酸偶联到氯甲基化的聚苯乙烯树脂或类似物上。除去α-氨基保护基团（如使用二氯甲烷中的三氟乙酸）之后，可随时进行下一步合成步骤。可使用文献中描述的其他标准裂解试剂和条件除去特定的氨基保护基团。

然后分步按预期次序偶联其余的α-氨基和侧链保护的氨基酸，以得到一个连接到树脂上的中间体化合物。合成中另一种分别加上各氨基酸的方法是可使某些氨基酸相互偶联，然后再加到生长的固相链上。如何选择适当的偶联剂是本领域的一般技术人员熟知的。

化学合成肽类的共同手段是，用适当保护基在不稳定的支链基团位点上保护各种氨基酸，直到所说链完全组装好之后再最后除去所说的保护基团。另一个共同点是保护氨基酸或片段上的α-氨基基团，同时该整体在羧基上相互作用，然后通过选择性除去α-氨基保护基团使继后的反应在该位置上进行。因此，作为合成过程中的一个步骤，其共同特点是产生一种中间体化合物，该化合物包含的各个氨基酸残基均定位于肽链的所需顺序中，同时这些残基均具有侧链保护基团。然后基本上在同一时间除去这些保护基团，以便在纯化后得到预期的产品。

完成所需的氨基酸顺序之后，经用液态HF等试剂处理以由树脂载体上除去中间体肽，所说的试剂不仅可由树脂上裂解肽，而且可裂解所有保留的支链保护基团。用凝胶渗透法，然后用半制备HPLC法纯化多肽（参见Rivier等，Peptides：Structure and Biological Function，pp125-128，1979）。完全可以获得纯度达93%或更高些的产品，并可用于临床检验和/或应用。实践中可用纯度为98%的产品，但体外应用时，较低纯度也是可以接受的。因此，就本发明的目的来说，基本纯的产品，即至少占总肽量50%（重量）的产品是适用的。

以下提供本发明各种多肽及合成方法的实例

实施例8

丁氧羰基-邻-苄基苏氨酸-聚丙烯酰胺〔Boc-Thr（Bzl）O-Pam〕树脂、丁氧羰基（Boc）保护的氨基酸及所用在Applied Biosystems 430 A（ABI）肽合成仪中合成所需的其他试剂均由制造厂购得。侧链保护的Asp、Glu和His是由Bachem公司提供的。溶剂二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷得自Burdick和Jackson公司。二硫苏糖醇（DTT）购自Bethesda Res.Labs.公司。二硫赤藓糖醇（DTET）购自Chemical Dynamic公司，对甲苯酚和对甲苯硫酚购自Aldrich Chemical公司。

小蝰蛇毒素的合成

使用0.5mM（0.69g）Boc-Thr（Bzl）O-Pam树脂（在0.72mM Thr/克树脂浓度下置换）为原料，用ABI自动肽合成仪以分步法进行合成（参见Kent and Clark-Lewis（1985），Synthetic Peptides in Biology and Medicine，Proc.Labsystems Res.Symp.，Eds.，Alitalo et al.，Elsevier，Netherlands pp 29-57）。使用厂商提供的药筒引入氨基酸（各2mM）。侧链保护包括：Arg（Tos）、Asp（OcHx）Cys（Meb）、Glu（OcHx）、His（Bom）、Lys〔Z（Cl）〕、Ser（Bzl）、Thr（Bzl）、Tyr〔Z（Br）〕。〔其中Tos是对苯磺酰基、CHX是环己基、Meb是4-甲基苄基、Z（Cl）是2-氯苄氧羰基、Bom是苄氧甲基、Bzl是苄基、Z（Br）是2-溴苄氧羰基。除Arg（Tos）、Asn和His（Bom）外（其在双偶联过程中使用了溶于DMF中的羟基苯并三唑酯），所有Boc保护的氨基酸均采用有对称酐的双偶联（在CH₂Cl₂中进行，然后用DMF进行溶剂交换）。为防止三氟乙酸（TFA）去封闭期间出现不期望有的对Cys和Met的酸催化的氧化作用（Draper等，J.Med.Chem.Vol.16，pp1326-1329，1973），须加入0.1%（W/V）DTE作为清除剂。连接N末端谷氨酸（Glu）后，用TFA除去Boc基团，然后干燥得到的肽-树脂。N末端去封闭的肽-树脂的终重量为4.15g。

HF裂解和氧化

将组合好的肽-树脂（2.0g）悬浮于HF装置（Peninusula Labs.有限公司，1B型）内的3ml 1∶1（V/V）对-甲苯硫酚/对-甲苯酚混合物中。用机械真空泵将系统抽成真空，并使用液氮冷却法冷凝HF（30ml）。0-5℃下搅拌1.5小时后，使用液氮阱（Iiquid nitrogen trap）真空蒸发反应混合物（20-30分钟）。用乙醚研制残留物、过滤并用乙醚洗三次。将滤后的残留物直接移入4升搅拌的稀醋酸（0.4%/H₂O）溶液中。搅拌数分钟后，用氢氧化铵将混合物的pH调到8.0。过滤除去树脂后，将粗制氧化产物在5℃下放置18小时（不搅拌），然后在室温（19-20℃）下放置3天。用分析HPLC法监测氧化进程。纯化前用定量Ellman试验（Habeeb，Methoels in Enzymology（1972），Eds.Hirs and Timasheff，Academic Press，New York，PP457-464）监测游离巯基基团的消失。这一试验是用1ml经过冻干以除去残留之对位甲苯硫酚的样品进行的。

氧化的小蝰蛇毒素粗品的提纯

用乙酸（10ml）酸化粗制的氧化溶液（4l）并直接泵到C₁₈硅胶（5×30cm，15m，300A）药筒（Waters Associates）上。使用制备HPLC柱（Separations Technology有限公司）纯化产品。阶式梯度（增量100ml）是由可分别相继地提高流动相浓度的1升溶液产生的。用于洗脱产品的流速为70ml/分。合并并冻干经RP-HPLC（Vydac C₁₈，218TP5415）检测为均一成分（＞95%）的各部分，得到72mg产品。由一个达到产物峰的峰肩可知半纯产品被较小极性的成分所污染。使洗脱物再次通过HPLC柱进一步按同样方法纯化产品，得到小蝰蛇毒素（54mg）。按0.25mM原料树脂计算，这一重量代表了4%总收率。用分析HPLC法证明产品的均质性。同时注入合成产品和天然产品，结果出现单一峰。通过用6N HCl水解后作氨基酸分析（表3）和自动Edman降解（ABI 470A蛋白质顺序仪）进一步确定蛋白质的特征。

表3

合成小蝰蛇毒素的氨基酸分析^a结果

（括号内为理论计算值）

Lys 5.00（5） Gly 5.03（5）

His 1.00（1） Ala 2.10（2）

Arg 3.87（4） Cys^d7.67（8）

Asp 8.13（8） Met^c0.84（1）

Thr^b2.99（3） Leu 0.98（1）

Ser^b1.04（1） Phe 0.95（1）

Glu 3.07（3） Tyr 1.00（1）

Pro 4.08（4） Ile+allo-Ile 0.99（1）

a：于100℃用6NHCl水解70小时后;

b：校正水解期间分解率;

c：未校正;

d：完成酸氧化后作为磺基丙氨酸测定的。

观察到预检最大值为1.9%。第一步获得高产率PTH氨基酸，也证并没有发生C末端Glu（谷氨酸）变为焦谷氨酸（Pyro-Glu）的环化作用。

合成小蝰蛇毒素的还原和重折迭

将合成的小蝰蛇毒素（0.5mg）溶解在1ml 0.07M乙酸铵（10mM DTT）（pH8.0）中，并用分析HPLC监测还原过程。1小时后原料定量地转化为单一的还原产物。使用直径12mm，截留分子量为1，000的纤维素管系（SpectrumMedical Ind.），对4升0.07M乙酸铵缓冲液（pH8.0）透析（24小时）还原产物，结果只产生小蝰蛇毒素。为了证明小蝰蛇毒素在重新氧化之前处于完全还原的状态。按前述方法但于6M盐酸胍存在下反复用DTT还原合成的小蝰蛇毒素。HPLC分析证实还原产物具有完全相同的保留时间。用半制备HPLC法分离还原的小蝰蛇毒素，然后经定量Ellman分析（Habeeb，出处同上）显示该产品是八氢形式的。

血小板聚集作用的检测

37℃下在计时聚集仪（Chronolog aggregometer）中检测血小板聚集。反应混合物含有洗过的血小板（2×10⁸个/ml）、血纤维蛋白原（100mg/ml）、Ca²⁺（1mM）和待检的血小板聚集抑制剂部分。加入其他成分后，通过加入10mMADP（1分钟）引发聚集作用。反应至少进行2分钟。用在没有抑制剂存在下测得之聚集速率的百分数表示聚集抑制作用的程度。合成的小蝰蛇毒素具有不同于天然小蝰蛇毒素的化学和生物学性质（表4）。

表4

天然和合成的小蝰蛇毒素对人血小板

聚集抑制作用的影响

肽 IC₅₀（可信限95%）

天然小蝰蛇毒素 0.032（0.026-0.039）

合成小蝰蛇毒素 0.033（0.026-0.041）

用得自2-4个供血者的血小板，测定使人血小板聚集速率抑制到50%所需的肽浓度（IC₅₀）。对每个供血者的样品均作双份测定。

实施例9-20

按照实施例8中所述的一般方法，制备多种与小蝰蛇毒素有相似顺序，并属于结构通式Ⅰ之范围内的多肽。

表5

用合成法制得的小蝰蛇毒素类似物

及其对人血小板聚集作用的影响

实例号顺序 IC₅₀（μM）（可信限95%）

9 phe 27-小蝰蛇毒素 .013（.010-.016）

10 phe 27，leu

28-小蝰蛇毒素 .016（.011-.022）

11 trp 27-小蝰蛇毒素 .017（.014-.019）

12 pro 23，phe 27，

leu 28-小蝰蛇毒素 .026（.021-.033）

13 leu 28-小蝰蛇毒素 .034（.026-.043）

14 phe 28-小蝰蛇毒素 .038（.026-.058）

15 asn 22，phe 27，

leu 28-小蝰蛇毒素 .038（.031-.047）

16 （1-41）-小蝰蛇毒

素酰胺 .066（.048-.084）

17 （1-43）-小蝰蛇毒

素酰胺 .081（.066-.099）

18 met SO 28-小蝰蛇

毒素 .088（.033-.154）

19 （1-39）-小蝰蛇毒

素酰胺 .327（.214-.414）

20 （1-39）-小蝰蛇毒

素 .800（.580-.1.1）

注：phe-苯丙氨酸;pro-脯氨酸;

leu-亮氨酸;asn-天冬酰胺;

trp-色氨酸;met-蛋氨酸;

上述缩略词限定了各种合成的多肽。实施例9-15和18中，指出了被置换的顺序位号和用于取代天然残基的残基。例如实施例9中，天然小蝰蛇毒第27位残基Asp被phe取代。残基1-26和28-49与天然小蝰蛇毒素完全相同。实施例16、17、19和20是具有趋向被删除之羧基末端残基的顺序（如实施例20中，残基42-49已被删除）。实施例18中met SO代表蛋氨酸亚砜。

治疗实用性

在任何期望抑制人或哺乳动物血小板聚集或粘连的情况下，均可给予本发明的多肽。

本发明的多肽可从循环中迅速排除，并且当需要在短期内导致一种强抗血栓形成效果时，这些多肽在抑制血小板聚集中是特别有用的。因此，可将其用于外周动脉外科（如动脉移植、颈动脉内膜切除术）及心血管外科中，因对这些动脉和器官的手术操作和/或血小板和人工表面的相互作用，可导致血小板聚集和消耗。聚集的血小板可形成血栓和血管栓塞。可将本发明的多肽施用于这些外科病人用以防止血栓和栓塞形成。

心血管外科中一般都使用体外循环来使血液结合氧，且常导致血小板粘附在体外循环装置的表面上。粘附作用取决于血小板膜上的GPⅡb/Ⅲa与吸附于回路表面上的血纤维蛋白原之间的相互作用（Gluszko等，Amer.J.Physiol.，252：H，PP 615-621，1987）。由人工表面释放的血小板显示有受到损伤的止血功能。给予本发明的多肽可以防止粘附。

这些多肽的其他应用包括：在血栓溶解治疗期间或治疗后防止血小板血栓形成、血栓栓塞和再阻塞，在冠状动脉和其他动脉血管成形术后及冠状动脉搭桥术后防止血小板血栓形成、血栓栓塞和再阻塞。在许多临床中心，经受过上述处理的病人中许多都接受过比本发明的多肽有较弱的抑制血小板聚集作用的抗血小板药物。本发明的多肽也可用于预防心肌梗塞。

这些多肽可依照任何适于向血流中大量输入的方式给药。为了抑制血小板的聚集作用这些多肽既可以和纤维蛋白溶酶原或链激酶等血栓溶解剂合并使用，也可以和肝素、乙酰水杨酸或新双香豆素等抗凝血剂合并使用。优选的给药途经是静脉内给药。因为这些多肽易溶于水，故可以溶液形式给药。

在一个应用实例中，对作血管成形术的心脏病发作病人静脉内给予适当量的小蝰蛇毒素。可在血管成形术期间或术前几分钟给药，且给药量应足以抑制血小板聚集，如使其稳态血浆浓度达到0.05～2μM。如果病人需作血管搭桥手术，可立即停止给予小蝰蛇毒素，并且手术期间将不会产生由阿斯匹林或单克隆抗体（如7E₈、见Cold等所述）等其他物质引起的并发症，其中所说的作用在停止给药后会持续数小时。

本发明还包括一种含有重组单链组织型纤维蛋白溶酶原激活剂或链激酶及具有下列顺序之多肽的组合物：

H₂N-（Ch）-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-（Cx）-H

其中R代表任何相同或是不同的氨基酸。

本发明还包括促进病人血栓溶解和防止再阻塞的方法，包括给病人使用一定量的重组单链组织型纤维蛋溶酶原激活剂和一定量具有下列顺序的肽：

H₂N-（Ch）-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-（Cx）-H

其中R可以是任何相同或不同的氨基酸。

本发明在不违背其精神实质和基本特征的前提，亦可包括其他一些特定形式。因此，不应将上述特定实施例看作是对本发明的限制。

Claims

1、一种具有下列氨基酸顺序的多肽：

X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y

其中X是H或至少一个氨基酸；Y是OH或至少一个氨基酸；且R是相同或不同的任何氨基酸。

2、根据权利要求1的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

H₂N-（Ch）-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-Cys-（Cx）-H

其中Ch代表至少一个氨基酸;Cx代表至少一个氨基酸;且各R无论是相同的或不同的，均代表一个氨基酸。

3、根据权利要求1的称为“小蝰蛇毒素”之基本上纯的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

4、根据权利要求1的称为“蝮蛇毒素”之基本上纯的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Val-Gln-Pro-Ala-Asn-Pro-Cys-Cys-Asp-Ala-Ala-Thr-

Cys-Lys-Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Ala-Glu-Gly-

Leu-Cys-Cys-Asp-Gln-Gys-Lys-Phe-Ile-Lys-Ala-Gly-

R-Ile-Cys-R-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp-Asn-Y

5、根据权利要求1的称为“巨蝰蛇毒素1”之基本上纯的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu-

Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-

Gln-Asp-Arg-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-

Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-

Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-

Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-

Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His

6、根据权利要求1的称为“巨蝰蛇毒素2”之基本上纯的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-Gln-

Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys-

Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu-

Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys-

Asp-Gln-Asp-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys-

Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-

Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His

7、根据权利要求1的称为“巨蝰蛇毒素3”之基本上纯的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Val-Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-

Gln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-

Cys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-

Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-

Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-

Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-

Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His

8、根据权利要求1的称为“Eristostatin”之基本上纯的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Gln-Glu-Glu-Pro-Cys-Ala-Thr-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-

Arg-Cys-Lys-Phe-Lys-Arg-Ala-Gly-Lys-Val-Cys-Arg-

Val-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr-

Gly-Lys-Ser-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Trp-Asn-

His

9、根据权利要求1的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Phe-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

10、根据权利要求1的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Gly-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

11、根据权利要求1的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Trp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

12、根据权利要求1的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Pro-Arg-

Gly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

13、根据权利要求1的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Asp-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

14、根据权利要求1的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Asp-Phe-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

15、根据权利要求1的多肽，其具有下列氨基酸顺序：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Asn-Ala-Arg-

Gly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

16、一种抑制血纤维蛋白原与哺乳动物血小板结合或抑制血纤维蛋白原诱导的哺乳动物血小板聚集的方法，其包括将哺乳动物血小板与权利要求1的多肽一起保温。

17、一种抑制哺乳动物体内血小板聚集的方法，其包括给哺乳动物使用权利要求1的多肽，以抑制血液中血小板聚集作用的发生。

18、一种纯化具有下列顺序之多肽的方法：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

其包括：

（a）将冻干的Echis carinatus毒液溶解在弱碱性溶液中;

（b）离心该溶液以得到上清液;

（c）将所说的上清液加于柱上，并

（d）确定含血小板聚集抑制活性的部分并于真空下浓缩之。

19、含有编码下列氨基酸顺序之多肽的重组DNA分子的基因：

H₂-（Ch）-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-

（Cx）-H

其中Ch代表至少一个氨基酸;Cx代表至少一个氨基酸;且各个R无论是相同或不同的，均代表一个氨基酸，其中所说的多肽抑制血小板聚集作用。

20、根据权利要求19的基团，其中所说的氨基酸顺序是：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

21、一种可复制的微生物表达载体，其包含一个能在微生物中表达异源蛋白质的启动子-操纵子顺序，后面是编码有下列氨基酸顺序之血小板聚集抑制剂的DNA：

H₂N-（Ch）-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-

（Cx）-H

其中Ch代表至少一个氨基酸;Cx代表至少一个氨基酸;且各个R无论是相同或不同的，均代表一个氨基酸，其中所说DNA在转化体微生物内的转录是在所说之启动子-操纵子控制下进行的。

22、根据权利要求21的表达载体，其中所说的氨基酸顺序是：

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys-

Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg-

Gly-Asp-Asp-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr-

Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala-

Thr

23、一种包含被权利要求22的表达载体转化之细胞的活细胞培养物。

24、一种制备富含半胱氨酸之多肽的方法，所说的多肽包含下列顺序：

H₂N-（Ch）-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-

Cys-（Cx）-H

其中Ch代表至少一个氨基酸;Cx代表至少一个氨基酸;且各个R无论是相同或不同的，均代表一个氨基酸，该方法包括：

（a）使所说顺序的C末端第一个氨基酸接到固相交联的聚苯乙烯树脂上，以形氨基酰基聚合物，由氨基酰基聚合物上除去C末端第一个氨基酸封闭基团，使继后的第二个氨基酸偶联在C末端氨基酸残基上，以分步方式依次偶联后面的各氨基酸以形成多肽顺序，并除去保护N末端氨基酸的N末端Boc（丁氧羰基）基团;

（b）用HF和一种或多种含硫清除剂处理多肽顺序;

（c）洗涤经处理的序列并由层析柱中移入大体积稀乙酸中，以尽可能地减少不期望的交联;以及

（d）将由步骤（c）得到的溶液搅拌下调到pH8.0左右。