CN1181099C

CN1181099C - 兼抗凝溶栓双重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB

Info

Publication number: CN1181099C
Application number: CNB021361584A
Authority: CN
Inventors: 孙树汉; 颜宏利; 陈蕊雯
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2002-07-23
Filing date: 2002-07-23
Publication date: 2004-12-22
Anticipated expiration: 2022-07-23
Also published as: CN1401662A

Abstract

本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种兼具抗凝、溶栓双重功能的血栓靶向性融合蛋白mA5UKB。该蛋白由膜联蛋白5(AnnexinA5)的突变体mAnxA5和尿激酶B链(UKB)融合而成。AnnexinA5有四个同源结构域，而mAnxA5仅包含第一、第二个结构域，其分子量仅为前者的一半，但保留了AnnexinA5的血栓靶向功能和抗凝血功能，且第二结构域中的缬氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(V-G-D)序列突变成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D)序列，使mAnxA5具有更强的抗凝血功能。将mAnxA5与具有溶栓作用的UKB融合，所得到的融合蛋白mA5UKB能够靶向性地作用于血栓部位，提高了溶栓效率，并减小了出血等不良反应。本发明融合蛋白兼具抗凝溶栓作用，可将其制备成为溶栓药物。

Description

兼抗凝溶栓双重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB

技术领域：

本发明涉及医药生物工程技术领域，是膜联蛋白A5(AnnexinA5)的一种突变体mAnxA5和尿激酶B链(UKB)的融合蛋白mA5UKB，该融合蛋白具有血栓靶向性的溶栓作用，兼具有抗凝作用。

背景技术：

血栓症，如急性心肌梗塞(AMI)、静脉血栓栓塞等是一类严重危及人类健康及生命的心血管疾病。在西方国家，因血栓引起的死亡已占人口总死亡率的首位。在我国，随着经济发展和人口趋向老龄化，血栓症患者日益增多，对抗血栓药物的需求也越来越大。目前临床上常用的溶栓药物主要为纤溶酶原激活剂，如链激酶(SK)、尿激酶(UK)、单链尿激酶(scu-PA)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等，这些药物虽然都具有较强的溶栓效果，但均存在如下问题：(1)出血：由于这些药物不仅激活纤维蛋白凝块中的纤溶酶原，同时也激活血浆中的纤溶酶原，使血浆中纤溶酶活性增高，血浆纤溶酶能水解凝血因子VII等，导致凝血因子减少而引起出血。(2)体内半衰期短，故治疗用量大。(3)再梗死：纤溶酶系统被激活后可同时活化血小板，使纤维蛋白原和Von Willebrand因子聚集于血小板GpIIb/IIIa受体，从而促使血栓形成，在溶栓后短时间内容易再次形成血栓，使治疗失败。因此，如何能够使溶栓药物靶向性的激活血栓中的纤溶酶原、开发新型的效力更强、溶栓专一性更好、并能有效预防再栓塞的溶栓制剂是目前抗血栓药物研究的热点。

发明内容：

众所周知，血液凝固过程是一个级联反应：首先是血小板活化，使得质膜内侧的膜磷脂如磷脂酰丝氨酸(PS)暴露在血小板外侧；接下来凝血因子IX、X等在膜磷脂的表面不断被激活；最后使凝血酶原激活为凝血酶。因此，血小板的膜磷脂在凝血过程中具有至关重要的作用，是溶栓和抗凝药物的一种有效的作用靶点。基于这一事实，本发明设计了一种具有靶向性溶栓和抗凝作用的融合蛋白。本融合蛋白由两种蛋白融合而成，一为AnnexinA5的突变体mAnxA5，另一为尿激酶的B链UKB。

一、AnnexinA5突变体mAnxA5

AnnexinA5是膜联蛋白家族(Annexin family)中含量最丰富的一种钙结合蛋白，在钙离子存在的情况下，可以高亲和性地同血小板活化后所暴露出的的膜磷脂结合。研究证实，每个活化血小板的表面约有20万个AnnexinA5的结合位点，大约是抗血小板糖蛋白IIb/IIIa单克隆抗体结合位点的10倍(Shattil SJ.et al.，1985，J Biol Chem，260：11107)。动物实验也表明，同位素标记的AnnexinA5静脉注射后主要聚集于主动脉血栓部位(Tait JF，et al.1994，Thromb Res.，75：491)。因此，AnnexinA5可以作为一种“生物导弹”研制动脉血栓的靶向溶栓药物。但有一个问题不容忽视：AnnexinA5的分子量为34kDa，所以和溶栓药物融合后分子量往往太大(一般为90kDa左右)，这样不仅不利于融合蛋白的表达，也导致了其半衰期的缩短，因而溶栓效率降低。针对这种情况，本发明根据AnnexinA5具有四个同源结构域的特点对AnnexinA5进行了基因改造，得到了一个仅包含第一、第二结构域的序列缺失突变体mAnxA5，其分子量仅为原来的一半，但保留了AnnexinA5的血栓靶向功能和抗凝血功能。

除了序列缺失突变外，mAnxA5还含有一个点突变，亦即将第二结构域中的缬氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(V-G-D)序列改造成精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D)序列，以增强mAnxA5的抗凝血作用。其理论依据为：在凝血过程中，血小板通过其膜整合素受体GP IIb/IIIa与纤维蛋白和Von Willebrand factor(vWF)等粘附分子中的“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(R-G-D)”序列结合，可介导血小板的粘附和聚集。实验证明含有R-G-D序列的天然和人工短肽能够显著抑制血小板的聚集反应，具有抗凝血的功能(Collen D et al.，Thromb Haemost，1994，71：95)。因此，mAnxA5不仅具有血栓靶向性，还有很强的抗凝血活性，且分子量仅为AnnexinA5的一半，所以非常适合于作为溶栓药物的载体。

二、尿激酶B链(UKB)

Scu-PA是目前临床上常用的一种溶栓药物，具有较强的溶栓活性和一定的纤维蛋白特异性。尿激酶B链(UKB)是单链尿激酶纤溶酶原激活剂(Scu-PA)的衍生物，由Scu-PA的第159～411位氨基酸残基组成。Kenji等(Kenji et al.，Biochemistry，1996，35：924)的研究表明，UKB具有和Scu-PA相似的溶栓活性。由于其分子量仅为30kDa，因而是目前构建嵌合体溶栓剂常用的分子。

本发明利用mAnxA5的血栓靶向性和抗凝活性，利用尿激酶B链(UKB)的溶栓功能，制备成一种兼有抗凝、溶栓双重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB。由于该蛋白还具有血栓靶向的特性，所以溶栓效率优于一般的溶栓剂。

本发明融合蛋白mA5UKB是通过基因工程的方法制备的，具体制备过程为：

一、构建融合基因mA5UKB

1、基因突变体mAnxA5的构建

mAnxA5基因是以AnnexinA5基因(GenBank No.M18366)为基础，通过定点突变和PCR等方法得到。整个构建过程分两步：

第一步：进行点突变，将AnnexinA5基因第二结构域中“V-G-D”序列突变为“R-G-D”序列

将缬氨酸(V)突变为精氨酸(R)采用重叠区基因扩增法，共需合成四条引物，分别为：

P：5’GC CCATGGATGGCACAGGTTCTCAG 3’

P2：5’

CACGTCATCTTC 3’

P3：5’ ACTTCAGGGTAC 3’

P4：5’TTACAGTAGAAGAGGT GTCGACGC 3’

其中：

P1与AnnexinA5基因的5’端相一致，并引入Nco I酶切位点CCATGG。

P2含有精氨酸密码子的互补核苷酸序列ACG。

以含有AnnexinA5基因的质粒pUC119-AnxA5为模板，P1，P2为引物扩增，得到的序列称为P1P2。

P3含有精氨酸密码子序列CGT。

P4同AnnexinA5的3’末端互补。以含有AnnexinA5基因的质粒pUC119-AnxA5为模板，P3，P4为引物扩增，得到的序列称为P3P4。

引物P2，P3具有一段互补的序列(引物中有阴影的部分)，所以P1P2和P3P4的序列中也存在这一互补序列。将P1P2和P3P4变性后退火，可以在这段互补区形成双链。提供PCR反应条件，P1P2和P3P4可以互为引物进行扩增，扩增后的产物为P1P4。通过这种方法，将AnnexinA5第二结构域中“V-G-D”序列突变为“R-G-D”序列。

第二步：PCR扩增P1P4序列中的第一、二结构域，得到突变体基因mAnxA5以P1P4为模板，以P1，P5为引物进行PCR扩增，得到的产物即为本发明的突变体基因mAnxA5基因，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别见表1和表2。

P1：5’GC CCATGGATGGCACAGGTTCTCAG 3’

P5：5’ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAGA 3’

P1与第一步所用的P1相同，P5与编码AnnexinA5第154-157位氨基酸残基的核苷酸序列互补。

2、尿激酶B链(UKB)基因的获得

人工合成人尿激酶原基因(GenBank No.M15476)中编码第159-411氨基酸序列的核苷酸序列，该基因序列即称为UKB基因，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别见表3和表4。

3、融合基因mA5UKB基因的构建

PCR扩增UKB的基因序列，所用的引物为：

P6：5’GGATCCGGTGGCGGTCCATCACCGCCTAGGCC 3’

P7：5’GC GTCGAC TTAGAGGGCCAGGCCATTCTC 3’

PCR扩增mAnxA5的序列，所用的引物为：

P1：5’GC CCATGGATGGCACAGGTTCTCAG 3’

P5：5’ACCGCCACCGGATCCGCCACTACCCTGAAGGAG 3’

因为引物P6和P5有一段序列互补，所以利用上述方法得到的mAnxA5和UKB在变性后退火，可形成互补的双链。提供PCR条件，可以得到mAnxA5和UKB的融合基因mA5UKB，并在其两端分别引入Nco I和Sal I酶切位点。为使两个基因连接后所编码的融合蛋白能够各自保持正确的空间结构，本发明以甘氨酸和丝氨酸为主的G-S-G-G-S-G-S作为连接肽(斜线部分)，最终得到的融合基因命名为mA5UKB基因，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别见表5和表6。

二、构建原核表达质粒pET28a-mA5UKB和工程菌BL21(mA5UKB)

将融合基因mA5UKB利用Nco I和Sal I双酶切，插入经相应双酶切的原核表达质粒pET28a，所得到的重组质粒为pET28a-mA5UKB。将质粒pET28a-mA5UKB转化感受态细菌BL21(DE3)，通过卡那抗性筛选阳性重组子。含有质粒pET28a-mA5UKB的大肠杆菌BL21(DE3)即为工程菌BL21(mA5UKB)。

三、融合蛋白mA5UKB的制备

1、培养菌体，诱导融合蛋白表达：

挑取少量工程菌BL21(mA5UKB)于LB培养基(含卡那100μg/ml)中37℃振荡培养过夜，然后按照1％的接种量转接于LB培养基(含卡那100μg/ml)中，37℃振荡培养3小时至A₆₀₀＝0.5-0.6，加IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃诱导培养8小时。

2、制备包含体：

离心收集菌体，按照每克湿菌加3ml裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mmol/L)的比例加入裂解缓冲液，悬浮沉淀。冰浴超声以破碎菌体，离心收集沉淀。

加入洗涤液(0.5％ Triton X-100，10mmol/L EDTA，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)悬浮离心洗涤3次，可得初步纯化的包含体。

3、溶解包含体：

包含体溶解在变性液中(8M尿素，0.5M NH₄Cl，50mmol/L Tris-HCl，pH8.5，100mmol/L β-巯基乙醇)，室温保温4小时，然后12,000g离心10分钟，取上清液，得到粗蛋白溶液。

4、分子筛纯化：

上述获得的上清液在变性状态下通过Sephacryl S-200分子筛，平衡和洗脱液为(5M尿素，0.5M NH₄Cl，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mmol/L EDTA，10mmol/Lβ-巯基乙醇)，收集洗脱峰样品液，得到初步纯化的蛋白。加入β-巯基乙醇至终浓度为100mmol/L。

5、稀释复性：

上述样品液对5M尿素，0.5M NH₄Cl，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0，0.5mmol/LEDTA，10mmol/L β-巯基乙醇透析过夜。

滴入100倍体积的复性液(2.5M尿素，0.5M NH₄Cl，10mmol/L Tris-HCl，pH8.0)中，4℃静置24小时。

6、离子交换进一步纯化

复性后的样品液用弱阴离子交换柱DEAE-Sephoarose进行离子交换层析。收集含有融合蛋白mA5UKB的洗脱峰，利用中空超滤纤维超滤浓缩，将浓缩液加入80％硫酸铵溶液进行沉淀，置于-20℃冻存。

四、融合蛋白mA5UKB的生物活性测定

本发明所提供的融合蛋白mA5UKB主要具有三种生物活性：一是同尿激酶原类似的溶栓活性，该活性可以利用血纤维蛋白平板法证实，利用本发明所提供的工艺纯化蛋白，比活可以达到4万IU/mg蛋白。二是抗凝血活性。抗凝实验表明，融合蛋白mA5UKB和AnnexinA5类似，能够显著延长白陶土激活的部分凝血酶原时间(KPTT)，说明该蛋白具有较强的抗凝血活性。三是对活化血小板具有较高的亲和力。膜结合特异性研究表明，mA5UKB与AnnexinA5的下降趋势基本一致，因此说明mA5UKB对活化血小板的亲和力和AnnexinA5相当。

以上实验证实，mAnxA5同尿激酶原B链融合表达后，表达产物能保留各自的生物学活性，从而得到一种具有抗凝和溶栓双重功能且具有血栓靶向的新型溶栓蛋白。依据同样的思路，可以将mAnxA5作为一种血栓靶向的载体，同其他一些溶栓剂如组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、链激酶等构建血栓靶向性溶栓药物。

综上所述，同现有的溶栓药物相比，本发明具有如下优点：1、mAnxA5对活化的血小板具有较高的亲和力，因而可以靶向作用于血栓部位，提高了溶栓效率，减小了用量；2、降低了对血液中纤溶酶原的激活，减小了系统性出血等不良反应；3、本发明利用的溶栓剂是尿激酶B链，缺失了凝血酶敏感的位点，从而能够延长融合蛋白mA5UKB的半衰期；4、mAnxA5本身具有很强的抗凝血活性，大大减小了血栓溶解后再栓塞的几率。因此，本发明mA5UKB可用于制备血栓靶向性的溶栓药物。

本发明采用目前表达效率最高的T7噬菌体原核表达系统，因而表达量远远高于其他表达系统中尿激酶的表达量，有利于规模化生产。

附图说明：

图1重组质粒pET28a-mA5UKB的结构示意图谱

图2mA5UKB的抗凝活性柱形图

图3mA5UKB对活化血小板亲和力的曲线图

1：mA5UKB；2：AnnexinA5

图4mA5UKB溶栓测定结果示意图

1：阳性对照(尿激酶20IU)；2：阴性对照(1×PBS)

3：0.3μg蛋白mA5UKB；4：0.4μg mA5UKB

具体实施方式：

试剂与材料：

本发明所用的质粒pUC119购自invitrogen公司；原核表达质粒pET28a和宿主菌BL21(DE3)购自Novagen公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、pfu DNA聚合酶均购自TaKaRa公司，dNTP购自上海博彩生物工程公司。引物的合成和核苷酸序列测序均由上海基康公司完成。纯化用的层析柱及其填料Sephacryl S-400、DEAE购自Pharmacia公司。抗尿激酶单克隆抗体购自华美生物工程公司。

实施例1构建mAnxA5突变体基因

人AnnexinA5的基因序列从人胎盘组织中利用RT-PCR方法得到，为方便进一步的扩增、酶切等操作，将该基因插入质粒pUC119，得到重组质粒pUC119-AnxA5。(参见《分子克隆》相关章节，科学出版社，1992出版)。

1、将AnnexinA5基因中第142-144位的“V-G-D”序列突变为“R-G-D”序列

在100μl的PCR反应体系中，加引物P1，P2各2μl(15pmol/μl)，pUC119-AnxA5模板DNA1μl(50ng/μl)，15mM MgCl₂ 10μl，高保真pfu DNA聚合酶3个单位，10mMdNTP为5μl，10×PCR缓冲液10μl，补双蒸水至100μl。PCR条件为：第一循环94℃变性4分钟，第二循环为：94℃变性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸1分钟。共进行30个循环，最后一个循环72℃延伸10分钟，反应后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收PCR产物，命名为P1P2。

在100μl的PCR反应体系中，加引物P3，P4各2μl(15pmol/μl)，pUC119-AnxA5模板DNA1μl(50ng/μl)，15mM MgCl₂ 10μl，高保真pfu DNA聚合酶3个单位，10mMdNTP为5μl，10×PCR缓冲液10μl，补双蒸水至100μl。PCR条件为：第一循环94℃变性4分钟，第二循环为：94℃变性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸1分钟。、共进行30个循环，最后一个循环72℃延伸10分钟，反应后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收PCR产物，命名为P3P4。

因为引物P2和P3具有互补的一段核苷酸序列，因而退火后可以使P1P2的单链和P3P4的单链在互补区形成局部双链。在100μl反应体系中，各取5μl(500ng)回收的P1P2、P3P4产物混合，94℃变性5分钟，50℃退火1分钟。然后加入引物P1，P4各2μl(15pmol/μl)，15mM MgCl₂ 10μl，高保真pfu DNA聚合酶4个单位，10mM dNTP为5μl，10×PCR缓冲液10μl，补双蒸水至100μl。PCR条件为：第一循环94℃变性4分钟，第二循环为94℃变性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸2分钟。共进行30个循环，最后一个循环72℃延伸10分钟，反应后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收PCR产物，命名为P1P4。经测序证实得到的PCR产物AnnexinA5第二结构域中“V-G-D”序列密码子突变为“R-G-D”序列，该基因片段成为P1P4。

2、PCR扩增得到基因突变体mAnxA5

在100μl的PCR反应体系中，引物P1，P5各2μl(15pmol/μl)，P1P4模板DNA1μl(50ng/μl)，15mM MgCl₂ 10μl，高保真pfu DNA聚合酶3个单位，10mM dNTP为5μl，10×PCR缓冲液10μl，补双蒸水至100μl。PCR条件为：第一循环94℃变性4分钟，第二循环为94℃变性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸1分钟。、共进行30个循环，最后一个循环72℃延伸10分钟，反应后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收PCR产物，经测序证实获得的产物为mAnxA5基因突变体。

实施例2构建融合基因mA5UKB

1、PCR扩增尿激酶B链基因

人工合成的尿激酶B链基因插入质粒pUC119得到重组质粒pUC119-UKB。100μlPCR反应体系中，加15pmol/μl的P6，P7引物各2μl，模板质粒DNA pUC119-UKB1μl(50ng)，10mM dNTP 5μl，10×PCR缓冲液10μl，15mM MgCl₂ 10μl。PCR条件为：第一循环94℃变性4分钟，第二循环为：94℃变性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸1分钟。共进行30个循环，最后一个循环72℃延伸10分钟，反应后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收PCR产物，得到的PCR产物经测序证实为尿激酶B链基因(UKB基因)。

2、构建融合基因mA5UKB基因

因为引物P5和P6具有互补的部分序列，所以退火后mAnxA5基因的单链可以和尿激酶B链基因的单链退火，然后互为模板向两边延伸，最终得到mAnxA5基因和尿激酶B链基因的融合基因mA5UKB基因。将PCR扩增的基因突变体mAnxA5基因和UKB基因各10μl(500ng)混合，94℃变性5分钟，50℃退火1分钟。100μl PCR反应体系中，加10pmol/μl的P1，P7引物各2μl，10mM dNTP 5μl，10×PCR缓冲液10μl，15mM MgCl₂ 10μl。PCR条件为：第一循环94℃变性4分钟，第二循环为：94℃变性45秒；55℃退火45秒；72℃延伸2分钟。共进行30个循环，最后一个循环72℃延伸10分钟，反应后产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收PCR产物，经测序证实得到的PCR产物即为尿激酶B链基因UKB和mAnxA5的融合基因mA5UKB，并且在5’和3’端分别引入了Nco I和Sal I的酶切位点。

实施例3构建原核表达质粒pET28a-mA5UKB和工程菌BL21(mA5UKB)

本发明采用IPTG诱导型大肠杆菌表达载体pET-28a。该质粒全长5396bp(碱基对)，含有噬菌体T7启动子、Luc阻抑物基因LucI，质粒复制起点(ori)和卡那抗性基因(kan^r)。将实施例2获得的融合基因mA5UKB用Nco I、Sal I双酶切，胶回收酶切片段。与同样用Nco I、Sal I双酶切的载体pET28a混合(分子数5∶1)，于20ul连接体系中，加T4连接酶，14℃连接过夜，得重组质粒pET28a-mA5UKB(图1)。

制备感受态细胞BL21(DE3)：挑取大肠杆菌BL21(DE3)单菌落，于3ml LB培养基(含1％的胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠，pH7.0)中37℃振荡培养过夜。然后按照3％的接种量接种于50ml LB培养基，37℃继续振荡培养，至OD₆₀₀＝0.4。4℃以4000rpm的转速离心10分钟；去上清后，菌体用1～2ml冰预冷的100mM的氯化钙溶液重悬，即得大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞。

转化：将上述连接混合液20ul与200ul感受态细胞混匀，冰浴30分钟。42℃热休克90秒，然后再于冰浴中10分钟。取0.2ml转化混合液涂布于含有卡那霉素100ug/ml的LB琼脂平板上，37℃培养12-15小时，挑取单菌落于3ml卡那抗性的LB培养基37℃振荡培养过夜。抽提质粒，用Nco I、Sal I双酶切能够切出一条1260bp的条带。该转化子即为含有重组质粒pET28a-mA5UKB的工程菌BL21(mA5UKB)。

实施例4融合蛋白mA5UKB的诱导表达

挑取大肠杆菌BL21(mA5UKB)的单菌落，于3ml含卡那霉素100μg/ml的LB培养基中37℃振荡培养过夜。按照1％的接种量接种于500ml LB培养基(含卡那100μg/ml)，继续振荡培养2-3小时。至OD₆₀₀＝0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度1mM。继续培养5-6小时。含质粒pET28a的BL21(DE3)以同样条件培养、诱导，菌体经超声处理后，取样品上清和沉淀作SDS-PAGE及其Western Blot分析。结果表明，工程菌诱导后在56kDa处有一明显的表达条带，主要存在于超声沉淀中，而含有pET28a质粒的对照菌体无此条带。说明表达蛋白为融合蛋白mA5UKB，表达量占菌体总蛋白的25％左右，主要以包含体的形式表达。

实施例5融合蛋白mA5UKB的分离纯化

1、超声破菌

诱导培养后的菌液7700g离心10分钟，收集菌体。

按照每克湿重菌体加3ml缓冲液的比例，用缓冲溶液(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，pH8.0)悬浮菌沉淀。再加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，0℃冰浴15分钟；超声破菌，超声功率100W，30秒/次，显微镜检查菌体破碎情况。当菌体基本破碎后停止超声。

2、包含体制备

超声液经10000g离心15分钟，弃去上清。包含体沉淀用9倍体积的洗涤液(50mM Tris-HCl，10mM EDTA，100mM NaCl，0.5％ Triton X-100，pH8.0)离心洗涤两次，弃上清。

按照每克湿重包含体9ml缓冲液的比例，用12ml裂解液(8M尿素，0.5MNH₄Cl，500mM Tris-HCl，pH8.5)悬浮沉淀，室温振荡4小时。然后7700g离心将不溶的部分除去。利用这种方法可以制备含量约70％的粗蛋白。

3、融合蛋白mA5UKB经分子筛纯化

粗蛋白在变性状态下进一步经Sephacryl S-400凝胶层析柱纯化。平衡和洗脱液均为5M尿素，0.5NH₄Cl，50mM Tris-HCl，pH8.0，0.5mM EDTA，10mM DTT。根据SDS-PAGE分析，收集峰值的蛋白样品液，-20℃保存。

4、蛋白稀释复性

上述样品透析12小时，透析液为10倍体积的5M尿素，0.5NH₄Cl，50mMTris-HCl，pH8.5。尿激酶原含有12对二硫键，因此在透析过程中应注意去除透析液中氧气。先将透析液超声除气10分钟，然后通入N₂ 5分钟，最后用parafilm膜将透析的三角烧瓶密封。

透析后的样品逐滴加入100倍体积的缓冲液，含2M尿素，0.5NH₄Cl，50mMTris-HCl，0.5mM EDTA，1.25mM还原型谷胱甘肽，0.5mM氧化型谷胱甘肽，pH8.5。4℃轻轻搅动24小时，然后再加入0.5mM氧化型谷胱甘肽，继续搅动24小时。最后，样品在12倍体积的缓冲溶液10mM Tris-HCl，pH8.0中透析12小时。透析后的样品利用超滤膜浓缩。

5、离子交换进一步纯化

上述样品再用二乙胺基乙基琼脂糖(DEAE Sepharose)弱阴离子交换柱进行离子交换层析。层析柱用50mM Tris·HCl，pH8.0平衡。洗脱盐浓度从0～1mol/L NaCl进行等浓度梯度洗脱，流速为1ml/分钟。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定重组蛋白洗脱的峰值，发现重组蛋白在盐浓度为0.4mol/L时被洗脱下来。收集峰值洗脱液，经10％ SDS-PAGE电泳分离，考马氏亮蓝染色显示为51kDa的单一蛋白条带，凝胶扫描发现该蛋白的纯度达95％。

实施例6融合蛋白mA5UKB的生物活性鉴定

大肠杆菌表达的融合蛋白mA5UKB具有三种显著的生物活性：

(一)溶栓活性。采用纤溶活性测定的标准方法(中国生物制品规程2000版，中国生物制品标准化委员会编，化学工业出版社，423页)：125mg琼脂糖，加入23ml生理氯化钠溶液，煮沸溶解，60℃水浴平衡，加凝血酶14ul(100 IU/ml)，纤溶酶原280ul(0.5mg/ml)，要边加边摇匀，然后加2.2ml人纤维蛋白原(6mg/ml)，不停(应在两天之内使用)。标准品用生理盐水溶液稀释成以下5个稀释度(IU/ml)：1000，250，62.5，15.6，3.9待检样品根据标示量稀释至大约100IU/ml或1ug/ml的浓度，待用。

在形成的纤维蛋白平皿内打孔(直径2mm)，每孔点样10ul，每个待检样品和标准品各点两个孔，37℃湿盒(在饭盒内加少量水以保持一定的湿度)水平放置24小时。

纵横两次量取溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数(X)为横坐标，以溶圈直径的平均数(4次量取得数值)的对数为纵坐标(Y)，按生物统计学方法分析结果，并求得y＝a+bx中的a和b及线性回归系数r值，根据待检样品的溶圈直径可求得待检样品的活性。实验证实大肠杆菌表达的融合蛋白mA5UKB具有同尿激酶相似的溶栓活性，比活约为4万IU/mg(图2)。

(二)抗凝活性。抗凝试验采用部分激活的凝血活酶试验(KPTT)法，取100ul的活化部分凝血活酶试剂，加入100ul的待测样品，37℃温育3分钟；加入100ul的参比血浆，37℃温育3分钟；加入100ul CaCl₂溶液，测定反应物凝固时间。试验表明，融合蛋白mA5UKB能够显著延长KPTT时间，抗凝血活性优于AnnexinA5(图3)。

(三)mA5UKB能特异性结合活化的血小板，所以对以活化血小板为主的主动脉血栓具有血栓靶向性。膜特异性的分析采用血小板结合试验进行，方法如下：制备分离¹²⁵I标记的蛋白¹²⁵I-AnnexinA5，按照文献(Patrick J等，Thrombin stimulates theintracellular relocation of annexin V in human platelets，Biochimica etBiophysica Acta，1222：135)的方法制备凝血酶活化的血小板5×10⁷/ml，在下列反应体系：10mmol/L Na-HEPES(pH7.4)，150mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl₂，2.7mmol/LKCl，2mmol/L MgCl₂，1mmol/L NaH₂PO₄，5mmol/L glucose，5mg/ml BSA中加入不同浓度的AnnexinA5及mA5UKB，离心收集血小板及上清，分别测定其放射活性，计算结合百分比。

研究表明，mA5UKB融合蛋白对活化血小板亲和力与AnnexinA5相当(图4)。

上述结果表明，mA5UKB融合蛋白不仅具有对以活化血小板为主要成分的主动脉血栓的靶向溶栓作用，而且兼具有抗凝功能，可用其制备新型溶栓药物。

表1 mAnxA5基因的核苷酸序列表

ATGGCACAGGTTCTCAGAGGCACTGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCTGAT 60

GCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGCATCCTGACT 120

CTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTG 180

TTTGGCAGGGATCTTCTGGATGACCTGAAATCAGAACTAACTGGAAAATTTGAAAAATTA 240

ATTGTGGCTCTGATGAAACCCTCTCGGCTTTATGATGCTTATGAACTGAAACATGCCTTG 300

AAGGGAGCTGGAACAAATGAAAAAGTACTGACAGAAATTATTGCTTCAAGGACACCTGAA 360

GAACTGAGAGCCATCAAACAAGTTTATGAAGAAGAATATGGCTCAAGCCTGGAAGATGAC 420

GTGCGTGGGGACACTTCAGGGTACTACCAGCGGATGTTGGTGGTTCTCCTTCAG

表2 mAnxA5的氨基酸序列表

5 10 15 20

METAlaGlnValLeuArgGlyThrValThrAspPheProGlyPheAspGluArgAlaAsp

25 30 35 40

AlaGluThrLeuArgLysAlaMETLysGlyLeuGlyThrAspGluGluSerIleLeuThr

45 50 55 60

LeuLeuThrSerArgSerAsnAlaGlnArgGlnGluIleSerAlaAlaPheLysThrLeu

65 70 75 80

PheGlyArgAspLeuLeuAspAspLeuLysSerGluLeuThrGlyLysPheGluLysLeu

85 90 95 100

IleValAlaLeuMETLysProSerArgLeuTyrAspAlaTyrGluLeuLysHisAlaLeu

105 110 115 120

LysGlyAlaGlyThrAsnGluLysValLeuThrGluIleIleAlaSerArgThrProGlu

125 130 135 140

GluLeuArgAlaIleLysGlnValTyrGluGluGluTyrGlySerSerLeuGluAspAsp

145 150 155 160

ValArgGlyAspThrSerGlyTyrTyrGlnArgMETLeuValValLeuLeuGln

表3 UKB基因的核苷酸序列表

GGCGGATCCGGTGGCGGTAAGATTATTGGGGGAGAATTTACCACCATCGAGAACCAGCCC 60

TGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGC 120

AGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAG 180

AAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAG 240

ATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCT 300

CACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCA 360

TCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACA 420

AGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAAAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAG 480

CTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTAC 540

GGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTATGTGCTGCTGACCCCCAATGGAAAACAGATTCC 600

TGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACT 660

GGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGA 720

GTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTC 780

TAA

表4 UKB的氨基酸序列表

5 10 15 20

GlyGlySerGlyGlyGlyLysIleIleGlyGlyGluPheThrThrIleGluAsnGlnPro

25 30 35 40

TrpPheAlaAlaIleTyrArgArgHisArgGlyGlySerValThrTyrValCysGlyGly

45 50 55 60

SerLeuIleSerProCysTrpValIleSerAlaThrHisCysPheIleAspTyrProLys

65 70 75 80

LysGluAspTyrIleValTyrLeuGlyArgSerArgLeuAsnSerAsnThrGlnGlyGlu

85 90 95 100

MetLysPheGluValGluAsnLeuIleLeuHisLysAspTyrSerAlaAspThrLeuAla

105 110 115 120

HisHisAsnAspIleAlaLeuLeuLysIleArgSerLysGluGlyArgCysAlaGlnPro

125 130 135 140

SerArgThrIleGlnThrIleCysLeuProSerMetTyrAsnAspProGlnPheGlyThr

145 150 155 160

SerCysGluIleThrGlyPheGlyLysGluAsnSerThrAspTyrLeuTyrProGluGln

165 170 175 180

LeuLysMETThrValValLysLeuIleSerHisArgGluCysGlnGlnProHisTyrTyr

185 190 195 200

GlySerGluValThrThrLysMetLeuCysAlaAlaAspProGlnTrpLysThrAspSer

205 210 215 220

CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysSerLeuGlnGlyArgMETThrLeuThr

225 230 235 240

GlyIleValSerTrpGlyArgGlyCysAlaLeuLysAspLysProGlyValTyrThrArg

245 250 255 260

ValSerHisPheLeuProTrpIleArgSerHisThrLysGluGluAsnGlyLeuAlaLeu *

表5 mA5UKB基因的核苷酸序列表

ATGGCACAGGTTCTCAGAGGCACTGTGACTGACTTCCCTGGATTTGATGAGCGGGCTGAT 60

GCAGAAACTCTTCGGAAGGCTATGAAAGGCTTGGGCACAGATGAGGAGAGCATCCTGACT 120

CTGTTGACATCCCGAAGTAATGCTCAGCGCCAGGAAATCTCTGCAGCTTTTAAGACTCTG 180

TTTGGCAGGGATCTTCTGGATGACCTGAAATCAGAACTAACTGGAAAATTTGAAAAATTA 240

ATTGTGGCTCTGATGAAACCCTCTCGGCTTTATGATGCTTATGAACTGAAACATGCCTTG 300

AAGGGAGCTGGAACAAATGAAAAAGTACTGACAGAAATTATTGCTTCAAGGACACCTGAA 360

GAACTGAGAGCCATCAAACAAGTTTATGAAGAAGAATATGGCTCAAGCCTGGAAGATGAC 420

GTGCGTGGGGACACTTCAGGGTACTACCAGCGGATGTTGGTGGTTCTCCTTCAGGGTAGT 480

GGCGGATCCGGTGGCGGTAAGATTATTGGGGGAGAATTTACCACCATCGAGAACCAGCCC 540

TGGTTTGCGGCCATCTACAGGAGGCACCGGGGGGGCTCTGTCACCTACGTGTGTGGAGGC 600

AGCCTCATCAGCCCTTGCTGGGTGATCAGCGCCACACACTGCTTCATTGATTACCCAAAG 660

AAGGAGGACTACATCGTCTACCTGGGTCGCTCAAGGCTTAACTCCAACACGCAAGGGGAG 720

ATGAAGTTTGAGGTGGAAAACCTCATCCTACACAAGGACTACAGCGCTGACACGCTTGCT 780

CACCACAACGACATTGCCTTGCTGAAGATCCGTTCCAAGGAGGGCAGGTGTGCGCAGCCA 840

TCCCGGACTATACAGACCATCTGCCTGCCCTCGATGTATAACGATCCCCAGTTTGGCACA 900

AGCTGTGAGATCACTGGCTTTGGAAAAGAAAATTCTACCGACTATCTCTATCCGGAGCAG 960

CTGAAAATGACTGTTGTGAAGCTGATTTCCCACCGGGAGTGTCAGCAGCCCCACTACTAC 1020

GGCTCTGAAGTCACCACCAAAATGCTATGTGCTGCTGACCCCCAATGGAAAACAGATTCC 1080

TGCCAGGGAGACTCAGGGGGACCCCTCGTCTGTTCCCTCCAAGGCCGCATGACTTTGACT 1140

GGAATTGTGAGCTGGGGCCGTGGATGTGCCCTGAAGGACAAGCCAGGCGTCTACACGAGA 1200

GTCTCACACTTCTTACCCTGGATCCGCAGTCACACCAAGGAAGAGAATGGCCTGGCCCTC 1260

TAA

表6 mA5UKB的氨基酸序列表

5 10 15 20

METAlaGlnValLeuArgGlyThrValThrAspPheProGlyPheAspGluArgAlaAsp

25 30 35 40

AlaGluThrLeuArgLysAlaMETLysGlyLeuGlyThrAspGluGluSerIleLeuThr

45 50 55 60

LeuLeuThrSerArgSerAsnAlaGlnArgGlnGluIleSerAlaAlaPheLysThrLeu

65 70 75 80

PheGlyArgAspLeuLeuAspAspLeuLysSerGluLeuThrGlyLysPheGluLysLeu

85 90 95 100

IleValAlaLeuMETLysProSerArgLeuTyrAspAlaTyrGluLeuLysHisAlaLeu

105 110 115 120

LysGlyAlaGlyThrAsnGluLysValLeuThrGluIleIleAlaSerArgThrProGlu

125 130 135 140

GluLeuArgAlaIleLysGlnValTyrGluGluGluTyrGlySerSerLeuGluAspAsp

145 150 155 160

ValArgGlyAspThrSerGlyTyrTyrGlnArgMETLeuValValLeuLeuGln GlySer

165 170 175 180

GlyGlySerGlyGlyGlyLysIleIleGlyGlyGluPheThrThrIleGluAsnGlnPro

185 190 195 200

TrpPheAlaAlaIleTyrArgArgHisArgGlyGlySerValThrTyrValCysGlyGly

205 210 215 220

SerLeuIleSerProCysTrpValIleSerAlaThrHisCysPheIleAspTyrProLys

225 230 235 240

LysGluAspTyrIleValTyrLeuGlyArgSerArgLeuAsnSerAsnThrGlnGlyGlu

245 250 255 260

MetLysPheGluValGluAsnLeuIleLeuHisLysAspTyrSerAlaAspThrLeuAla

265 270 275 280

HisHisAsnAspIleAlaLeuLeuLysIleArgSerLysGluGlyArgCysAlaGlnPro

285 290 295 300

SerArgThrIleGlnThrIleCysLeuProSerMetTyrAsnAspProGlnPheGlyThr

305 310 315 320

SerCysGluIleThrGlyPheGlyLysGluAsnSerThrAspTyrLeuTyrProGluGln

325 330 335 340

LeuLysMETThrValValLysLeuIleSerHisArgGluCysGlnGlnProHisTyrTyr

345 350 355 360

GlySerGluValThrThrLysMetLeuCysAlaAlaAspProGlnTrpLysThrAspSer

365 370 375 380

CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysSerLeuGlnGlyArgMETThrLeuThr

385 390 395 400

GlyIleValSerTrpGlyArgGlyCysAlaLeuLysAspLysProGlyValTyrThrArg

405 410 415 420

ValSerHisPheLeuProTrpIleArgSerHisThrLysGluGluAsnGlyLeuAlaLeu *

注：划线部分代表两基因融合时中间的甘氨酸和丝氨酸接头。

Claims

1、一种兼抗凝溶栓双重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB，其特征在于氨基酸序列

如下：

5 10 15 20

METAlaGlnValLeuArgGlyThrValThrAspPheProGlyPheAspGluArgAlaAsp

25 30 35 40

AlaGluThrLeuArgLysAlaMETLysGlyLeuGlyThrAspGluGluSerIleLeuThr

45 50 55 60

LeuLeuThrSerArgSerAsnAlaGlnArgGlnGluIleSerAlaAlaPheLysThrLeu

65 70 75 80

PheGlyArgAspLeuLeuAspAspLeuLysSerGluLeuThrGlyLysPheGluLysLeu

85 90 95 100

IleValAlaLeuMETLysProSerArgLeuTyrAspAlaTyrGluLeuLysHisAlaLeu

105 110 115 120

LysGlyAlaGlyThrAsnGluLysValLeuThrGluIleIleAlaSerArgThrProGlu

125 130 135 140

GluLeuArgAlaIleLysGlnValTyrGluGluGluTyrGlySerSerLeuGluAspAsp

145 150 155 160

ValArgGlyAspThrSerGlyTyrTyrGlnArgMETLeuValValLeuLeuGlnGlySer

165 170 175 180

GlyGlySerGlyGlyGlyLysIleIleGlyGlyGluPheThrThrIleGluAsnGlnPro

185 190 195 200

TrpPheAlaAlaIleTyrArgArgHisArgGlyGlySerValThrTyrValCysGlyGly

205 210 215 220

SerLeuIleSerProCysTrpValIleSerAlaThrHisCysPheIleAspTyrProLys

225 230 235 240

LysGluAspTyrIleValTyrLeuGlyArgSerArgLeuAsnSerAsnThrGlnGlyGlu

245 250 255 260

MetLysPheGluValGluAsnLeuIleLeuHisLysAspTyrSerAlaAspThrLeuAla

265 270 275 280

HisHisAsnAspIleAlaLeuLeuLysIleArgSerLysGluGlyArgCysAlaGlnPro

285 290 295 300

SerArgThrIleGlnThrIleCysLeuProSerMetTyrAsnAspProGlnPheGlyThr

305 310 315 320

SerCysGluIleThrGlyPheGlyLysGluAsnSerThrAspTyrLeuTyrProGluGln

325 330 335 340

LeuLysMETThrValValLysLeuIleSerHisArgGluCysGlnGlnProHisTyrTyr

345 350 355 360

GlySerGluValThrThrLysMetLeuCysAlaAlaAspProGlnTrpLysThrAspSer

365 370 375 380

CysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysSerLeuGlnGlyArgMETThrLeuThr

385 390 395 400

GlyIleValSerTrpGlyArgGlyCysAlaLeuLysAspLysProGlyValTyrThrArg

405 410 415 420

ValSerHisPheLeuProTrpIleArgSerHisThrLysGluGluAsnGlyLeuAlaLeu。

2、权利要求1所述兼抗凝溶栓双重功能的血栓靶向融合蛋白mA5UKB用于制备溶栓药物的用途。