CN1726283A - 利用c4bp支架制备多聚体融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

所述发明提供了获得重组融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含C4bpα链的C－末端核心蛋白支架，并且所述重组融合蛋白能在原核宿主细胞中形成可溶形式的多聚体，所述方法包括以下步骤：(i)提供带有编码所述重组蛋白的核酸的原核宿主细胞，所述核酸与在所述原核细胞中有功能的启动子可操作地连接；(ii)在所述的重组蛋白能够被表达的条件下培养宿主细胞；和(iii)回收该重组蛋白，其中所述蛋白以多聚体形式被回收而不需要支架重折叠的步骤。

Description

利用C4BP支架制备多聚体融合蛋白
技术领域
所述发明涉及在原核细胞内制备高产量融合蛋白和多肽的方法，其中所述蛋白或肽包含C4bp结构域。
背景技术
重组DNA技术的出现使大规模生产治疗用生物活性蛋白成为可能。目前临床上或研究中有许多重组DNA制备的产物，包括大分子蛋白如促红细胞生成素，小分子肽和抗体片段。
本领域内众所周知，蛋白的一个难题是其半衰期。许多蛋白和肽在体内的半衰期较短，减少了它们的用途。目前已发现，蛋白和肽分子的多聚化是延长这些分子的半衰期，从而允许它们在更长的时间内发挥作用的方法。发现许多有功能的生物分子处于寡聚物结构时，在体内会更有效。这是由于以下因素造成的，如通过亲合力(avidity)而不是亲和力(affinity)进行结合，和/或使分子交联的能力(例如，胰岛素受体的相同受体亚单位通过二聚化作用被激活，或非相同的分子以便在细胞如淋巴细胞表面形成信号复合物)。这些增加半衰期和亲合力的性质使得蛋白或肽分子的使用量更小，从而减少费用和剂量依赖性的副作用。
人们曾提出了制备重组蛋白多聚体的不同方法。例如，已尝试了蛋白与聚合物如聚乙二醇的化学连接(Katre等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，1487)。然而这项技术不但烦琐而且需要大量纯化的物质。在抗体分子中，尝试改变在铰链区和该分子的其它区域中形成二硫化物的可能性，用来调节抗体互相结合的程度。然而结果是不一致且不可预知的。同样，使用蛋白A融合物产生多聚抗体可以成功地连接抗体片段，但是在其它领域的应用有限。
在WO91/11461中描述了使用补体4结合蛋白(C4bp)的新多聚化系统。人补体4结合蛋白(C4bp)是高分子量的(570kDa)血浆糖蛋白，其具有由7个相同的α链和单独的β链组成的蜘蛛样(spide like)结构。C4bp的α链有负责将分子装配成多聚体的C-末端核心区。根据标准模型，C4bp单体+498位的半胱氨酸和另一单体+510位的半胱氨酸形成二硫键。在人血浆中还发现了只有7个α链组成的较小形式(minor form)。这种血浆糖蛋白的天然功能是抑制补体活化的经典途径。
WO 91/11461提出C4bp蛋白的多聚化能力可以用来制备包含全部或部分C4bp和目的(interested)生物蛋白的融合蛋白。这个融合蛋白将形成多聚体，该多聚体为目的蛋白提供，其中所述蛋白有更长的血浆半衰期并且与其靶的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)更强。在WO 91/11461中，C4bp融合蛋白成为治疗性产品的新的递送和载体系统的焦点。
C4bp的大多数α链由8个长度约为60个氨基酸的结构域串联排列组成，该结构称为补体控制蛋白(complement control protein)(CCP)重复。WO91/11461中描述的融合蛋白中，优选包含一个或多个这样的结构域。但是现已证实，所有的CCP都能缺失(只留下C-末端的57个氨基酸)，而不会抑制多聚化(Libyh M.T.等，(1997)Blood 90，3978)。C4bp的这个C-末端区域称为C4bp核心。
Libyh等(1997)描述了基于C4bpα链C-末端部分的蛋白多聚化系统。C4bp的C-末端部分缺乏生物功能，但是它负责使产生C4bp CHO细胞胞浆中的C4bp发生多聚化。Libyh等能够用C4bp片段诱导相关抗体片段的自发多聚化，从而产生ScFv片段的同源多聚体。所使用的C4bp的C-末端部分被置于ScFv序列的C-末端，可选由MYC标记隔开(space)。
Oudin等(2000，Journal of Immunology，164，1505)进一步应用C4bp核心多聚化系统形成异源多聚体多(multimeric multi)CR1/ScFv抗-Rh(D)分子。该嵌合体蛋白通过共转染CHO细胞系以及两种不同的载体(一种编码CR1，另一种编码ScFv抗Rh-D)而在所述细胞内表达，并且发现所述嵌合蛋白在分泌它们的转染的细胞的胞浆中能自发地进行多聚化。
Christiansen等(2000，Journal of Virology，74，4672)进一步证明在293EBNA细胞中可产生同源多聚体融合蛋白，所述融合蛋白包含与C4bp核心相连的CD46外部结构域。
在Shinya等(1999，Biomed & Pharmacother，53，471)也已经证实了自我装配型多聚体可溶性CD4-C4bp融合蛋白，该融合蛋白可在293细胞表达。
由于这些重组融合蛋白在小鼠体内的血浆半衰期延长，Shinya等进一步建议改进包含C4bp核心结构域的融合蛋白的药代动力学性质。由于所使用的核心结构域是人源的，将它给药人类所产生的不利免疫学后果可最小化。
目前，基于C4bp核心蛋白的融合蛋白已经可在真核细胞中表达。真核细胞的融合蛋白产量很少达到2mg/每毫升培养基上清液，(Oudin等ibid)，并且只有在基因扩增进行数个循环后才能达到这样的水平。这个水平对于许多治疗用融合蛋白的经济化大量生产来说太低了。
一种获得更高产量的方法是使用原核表达系统。WO 91/00567建议原核宿主细胞可以用于制备基于C4bp的蛋白，尽管这种生产还未得到实验证实。然而大量的考虑都提示使用原核系统是不利的。尤其是许多真核蛋白在诸如大肠埃希氏菌属等细胞中表达时，将失去它们的一些或全部有活性的折叠结构。其它真核蛋白在原核细胞中表达时会变性或完全失活。
C4bp是哺乳动物的分泌蛋白，且本领域已知在原核细胞中制备折叠形式的所述蛋白尤其困难。有二硫桥的蛋白和需要寡聚化的蛋白更麻烦。在细菌胞浆的还原性环境中二硫键无法正常产生，且它们一旦形成则会稳定所述蛋白的错误折叠或聚集形式。
通常在原核细胞内表达的重组蛋白会在宿主原核细胞内的内含体中聚集。所述内含体是与细胞的其它成分分离的离散颗粒或小球，所述细胞包含通常是聚集或失活形式的表达的蛋白。表达的蛋白在包含体中的存在使得使蛋白恢复活性可溶的形式非常困难，因为重折叠技术是无效而且费用高昂的。由内含体中纯化的蛋白必须消耗大量劳动来操作，变性并重折叠以获得相对低产量的活性、有功能的蛋白。
对于在原核细胞中表达C4bp核心融合蛋白，还必须考虑其它问题。首先，每个核心单体都保留两个半胱氨酸残基，根据本领域所接受的C4bp多聚体模型，这些半胱氨酸是在多聚体装配过程中形成分子间二硫键所必需的。期望原核细胞胞质的还原环境(例如细菌的胞质)能通过减少这些二硫键来阻止C4bp核心多聚体的形成。
第二，多聚体通过真核细胞的分泌装置(secretion apparatus)时被组装，这些分泌装置已知能辅助蛋白以原核细胞不能提供的方式(例如，存在蛋白的二硫化物异构酶和独特的陪伴分子)进行折叠，第三，即使在使真核细胞中所得产量相对较低(mg/dl)的条件下，这个分泌路径仍不能产生同源蛋白。
发明概述
本发明人惊奇地发现，不仅C4bp核心融合蛋白能在原核细胞中有效合成，而且C4bp核心本身能够进行正确的折叠，并在原核细胞胞浆的还原性境中组装成同源多聚体。吃惊地发现在原核细胞中产生的C4bp核心多聚体含有二硫键。
进而，发明者还发现，与产自原核细胞表达系统的C4bp核心相融合的蛋白保留它们的功能活性。因此所述发明提供了获得重组融合蛋白的方法，该融合蛋白包含C4bpα链的C-末端核心蛋白支架，且所述的重组融合蛋白能够在原核宿主细胞的胞质中形成可溶的多聚体，该方法包括以下步骤：
(i)提供原核宿主细胞，其带有编码所述重组蛋白的核酸，该核酸与在所述原核细胞中有功能的启动子可操控地连接；
(ii)在所述重组蛋白能被表达的条件下培养所述宿主细胞；和
(iii)回收重组蛋白，其中所述蛋白以多聚体形式被回收而无需支架重折叠的步骤。
我们已发现本发明细胞培养物中蛋白的产量可相对较高，例如大于2mg/l培养物，如大于5mg/l培养物，优选大于10mg/l培养物，如大于20mg/l培养物，甚至更优选大于100mg/l培养物。
发明的C4bp核心融合蛋白包含更优选C4bp核心蛋白序列，其N或C-末端与有生物活性的目的序列相融合。
附图说明
图1示不同物种的C4bp序列的比对。
图2示融合蛋白db-C4bp(db是实施例1所描述的肽)通过离子交换柱的纯化。
图3示db-C4bp在第二个离子交换柱的进一步纯化。
图4示db-C4bp在凝胶层析柱的纯化。
图5示加热步骤后db-C4bp在离子交换柱上的纯化。
图6示db-C4bp在凝胶层析柱中的进一步纯化。
图7示DsbA-C4bp在胰岛素实验中的作用。
图8示pAVD77启动子的序列和C4bp编码区域。
图9示在非还原条件下的C4bp融合蛋白分析。
发明内容
C4bpα链核心蛋白
本文的“C4bp核心蛋白”，或“核心蛋白”，或“C4bp支架”是可以互相取代的。该蛋白可以是哺乳动物的C4bp核心蛋白，或其能形成多聚体的片段，或其能形成多聚体的合成变体。
许多哺乳动物的C4bp蛋白的序列在本领域是可得的。所述蛋白包括人类C4bp核心蛋白(SEQ ID NO：1)。本领域可以提供人类C4bp核心蛋白的大量同源物。共有两种同源物：直向同源物(orthologues)和共生同源物(paralogues)。直向同源物被定义为不同生物体中的同源基因，即基因与产生它们的物种形成事件(speciation event)有共同祖先。共生同源物被定义为源自基因、染色体或基因组复制品的相同生物体内的同源基因，即从最近的一次物种形成事件起出现的基因的共同祖先。
例如一项关于Genbank的搜索表明以下物种具有哺乳动物C4bp核心同源蛋白，包括所述物种兔，大鼠，小鼠，和牛来源(分别为SEQ ID NO：2-5)。平行同源物已在猪(ApoR)，豚鼠(AM67)，和小鼠(ZP3)中鉴定，分别显示为SEQ ID NO：6-8。
SEQ ID No：1-8的比对如图1所示。可以看出尽管在C-末端有很大程度的变异，但所有的8个序列还是有高度的相似性。还可使用通常可得的搜索程序如BLAST，通过搜索DNA或蛋白序列的数据库，鉴定C4bp核心蛋白。
当所需哺乳动物来源的C4bp蛋白在数据库中不能获得时，则该蛋白可以通过本领域已建立的常规克隆方法获得。本质上，这种技术包括使用编码可得的C4bp核心蛋白之一的核酸作为探针，来复原并确定来自其它目的物种的C4bp核心蛋白序列。大量的技术都可用于该目的，比如PCR扩增和采用适当的mRNA源克隆所述基因(例如：由胚胎，或活跃分化的细胞或肿瘤细胞)，或者如下方法，包括从哺乳动物获得cDNA库，例如来源于上述来源之一的cDNA文库，在高严谨度条件下(如：0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，在约50-约60℃)用已知的C4bp核酸检测所述的文库，以及回收编码全部或部分该哺乳动物C4bp蛋白的cDNA。如果获得部分cDNA，那么可通过引物延长技术测定编码序列的全长。
能形成多聚体的C4bp核心蛋白的片段包括至少47个氨基酸，优选至少50个氨基酸。所述片段形成多聚体的能力的检测可以通过如下方法进行：在本发明原核宿主细胞中表达该片段，在导致共57个氨基酸的C4bp核心发生多聚化的条件下回收所述C4bp片段，以及确定该片段是否也形成多聚体。可取地，C4bp核心片段包含SEQ ID NO：1的至少6-52位残基，或其同源物的相应残基。
人SEQ ID NO：1的C4bp核心蛋白对应全长C4bp蛋白序列的氨基酸+493至+549。本领域中已知形成多聚体的这种片段相当于C4bp核心蛋白的氨基酸+498至+549。
也可用C4bp核心的变体和能形成多聚体片段，所述变体保留形成多聚体的能力(可如上文对所述片段的描述那样来确定)。所述变体与野生型哺乳动物C4bp核心或其多聚体形成片段优选具有至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，如至少95％或最优选至少98％的序列同一性。一方面，C4bp核心包含出现在SEQ ID No：1-3和5-8的位置6和18的两个半胱氨酸残基。可取地，该变体能保留这2个残基间的部分(relative spacing)。
上述具体程度的同一性是与SEQ ID No：1-8之一或其复合物形成片段的同一性。
最优选上述具体程度的同一性是与SEQ ID NO：1或其多聚体形成片段的同一性。
序列同一性程度由GAP算法决定，该算法是在本领域广泛应用算法的“Wisconsin包(package)”的一部分，由Accelrys(formerly Genetics ComputerGroup，Madison，WI)提供。GAP使用Needleman和Wunsch算法对2个完整的序列进行比对，以使匹配的数量最大而缺口的数量最小。GAP可用于比对长度相似的密切相关的短序列，因此适合用来确定序列是否符合上述同一性水平。GAP可以使用默认参数。
哺乳动物C4bp核心蛋白的合成变体包括在C或N-末端有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的变体。其中取代是具体所考虑的。取代包括保守取代。保守取代的例子包括下表所列出的取代，其中第二栏同一区的氨基酸和第3栏完全同一行的氨基酸可以互相取代。
  脂肪族   非极性   G   A  P
  I   L  V
  极性-不带电的   C   S  T  M
  N   Q
  极性-带电的   D   E
  K   R
  芳香族   H   F  W  Y
  其它   N   Q  D  E
可以制备并检测其形成多聚体的能力的C4bp核心蛋白的片段和变体的例子，包括SEQ ID No：9至16，如下表1所示：
  A                                       B   C
  9   -----CEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL   100
  10   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIKQLELQRDSARQSTLDKEL   98
  11   -----CEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIKQLELQRDSARQSTLDKEL   98
  12   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEIYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL   98
  13   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEIYKLSLEIKQLELQRDSARQSTLDKEL   96.5
  14   ---EGCEQALTGKRLMQCLPNPEDVKMALEIYKLSLEIKQLELQRDSARQSTL----   94
  15   ETPEGSEQVLTGKRLMQSLPNPEDVKMALEVYKLSLEIKQLELQRDSARQSTLDKEL   94
  16   ---EGSEQALTGKRLMQSLPNPEDVKMALEIYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDK--   92.3
A＝SEQ ID NO：；B＝序列，C＝％同一性，参照同样长度的SEQ ID NO：1的片段计算。
除了N或C-末端平截外，在序列中进行缺失时，所述缺失优选被限定为不多于l、2或3个相邻或不相邻的缺失。
对核心蛋白序列进行插入或N-末端或C-末端延长时，所述延长可取地限定在一定数目以内，以使得核心蛋白的大小超过野生序列的长度不多于20，优选不多于15，最优选不多于10个氨基酸。因此，对于SEQ ID NO：1，通过插入或延长来进行修饰的核心蛋白的长度可取地不超过77个氨基酸。
N或C-末端延长可包括柔性接头，如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，(n＝1-4)，所述接头在本领域中用来使蛋白结构域互相连接(尤其是抗体V结构域)。
当发明中所述的融合蛋白由化学合成方法制备时，N或C-末端延长物可包括非天然存在于蛋白质中的氨基酸类似物，所述氨基酸类似物可用于本领域的肽或多肽的合成。
重组蛋白
本发明的重组蛋白包含如上所述的C4bp核心(或“支架”)，其可单独组成，或在框内(in frarne)连接至少一个有生物价值(biological interest)的序列。这种序列可以包括用于鉴定或纯化蛋白的标记，和/或可用于治疗，具体是人类治疗的蛋白。
重组蛋白可以被描述为有共同的结构式：BiN-Co-Bic，其中Co是上述的核心蛋白；BiN是核心蛋白的氨基末端或至少一种(例如1或2种)目的生物序列，Bic是核心蛋白的C-末端或至少一种(例1或2种)目的生物序列。
优选，BiN和Bic之一不是目的生物序列(如其中一个或另一个是融合物的末端或可选为标记，例如聚组氨酸标记，以辅助回收所述蛋白)。更优选，所述目的生物序列由BiN代表。
可选地，目的蛋白或非蛋白产物可以通过合成手段而与核心的侧链相偶联，例如通过赖氨酸残基侧链的氨基基团或通过加入所述核心序列或位于其末端的半胱氨酸残基；或是与存在的半胱氨酸残基相偶联。
优选目的生物序列不是通常与C4bp核心蛋白连接的C4结合蛋白的全部或部分，即所述目的生物序列是异源序列。
我们发现，符合上述定义的蛋白可以在细菌表达系统中表达并从该细菌表达系统中以多聚物的形式回收而无需支架重折叠。我们已经表达了单体重量约30kDa的蛋白。因此，该发明可以用于表达在该大小范围内的蛋白，更常用于约100kDa的蛋白，更优选，约50kDa。
一类具体的融合蛋白是指其中C4bp核心与具有2至25个氨基酸残基的肽相融合的融合蛋白。许多生物活性肽是已知的或能够通过噬菌体展示选出。然而，它们在体内常常是不稳定的，这不仅是因为它们能通过肾小球滤过。它们融合成核心支架后变成不可滤过的。此外，还赋予了寡聚肽亲合力(使得它们在更低的剂量时与靶更紧密地结合，而且使受体发生交联)。具体的目的生物活性肽包括天然存在的肽或多肽激素，例如促生长激素抑制素、降钙素、和α-MSH(黑素细胞刺激素)，及其变体以及本文所述的其它肽。
因此，一定范围的C4bp核心蛋白的融合蛋白可以通过本发明的方法合成。预期所产生的多聚体融合蛋白显示出增强的生物活性，这是因为多聚体具有更高密度的附着于C4bp核心蛋白的部分，所以预期有更长的半衰期和降低的转化率。
目的生物序列可以是多肽或化合物(如药物或药物前体)，或与发明中所用的C4bp核心蛋白异源的碳水化合物。也就是说，它不是天然存在的相同分子的一部分，它可以产生自相同的生物体。当连接的部分是化合物时，这种连接可以起到保护该复合物以免其例如通过肝细胞色素发生代谢及被排出。并且将它递送到组织。多肽的例子包括那些用于医疗或生物技术的多肽，如：胰岛素，细胞因子(包括白细胞介素和干扰素)，抗体及其片段，生长因子，受体，受体配体，激动剂或拮抗剂，酶，酶拮抗物，抗原、毒素和蛋白酶。
根据本发明制备的融合蛋白和本发明的新的融合蛋白可以制备为药物组合物的形式，所述组合物包括蛋白以及一种或多种可药用的载体或稀释剂。该组合物根据目的用途和给药融合蛋白的途径来制备。
可药用的载体或稀释剂包括适合经口服，经直肠，经鼻，经局部(包括经颊和舌下)，经阴道或胃肠外(包括经皮下、经肌肉内、经静脉内、经皮内、经鞘内和经硬膜外)给药的配制剂中所用载体和稀释剂。所述配制剂可以方便地作为单位剂量形式存在并由任何药学领域已知的方法制备。
对于固体组合物而言，可应用传统的非毒性固体载体包括例如：药用等级的甘露醇，乳糖，纤维素，纤维素衍生物，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等。以上所定义活性化合物可以利用如聚乙二醇，乙酰化的三甘油酯等作为载体配制成栓剂。可药用的液体组合物可以例如通过在载体中对本发明的融合蛋白以及可选的药物佐剂进行溶解、分散等以形成溶液或悬液来制备，所述载体例如水，右旋糖盐水溶液，甘油，乙醇等等。如需要，待给药的组合物也可以是辅助物质例如pH缓冲剂等等。对那些本领域熟练技术人员来说，制备这种制剂形式的实际方法是已知的，或者显而易见的，见Remington’s Pharmaceuticai Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania，19th Edition，1995。
在任何情况下，所给药的组合物或制剂包含一定量的活性化合物，所述量能够有效减轻得治疗对象的症状。可以这样的制备剂量形式或组合物，其包含的活性成分在0.25-95％范围内，其余部分由非毒性载体平衡。
经胃肠外给药的特征通常为注射，如经皮下、肌肉内、或静脉内注射。注射剂可以制备成传统形式，可制成液体溶液或悬液，适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式，或乳剂。适当的赋形剂为，例如水、盐水、右旋糖、甘油，乙醇等。更新的经胃肠外给药方法设计为植入缓释或持续释放系统，以便维持恒定的剂量水平。见例如：美国专利3,710,795。
下面所述的多肽种类是优选的，但所述发明不限于此。
细胞因子
白介素包括任何已知的白介素，包括IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11和IL-12。白介素是免疫系统的调节物。一些白介素参与炎性反应或对疾病的免疫反应。
干扰素包括IFN-α的任何形式，同样也包括IFN-β和INF-γ。这些物质用于免疫反应的调控。
另一种细胞因子是肿瘤坏死因子TNF-α和TNF-β。
其它的细胞因子包括MIP系统成员，包括MIP-1α，MIP-1β和RANTES。RANTES与CCR5 HIV共同受体(co-receptor)结合，且使用RANTES的治疗能有效地减缓HIV感染的进程。
抗体
当将所述抗体通过所述发明的方法而制备为C4bp融合蛋白时，抗体或抗体片段对抗原的亲和力可以通过寡聚化作用被增强。抗体片段可以是片段诸如Fv，Fab，和F(ab’)2等或其任何衍生物，如单链Fv片段。抗体和抗体片段可以是非重组的、重组的或人源化的。抗体可以是任何免疫球蛋白同种型，例如IgG、IgM等等。
在另一方面，抗体片段可以是骆驼源化的(camelised)VH结构域。众所周知，抗体及其同源抗原之间的主要分子间相互作用是通过VH CDR3介导的。然而，仅有VH的抗体(VH-Only antibody)，比如源自骆驼或llama的抗体(天然仅有VH的单链抗体)，与同源抗原只有较低的亲和力。
本发明中的方法使改善有VH区或VH CDR3区的C4bp核心蛋白寡聚物的产量成为可能，所述寡聚物是具有高亲和力的抗体。两个以上的结构域可以包括在通过本发明的方法所制备的C4bp核心寡聚物中，所述寡聚物可包括8个结构域，形成8聚抗体分子。
抗体的靶可以包括肿瘤相关抗原，包括CEA和erbB，其可以分别见于许多结肠和乳腺肿瘤。
在一个实施方案中，目的生物蛋白可包含与酶融合的抗体，这种酶可将药物前体转化成对肿瘤细胞有毒性的药物。这可用于抗体指导的酶-药物前体治疗(ADEPT)法中。可选，带有抗肿瘤抗体的单体和带有所述酶(如羧肽酶，硝基还原等)的单体可以在细胞中共表达或在不同细胞中表达，再混合在一起形成抗肿瘤细胞的异多聚体。
抗体也可以靶向病原生物体的抗原，包括下文提到用作免疫原的抗原。
生长因子
生长因子包括激素，如生长激素(尤其是人生长激素hGH，以及单核细胞集落刺激因子(M-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，EPO，和血小板来源的生长因子(PDGF)。这些生长因子的活生片段也可以应用。哺乳动物，尤其是人生长因子是具体优选的。
受体
受体在与人体内以异常或不需要的水平表达的蛋白相结合，从而可以发挥治疗作用。
例如，TNF-α的过度表达与类风湿性关节炎有关，抗TNF治疗对治疗所述疾病已经成功了。因此目的生物蛋白可以是TNF-α受体。
目的受体是TNF受体家族的另一成员，即BAFF受体(Thompson等Science，2001，293，2108)。人BAFF受体(Genbank登录号AF373846)是184个氨基酸的蛋白，其与TNF相关的配体BAFF相结合。这种配体在小鼠体内的过度表达能导致系统性红斑狼疮(SLE)样症状，因此BAFF受体用于这种疾病的治疗。
一方面，本发明提供了C4bp核心和BAFF受体的融合蛋白，包括其胞外结构域的片段，该片段能够结合BAFF配体。这种片段对应BAFF的第2-51位氨基酸。
细胞表面受体也所是感兴趣的。例如：CD4受体是HIV表面蛋白gp120/160的靶，本领域已广泛提出使用CD4或其可溶性片段作为HIV感染的治疗，使得CD4能阻断循环中的HIV进入CD4+T细胞的能力。
其它细胞表面受体也与病毒感染有关，如：CD46和麻疹病毒(Christiansen等，ibid)感染相关，这种细胞表面受体蛋白也可以用于本发明中。
受体配体，激动剂和拮抗剂
许多细胞表面受体被二聚化作用活化。已知的例子是胰岛素和促红细胞生成素的受体。所述配体的功能是同时和两个受体结合，从而使它们发生二聚化并被活化。所述例子中，发生受体的自身磷酸化。这激活了所述受体，其中该受体其分子间部分有酪氨酸激酶结构域。当受体是单体时，激酶是无活性的，在发生二聚化时所述激酶被激活。这触发分子间事件的级联反应，统称为信号传导。
虽然一些配体，诸如P物质等，是短的多肽；其它(包括胰岛素(51个氨基酸)，以及激酶和活性磷酸酶底物)是复合分子，所述复合分子具有由其表面伸出的结合环。能够模拟受体的天然配体的较小分子可用于研究(例如，为了理解配体受体结合的特异性)。
短肽或环可以掺入本发明的融合蛋白，以形成多价的受体配体或激酶/活性磷酸酶底物，用于在非常低的浓度下活化或抑制受体和/或激酶。
变化可以导入到插入支架的异源多肽中，以便显示(map)受体或激酶/磷酸酶对它们的配体或底物的特异性。变体可以带有同样的环，或可设计一系列标准的不同环，以迅速评估新的激酶/磷酸酶的特异性。
根据已知的技术，诸如PCR等，变体可以通过序列的随机化产生。掺入发明的蛋白支架之前，所述变体可以通过筛选方案如噬菌体展示来选择。
激动剂包括肽(包括肽模拟物)，它与受体结合，从而在即便不存在该受体的天然配体的条件下激发所述受体的作用。激动剂的例子是血小板生成素激动肽。这个线形14-聚肽的二聚体比其单体的活性高4000倍。(DowerW.J.et al.Stem Cells(1998)16，Suppl 2，21 Peptide agonists of thethrombopoietin receptor)。这个序列与C4bp的核心结构域的融合物IEGPTLROWLAARA，和下述其它肽一样，可产生非常有效的血小板生成素激动剂，用于启动血小板产生和/或成熟。
在另一方面，发明提供了包含C4bp核心蛋白和血小板生成素激动剂肽的重组蛋白，以及这种蛋白在用于促进人类受试者体内血小板产生和/或成熟的治疗方法中的作用。该方法应包括给予需要治疗的受试者有效剂量的所述蛋白。
另一激动剂的例子是促生长激素抑制素肽。已知这种循环肽与大量的G蛋白受体偶联的相结合，从而抑制生长激素的释放。类似物以Sandostatin(Novartis)进入市场用于大量医学指征，包括治疗与恶性类癌肿瘤相关的副作用以及治疗由胃肠道感染引起的腹泻。
促生长激素抑制素序列与丝状噬菌体的融合物，如British Journal ofPharmacology(1998)，“Somatostatin displayed on filamentous phage as areceptor-specific agonist”第125卷，5-16页所描述的，可产生能结合并活化促生长激素抑制素受体的杂种噬菌体。促生长激素抑制素与C4bp支架的融合物(该支架噬菌体)近似产生促生长激素抑制素受体的强激动剂，与杂种噬菌体相比所述激动剂作为药物具有更可取的性能。类似地，这样产生的寡聚激动剂能够使促生长激素抑制素受体发生寡聚化作用，这可以加强信号，如Patel等in Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)Volumn 99，第3294-3299页所述。
因此，所述发明提供了制备上述重组融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白包含有促生长激素抑制素。发明更进一步提供了一种融合蛋白，其为C4bpα链的C-末端核心蛋白与促生长激素抑制素相连形成的融合蛋白。发明进一步提供这种融合蛋白或编码这种蛋白的核酸载体(如本文进一步定义和描述)在治疗方法中的用途，所述治疗包括治疗与恶性类癌肿瘤相关的副作用以及治疗由胃肠道感染引起的腹泻。
拮抗剂包括与受体结合并阻止天然配体与所述受体结合的肽。
酶
多种生物反应包括大量蛋白的序贯和/或协同的作用。这种蛋白活性可掺入本发明的单个分子。因此，优选用于组成本发明寡聚物的单体包含编码不同生物活性的氨基酸序列。有利地，所述活性是互补的，以便它们在生物反应中被序贯地需要，或协同地起作用。因此发明提供包含一种或多种酶的多功能大分子结构。
酶的例子包括细菌酶，如大肠杆菌的DsbA。
抗原
根据本发明产生的多聚体的具体作用是产生免疫原(本文中这个本语等同于“抗原”)。这个根据本发明的方法产生的C4bp核心融合蛋白支架技术的主要应用是利用经组装的或多聚化的肽或多肽作为抗原。寡聚化作用改进抗这类抗原的抗体的检测和诱导。这些抗原中的一些有预防疾病的价值；它们可以用于预防接种。该方法允许由核苷酸序列快速进展为产生多价形式的重组抗原。预期的可读框(ORF)可以用于设计编码预期蛋白序列的寡核苷酸序列。将这些寡聚核苷酸克隆进入编码C4bp核心蛋白的载体中允许抗原快速产生，而不需要例如分离cDNA以及在异源系统如大肠杆菌中表达它们。
细菌免疫原，寄生虫免疫原，和病毒免疫原可用作多肽部分以产生多聚或异源-多聚C4bp融合蛋白，所述融合蛋白可用作疫苗。
这些免疫原的细菌来源包括那些导致细菌性肺炎，肺囊性肺炎(pneumocystis pneumonia)，脑膜炎，霍乱、破伤风，肺结核和麻风病的细菌。
寄生虫来源包括疟疾寄生虫，如疟原虫(plasmodium)。
病毒来源包括痘病毒(poxviruses)，如牛痘病毒和orf病毒(orf virus)；疱疹病毒(herpes viruses)，如1和2型单纯疱疹病毒，B-病毒，天花病毒(varicellazoster viruses)，巨细胞病毒和EB病毒；腺病毒(adenoviruses)，如哺乳动物腺病毒(mastadenovirus)；乳多空病毒(papovaviruses)，如乳头瘤病毒如HPV-16，以及多瘤病毒(polyomaviruses)，如BK和JC病毒；细小病毒(parvoviruses)，如腺伴随病毒；呼肠病毒(reoviruses)，如呼肠病毒1、2，和3；环状病毒(orbiviruses)，如科罗拉多壁虱热病毒(Colorado tick fever)；轮状病毒(rotaviruses)，如人轮状病毒；甲病毒属(alphavirases)，如东方脑炎病毒(Eastern encephalitis virus)和委内瑞拉脑炎病毒(Venezuelanencephalitisvirus)；风疹病毒(rubiviruses)，如风疹病毒(rubella)；黄病毒(flaviviruses)，如黄热病病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，蜱传脑炎病毒(Tiek-borne encephalitis)和丙肝病毒；冠状病毒(coronaviruses)如人冠状病毒；副粘病毒(paramyxoviruses)，如副流感病毒1、2、3和4以及腮腺炎病毒；麻疹病毒(morbilliviruses)，如麻疹病毒(measles virus)；肺病毒(pneumovirus)，如呼吸道合胞病毒；水泡病毒(vesiculovirus)，如水泡性口炎病毒；狂犬病毒(lyssaviruses)，如狂犬病毒；正粘病毒(orthomyxoviruses)，如流感病毒A和B；布尼亚病毒(bunyaviruses)，如LaCrosse病毒；白蛉热病毒(phlebovirus)，如立夫特谷热病毒(Rift valley fever virus)；内罗病毒(nairovirus)，如刚果出血热病毒；嗜肝DNA病毒属(hepadnaviridae)，如，乙肝病毒；沙粒病毒(arenaviruses)，如1cm病毒，Lasso病毒和Junin病毒；逆转录病毒(retroviruses)，如HTLV I，HTLV II，HIV-1和HIV-2；肠病毒(Enterouirus)，例如脊髓灰质炎病毒1，2和3，柯萨奇病毒(coxackie virus)，埃可病毒(echovirus)，人肠病毒，甲肝病毒，戊肝病毒和诺沃克病毒(Norwalk-virus)；鼻病毒(rhinoviruses)，如人鼻病毒；和丝状病毒属(filoviridae)，如马尔堡(病)病毒(Marburg(disease)virus)和埃鲍拉(Ebola)病毒。
来自这些细菌、病毒和寄生虫来源的抗原可用于制备用作疫苗的多聚蛋白。所述多聚体可以包含携带不同抗原的单体的混合物。
可以制备用于研究或治疗目的的人蛋白的免疫原。免疫原性肽在暴露于生物体免疫系统时能激发免疫反应，其是用于根据本发明所述的方法制备C4bp核心蛋白融合蛋白的优选多肽。本发明的寡聚化C4bp核心融合蛋白的提高的产量有许多应用，其不仅可用于预防接种中，而且也可用于研究。例如：由人类基因组工程产生的人类基因序列数据使得产生与新的多肽反应的抗血清成为迫切的需要。同样的需要适用于原核细胞(如细菌)和其它真核细胞(包括真菌)的基因产物。由于与C4bp核心多聚体融合的目的免疫原对免疫球蛋白分子的亲合力增强，认为它们具有更高的效力。
本发明在免疫应答的引发方面有许多优势。例如，寡聚体的应用允许向免疫系统同时呈递多个抗原。这允许多价疫苗的制备，所述疫苗可激发针对存在于单一生物体或许多不同生物体内的一种以上表位的免疫应答。因此，根据本发明制成的疫苗可用于同时对一种以上疾病进行预防接种，或用于同时靶向给定病原体上的数个表位。所述表位可存在于单个的单体单位或不同的单体单位上，所述不同的单体单位相互结合以提供异源多聚体。
此外，本发明可通过将佐剂掺入C4bp核心寡聚体上，并和免疫原一起进行应用。适合的佐剂包括，例如，细菌毒素和细胞因子，如白细胞介素。免疫原的效价得以提高，使得抗血清的激发和免疫均更为有效。高度优选的佐剂是补体的C3d组分。
C4bp核心融合蛋白在免疫中是有用的，因为该核心蛋白不仅通常不存在于免疫受体的血清或血浆中，而且它本身不诱发免疫应答。C4bp蛋白已知存在于许多哺乳动物种类中，并且本领域的熟练技术人员可使用标准基因克隆技术发现哺乳动物种类的适当同源物。
该系统允许在大肠杆菌中制备可溶蛋白的事实，使得可利用该系统将由于缺少C-末端和/或N-末端的限制(constraint)因而在其自己单独表达时不进行折叠的蛋白制备为例如折叠的可溶蛋白，结构域或片段。改造具体的切割位点能产生目的游离结构域。类似地，在重折叠过程中限制目的肽的N-末端和/或C-末端是有益的。此外，由于寡聚化结构对于变性和分解(disassembly)有很强的抵抗力，在插入蛋白的变性过程中所述结构将保持稳定。因此，在重折叠过程中，对于等量的目的蛋白，游离蛋白的实际浓度可通过与寡聚化数目等同的因素而降低。寡聚化反应对于纯化也是有益的，因为蛋白技术中许多方法对于蛋白，且特别是低分子量的肽而言不是最佳的。
实验方法
根据本发明方法制备的C4bp核心融合蛋白可用于在体内或体外检测或中和抗体。例如，在体外，多价或单价抗原携带型C4bp核心融合蛋白可用于从噬菌体展示实验选择抗体分子。此外，在体内，按照本发明方法制备的抗原携带型C4bp核心融合蛋白可用于中和自身免疫疾病的自身抗体，或用于检测可指示病理状态的抗体，如用于HIV检测或其它诊断用途。
噬菌体展示
噬菌体展示技术被证实在生物学研究中非常地有用。它使配体能够从庞大的分子库中被挑选出来。本发明的蛋白也利用这种技术的作用(power)，且比普通应用展现出更有力的优势。C4bp分子可显示为fd噬菌体上的单体，如同单链Fv分子一样。融合物文库依据标准方法构建，在所得文库中筛选目的配体。应注意这是基于亲和力(affinity)的选择。经过定性后，根据亲和力选择的配体可被寡聚化从而可利用抗体对抗原的亲合力(avidity)。当配体的靶是寡聚物形式时，将形成非常紧密的结合。此外，单体形式的配体，可以和它们的结合配偶体交联或寡聚化。这种效应的一个应用是触发受体活化。
蛋白芯片
当前，DNA微阵列(无论是寡核苷酸，PCR产物或克隆的DNA)，是促进基因表达的高度平行分析快速发展的主要工具。很明显在许多情况下，直接监测基因表达是更优选的，也就是说，测定蛋白表达水平而非mRNA水平。后者仅能间接测定基因活性，其依赖标记cDNA的杂交，且非常易引起误解，因为通常具体mRNA的丰度和所述mRNA翻译为蛋白的频度之间存在较低的相关性。此外，mRNA分析不可能测定编码蛋白(即使被翻译后)是否具有活性。这依赖于翻译后修饰。
因此包含融合蛋白的蛋白序列可被产生并用于测定样品中那些蛋白的表达水平，其中所述融合蛋白为核心支架融合蛋白与目的蛋白的一定范围的配体的融合蛋白。
例如，可提供表达支架-配体融合蛋白的细菌细胞阵列，使得加入样品后，融合蛋白可在原位表达和回收。可选，融合体可分别生成，然后排列在适合的固体支持物上，用于检测所述样品中的蛋白。检测可通过提供预定量的标记的目的蛋白，来与所述样品中的蛋白竞争，然后测定有多少标记蛋白与配体结合来进行。可选，可标记所述配体并检测与目的蛋白结合的标记后配体的量。
核酸
包含C4bp核心的蛋白可通过利用编码该重组蛋白的核酸构建体，在原核宿主细胞中表达该蛋白来制备。
所述构建体通常是可复制的载体，其中所需宿主细胞中编码蛋白的序列可操作地连接于适合蛋白表达的启动子。所述启动子可以是诱导型启动子。适合的启动子包括T7启动子，tac启动子，trp启动子，λ启动子PL或PR以及本领域熟练技术人员所熟知的其它启动子。
所述载体可包含复制起点并可选地包含启动子的调节物。所述载体可包含一或多个可选择的标记基因，例如抗生素抗性基因如氨苄青霉素，四环素或优选卡那霉素抗性基因。本领域中有多种已知的细菌表达载体，本发明可依据本领域内熟练技术人员的个人偏好而利用任何载体。
多种原核宿主细胞可用于本发明的方法中。这些宿主包括埃希氏菌属(Escherichia)，假单胞菌属(Pseudomonus)，芽孢杆菌属(Bacillus)，乳杆菌属(Lactobacillus)，嗜热菌属(Thermophilus)，沙门氏菌属(Salmonella)，肠杆菌属(Enterobacteriacae)或链霉菌属(Streptomyces)的菌株。例如，埃希氏菌属的大肠杆菌(E.coli)用于本发明方法时，该细菌的优选菌株包括BL21(DE3)和它们的衍生物包括C41(DE3)，C43(DE3)或CO214(DE3)，或其它对重组蛋白表达毒性有抵抗性的菌株，其在WO98/02559中描述并且可得。
甚至更优选，当启动子不是T7启动子时，可利用缺少原噬菌体DE3的这些菌株的衍生物。
DNA疫苗和治疗法
另一方面，本发明提供真核表达载体在人体或动物体的治疗中的用途，所述载体包含编码重组融合蛋白的核酸序列，所述重组融合蛋白包含C4bpα链C-末端核心蛋白支架。
这种治疗可通过向患有遗传病或其它疾病的细胞或组织内引入具体的核酸序列，或通过引入编码用于激发免疫应答的抗原的核酸序列来实现其治疗作用。为证明基因产物将对疾病细胞或组织产生直接或间接影响，也可以将基因序列引入细胞或组织，其不同于患所述疾病的细胞或组织。核酸的递送可利用质粒载体(“裸露的”或配制剂形式)或重组表达载体来实现。
可用于基因治疗的多种病毒载体包括腺病毒，疱疹病毒，痘病毒或RNA病毒如逆转录病毒。所述逆转录病毒载体可以是鼠或鸟逆转录病毒的衍生物。可插入单个外源基因的逆转录病毒载体的实例包括但不仅限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)，哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)，和劳斯肉瘤病毒(RSV)。当对象是人类时，可利用载体如长臂猿白血病病毒(GaLV)。
所述载体将包括转录调节序列，特别是足以指导RNA合成开始启动子区域。适合的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等1982 J.Molec.Appl.Genet.1，273)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，1982Cell 31，355)；SV40早期启动子(Benoist等1981 Nature 290，304)；劳斯肉瘤病毒启动子(Gorman等1982 Proc.NatlAcad.Sci USA 79，6777)；和巨细胞病毒启动子(Foecking等1980 Gene 45，101)。
用于需要基因治疗的具体细胞类型的启动子在许多情况下是需要的。在具体细胞类型用作平台以产生目标为另一位点(直接或间接作用)的治疗性蛋白时，所选的启动子应在“工厂”位点良好工作。肌肉是上述观点的很好实例，是因为其处于有丝分裂期后，它在没有针对蛋白表达型肌纤维的免疫应答的情况下，可连续数年产生治疗性蛋白。因此，利用强肌肉启动子尤其适于本发明。除了治疗肌肉疾病本身，肌肉的应用通常只适用于分泌型蛋白，所述分泌型蛋白可循环并在其它部位发挥功能(例如，激素，生长因子，凝血因子)。
将本发明这一方面的载体作为质粒载体或作为部分病毒载体给药受试者，可受许多不同途径的影响。质粒DNA可用于直接或间接给药，其可以是“裸露的”或与阳离子和中性脂质(脂质体)配制在一起或微囊化的。所述DNA序列也可以包含于病毒(如，腺病毒，逆转录病毒，疱疹病毒，痘病毒)载体中，所述载体用于直接或间接递送。递送途径包括但不仅限于经肌肉内，皮内(Sato，Y.等1996 Science 273，352)，静脉内，动脉内，鞘内，肝内，吸入，阴道内滴注(Bagarazzi等1997 J Med.Primatol.26，27)，直肠内，肿瘤内或腹膜内。
因此本发明包括本文描述的载体作为药物组合物，所述药物组合物允许用DNA载体转染一些细胞，从而使治疗性多肽得以表达并产生治疗效果(改善感染或疾病引起的症状)。本发明的药物化合物可通过使本发明的构建体成为适合利用溶剂，载体，递送系统，赋形剂和添加剂或辅助剂并给药受试者的形式来制备。经常使用的溶剂包括无菌水和盐水(缓冲的或非缓冲的)。载体包括金微粒，其通过基因枪(biolistically)递送(如在气压(gas pressure)下)。其它常用的载体或递送系统包括阳离子脂质体，螺旋物(cochleate)和微囊，所述载体或递送系统可以为液体溶液，包含在递送胶囊中或者或掺入食物中。
给药基因治疗载体的另一可选配制剂包括脂质体。脂质体的被囊化(encapsulation)为给药多核苷酸和表达载体提供了可选配方。脂质体是由含水区室周围的一个或多个脂质双分子层组成的微观小泡。通常参见，Bakker-Woudenberg等1993 Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12，Suppl.1，S61，和Kim，1993 Drugs 46，618。脂质体的成分和细胞膜相似，所以脂质体可被安全地给药，并且是可生物降解的。依赖这种制备方法，脂质体可以是单层的或多层的，并且脂质体的大小可不同，直径范围从0.02μM到大于10μM。参见，例如，Machy等1987 LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY ANDPHARMACOLOGY(John Libbey)，和Ostro等1989 American J.Hosp.Phann.46，1576。
利用标准技术可将表达载体包入脂质体中。许多不同的脂质体组合物和合成方法为本领域熟练技术人员所熟知。参见，例如，美国专利4,844,904、美国专利5,000,959，美国专利4,863,740，美国专利5,589,466，美国专利5,580,859，和美国专利4,975,282，以上全部文献包含在本文中作为参考。
通常，脂质体-被囊化的载体的给药剂量根据以下因素变化，如病人的年龄，体重，身高，性别，总体医学情况和既往医学记录。具体配制剂的剂量范围可通过利用适合的动物模型确定。
在一个实施方案中，所述载体编码融合蛋白，此融合蛋白包含核心和另外的一或多种抗原，并可选且优选地包含具有免疫刺激特性的蛋白。C3d已知具有强大的免疫刺激特性并可用于所述目的，也可以用白细胞介素，尤其是白介素-2(IL-2)和白介素-12(IL-12)。
细胞培养
本发明编码融合蛋白的质粒可利用常规转化技术引入宿主细胞，并且在促进该融合蛋白产生的情况下培养所述细胞。在利用诱导型启动子时，细胞最初在缺乏诱导物的条件下培养，所述诱导物可在细胞生长到较高密度时加入以使蛋白回收最大化。
细胞培养条件是本领域内所熟知的，并且可根据已知方法使用。
从培养物中回收蛋白
当细胞生长到允许产生蛋白时，可从该细胞中回收所述蛋白。我们惊奇地发现所述蛋白保持可溶状态，因此细胞通常经旋转沉下(spun down)并通过超声处理而溶解，此过程中使蛋白级分保持可溶状态并允许所述级分保留于上清液中，之后进一步高速(如15rpm，000进行1小时)离心。
上清液蛋白级分中的融合蛋白可通过标准蛋白层析技术的任意适合组合而纯化。我们采用离子交换层析，之后用凝胶过滤层析。其它层析技术，如亲和层析，也可被应用。
在一个实施方案中，我们发现在溶解产物离心后或在任何其它纯化步骤后加热上清液样品，将有助于蛋白的回收。所述样品可被加热到70-80℃、持续大约10到30分钟。
依据蛋白的目的用途，可对所述蛋白进行进一步的纯化步骤，例如透析，或浓缩步骤，例如冷冻干燥。
以下实例将说明本发明。
实施例1.db-C4bp的生产
载体构建体
构建表达载体，其编码下游盒肽序列MASMNHKGS(Sprengert M.L，Fuchs E.和Porter A.G 1996“The downstream box：an efficient andindependent translation initiation signal in Escherichia coli”EMBO J.Volume15，665-674)，所述序列的N-末端与人类C4bpα链的57个氨基酸的“核心”区域相融合。
简言之，C4bp核心结构域完全由人类基因组中的单个外显子编码，因此允许它从人类基因组DNA中直接扩增。利用的寡核苷酸引物是：
AVD 102：5’CCCGCGGATCCGACCCCCGAAGGCTGTGA3’；和
AVD 103：5’CCCCGGAATTCTTATTATAGTTCTTTATCCAAAGTGG3’。
其包含加入的限制酶切位点，该位点用于克隆扩增的DNA片段。用BamHI和EcoRI酶消化PCR产物而获得的183个碱基对的片段，所述片段在质粒载体中在翻译增强子或“下游盒”和T7启动子的下游克隆。所述质粒来源于Invitrogen提供的质粒pRsetA，但是复制的f1起点被来自质粒pSC101的对等(par)基因座所取代。因此它包含如下功能元件：选择标记(氨苄青霉素抗性)、复制起点(来自pUC家族)、T7启动子、T7转录终止子以及对等基因座。产生的构建体被命名为质粒pAVD77。图8显示融合于C4bp编码序列的翻译增强子和T7启动子序列(小写字母)。
db-C4bp融合蛋白的预测大小是7491.5Da。
转化和表达
所述载体被转化入大肠杆菌C41(DE3)菌株中，所述菌株为BL21(DE3)的衍生物(Bruno Miroux和John E.Walker 1996“Over-production of Proteins inEscherichia coli：Mutant Hosts that Allow Synthesis of some Membrane Proteinsand Globular Proteins at High Levels”Journal of Molecular Biology Volume 260，289-298)。
将细胞接种于1L LB-氨苄青霉素培养基，所述细胞在37℃、震摇条件下保温3小时(直到OD600nm达到0.6)，然后用终浓度为0.7mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导3小时。所述细胞在4600rpm离心30分钟收集。
这些沉淀(P)被重悬浮于30ml Tris 50mM pH7中，并且利用Emulsiflex仪器通过超声处理两次破坏所述细胞(在每次处理之间，以15000rpm离心1小时，保存每次离心所得的上清液(分别命名为SN1和SN2)，并且将沉淀P1重悬于相同的缓冲液中)。
混合两次的上清液(60ml)并分为成每份30ml的两份溶液。每份db-C4bp融合蛋白的30ml等分试样用两种类似方法之一进行纯化：除了一种方法中加热的步骤在另一种方法中用MonoQ离子交换步骤所取代以外，这两种方法完全相同。
不包括加热步骤的纯化
利用离子交换层析(DEAE Fast Flow 70，利用13cm高，直径2.6cm的柱)从500ml培养物中纯化天然db-C4bp，所述过程使用TrisHCl缓冲液(50mM pH7)和盐梯度(0M-1M NaCl)。所述融合蛋白在300-400mM NaCl之间洗脱。收集均为7.5ml的各个级分-见图2。
将级分B8至B11混合，并用TrisHCl 20mM pH7透析。然后这种溶液加样子离子交换柱上(MonoQ HR 16/10)，使用的是Tris缓冲液(50mM pH7)和盐梯度(0M-1M NaCl)。收集2.5ml的级分。所述融合蛋白在500-550mMNaCl之间洗脱(图3)。
将级分A10至B1混合，随后将终溶液浓缩为10ml，然后在凝胶过滤柱(S75 26/60)上对所述溶液进行层析。收集5ml的级分。使用139ml的缓冲液(TrisHCl 100mM pH7，150mM NaCl)从该柱上洗脱所述融合蛋白，见图4。以分子量标准物校准该柱，提示这种蛋白的分子量与白蛋白相似(67kDa)，其中白蛋白也在139ml的Tris 50mM+NaCl150mM中洗脱，然而所述单体的预期分子量是7.491kDa。这表明所述融合蛋白从大肠杆菌胞液中纯化出来时即是寡聚物结构，而无需任何重折叠步骤。
将级分A10至B1混合(312μg/ml)，并且用磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.4)对等分试样进行透析。
纯化后每升培养物的蛋白产量是12.4毫克。
检测CD谱显示存在明显的二级结构，所述结构与正确折叠的蛋白复合物一致。
实施例2.有加热步骤的db-C4bp纯化
将含另一份30ml db-C4bp等分试样的溶液在76℃加热15分钟，然后以20,500rpm离心1小时。包含db-C4bp的上清液通过离子交换层析(DEAEFast Flow 70ml)纯化，使用的是Tris缓冲液(50mM pH7)和盐梯度(0M-1MNaCl)。收集7.5ml的级分。所述融合蛋白在300-400mM NaCl之间洗脱(图5)。
将片段B8至B11混合，随后将终溶液浓缩为10ml，然后在凝胶过滤柱(S75 26/60)上对所述溶液进行层析。收集5ml的级分。使用140ml的缓冲液(TrisHCl 100mM pH7，150mM NaCl)从该柱上洗脱所述融合蛋白(图6)。以分子量标准物校准该柱，提示这种蛋白的分子量与未经加热而纯化的蛋白的相似(67kDa)，其中所述单体的预期分子量是7.491kDa。因此该融合蛋白从大肠杆菌胞液中纯化出来时也是寡聚物结构，而无需任何重折叠步骤。而且，即使在包含50mM TrisHCl pH7(也就是不含盐)的缓冲液中加热至760℃持续15分钟时，所述融合蛋白仍保持寡聚物结构。
将级分A11至B1混合(312μg/ml)，并且用磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.4)对等分试样进行透析。
利用圆二色性(circular dichroism)分析显示，经过加热的样品的光谱与未经加热的样品的光谱是相同的。这证实了尽管进行了加热，蛋白的二级结构要素(element)依然保持。
有加热步骤时的产量是每升3.5毫克。
加入加热步骤可显著简化蛋白的纯化。本发明的实施例中，加热取代了离子交换(MonoQ)步骤，且仍然得到至少相等纯度的蛋白。
实施例3.使用变性剂处理蛋白
为进一步确定蛋白确实是寡聚的，尝试使纯化的蛋白在室温在6M氯化胍和20mM DTT(二硫苏糖醇)中变性，然后在变性条件下重复凝胶过滤。
简言之，如上所述使实施例1中的500ml细胞培养物生长并对其进行诱导。所述融合蛋白通过离子交换层析纯化，使用的是TrisHCl缓冲液(50mM pH7.4)和盐梯度(0M-1M NaCl)。所述融合蛋白在450-650mM NaCl之间洗脱，然后浓缩为10ml。经过浓缩步骤以后，db-C4bp蛋白的浓度为740微克每毫升。
然后所述蛋白以每毫升740微克的浓度、在4℃由6M氯化胍和20mMDTT处理，然后通过凝胶过滤柱(S-75)中进行层析。所述融合蛋白由11.4ml的缓冲液中从该柱洗脱。以分子量标准物校准层析柱显示，该蛋白的分子量约为60kDa，然而单体预期的分子量是7.5kDa。因此该融合蛋白当从大肠杆菌胞液中纯化出来时是寡聚物结构，而无需任何重折叠步骤，且即使处理为变性条件时也是这样。
由CD分析证实，用6M胍HCl重复变性步骤2或6小时、并加热至75℃-80℃确实产生了变性的蛋白。
实施例4.在大肠杆菌中克隆并重组表达融合于组氨酸标记序列的人 C4bp核心
为证实翻译增强子不是大肠杆菌内核心区的高水平表达所必需的，并促进蛋白的纯化，编码下游盒的DNA序列由编码6x组胺酸标记的序列所取代，其中用以下序列取代pAVD内的NdeI/BamHI限制性酶切片段：CATATGCGGG GTTCTCATCA TCATCATCAT CATGGTCTGG TTCCGCGTGG ATCC
得到的质粒pAVD 93，超量生产8.46kDa的重组蛋白，所述蛋白具有以下氨基酸序列：
MRGSHHHHHH GLVPRGSETP EGCEQVLTGK RLMQCLPNPE
DVKMALEVYK LSLEIEQLEL QRDSARQSTL DKEL
质粒pAVD 93被转化入细菌菌株C41(DE3)，并如上所述使用IPTG诱导融合蛋白的表达。SDS-PAGE分析显示的8.5kDa蛋白在诱导3小时后出现于被诱导的培养物中，但不存在于未经诱导的培养物中。
实施例5.在大肠杆菌中克隆并重组表达融合于DsbA蛋白的人C4bp 核心
C4bp核心区与下游盒增强子编码的短肽序列或组胺酸标记的融合，并不必定意味着核心区与较大蛋白的融合是可行的。为证实上述观点，C4bp核心被融合于DsbA蛋白的C-末端，DsbA蛋白是通常在大肠杆菌周质间隙中发现的一种酶。DsbA由177个氨基酸组成，因此比核心区域本身(57个氨基酸)大。
构建编码DsbA-C4bp融合蛋白的质粒pAVD 78
pAVD77中编码下游盒增强子的NdeI-BamHI DNA片段被编码DsbA的NdeI-BamHI片段所取代。用于获得编码DsbA片段的寡核苷酸引物是：
AVD52：5’GGGGCCCCCATATGGCGCAGTATGAAGATGGTAAACAG3’；和AVD115：
5’GGGGAATTCTTAGGATCCAGAACCTTTTTTCTCGGACAGATATITCAC3’。
这些引物用于扩增来自大肠杆菌基因组DNA的DsbA编码序列(缺乏终止密码子)。PCR产物用NdeI和BamHI限制酶消化，并克隆入pAVD 77以产生pAVD 78。
质粒pAVD 77被转化入细菌菌株C41(DE3)，并如上所述使用IPTG诱导融合蛋白的表达。SDS-PAGE分析所示的28kDa蛋白存在于被诱导3小时后的培养物中，但不存在于未经诱导的培养物中。令人惊奇地是，这种蛋白存在于所述细胞提取物的可溶级分中。
DsbA-C4bp融合蛋白的纯化
融合蛋白通过两步离子交换层析(第一次用DEAE，第二次用MonoQ)纯化，每种情况都使用Tris HCl缓冲液(50mM pH7.4)和盐梯度(0M-1MNaCl)。所述融合蛋白在第一次(DEAE)离子交换层析后在大约100mM NaCl时洗脱，然后由分辨率更高的(MonoQ)离子交换层析纯化。从MonoQ在350mM NaCl洗脱的融合蛋白用S200凝胶过滤柱(10/30)浓缩，然后进行层析。融合蛋白在12.54ml的缓冲液中从层析柱上洗脱。
以分子量标准物校准层析柱显示，该蛋白的分子量约为200kDa。单体的预期分子量是28.08kDa。因此该融合蛋白当从大肠杆菌胞液中纯化出来时也是寡聚物结构，而无需任何重折叠步骤。
为证实融合蛋白确实是寡聚体，而不是在凝胶过滤时表现异常，纯化后的蛋白在6M氯化胍和20mM DTT(2小时30分钟，在室温)中变性，并在变性条件下(也就是在6M氯化胍和20mM DTT存在的条件下)重复所述凝胶过滤。
在这些环境下，在12.5ml的体积中洗脱的蛋白，分子量大约为220kDa。因此所述融合蛋白在这些条件下没有变性：该蛋白仍是寡聚物。
用盐酸胍在4℃处理16小时之后获得这种蛋白的完全变性，这与上述实施例3相反，所述实施例3中需要加热至75℃-80℃来进行完全变性。
DsbA-C4bp融合蛋白的活性
为检测DsbA-C4bp的活性，进行胰岛素实验。在DTT存在的条件下，活性DsbA催化胰岛素二硫键的还原，使得两条链分离，并由此导致游离胰岛素B链的沉淀。浊度测定法因此被用来测定胰岛素二硫键的还原作用。(Holmgren A(1979)Thioredoxin catalyses the reduction of insulin disulfides bydithiothereitol and dihydrolipoamide。J.Biol.Chem.254，9627)。
终反应混合物的终体积为1.2ml，其中含0.14mM新鲜制备的胰岛素，0.1M磷酸钾pH7.0，2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，和0.67mM DTT，和100μg DsbA-C4bp融合蛋白。
该反应通过加入8μl的0.1M的DTT来启动，并通过每5分钟测定650nm的浊度增加直至第60分钟为止进行监测。测定每份样品在650nm的吸光率之前，将所述样品混合3-4次。该反应的容器空白(instrument blank)含0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0，和2mM EDTA。
结果见图7，并说明存在于DsbA-C4bp融合蛋白中的DsbA仍有活性，且其活性可与可溶的DsbA的活性直接可比。
实施例6.非还原条件下C4bp融合蛋白的分析
在变性但非还原性条件下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对C4bp融合蛋白进行分析，以确定在寡聚体的单体间是否存在二硫键。
db-C4bp(312μg/ml)的等分样品(12μl)与Laemmli缓冲液(Tris HCl 1.5MpH6.8，SDS 2％，丙三醇15％，0.02％溴酚蓝)在存在或不存在β-巯基乙醇时进行混合。这些样品在90℃煮沸5分钟，并通过含18％十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，同样缺乏β-巯基乙醇。
其结果是，在缺乏β-巯基乙醇的条件下，db-C4bp融合蛋白作为寡聚体迁移(在凝胶顶部，图9右侧)，显示单体间存在二硫键。相反，加入β-巯基乙醇导致db-C4bp蛋白以其单体分子量进行迁移，见于前述图和图9左侧(显示纯化过程中db-C4bp的还原的样品)。
                   序列表
<110>阿维迪斯公司(AVIDIS SA)
<120>利用C4bp支架制备多聚体融合蛋白
<130>AHB/FP6155089
<140>
<141>
<150>EP 02292043.3
<151>2002-08-14
<160>29
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>57
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>2
<211>57
<212>PRT
<213>穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>2
Glu Val Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Gln Ala Gly Arg Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Ala Asp Pro Tyr Glu Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Leu Leu Glu Leu Gln Arg Asp Lys Ala
         35                  40                  45
Arg Lys Ser Ser Val Leu Arg Gln Leu
     50                  55
<210>3
<211>55
<212>PRT
<213>家鼠(Rattus sp.)
<400>3
Glu Val Pro Lys Asp Cys Glu His Val Phe Ala Gly Lys Lys Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Ser Asn Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Thr Leu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Leu Gln Ile Asp Lys Ala
         35                  40                  45
Lys His Val Asp Arg Glu Leu
     50                  55
<210>4
<211>54
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus sp.)
<400>4
Glu Ala Ser Glu Asp Leu Lys Pro Ala Leu Thr Gly Asn Lys Thr Met
  1               5                  10                  15
Gln Tyr Val Pro Asn Ser His Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Thr Leu Glu Val Glu Leu Leu Gln Leu Gln Ile Gln Lys Glu
         35                  40                  45
Lys His Thr Glu Ala His
     50
<210>5
<211>67
<212>PRT
<213>牛(Bos sp.)
<400>5
Glu Tyr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Val Thr Gly Arg Lys Leu Leu
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Ser Arg Pro Glu Glu Val Lys Leu Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Ile Leu Gln Thr Asn Lys Leu Lys Lys
         35                  40                  45
Glu Ala Phe Leu Leu Arg Glu Arg Glu Lys Asn Val Thr Cys Asp Phe
     50                  55                  60
Asn Pro Glu
 65
<210>6
<211>57
<212>PRT
<213>野猪(Sus scrofa)
<400>6
Glu Tyr Pro Glu Asp Cys Glu Gln Val His Glu Gly Lys Lys Leu Met
  1               5                  10                  15
Glu Cys Leu Pro Thr Leu Glu Glu Ile Lys Leu Ala Leu Ala Leu Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Thr Asn Leu Leu Glu Leu Gln Ile Asp Lys Glu
         35                  40                  45
Lys Lys Ala Lys Ala Lys Tyr Ser Thr
     50                  55
<210>7
<211>56
<212>PRT
<213>豚鼠(Cavia porcellus)
<400>7
Glu Val Pro Glu Glu Cys Lys Gln Val Ala Ala Gly Arg Lys Leu Leu
  1               5                  10                  15
Glu Cys Leu Pro Asn Pro Ser Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Lys Glu Lys Tyr Val Lys
         35                  40                  45
Ile Gln Glu Lys Phe Ser Lys Glu
     50                  55
<210>8
<211>59
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus sp.)
<400>8
Glu Val Leu Glu Asp Cys Arg Ile Val Ser Arg Gly Ala Gln Leu Leu
  1               5                  10                  15
His Cys Leu Ser Ser Pro Glu Asp Val His Arg Ala Leu Lys Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Phe Leu Glu Ile Glu Arg Leu Glu His Gln Lys Glu Lys Trp
         35                  40                  45
Ile Gln Leu His Arg Lys Pro Gln Ser Met Lys
     50                  55
<210>9
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白的变体
<400>
Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn
  1               5                  10                  15
Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu
             20                  25                  30
Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu
         35                  40                  45
Asp Lys Glu Leu
     50
<210>10
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白的变体
<400>10
Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>11
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白的变体
<400>11
Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu Pro Asn
  1               5                  10                  15
Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr Lys Leu Ser Leu Glu
             20                  25                  30
Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser Thr Leu
         35                  40                  45
Asp Lys Glu Leu
     50
<210>12
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白的变体
<400>12
Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>13
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白的变体
<400>13
Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>14
<211>50
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白的变体
<400>14
Glu Gly Cys Glu Gln Ala Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Cys Leu
  1               5                  10                  15
Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Leu Ser
             20                  25                  30
Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser
         35                  40                  45
Thr Leu
    50
<210>15
<211>57
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白的变体
<400>15
Glu Thr Pro Glu Gly Ser Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met
  1               5                  10                  15
Gln Ser Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val Tyr
             20                  25                  30
Lys Leu Ser Leu Glu Ile Lys Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala
         35                  40                  45
Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
     50                  55
<210>16
<211>52
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：C4bp核心蛋白的变体
<400>16
Glu Gly Ser Glu Gln Ala Leu Thr Gly Lys Arg Leu Met Gln Ser Leu
  1               5                  10                  15
Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Leu Ser
             20                  25                  30
Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser Ala Arg Gln Ser
         35                  40                  45
Thr Leu Asp Lys
     50
<210>17
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：柔性接头
<400>17
Gly Gly Gly Gly Ser
  1               5
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：柔性接头
<400>18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  1               5                  10
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：柔性接头
<400>19
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  1               5                  10                  15
<210>20
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：柔性接头
<400>20
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
  1               5                  10                  15
Gly Gly Gly Ser
             20
<210>21
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：血小板生成素激动肽
<400>21
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
  1               5                  10
<210>22
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：下游盒肽序列
<400>22
Met Ala Ser Met Asn His Lys Gly Ser
  1               5
<210>23
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>23
cccgcggatc cgagaccccc gaaggctgtg a                               31
<210>24
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>24
ccccggaatt cttattatag ttctttatcc aaagtgg                         37
<210>25
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：编码6x组氨酸标记的序列
<400>25
catatgcggg gttctcatca tcatcatcat catggtctgg ttccgcgtgg atcc      54
<210>26
<211>74
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：由质粒pAVD 93产生的氨基酸序列
<400>26
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Leu Val Pro Arg Gly
  1               5                  10                  15
Ser Glu Thr Pro Glu Gly Cys Glu Gln Val Leu Thr Gly Lys Arg Leu
             20                  25                  30
Met Gln Cys Leu Pro Asn Pro Glu Asp Val Lys Met Ala Leu Glu Val
         35                  40                  45
Tyr Lys Leu Ser Leu Glu Ile Glu Gln Leu Glu Leu Gln Arg Asp Ser
     50                  55                  60
Ala Arg Gln Ser Thr Leu Asp Lys Glu Leu
 65                  70
<210>27
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>27
ggggccccca tatggcgcag tatgaagatg gtaaacag                           38
<210>28
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>28
ggggaattct taggatccag aacctttttt ctcggacaga tatttcac                48
<210>29
<211>303
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：pAVD77中的启动子和C4bp编码区
<400>29
gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct   60
agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tggctagcat gaatcacaaa  120
ggatccgaga cccccgaagg ctgtgaacaa gtgctcacag gcaaaagact catgcagtgt  180
ctcccaaacc cagaggatgt gaaaatggcc ctggaggtat ataagctgtc tctggaaatt  240
gaacaactgg aactacagag agacagcgca agacaatcca ctttggataa agaactataa  300
taa                                                                303

Claims (21)

1.获得包含C4bpα链的C-末端核心蛋白支架的重组融合蛋白的方法，该重组融合蛋白能在原核宿主细胞中形成可溶的多聚体，所述方法包括以下步骤：
(i)提供携带编码所述重组蛋白的核酸的原核宿主细胞，该核酸与在所述原核细胞中有功能的启动子可操作地连接；
(ii)在所述重组蛋白被表达的条件下培养该宿主细胞；和
(iii)回收所述重组蛋白，其中所述蛋白以多聚体形式被回收，而无需支架重折叠的步骤。
2.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白以至少2mg/l细胞培养物的浓度存在。
3.权利要求1或2的方法，其中所述宿主原核细胞是大肠杆菌。
4.权利要求3的方法，其中所述大肠杆菌选自菌株C41(DE3)[B96070444]，C43(DE3)[B96070445]或CO214(DE3)[NCIMB40884]，或对超量表达的重组蛋白的毒性有抗性的其它菌株。
5.权利要求1至4中任何一个的方法，其中所述重组蛋白包含与异源多肽融合的C4bp核心蛋白。
6.权利要求1至6中任何一个的方法，其中所述异源多肽是TNF受体蛋白。
7.前述权利要求中任何一个的方法，其中所述异源多肽是BAFF-R的BAFF结合部分。
8.权利要求1至6中任何一个的方法，其中所述异源多肽是血小板生成素激动肽IEGPTLRQWLAARA或促生长激素抑制素。
9.分离的核酸，所述核酸包含编码融合蛋白的序列，所述融合蛋白为C4bpα链的C-末端核心蛋白与BAFF-R的融合蛋白。
10.分离的核酸，所述核酸包含编码融合蛋白的序列，所述融合蛋白为C4bpα链的C-末端核心蛋白与血小板生成素激动肽IEGPTLRQWLAARA或促生长激素抑制素的融合蛋白。
11.原核表达载体，所述载体包含编码C4bpα链的C-末端核心蛋白与异源多肽的融合蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列与在原核细胞中有功能的启动子可操作地连接。
12.细菌宿主细胞，其由权利要求11中的表达载体转化。
13.蛋白，所述蛋白包含与BAFF-R融合的C4bpα链C-末端核心蛋白。
14.蛋白，所述蛋白包含与血小板生成素激动肽IEGPTLRQWLAARA融合的C4bpα链C-末端核心蛋白。
15.权利要求1至8中任何一个的方法，其还包括将所述重组蛋白配制成组合物，所述组合物包含可药用的载体或稀释剂。
16.治疗患者疾病的方法，所述疾病与血清BAFF水平的升高相关，所述方法包括将治疗有效量的权利要求14的蛋白或权利要求9的核酸给药患者的步骤。
17.权利要求16的方法，其中所述疾病是系统性红斑狼疮。
18.真核表达载体，所述载体包含编码权利要求13或14的蛋白的核酸序列，所述核酸序列与在真核细胞中有功能的启动子可操作地连接。
19.真核宿主细胞，其由权利要求18的载体转化。
20.权利要求18的表达载体在治疗人体或动物体的方法中的应用。
21.真核表达载体在人体或动物体的治疗中的用途，其中所述载体包含编码重组融合蛋白的核酸序列，所述重组融合蛋白包含C4bpα链的C-末端核心蛋白支架。
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