CN1646564A - 修饰的因子ⅷ - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对人因子VIII(FVIII)进行修饰，从而导致当用于体内时与任何未修饰的亲代抗体相比基本无免疫原性或具低的免疫原性的FV VIII蛋白质。本发明也涉及来源于所述未经修饰的蛋白质的T－细胞表位肽，通过该肽可以构建具有降低的免疫原性的修饰的FVIII变体。

Description

修饰的因子VIII
发明领域
本发明涉及尤其是向人施用的且特别是用于治疗用途的多肽。该多肽是修饰的多肽，所述修饰导致该多肽当给予人被试者时具有减少的引起免疫反应的倾向。本发明具体地涉及对人因子VIII(FVIII)进行修饰，从而导致当体内应用时与任何未修饰的对应物相比基本无免疫原性或具低的免疫原性的因子VIII蛋白质。本发明还涉及来源于所述未修饰的蛋白质的T细胞表位肽，通过这些肽可以构建具有降低的免疫原性的FVIII修饰变体。
发明背景
有许多关于治疗性蛋白质的功效受对该治疗性蛋白质有害的免疫反应限制的例子。几种小鼠单克隆抗体已显示出有希望用作许多人类疾病情形的治疗剂，但在某些情况下由于引起显著程度的人抗-鼠抗体(HAMA)反应而失败[Schroff，R.W.等人(1985)Cancer Res. 45：879-885；Shawler，D.L.等人(1985)J.Immunol. 135：1530-1535]。对于单克隆抗体已发展了许多技术来试图减少HAMA反应[WO8909622；EP0239400；EP0438310；WO9106667]。这些重组DNA方法通常减少最终抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。但是，在几种情况下，结果所得的“人源化”抗体仍然在患者中引起免疫反应[Issacs，J.D.(1990)Sem.Immunol. 2：449，456；Rebello，P.R.等人(1999)Transplantation  68：1417-1420]。
抗体不是唯一一类作为治疗剂给药而可产生免疫反应的多肽分子。即使人来源的且与人体内存在的蛋白质具有相同氨基酸序列的蛋白质也可诱导人体内免疫反应。显著的例子包括粒细胞巨噬细胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等人(1999)Clin.Cancer Res. 5：1353-1361]和干扰素α2[Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem. 94：300-305；Stein，R.等人(1988)New Engl.J.Med. 318：1409-1413]等的治疗应用。在这些人蛋白质具有免疫原性的情况下，原本在这些个体中起作用的针对这些蛋白质的免疫耐受性，推测将被破坏。
这种将人蛋白质用作替代疗法的情形是不同的，例如用在所说蛋白质天然不足的遗传性疾病的治疗中，诸如血友病、Christmas病、Gauchers病之类疾病以及许多其它例子中。在这样的情况中，治疗用的替代蛋白质从开始就可起到免疫学上外源分子的作用，并且当个体能对治疗剂产生免疫应答时，治疗的效力有可能被显著降低。
无论所说的蛋白质治疗剂是否被宿主免疫系统认作外源分子，或现存的对这些分子的耐受性是否被克服，对这些蛋白质的免疫反应性的机制是相同的。诱发免疫应答的关键是在这些蛋白质内存在能通过呈递于II型MHC分子上而刺激T细胞活性的肽，即，所谓的“T细胞表位”。这样的T细胞表位通常被定义为能结合II型MHC分子的任何氨基酸序列。言外之意，“T细胞表位”指当结合MHC分子时能被T细胞受体(TCR)识别并至少在原则上能通过结合TCR促进T细胞应答而引起这些T细胞活化的表位。
II型MHC分子是一组在辅助T-细胞的选择和活化中起重要作用的高度多态的蛋白质。人类DR类白细胞抗原(HLA-DR)是该组蛋白质的主要同种型，然而同种型HLA-DQ和HLA-DP也发挥相似的功能。在人类群体中，每个个体携带2-4个DR等位基因、2个DQ和2个DP等位基因。对于DR同种型来说约存在70种不同的同种异型，对于DQ是30种不同的同种异型，对于DP是47种不同的同种异型。许多DR分子的结构已得到了解析，这些结构显示为具有许多疏水口袋的开放式(open-ended)肽结合沟，这些疏水口袋与肽的疏水残基(口袋残基)啮合[Brown等人Nature(1993) 364：33；Stern等人(1994)Nature  368：215]。MHC DR分子由在C末端插入细胞膜的α链和β链组成。每个异二聚体都具有能结合9-20个氨基酸长度的肽的配体结合域，但是结合沟最大能容纳11个氨基酸。最近的研究显示DQ分子具有同源结构，而且预期DP家族蛋白质将非常相似。确立不同II型MHC分子同种异型的多态性造成了肽结合沟中多种多样的不同肽结合表面，且在群体水平上确保了能够最大的灵活度地识别外源蛋白质及对病原体生物产生免疫反应。
对治疗性蛋白质的免疫反应通过II型MHC肽呈递途径进行。在此，外源蛋白质被吞入并经加工以与DR、DQ或DP类的II型MHC分子结合进行呈递。II型MHC分子是由专门的抗原呈递细胞(APC)，如巨噬细胞和树突细胞等表达的。II型MHC肽复合物与T-细胞表面上关连T-细胞受体的结合，加上某些其他共同受体如CD4分子的交互结合可诱导T-细胞内的活化状态。该活化导致细胞因子的释放，从而进一步活化其他淋巴细胞如B细胞以产生抗体，或者活化T杀伤细胞而形成完全的细胞免疫反应。
T-细胞表位的鉴定是表位消除的第一步，然而在本领域中几乎没有清楚的案例将鉴定表位和去除表位整合在单个方案中。WO98/52976和WO00/34317讲授了鉴定多肽序列的计算穿线(computational threadingapproach)方法，该多肽序列具有与人II型MHC DR同种异型亚型结合的潜力。在这些讲授中，预测的T-细胞表位通过在目的蛋白质中应用合理的氨基酸替代而去除。然而利用该方案和其他鉴定表位的基于计算的程序[Godkin，A.J.等人(1998)J.Immunol. 161：850-858；Sturniolo，T.等人(1999)Nat.Biotechnol. 17：555-561]，预测能够与II型MHC分子结合的肽可能并不会在所有情况下，特别是在体内(由于加工途径或其他现象)发挥T-细胞表位的功能。此外，这些预测T-细胞表位的计算方法通常不能够预测具有DP或DQ限制性的表位，尽管这些系统的表位识别通常相互重叠。
除计算技术之外，存在测量合成的肽与II型MHC分子结合能力的体外方法。一种示例性的方法应用具有限定的MHC同种异型的B-细胞系作为II型MHC结合表面的来源，且可应用于II型MHC配体的鉴定中[Marshall K.W.等人(1994)J.Immunol. 152：4946-4956；O’Sullivan等人(1990)J.Immunol. 145：1799-1808；Robadey C.等人(1997)J.Immunol.159：3238-3246]。然而，这种技术不适用于筛选可针对广泛多样的MHC同种异型的多重潜在表位，且它们也不能证实结合的肽能否发挥T-细胞表位的功能。
最近采用重组MHC分子与合成的肽的可溶性复合物的技术已得到应用[Kern，F.等人(1998)Nature Medicine  4：975-978；Kwok，W.W.等人(2001)TRENDS in Immunol. 22：583-588]。这些试剂和方法可用于鉴定来自人或实验动物被试者的外周血液样品中是否存在能够结合特定的MHC-肽复合物的T-细胞克隆，但这些方法和试剂也不适用于筛选可针对广泛多样的MHC同种异型的多重潜在表位。
T-细胞活化的生物学测定法可提供实际的选择方案，通过该方案可读出所检测的肽或整个蛋白质序列引起免疫反应的能力。该类方法的例子包括Petra等人的工作，该工作对细菌蛋白质葡萄球菌激酶应用T-细胞增殖测定，随后用合成的肽刺激T-细胞系以对表位进行作图[Petra，A.M.等人(2002)J.Immunol. 168：155-161]。类似地，应用合成的破伤风毒素蛋白质的肽进行的T-细胞增殖测定导致对毒素中免疫优势表位的确定[Reece J.C.等人(1993)J.Immunol. 151：6175-6184]。WO99/53038公开了所测试蛋白质的T-细胞表位可用分离的人免疫细胞亚群进行确定的方法，其中细胞分离后，促进其在体外分化并在合成的目的肽存在时进行细胞培养，在培养的T-细胞中对任何诱导的增殖进行测量。相同技术也由Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)J.Immunotherapy  23：654-660]描述，其中在两种情况下该方法应用于在细菌枯草杆菌蛋白酶中探测T-细胞表位。这种技术需要仔细地应用细胞分离技术和利用多种细胞因子补充物进行细胞培养以便获得想要的免疫细胞亚群(树突细胞、CD4+和/或CD8+T-细胞)，且不利于应用多个供体样品的快速通量筛选。
如上所述，由此期望从给定的原则上有治疗价值但最初为免疫原性的肽、多肽或蛋白质中鉴定并去除或至少减少T-细胞表位。这种治疗上有价值的分子之一是FVIII。本发明提供除去了一个或多个T细胞表位的修饰形式的人FVIII。
FVIII是固有的血液凝固途径中的一个凝血因子。FVIII是因子IXa的辅因子，其在钙离子和磷脂存在的条件下将因子X转变成活化形式Xa。现已对FVIII的分子遗传学有了很好的研究，相当重要的原因是当X-连锁基因中缺乏FVIII时会导致A型血友病。FVIII基因编码两种可选择剪切的转录产物，可产生A同种型的大糖蛋白FVIII和较小的B同种型。在天然状态下可鉴别到来源于A同种型前体的多种降解或加工形式，且特定的功能活性已被定位于特定的片段。FVIII分子被划分为6个结构域：三个A结构域(A1、A2、A3)，一个富碳水化合物且非必需的中央结构域(B-结构域)和两个C结构域(C1、C2)。FVIII的凝血酶和因子Xa蛋白水解位点在残基372、740和1689之后。Xa与活化的蛋白质C一道的裂解位点发生在残基336之后。
FVIII蛋白质在功能上可定义为能矫正A型血友病患者血浆中凝血缺陷的因子。为了治疗A型血友病，已生产来自人或猪血浆的纯化形式的FVIII，最近还通过重组DNA技术生产FVIIII。1984年，人FVIII基因被至少两个独立的实验小组分离和表达于哺乳动物细胞中[Toole，J.J.等(1984)，Nature 312：342-347；Gitschier，J.等(1984)，Nature 312：326-330；Wood，W.I.等(1984)，Nature 312：330-337；Vehar，G.A.等(1984)，Nature 312：337-342；WO87/04187；WO88/08035；WO88/03558；US4757006]。从cDNA中推知了其氨基酸序列并已开发了治疗用量的FVIII的重组生产，例如US4965199公布了一种用于在哺乳动物宿主细胞中生产FVIII和纯化人FVIII的方法。已有关于在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞和BHKC(幼仓鼠肾细胞)中表达人FVIII的报道，而最近FVIII已被修饰成缺失部分或全部的B结构域[美国专利申请4868112]，且这样的分子已在临床试验中显示出了功效[Lusher，J.M.等(2003)Haemophilia  9：38-49]。这一分子事实上已获得了应用许可-Refacto是遗传研究所和Pharmacia Upjohn合作在CHO细胞中制备的。
尽管可以得到治疗量的FVIII，仍然继续需要具有增强特性的FVIII类似物。期望达到的增强作用包括蛋白质表达和纯化的可选择方案和形式，还有尤其是对蛋白质生物学特性的改进。在用作治疗剂时特别需要增强其体内特性。在这方面，非常期望的是提供减少或缺失在人受试者体内诱发免疫应答的潜力的FVIII。预期这样的蛋白质会呈现出在人受试者体内循环时间增加且对慢性和复发性疾病尤其有益，诸如A型血友病，尤其是在血友病患者可能对外源重组因子VIII敏感且原本产生会限制其治疗效力的抗因子VIII抗体的情况下尤其有益。
其它文献也提供了FVIII分子和特别是重组修饰FVIII[US4757006；US5633150；US5668108]，但它们之中无一认识到T细胞表位对于该蛋白质免疫原性的重要，也无一考虑到按本发明的方案以特异且受调控的方式直接影响这些特性。
本领域中关于FVIII修饰的许多例子中包括US5948407，为了产生对治疗用蛋白质抗原的抑制性T细胞全部组分，此文献中公布了用于产生能经粘膜(如口腔)施用该蛋白质的制剂的方案。
其它文献也试图修饰FVIII以达到提高其在受试血友病患者体内的半衰期的目的，例如US6037452描述的聚(环氧烷)因子VIII缀合体。
在A型血友病治疗中的一种特殊的并发症是在某些病人中诱发针对所施用FVIII制品的抑制性抗体。现已提出几种策略来克服血友病患者中对FVIII的免疫学应答。耐受性诱导治疗是这些方法中的一种，但目前需要在血友病患者的极早期施用很大剂量(且昂贵)的FVIII制品。此方法只在部分病例中成功获得了耐受性[Colowick，A.B.等(2000)Blood  96：1698-1702]。在预先未接受治疗的受试者中进行的两种不同的重组产物的临床试验报告显示，在20％左右的病例中有抑制物的产生[Lusher，J.M.等(1993)N.Engl.J.Med  328：453-459；Bray，G.L.等(1994)Blood  83：2428-2435]。FVIII抑制物是在血浆中中和FVIII活性的免疫球蛋白抗体。在用FVIII浓缩品或重组FVIII治疗的约25％严重血友病患者和5-15％轻度至中度患者中所说的抑制物作为同种抗体出现。
对于含有抑制物的病人还采用了因子IX复合物或“凝血酶原复合物”进行治疗。通常这些药剂是包括如因子II、VII、IX和X在内的多种不同因子的混合制品。EP0044343-B1提供这样一种以已活化的成分(FVIIa)为特征的凝血酶原复合物。类似地，US6358534描述了包含小部分FVIII蛋白和相对较高比例的其它凝血蛋白因子及载体蛋白的免疫耐受性凝血酶原复合物。
US5543145提供了组合物以抑制FVIII抑制物的产生，该组合物包括例如以与FVIII混合的F(ab’)2形式的多克隆抗体或单克隆抗体。US4769336提供了结合并由此封闭FVIII抗体抑制物的FVIII片段。
其它的策略是利用猪因子VIII替代人FVIII，不过这样的治疗是一种暂时的方法，因为猪VIII本身是会产生免疫性的。
其它可选择的方法包括用免疫抑制性药物进行治疗并/或通过体外疗法从循环中除去抑制物，可以理解的是这些方法代表了对目前所出现问题的极端和冒险的解决方案。遗传工程技术的确为治疗用途的FVIII分子的修饰和产生提供了相当大的机会。A型血友病的药用组合物和疗法由文件US4965199、US5618788和US5668108和外国同族专利提供，应被认为是本领域中可获得的在此题目上进行大规模工作的典型例子。
用重组方法进行FVIII修饰的另外类型的例子参见文件US5859204、US6376463、US6485563和US6180371，它们共同提供了FVIII蛋白质及它们的编码基因，其中的定位替代导致了对抑制性抗体反应性的降低。在这些具体的文件中替代被限制在FVIII A结构域的第484-509位氨基酸之间。这样的修饰虽然改变了FVIII分子的表面布局从而使特定构象表位不再能被病人血清中的特定交叉反应抗体所识别，但是没有涉及驱使B细胞产生抗体所需的潜在T细胞表位。
其它文献已使用了重组DNA方法来提供通过定位氨基酸替代[WO87/07144]或相关分子间的结构域交换来修饰的FVIII分子。后一种方法的例子参见WO90/05530，其中提供了以人因子V的B结构域替代FVIII B结构域的FVIII分子。
还有其它文献提供了包含重组FVIII分子的嵌合FVIII制品，通过遗传工程化使其含有人和猪(或其它物种)来源的序列结构域。这样的杂合分子参见US5744446、US5663060、US5583209、US5364771、US5888974及其它文献中。
US5171844提供了遗传工程化的FVIII分子，该分子可能具有增强的活性和/或降低的免疫原性。后一种特性涉及通过删除缺失分子的某一部分。US4868112和国外同族专利中所述的较早工作提供了缺失B结构域的FVIII功能性删除突变体。
对FVIII蛋白质的其它遗传工程修饰致力于蛋白质生产过程的改进，US6,271,025提供了具体实例。提供此实例作为本领域可利用的且已知的许多更多相似工作的例示。
发明概述和描述
本发明提供了修饰形式的人因子VIII，此处称作“FVIII”，其中免疫特征通过减少或去除潜在T-细胞表位的数目而被修饰。
本发明公开了在FVIII一级序列中鉴定到的序列，该序列由于其II型MHC结合潜力而是潜在的T细胞表位。本公开尤其同样涉及2332个氨基酸残基的同种型A完整人FVIII蛋白质以及该蛋白质中缺少B域的较小版本。
本发明还公开了在保持最大程度的蛋白质生物学活性的前提下可以通过特定的氨基酸替代、添加或缺失进行改变的本发明分子的一级序列中的特定位点。在只有同时丧失生物学活性才能去掉免疫原性的情况下，可通过在所述蛋白的氨基酸序列中做进一步的改造以恢复所述的活性。
本发明还公开了用于生成这些经修饰分子的方法，首先是用于鉴定为了降低或消除免疫原性位点而需要改变的T细胞表位的方法。
本发明提供了预期在体内展示增强特性的经修饰形式的FVIII蛋白质。本发明公开了在人体内具有免疫原性的FVIII一级序列的主要区域，并提供了为了消除或降低这些位点的免疫原性效力而对序列进行的修饰。在一个实施方案中，为了提升对完整分子的耐受原性应答(tolerogenic response)，可在药学组合物中提供包含免疫原性区域的合成肽。
在另一个实施方案中，本发明的经修饰FVIII分子可用于制药学组合物。
概括而言，本发明涉及下面的要点：
●一种经修饰的分子，其具有FVIII的生物学活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子；
●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位而实现的；
●如上所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过减少能与由所述分子衍生的肽相结合的MHC同种异型的数量来实现的；
●如上所述的分子，其中，去除了一个T-细胞表位；
●如上所述的分子，其中，原本存在的T-细胞表位是II型MHC的配体，或表现出经II型分子呈递作用后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列；
●如上所述的分子，其中，所述的肽序列选自如下肽a-k：
a)＝ILLFAVFDEGKSWHS，
b)＝SYKSQYLNNGPQRIG，
c)＝GPQRIGRKYKKVRFM，
d)＝YKWTVTVEDGPTKSD，
e)＝ASNIMHSINGYVFDS，
f)＝VAYWYILSIGAQTDF，
g)＝MSSSPHVLRNRAQSG，
h)＝CNIQMEDPTFKENYR，
i)＝STLFLVYSNKCQTPL，
j)＝ISQFIIMYSLDGKKW，
k)＝IARYIRLHPTHYSIRSTLRM；
●如上所述的分子，其中所述肽序列选自表1和/或表2中的肽；
●如上所述的分子，其中，所述的肽序列选自如图1所示的肽；
●如上所述的分子，其中，任何原本存在的T-细胞表位中的1-9个氨基酸残基，优选1个氨基酸残基发生了改变；
●如上所述的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是在特定的位置对原本存在的氨基酸残基进行缺失或用其他的氨基酸残基进行替代、添加；
●如上所述的分子，其中，在需要时常通过替代，添加或缺失特定的氨基酸作进一步改变以恢复所述分子的生物学活性；
●与上文肽序列a-k之任一共享超过90％氨基酸同一性的上文肽分子；
●与上文肽序列a-k之任一共享超过80％氨基酸同一性的上文肽分子；
●与表1或图1之任一肽序列共享超过90％氨基酸同一性的上文肽分子；
●与表1或图1之任一肽序列共享超过80％氨基酸同一性的上文肽分子；
●能够结合II型MHC的上述肽序列；
●如上所述的FVIII分子，其中在对应于上文肽a-k之任一中的任一所示氨基酸的位置进行了一个或多个氨基酸替代；
●如上所述的FVIII分子，其中在对应于表1或图1中任一所示氨基酸的位置进行了一个或多个氨基酸替代；
●包含具有结合II型MHC的活性的上文任一个肽或修饰的肽的药物组合物；
●编码任何上述和下述经修饰分子的DNA序列或分子；
●包含具有FVIII生物学活性的经修饰分子的药物组合物；
●上述和/或权利要求中定义的药物组合物，其任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
●制造如上引用的任何权利要求中所定义的具有FVIII生物学活性的经修饰分子的方法，该方法包括下述步骤：(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通过任意方法，包括利用体外或硅片(in silico)技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；(iii)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或计算机技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定；(iv)通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体；和(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)；
●如上所述的方法，其中步骤(iii)是通过在任何原本存在的T-细胞表位中替代、添加或缺失1-9个氨基酸残基来进行的；
●选自图1的具有潜在的II型MHC结合活性且由未经修饰的FVIII产生的13肽T-细胞表位肽，及其在制造在体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于具有相同生物学活性的任何未经修饰的分子的FVIII中的用途；
●由上述的13肽T-细胞表位肽中的至少9个连续的氨基酸残基组成的肽序列，及其在制造在体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于任何未经修饰的分子并具有人因子VIII的生物学活性的FVIII中的用途。
●选自表1或图1中序列的具有潜在的II型MHC结合活性且由未经修饰的FVIII产生的13肽T-细胞表位肽，及其在制造在体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于任何未经修饰的分子并具有人因子VIII的生物学活性的FVIII中的用途；
●由来自表1或图1中任一序列的13肽T-细胞表位肽中的至少9个连续氨基酸残基组成的肽序列，及其在制造在体内使用时基本上没有免疫原性或免疫原性低于任何未经修饰的分子并具有人因子VIII的生物学活性的FVIII中的用途。
根据对本发明的理解，术语“T-细胞表位”是指具有下述能力的氨基酸序列，即能结合MCH II、能刺激T-细胞和/或也能以与MHC II形成复合物的形式结合(但不一定可测量地激活)T-细胞。
此处及后附权利要求中所用的术语“肽”是指包含两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸之间通过肽键相连(定义见下)。肽的生物生产中涉及20种不同的天然氨基酸，任意数量的所述氨基酸可按任意的顺序连接形成肽链或环。用于生物生产肽的天然氨基酸全部具有L-构型。可应用常规的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或两种不同构型的氨基酸的各种组合制备合成肽。一些肽仅包含少量的氨基酸单元。例如含有不到10个氨基酸单元的短肽有时被称作“寡肽”。其他的包含大量氨基酸残基，例如达100个或更多个氨基酸残基的肽称作“多肽”。习惯上将含有3个或3个以上氨基酸的任何肽链多看作“多肽”，而将“寡肽”视为特定类型的短“多肽”。因而本文所提到的“多肽”也包括“寡肽”。而且，所用到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。不同的氨基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，可形成的多肽的数量以及不同蛋白的数量实际上是无限的。“α碳(Cα)”是肽链中碳-氢(CH)组分中的碳原子。“侧链”是Cα的侧基，其可包含简单的或复杂的基团或部分，且具有与所述肽的大小相比可显著变化的外形大小。
本发明可应用于与此处公开的FVIII具有基本上相同的一级氨基酸序列的任何FVIII分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法获得的、可以包含多于或少于2332个氨基酸残基的FVIII分子。
对于特别优选的FVIII分子，分子中缺乏B结构域，而且任何剩余结构域中还包含一个或多个氨基酸替代，导致序列中一个或多个T细胞表位的消除。缺失了B结构域的1438个氨基酸残基的治疗性FVIII分子已经进行了成功的临床试验，正如Lusher等人及其中参考文献所述[Lusher，J.M.等(2003)Haemophilia 9：38-49]。本文图9描述了这种蛋白质的氨基酸序列。
FVIII蛋白，如从其他哺乳动物来源中鉴定出的相关蛋白与本发明中公开的肽序列之间存在大量共有序列，且与列表中公开的肽序列间存在大量基本上相同的共有序列。因此这样的蛋白序列也落入本发明的保护范围。
本发明设计用于克服实际应用中存在的下述问题，即将可溶性蛋白引入自体生物中可引发免疫应答，产生可与所述可溶性蛋白相结合的宿主抗体。对于许多A型血友病患者，针对现有治疗性FVIII制剂的抗体应答是处理他们疾病的重大问题。在任何个体中，少数T细胞表位能够驱动T辅助细胞信号传导而导致针对天然FVIII蛋白质中许许多多由B细胞所识别的表面暴露决定簇的持续抗体应答。对来自A型血友病患者的编码抑制剂抗体的基因的分析显示许多这样的抗体经历了亲和力成熟[Jacquemin，M.G.等(1998)Blood 92：496-506；van den Brink，E.N.等(2000)Blood 95：558-563]。亲和力成熟下面的超变现象只发生于应答T细胞辅助的B细胞中，同样早就认识到高比例的FVIII抑制剂抗体属于IgG4亚型[Andersen，B.R.和Terry，W.D.(1968)Nature 217：174-175]，而且类似地此必需的类型转变反应是T辅助细胞依赖性事件。应答FVIII的抗体是由T细胞驱动的其它证据来自具有FVIII抑制剂的HIV阳性患者中的观察结果，即FVIII抗体应答由于T细胞数目下降而丧失[Bray，G.L.等(1993)Am.J.Hematol.42：375-379]。因此，本发明试图通过提供在施用于人体时引发免疫应答的倾向发生改变的FVIII蛋白来解决这一问题。存在这样一种理解，当多数B细胞表位在经修饰的FVIII表面保持完整时，在缺乏持续T细胞辅助时抑制剂滴度将最终降低，而且对于接受这种疗法的新患者而言将开始就不能获得建立。
根据本文所述方法，本发明人发现了FVIII分子中包含关键T细胞表位的区域，这些表位驱动针对该蛋白质的免疫应答。
本发明中形成经修饰的FVIII的一般方法包括下述步骤：
(a)确定多肽或其中一部分的氨基酸序列；
(b)通过任意方法，包括利用体外或计算机技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；
(c)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或计算机技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定。构建此序列变体以避免由所述的序列变体产生新的潜在T-细胞表位，否则所述的新的潜在T细胞表位又通过此种方式进行修饰以基本上减弱或消除T-细胞表位活性；和
(d)根据已知的重组技术通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体。
对于步骤(b)中对潜在T-细胞表位的鉴定可依照本领域已公知的方法进行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317；WO02/069232中公开了适当的方法，可以用于鉴定FVIII-衍生的肽对II型MHC分子的结合倾向。在实践中，已经通过联合应用生物学离体人T细胞增殖测定法和采用WO02/06922中所略述方案的软件工具衍生了本发明的组合物，而且其中所述软件工具是本发明的一个实施方案。
软件在肽-II型MHC结合相互作用的水平模拟抗原呈递过程，为任何指定肽序列提供了结合评分。这种评分针对群体中现存的许多主要II型MHC同种异型而确定。由于此方案能够测试任何肽序列，因此能够预测氨基酸替代、添加或缺失在肽与II型MHC结合沟相互作用的能力方面的后果。因此，可以设计包含减少数目的能够与II型MHC相互作用从而发挥免疫原性T细胞表位功能的肽的新序列组合物。当生物学测定法能够评估任一指定供体样品与最多4种DR同种异型的结合时，硅片(in silico)方法可以同时用超过40种同种异型测试相同肽序列。在实践中，这种方法能够指导与多种MHC同种异型相互作用的能力受到损害的新序列变体的设计。
作为这种硅片方法的实例，图1提供了在完整人FVIII序列上进行的分析的结果。图中列出了衍生自FVIII且经检测具有以显著结合评分结合一种或多种II型MHC同种异型能力的13mer肽序列。从总体上看，针对人FVIII蛋白质，这组13mer肽数据集被认为以高度确定性提供了全部容许的MHC型配体。出于诸如对体内完整FVIII多肽的蛋白水解加工和导致FVIII肽呈递的其它生理学步骤的需要等原因，显然整个肽库中相对少数的肽将具有最终的生物学适用性。为了进一步鉴定这些生物学相关肽，发明人开发了采用离体人T细胞增殖测定法的方法。
这种方法已经被证明是一种特别有效的方法，而且在本文中公开作为本发明的实施方案。该方法可用于测试部分序列，例如缺乏所有或部分B结构域的FVIII蛋白质；该方法可用于序列中的选定区域，例如FVIII肽子集诸如图1中所列的所有或一些肽；或者该方法可用于测试完整FVIII序列。在本研究中，该方法包括在方案中测试重叠的FVIII衍生肽序列以扫描并测试缺乏B结构域的FVIII序列。对合成的肽测试它们在体外人T细胞培养物中引发增殖应答的能力。在使用来自健康供体的幼稚人T细胞进行这类方法时，本发明人确定了在这种测定法的操作中等于或大于2.0的刺激指数是所诱导增殖的有用测量值。刺激指数常规地通过用在有检验的肽时测量到的增殖分数(例如如果应用3H-胸苷掺入则为每分钟的放射性计数)除以在不与检验的肽接触的细胞中测量到的增殖分数而获得。
在这种方法的另一个实施方案中，本发明人提供了使用离体生物学T细胞测定法对FVIII序列扫描以确定T细胞表位的存在和定位的方法，其中T细胞来源于血友病患者。对于这些患者的一部分而言，FVIII蛋白质在体内构成外来蛋白质和有力抗原。本发明人确定了有可能在体外由这些个体的PBMC衍生多克隆和原则上单克隆T细胞系，而且这些细胞系可以在FVIII蛋白质的T细胞表位作图中用作有效试剂。
这是按如下实现的：将血友病PBMC T细胞在体外进行几轮抗原(FVIII)刺激，随后立即在存在IL-2时进行扩增。对于建立多克隆T细胞系而言，2-3轮抗原刺激通常足以生成大量的抗原特异细胞，而且这些细胞可以冷冻保存继而在需要时使用。细胞被用于筛选大量的合成肽。
在本情况中，使用每个库包含8种不同肽序列的一系统库分析了合成肽。图2图示了肽库方案。在包括将FVIII与PBMC一起孵育7天的最初一轮抗原(FVIII)刺激之后，随后在存在自体经照射PBMC作为抗原呈递细胞时用抗原再次刺激。这些轮次的抗原选择进行3-4天，并以包括用IL-2进行刺激的扩增阶段间隔，IL-2可以每3天添加一次，总计大约9天。使用“静息”的T细胞，即大约4天未经IL-2刺激的T细胞进行最后一次的再刺激。
如先前所述，使用最优选的自体抗原呈递细胞用抗原(如合成肽或完整蛋白质)刺激这些细胞大约4天，然后测量后继增殖应答(如果有的话)。组织这些肽库使得每个库包含与后继库重叠的肽。通过这种方式任何一个T细胞表位都出现在2个不同库中，而且将由使用这两个库的处理中检测到诱导的增殖。在对任何指定肽库检测增殖应答后，对肽库解码，使用分离的各个库成员重复此测定法。
在本方案中，特别希望采用来自称为“抑制剂患者”的患者类型的PBMC样品，因为可以预期由来自这些个体的T细胞集合所定义的FVIII蛋白质表位图谱将代表能够在体内环境中呈递的最普遍肽表位。在这方面，来自先前已被证明有免疫应答的患者的PBMC是体内致敏步骤的产物，而且可以预期这具有实践优势，即能够针对任何指定的刺激肽引起强得多的增殖应答。这降低了进行增殖测量的技术难度。
本研究揭示了能够引发显著增殖应答(即SI＞2.0)的38种肽序列。这些肽在表1中列出，而且是本发明的一个实施方案。在这组肽中，又鉴定了一个肽子集，经鉴定子集中的肽在2个或更多个供体样品中引发显著增殖应答，而且对于这些应答中的某些而言，应答水平事实上显著高于SI＝2.0。这些肽在表2中列出，而且是本发明的另一个实施方案。
表1：
  肽序列     残基 #*
  ATRRYYLGAVELSWD     1
  SWDYMQSDLGELPVD     13
  PVDARFPPRVPKSFP     25
  SVVYKKTLFVEFTDH     43
  VEFTDHLFNIAKPRP     52
  PWMGLLGPTIQAEVY     67
  LKNMASHPVSLHAVG     88
  VSYWKASEGAEYDDQ     103
  PGGSHTYVWQVLKEN     130
  ASDPLCLTYSYLSHV     148
  ILLFAVFDEGKSWHS     196
  SLPGLIGCHRKSVYW     241
  VYWHVIGMGTTPEVH     253
  QASLEISPITFLTAQ     283
  YIAAEEEDWDYAPLV     385
  SYKSQYLNNGPQRIG     406
  GPQRIGRKYKKVRFM     415
  PYNIYPHGITDVRPL     472
  YKWTVTVEDGPTKSD     511
  KESVDQRGNQIMSDK     556
  QIMSDKRNVILFSVF     565
  PAGVQLEDPEFQASN     598
  ASNIMHSINGYVFDS     610
  LQLSVCLHEVAYWYI     625
  VAYWYILSIGAQTDF     634
  GAQTDFLSVFFSGYT     643
  GCHNSDFRNRGMTAL     691
  TGDYYEDSYEDISAY     712
  LLSKNNAIEPRSFSQ     728
  MSSSPHVLRNRAQSG     817
  NEHLGLLGPYIRAEV     859
  AWAYFSDVDLEKDVH     940
  CNIQMEDPTFKENYR     1009
  IGEHLHAGMSTLFLV     1108
  STLFLVYSNKCQTPL     1117
  ISQFIIMYSLDGKKW     1204
  IARYIRLHPTHYSIR     1251
  RLHPTHYSIRSTLRM     1256
*依照B结构域缺失的序列进行序列编号(图9)
表2：
能离体刺激来自2个或2个以上供体样本的人T细胞的FVIII肽序列
肽编号     残基#* 肽序列 域
    P1     196     ILLFAVFDEGKSWSH     A1
    P2     406     SYKSQYLNNGPQRIG     A2
    P3     415     GPQRIGRKYKKVRFM     A2
    P4     511     YKWTVTVRDGPTKSD     A2
    P5     610     ASNIMHSINGYVFDS     A2
    P6     634     VAYWYILSIGAQTDF     A2
    P7     817     MSSSPHVLRNRAQSG     A3
    P8     1009     CNIQMEDPTFKENYR     A3
    P9     1117     STLFLVYSNKCQTPL     A3
    P10     1204     ISQFIIMYSLDGKKW     C1
    P11     1251     IARYIRLHPTHYSIRSTLRM     C1
*依照B结构域缺失的序列进行序列编号(图9)
本文所公开的肽序列是构建其中这些表位的一个或多个遭到破坏的经修饰FVIII分子所需要的关键信息。在本发明的方案中，通过突变破坏表位从而导致序列不再能够发挥T细胞表位的作用。可以用重组DNA方法来完成这些靶序列的定向诱变，许多这样的技术在本领域是可以获得的且众所周知的。
当本发明的目的是修饰上文表1所列举的至少一个或多个肽的氨基酸序列时，最优选修饰表2所示的肽P1-P11中的一个或多个序列。此处公布了能够达到双重目的的适宜修饰，所述目的即在作为一种或多种II型MHC同种型分子的配体的水平上，或者更特别地在能够诱导T细胞增殖(尤其是在T细胞是体外培养的人T细胞的情况)的水平上，降低或消除受试肽序列作为T细胞表位的能力。
这样一套优选修饰中的一个例子是破坏肽P10所包含的T细胞表位，P10的序列为ISQFIIMYSLDGKKW。此表位定位于FVIII的C1结构域，而且是能够引发来自血友病患者血液和健康非血友病个体的离体T细胞增殖的表位的一个典型例子。
以该肽序列在II型MHC配体活性方面的硅片分析结果为指导，将定点诱变方法用于在残基F1207、I1208、I1209和M1210处产生替代。残基依照缺失了B结构域的成熟FVIII序列进行编号(图9)。在F1207处的诱变导致了FVIII表达的丧失，而且在所采用的检测法中没有可检测的活性。相反，生成了包含I1208A或I1208T或I1208N和/或I1209C和/或M1210K或M1210N替代的活性FVIII分子。因此，具有一个或多个上述替代的活性FVIII蛋白是本发明方案下的优选组合物。尤其优选的替代是I1208A、I1209C、M1210K或M1210N，这些经过替代修饰的FVIII蛋白是本发明另外的实施方案。
同样优选的实施方案还包括在肽P8所具有的T细胞表位中包含替代的FVIII分子，P8序列为CNIQMEDPTFKENYR。此表位定位于FVIII蛋白质的A3结构域。定点诱变方法已应用于此序列，而且为了提供在Coatest分析法及硅片(in silico)免疫学参数和体外免疫学检测多方面看都保持了功能活性的分子，已生成了M1013K、I1011A或C或D或E或G或H或K或P或Q或R或S或T的替代。因此包含M1013K、I1011A或C或D或E或G或H或K或P或Q或R或S或T替代的FVIII分子是本发明的其它实施方案。
同样优选的实施方案还包括在肽P7所具有的T细胞表位中包含替代的FVIII分子，P7序列为MSSSPHVLRNRAQSG。此表位也定位于FVIII蛋白质的A3结构域。在V823位的替代被认为是特别期望的修饰而且也是本发明的一个实施方案。定点诱变方法已应用于此序列，且为了提供在Coatest分析法和硅片免疫学参数及体外免疫学检测多方面看都保持了功能活性的分子，已生成了V823A或D或E或G或H或N或P或S或T的替代。因此包含V823A或D或E或G或H或N或P或S或T替代的FVIII分子是本发明的其它实施方案。
在血友病患者血样中显示有活性的另一T细胞表位肽序列例子是肽P11，其序列为IARYIRLHPTHYSIRSTLRM。此表位定位于FVIII蛋白的C1结构域，而且原来已被鉴定为FVIII抑制剂产生的重要驱动剂[Jacquemin，M.等(2003)Blood  101：1351-1358]。在位点Y1254、I1255、L1257、Y1262、I1264、L1268处的替代被认为是尤其合乎需要的修饰，而且都是本发明的实施方案。
其它类似的优选实施方案有：于肽P9(STLFLVYSNKCQTPL)所含表位的L1119、F1120、L1121、V1122和Y1123位点含有替代，以及于肽P6(VAYWYILSIGAQTDF)所含表位的Y636、Y638、I637、L638和I639位点含有替代；于肽P5(ASNIMHSINGYVFDS)所含表位的I613和I617位点含有替代；于肽P4(YKWTVTVRDGPTKSD)所含表位的V515和V517位点含有替代；于肽P3(GPQRIGRKYKKVRFM)所含表位的I419位点含有替代；于肽P2(SYKSQYLNNGPQRIG)所含表位的Y407、Y411和L412位点含有替代；于肽P1(ILLFAVFDEGKSWSH)所含表位的L197、L198、F199、V201和F202位点含有替代的FVIII分子。
从上文可见，依照本发明可生成许多FVIII蛋白质变体并检测其期望的免疫和功能特性。用于制备和检测这些FVIII变体蛋白质的示例方法参见实施例。所有这些功能性蛋白质都是本发明的实施方案。而且，所进行的修饰均已被证明生成了不能以与亲本或“野生型”(wt)肽序列相同的亲合力结合II型MHC分子的肽序列，所用的证实方法是WO02/069232的预测性硅片II型MHC结合工具。此外，使用离体人T细胞生物学增殖测定法进行了这些例示性变体肽表位的实际测试，证实这些肽支持T细胞增殖的能力并由此起到T细胞表位的功能如所期望的丧失了。在本案例中这包括用生物学测定法鉴定并由此证实能支持T细胞激活的肽序列。有意义的是许多这样的肽能够促进来自血友病患者血液的T细胞体外增殖，因而是经过加工的表位的代表而不能被认为是隐蔽的或免疫学无关的决定簇。
尽管有其它的方法，包括可考虑化学合成FVIII片段，但变体蛋白质最优选用重组DNA技术产生。很容易利用本文所提供的蛋白质序列信息来推断任何优选变体FVIII分子或片段的多核苷酸(DNA)。最容易的是利用诸如DNAstar软件包(DNAstar Inc.Madison WI，美国)或类似的计算机软件为工具来完成此推断。任何编码本发明多肽或其重要同源物的这些DNA序列都应被认为是本发明的实施方案。
本发明涉及其中至少一个氨基酸已被替代的FVIII类似物，其中在所选位置的替代导致蛋白质的一个或多个潜在T细胞表位的消除或活性明显降低。在图1所示任一潜在II型MHC配体中或更优选的是表1和2的肽表位序列中，特殊位点处的一个或多个氨基酸替代可能导致产生在作为治疗剂施用于人宿主时其免疫原性潜能有所降低的FVIII分子。
最优选的是提供在亲代分子最具免疫原性的区域进行氨基酸修饰(如替代)而产生的FVIII分子。为了消除T-细胞表位，氨基酸替代优选在肽序列中预期可实现T-细胞表位活性的基本减少或消除的适当位点上进行。在实践中，适当的位点优选等同于可以在II型MHC结合沟所提供的其中一个口袋中结合的氨基酸残基。最优选地是改变肽在所谓的肽P1或P1锚定位置处与裂缝的第一个口袋的结合。在肽的P1锚定残基和II型MHC结合沟的第一个口袋之间的结合相互作用质量被公认为是完整肽的总结合亲和力的主要决定因素。在肽的该位置中的适当替代可为替代为较不易于容纳于口袋中的残基，如替代为更亲水的残基。肽中对应于与MHC结合裂缝其他口袋区域结合的位置的氨基酸残基也可以加以考虑并且属于本发明的范围内。
正如本发明技术人员所清楚的，进行多重复合替代可达到去除不想要的表位的目的。然而，所产生的序列被认为与本文所公布的具体组合物极为同源并因而属于本发明的范围之内。
可以理解的是在给定的潜在T细胞表位中单个氨基酸替代是最优选的消除表位的途径。在单个表位中也可以考虑进行组合替代，例如当单独限定的表位相互重叠时组合替代可能是特别适当的。此外，可以在就II型MHC结合沟而言非“口袋残基”的位置，在肽序列中任何位点处进行氨基酸替代，该氨基酸替代可以是于给定的表位中的单个替代或于单个表位中的组合替代。替代可参照同源结构或由本领域已知的计算机技术产生的结构方法进行，也可以根据本发明分子的已知结构特征进行。所有此类替代均落入本发明的范围内。
尤其可考虑与所列举肽中的替代相联合在以上限定的肽之外进行氨基酸替代。例如，可考虑进行某种改变来恢复变体分子的结构或生物学活性。这样的补偿性改变和包括从FVIII多肽中缺失或添加特殊氨基酸残基从而产生具有期望活性的变体的改变与任何已公布肽中的改变相联合均落入本发明的范围内。
就本发明来说，它还涉及已修饰的FVIII和含此已修饰FVIII蛋白质或其片段的组合物，且所涉及的组合物应认为是在本发明的范围之内。这方面的相关例子可以是开发肽介导的耐受性诱导策略，其中一个或多个已公布的肽以免疫治疗的目的施用于病人。因此，合成的肽分子，例如一个或多个表1中所列举的肽分子，是本发明已考虑过的实施方案。在另一方面，本发明涉及编码已修饰的FVIII的核酸。在又一方面，本发明涉及用已修饰的FVIII蛋白质对人进行治疗的方法。在还有一方面，本发明涉及利用含有序列与本文公布序列相同或部分相同的肽或衍生分子的药物制品进行治疗的方法。
现在将用以下实施例对本发明进行描述，但本发明并不局限于这些实施例。前文所述以及下面的实施例涉及以下附图：
图1提供了在人因子VIII中具有人II型MHC分子结合活性的一系列肽序列。肽长为13聚体，氨基酸以单字母密码表示。
图2描述了筛选肽库的方案。在本研究中肽为15聚体，且每个与后续的肽重叠12个残基。
图3提供的柱形图描述用FVIII衍生的合成肽处理后体外T细胞增殖测定法的结果。在此实施例中，用分离自血友病患者供体的FVIII T细胞系来筛选跨FVIII序列的重叠肽库。箭头指示诱发T细胞增殖并随后被解码的肽库。
图4提供的柱形图描述用FVIII衍生的合成肽处理后体外T细胞增殖测定法的结果。在此实施例中，使用分离自血友病患者供体的FVIII特异性T细胞系解码诱发T细胞增殖的两个肽库。含T细胞表位的肽用箭头指示。
图5提供的柱形图描述用FVIII衍生的合成肽处理后得到的体外T细胞增殖测定法结果。在此实施例中，用分离自两个供体的细胞来筛选跨越FVIII序列的肽。1#供体(A)和2#供体(B)具有相同的HLA-DR同种异型(DRB1*03、DRB1*04、DR3和DR4*01)。箭头指示含T细胞表位的肽。
图6提供了显示肽8(P8)突变体的活性数据和蛋白质表达水平的图：阳性对照是野生型因子VIII。M1013K描述了含M1013K替代的FVIII分子的表达和活性数据。其它柱子代表了同时含有M1013K替代以及I1011位变换成所显示氨基酸的改变的FVIII分子。
图7提供了显示肽7(P7)突变体的活性数据和蛋白质表达水平的图：阳性对照是野生型因子VIII，阴性对照是转染中未加入DNA。其它的样品是具有所指示氨基酸改变的V823突变体。
图8提供了示例性T细胞测定数据，数据给出在野生型序列肽显示刺激指数＞2.0的条件下具有刺激指数＜2.0的肽突变体。肽序列及PBMC供体同种异型数据已制成表格。
图9显示了用软件模拟肽与II型MHC分子结合所获的代表性结果。所示结果针对18种不同的HLA-DR同种异型，每个直立柱表示对单一同种异型的结合。A图显示在肽7周围针对野生型FVIII序列检测所得的结合图。肽7序列被加深标出。B图显示对含替代V823A的已修饰肽7序列进行检测得到的结合图，证实其丢失了针对多种同种异型的高亲和力配体。在每一图中通过标明每个13肽II型MHC配体的第一个残基来描述预期的MHC结合。以所示的各配体对各同种异型分子的计算结合分值为基础，用H、M或L表示结合强度。先前的物理结合研究已显示数值小于500000为可忽略的结合相互作用。
图10显示了野生型(WT)B结构域缺失的人FVIII序列的氨基酸序列及其编号。用单字母密码表示氨基酸。
实施例1
建立T细胞系和克隆的方法
从血友病患者血液中分离外周血单核细胞(PBMC)并低温保存于液氮中。血样的提供得到完全的知情同意并在当地Addenbrooke’s HealthCare Trust的批准下进行加工。通过用FVIII刺激大量培养中的抗原特异性T细胞，随后进行几个循环的IL-2诱导的扩增来建立T细胞系。最初在24孔板中将PBMC以2×106的密度保温(37℃、含5％CO2的潮湿空气中)于2ml含4μg/ml FVVIII(RefactoTM)的AIM V培养基中。保温7天后加入100U/ml的IL-2，继续培养3天。10天的抗原/IL-2刺激完成后收集T母细胞(T blast)并计数。为了保持抗原特异性，用经γ辐射的自体PBMC作为抗原呈递细胞对T母细胞进行第二轮抗原刺激。这一步的完成方法为：在用4000拉德γ射线进行辐射前将24孔板中的1×106个/孔的自体PBMC与4μg/ml FVIII在0.75ml AIMV(含5％的热失活人AB血清)中孵育1小时。将0.25ml AIM V中的自体T母细胞以4×105个细胞/ml的浓度加入经γ辐射的抗原呈递细胞(预负载FVIII)中并孵育3天。通过用100U/ml IL-2刺激细胞3天扩增T母细胞，然后每隔3天向培养物提供新鲜的IL-2(终浓度100U/ml)共9天。为了保证所有的扩增T母细胞都是抗原特异的，进行第三轮抗原刺激，其中T母细胞被收集并以4×105个细胞/ml的浓度重悬于AIMV培养基中。如前文所述通过将24孔板中的1×106个γ辐射的自体PBMC与4μg/ml FVIII在0.75ml AIMV(含5％的热失活人AB血清)中孵育1小时来产生抗原呈递细胞。将0.25ml AIM V中的自体T母细胞以4×105个细胞/ml的浓度加入经γ辐射的抗原呈递细胞中并孵育3天。最终在10U/ml的IL-2中扩增3天，然后收集T母细胞并用于筛选肽库。
从大量培养物克隆
在用FVIII抗原进行第三轮刺激后，收集T母细胞并通过系列稀释将其重悬至密度4×102-1×104个细胞/ml(2x培养物终密度)。融化自体PBMC并以2×106个细胞/ml(2x培养物终密度)的密度重悬于聚丙烯管中。然后将PBMC暴露于4000拉德γ射线辐射并用作抗原呈递细胞，通过限制稀释选择呈抗原反应性的T细胞克隆。将经γ射线辐射的抗原呈递细胞(1×106终浓度)与T母细胞(2×102-5×103终浓度)、1-10μg/ml FVIII抗原和100U/ml IL-2混合。通过在Terasaki平板中每孔加入20μl APC、T母细胞、FVIII和IL-2混合物而建立T细胞克隆。用一个Terasaki平板上2-50个T母细胞/孔的稀释度进行有限稀释克隆。
T细胞克隆的筛选和维持
T母细胞与FVIII抗原、IL-2和经γ射线辐射的自体抗原呈递细胞一起孵育约14天。鉴定所含细胞呈现明确生长的孔后，将T母细胞转移至含1×105经γ辐射的同种异体PBMC、100U/ml IL-2和1μg/ml植物凝集素(PHA)的圆底96孔板的单个孔中，终体积为200μl AIMV(含1％的热失活人AB血清)。在细胞汇合后将T细胞克隆传代，最后转移至含1×106经γ辐射的同种异体PBMC(饲养细胞)、100U/ml IL-2和1μg/ml植物凝集素(PHA)的24孔板的单个孔中，终体积为2ml AIMV(含1％的热失活人AB血清)。T细胞克隆的常规维持包括每隔2-3周(取决于细胞生长状态)用新鲜的PHA和同种异体饲养细胞刺激一次，以及用100U/mlIL-2每周刺激2次。只有被证实为FVIII特异性的T细胞克隆才被扩增并用于筛选FVIII肽。
自体B细胞的EBV转化
通过在4×106个PBMC中加入3ml已过滤(0.45μ)的B95.8上清并在37℃保温1小时，将来自PBMC制品的B细胞无限增殖化以产生B类淋巴母细胞系(BLCL)。沉淀PBMC并重悬于含5％热失活胎牛血清(FCS)和1μg/ml环孢菌素A的2ml RPMI中。保温7天后，用含5％FCS和2μg/ml环孢菌素A(达到终浓度为1μg/ml环孢菌素A)的新鲜RPMI置换1ml培养基。在第14和21天重复此饲喂方案，此后如需要用含5％FCS的RPMI进行细胞传代并扩大至组织培养瓶。
用T细胞系/克隆筛选FVIII肽
合成长度为15个残基且通过增加12个氨基酸而与先前的肽重叠的肽(Pepscan，荷兰)。为了保存，最初将肽以10mM的浓度溶于100％的二甲亚砜(DMSO)。建立肽库以便同时针对FVIII特异性T细胞系筛选大量肽。组织肽库以便每个库都与随后的库包含重叠肽，通过使用此方法，与两种肽重叠的T细胞表位将诱导两个不同库的增殖。通常每个库由8种肽组成，以1或5μM的浓度测试每种肽。肽库策略如图2所述。
自体PBMC(对于T细胞系来说)或EBV转化的BLCL(对于T细胞克隆来说)被用作抗原呈递细胞，将1×105个PBMC或BLCL悬浮于50μL AIMV培养基中并随后加入96孔圆底板的各个孔中。对于每个库来说分别以两个浓度(1或5μM)将肽库加入三个平行孔中。在暴露于4000拉德γ射线辐射之前将抗原呈递细胞和肽库于37℃孵育1小时。当用作T细胞克隆的抗原呈递细胞(代替已γ辐射的自体PBMC)时，BLCL在37℃用1μg/ml丝裂霉素C预处理1小时，随后在AIMV中洗4次。然后将抗原特异性T细胞系或T细胞克隆以5×104个细胞/孔的浓度加入并培养3天。第三天在每个孔中加入1μCi[3H]-胸腺嘧啶核苷至少脉冲8小时。在滤垫上收获平板后用Wallac小平板β计数器测定cpm/孔。图3显示了用T细胞系产生的表位图谱，其中T母细胞被用于鉴定含T细胞表位的肽库，随后将这些库解码以鉴别含T细胞表位的单个肽。
用来自健康供体的PBMC绘制幼稚T细胞表位图谱
用来自40名健康HLA-DR类型供体的血液分离PBMC，将此PBMC用于在两个浓度(1和5μM)筛选各FVIII肽。由于来自每个供体的PBMC数目不足以筛选所有的FVIII肽，供体被分成两组，其中前20个供体用于筛选跨越前半段分子的肽，第二组供体用于筛选剩余的肽。为了覆盖呈现于世界人群中的多种同种异型，按所表达的II型MHC同种异型来选择供体。检测MHC同种异型。
用购买到的试剂体系(Dynal，Wirral，英国)来检测所有PBMC样品的组织类型。按供应商推荐的方案用标准的辅助试剂及琼脂糖电泳体系来进行检测。
PBMC包含生理性数量的幼稚T细胞和抗原呈递细胞。这些细胞以2×105个细胞/孔(96孔平底板)的密度用于筛选三份平行200μL培养物中1μM和5μM的肽。将细胞与肽在37℃保温6天，然后在每个孔中加入1μCi[3H]-胸腺嘧啶核苷至少脉冲8小时。收获培养物于滤垫上后用Wallac小平板β计数器测定cpm/孔。图5显示了用两组供体分别筛选分子两半部分所产生的FVIII表位图谱。
实施例2
克隆和表达因子VIII的方法
mRNA提取和cDNA合成：
从医院病理学系获取人的肝组织。将样品切成方块并分成50mg的等分试样，保存于液氮中。将一份50mg试样匀浆并直接用PolyA TractSystem1000试剂盒(Promega)按制造商说明书提取mRNA，得到约10μg mRNA。用ImProm-II逆转录系统(Promega)以寡(dT)15为引物按制造商的说明书将1μg等分试样的mRNA在20μL反应体系中进行逆转录。然后在70℃加热15分钟灭活逆转录酶。
因子VIII序列的聚合酶链式反应扩增
由于待克隆的是B结构域缺失的因子VIII变体，所以此cDNA以两半段的方式扩增。用以下引物扩增5’端的mRNA：
SEQ ID NO.1    GCATCGCGCGCTAGCAATAAGTCATGCAAATAGAG
SEQ ID NO.2    GAAGCTCCTAGGTTCAATGGCATTGTTTTTACTCA
SEQ ID NO.1包含为方便克隆的两个限制性酶切位点加上因子VIIImRNA序列ATG起始密码子(粗体)周围的24个核苷酸。SEQ ID NO.2与因子VIII mRNA的第2420-2454位核苷酸互补并在第2445和2448位(粗体)包含两个改变的核苷酸，这样就引入了一个新的限制性酶切位点同时使蛋白质序列未受影响。
用以下引物对扩增因子VIII基因的3’端：
SEQ ID NO.3：
TGAGTCTTAAGCTAGCTAGATACCTAGGAGCTTCTCCCAAAACCCACCAGTCTTGAAACGCC
SEQ ID NO.4：
TACGTCTCGAGTCAGTAGAGGTCCTGTGCCTCGCA
SEQ ID NO.3包含限制性酶切位点NheI以便克隆，并包含与第5140-5164位核苷酸融合的因子VIII mRNA的第2442-2457位核苷酸。此引物因此建立了重链和轻链之间的联结，在此几乎整个B结构域缺失。此引物还含有在第2445和2448位点(粗体显示)处的核苷酸改变，这样就建立了也能在SEQ ID NO.2中找到的新限制性酶切位点。SEQ ID NO.4包含因子VIII编码序列的最后24个核苷酸加上一个方便克隆的限制性酶切位点。
用Expand HiFi聚合酶(Roche)及供应的含MgCl2的缓冲液进行PCR反应，终体积50μL。反应体系是1x缓冲液中含dNTP各200μM、引物各50pmol(或者是seq ID No.1加No.2，或者是seq ID No.3加No.4)、2.5个单位的RNaseH和5μL逆转录酶的反应混合物。为了提高PCR反应的效率将反应在37℃保温30分钟使RNA/cDNA杂交体中的RNA被RNaseH所降解。然后将反应在94℃加热2分钟预变性，随后的循环使用以下的温度和时间：94℃30秒，55℃30秒，72℃2.5分钟。在第一个退火步骤期间加入推荐量的聚合酶，反应进行20个循环。在第20个延伸步骤后的退火步骤中加入第二等份聚合酶并再进行20个循环的反应。然后将反应在72℃保温10分钟以保证所有的链完全聚合。
因子VIII基因的克隆和组装
用1％的琼脂糖凝胶分离PCR反应产物的一半，切下相应于因子VIIIcDNA 5’端的2286bp带和相应于3’端的2015bp带并通过Qiagen凝胶提取试剂盒将这两条带从琼脂糖中纯化出来。然后按制造商的说明将PCR产物连入PCR产物克隆载体(pGEM-T Easy Vector System，Promega)。按供应商所推荐的用0.1cm间距的电击杯将连接反应液各1μL电穿孔转化入20μL电感受态大肠杆菌菌株XL1-Blue(Stratagene)中。还按供应商所推荐的方法重悬细胞并使其复苏。将10μL和100μL等份的电穿孔细胞铺于含100μg/ml氨苄青霉素、80μg/ml Xgal和0.5mM IPTG的LB琼脂板上并在37℃培养过夜。
挑选白色菌落并分散于20μL水中。用供应的缓冲液和Taq聚合酶(Roche)以20μL的反应体积通过PCR分析来自各重悬菌落的样品。反应体系为在1x缓冲液中包含dNTP各200μM、标准M13正向和反向引物(本文的SEQ ID Nos5和6)各50pmol和1μL的重悬菌落。然后将反应在94℃加热2分钟预变性，随后的20个循环使用以下的温度和时间：94℃30秒，60℃30秒，72℃2分钟。然后将反应在72℃保温10分钟以保证所有的链完全聚合。
取各反应样品5μL于1％的琼脂糖凝胶上分离。含有约2300bp大小条带的样品被认为对于因子VIII 5’半侧的插入片段来说是阳性的，而含有约2150bp条带的样品被认为对于因子VIII 3’半侧的插入片段来说是阳性的。对于各插入片段，将8个菌落分别接种于含100μg/ml氨苄青霉素的5ml2YT肉汤液体培养基中并在37℃振荡培养过夜。用Qiagen小量提取试剂盒从1.5ml各培养物中制备质粒并将质粒送到合同测序机构进行序列测定，所用引物如下：
    5’半侧的克隆
    SEQ ID No.5  CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC                      (M13正向)
    SEQ ID No.6  AGCGGATAACAATTTCACACAGGA                      (M13反向)
    SEQ ID No.7  ATGATCAGACCAGTCAAAGG        (因子VIII mRNA nt573-592)
    SEQ ID No.8  CAGGAAATCAGTCTATTGGC        (因子VIII mRNA nt975-994)
    SEQ ID No.9  TGGGTACATTACATTGCTGC        (因子VIII mRNA nt1372-1391)
    SEQ ID No.10 ACAGTGACTGTAGAAGATGG        (因子VIII mRNA nt1768-1787)
    SEQ ID No.11 GTCTTCTTCTCTGGATATACC       (因子VIII mRNA nt2179-2199)
    3’半侧的克隆
    SEQ ID No.5  CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC                      (M13正向)
    SEQ ID No.6  AGCGGATAACAATTTCACACAGGA                      (M13反向)
    SEQ ID No.12 GAGTAGCTCCCCACATGTTC        (因子VIII mRNA nt5370-5361)
    SEQ ID No.13 GTGCACTCAGGCCTGATTGG        (因子VIII mRNA nt5786-5767)
    SEQ ID No.14 AGGTGTTTTTGAGACAGTGG        (因子VIII mRNA nt6187-6168)
    SEQ ID No.15 GAGGAAATTCCACTGGAACC        (因子VIII mRNA nt6594-6575)
    SEQ ID No.16 AATCTCTGCTTACCAGCATG        (因子VIII mRNA nt6993-6974)
已发现质粒pCF85编码因子VIII基因5’半侧的正确氨基酸序列。质粒pCF83则被发现编码因子VIII基因3’半侧的正确氨基酸序列。
用Bst98I和XhoI消化pCF83并通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得到的含因子VIII基因3’半侧的2.0Kbp片段，用标准技术将其克隆入同样酶切和纯化的pLitmus(NEB)中。如上所述通过PCR鉴别阳性菌落并选择一个克隆-pCLF83进行培养和DNA制备。
用BssHII消化pCF85并在dNTP各100μM存在的条件下用T4 DNA聚合酶将末端补平。然后将反应在70℃加热10分钟并随之以AvrII消化。通过琼脂糖凝胶电泳纯化酶切释放的2.3kbp片段，将其克隆入已用Bst98I消化并如上补平及用AvrII消化并进行凝胶纯化的pCLF83中。如上所述用引物Seq ID No.11和Seq ID No.17(ATCAGTAAATTCCTGGAAAAC[因子VIII mRNA第5448-5428位核苷酸])通过PCR筛选鉴别阳性菌落。这对引物扩增了跨越因子VIII基因两半间连接区的片段，因此只有在克隆成功的情况下才能得到约570bp的产物。选择阳性菌落并命名为pCLF8。培养此菌落，然后进行DNA制备和测序。用引物Seq ID No.6和Seq ID No.5证实了连接序列的正确。此5’和3’两半之间的连接也用引物Seq ID No.17得到了证实。
因子VIII的表达和活性分析
用已修饰的载体pCI变体(Promega，Southampton，英国)表达此FVIII蛋白。未修饰的pCI载体长4.0kbp，含用于哺乳动物表达的CMV增强子/启动子和SV40晚期聚腺苷酸化信号，还包含细菌繁殖所必需的序列。该载体还含有噬菌体F1的起点，用限制性酶BamHI和EcoO109I消化此质粒去除该起点。如上所述用T4 DNA聚合酶将消化产物补平，然后通过1％的琼脂糖凝胶分离。从凝胶中纯化3.2kbp的载体片段，自连接并如上所述转化入细菌菌株XL1-blue中。如上所述挑选菌落、培养过夜并小量制备质粒。用酶切位点出现于F1起点序列内的限制性酶NgoMIV消化已纯化的质粒样品并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。挑选抗性质粒并称之为pCIΔ。
用限制性酶NheI和XhoI消化pCIΔ并通过琼脂糖凝胶电泳纯化载体片段。用同样的酶消化pCLF8并通过琼脂糖凝胶电泳纯化含有因子VIII基因的4.4kbp片段，用标准技术将其克隆入酶切的pCIΔ中。用如上所述引物Seq ID No.11和Seq ID No.17通过PCR分析鉴别阳性菌落。
选择一阳性菌落，命名为pCIF8，将其接种入含100μg/ml氨苄青霉素的50ml 2YT肉汤培养基中37℃剧烈振荡培养过夜。用Qiagen小量制备试剂盒制备高纯度的质粒DNA。质粒DNA用分光光度法定量，稀释至0.2μg/μL并通过0.2μm孔径、1.5cm直径的滤器(Nalgene)进行无菌过滤。
HEK293细胞(ATCC CRL-1573)连续培养维持于75cm2组织培养瓶的DMEM中，此DMEM中含有Glutamax-I、丙酮酸钠和4500mg/ml葡萄糖(Invitrogen目录号31966-021)，补充有10％的热灭活胎牛血清(Perbio目录号CH30160.03)。细胞生长于37℃/5％CO2中并每48小时1/5稀释进行传代培养。HEK293细胞只微弱粘附于组织培养塑料制品上，通过洗涤培养瓶表面就使其脱离。
用Lipofectamine2000(Invitrogen)按制造商所述在聚L-赖氨酸包被的24孔组织培养皿(Beckton Dickinson)中转染HEK293细胞。用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤75cm组织培养瓶中几乎汇合的细胞，并用胰蛋白酶/EDTA溶液使其从组织培养瓶上分离下来。加入等体积的生长培养基灭活胰蛋白酶。用血球计数器进行细胞计数并将细胞悬浮液以1200rpm离心5分钟。去除上清，以4×105个细胞/ml的密度将细胞沉淀重悬于生长培养基中。在24孔组织培养皿的每孔中分配0.5ml细胞悬浮液并在37℃/5％CO2中培养过夜。转染前去除各孔中的培养基并置换成新鲜的0.5ml培养基。将0.8μg质粒pCIF8和阴性对照质粒pCIΔ分别在Optimem(Invitrogen目录号51985-026)中稀释至50μL。对于每次转染，将2μL Lipofectamine2000稀释至50μL，室温放置5分钟后与已稀释的质粒混合，随后再室温放置20分钟。进行三份平行的转染，然后在24孔板的每个孔中分别滴加100μL质粒/脂质混合物。然后将平板在37℃/5％CO2中保温。在24小时、48小时和72小时三个时间点从各转染样品中取出10μL的等分试样。将来自三个平行样品的等分试样合并得到每个样品的总体积为30μL，在进行活性分析前冻存于-80℃。
按制造商的说明书用Coatest F8：C/4试剂盒(Chromogenix)以微量滴定的形式检测上清液中的因子VIII活性。在冰上融化上清液样品，1/20和1/100稀释于检测缓冲液中并以双份平行样品进行检测。标准品是已对照因子VIII活性的国际标准(Chromogenix)定量的冻干血浆样品。按制造商说明书将一小瓶血浆重溶于1ml水中。对于血浆中因子VIII活性水平参考所附数据表，然后将血浆通过添加检测缓冲液进行100％稀释(1IU/ml)。然后按制造商提供的微量滴定检测方案中所述的步骤稀释标准品。24小时后发现来自pCIF8所转染细胞的上清中含0.16IU/ml活性，在48小时时增加到了0.74IU/ml，然后在72小时时又回落到0.5IU/ml。在用对照质粒转染的细胞上清中未观察到活性。因此因子VIII以足够测定突变体活性的量成功表达。
肽P10中氨基酸的诱变(表2)
肽10包含的4个疏水残基具有作为与II型MHC分子相互作用的主要锚定位点的潜能：F1207、I1208、I1209及M1210(按B结构域缺失的成熟序列编号)。因此这四个残基被选为突变的目标残基，以突变成不可能作为主要锚定位点的那些残基。F1207改变成：A、H、K、N、Q和R；I1208改变成：A、T、D、N；I1209改变成：A、C、D、N、P；M1210改变成：A、K、N和Q。用本领域众所周知的已建立的方法通过交迭PCR进行诱变。肽10位于因子VIII核苷酸序列中被PspOMI和SphI限制性位点所限定范围的片段内。合成用于扩增这些片段的PCR引物(下文的Seq IDNo.18和Seq ID No.19)，它们相应于紧邻此区域外侧的序列。对于F1207的诱变，合成的内部引物如下所述：
    SEQ ID No.18：  GGACACATTAGAGATTTTCA               (基因nt.3463-3482)
    SEQ ID No.19：  CAGTAATCTGTGCATCTGAT               (基因nt.3949-3930)
    SEQ ID No.20：  CTGAGAGATGTAGAGGCT                 (基因nt.3675-3658)
    SEQ ID No.21：  AGCCTCTACATCTCTCAGgccATCATCATGT              (F1207A)
    SEQ ID No.22：  AGCCTCTACATCTCTCAGcacATCATCATGT              (F1207H)
    SEQ ID No.23：  AGCCTCTACATCTCTCAGaagATCATCATGT              (F1207K)
    SEQ ID No.24：  AGCCTCTACATCTCTCAGaacATCATCATGT              (F1207N)
    SEQ ID No.25：  AGCCTCTACATCTCTCAGcagATCATCATGT              (F1207Q)
    SEQ ID No.26：  AGCCTCTACATCTCTCAGcgcATCATCATGT              (F1207R)
用Expand HiFi聚合酶(Roche)及供应的含MgCl2的缓冲液进行PCR反应，终体积50μL。5’片段的反应体系是1x缓冲液中含dNTP各200μM、引物各50pmol(Seq ID No.18加No.20)、100ng pCIF8和2.5个单位的Expand聚合酶。建立6个3’片段反应，体系为1x缓冲液中含dNTP各200μM、引物各50pmol(Seq ID No.19加Seq ID No.21、22、23、24、25或26)、100ng pCIF8和2.5个单位的Expand聚合酶。然后将反应在94℃加热2分钟预变性，随后的循环使用以下的温度和时间：94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒。反应进行20个循环，然后在72℃保温10分钟以保证所有的链完全聚合。
在1％琼脂糖凝胶上分离各PCR的一半反应产物，将226bp的5’片段和292bp的6个不同的3’片段从凝胶上切下来并用Qiagen凝胶提取试剂盒进行纯化。然后如下将5’片段与各个3’片段连接：如上所述用ExpandHiFi聚合酶进一步进行6个PCR反应，以已洗脱的5’片段2μL和6个已洗脱的3’片段各2μL作为模板，引物是Seq ID No.18和Seq ID No.19。将这些反应液各一半在1％的琼脂糖凝胶上进行分离并如上所述纯化6个486bp大小的片段。用限制性酶PspOMI和SphI在37℃消化各PCR产物过夜，总反应体积为50μL。同样在37℃消化4μg质粒pCIF8 2小时，并将质粒和PCR片段消化产物的一半进行1％琼脂糖凝胶电泳。从凝胶中切下7.2kbp的载体带和391bp的PCR片段并如上所述进行纯化，纯化产物分别溶于水中，终体积为30μL。在标准10μL连接反应体系中用T4DNA连接酶和所供应的缓冲液(Invitrogen)将1μL载体与6种片段各3μL连接。反应液在室温放置4小时。按供应商所推荐的用0.1cm间距的电击杯将连接反应液各1μL电穿孔转化入20μL电感受态大肠杆菌菌株XL1-Blue(Stratagene)中。还按供应商所推荐的方法重悬细胞并使其复苏。将10μL和100μL等份的电穿孔细胞铺于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上并在37℃培养过夜。
从各连接产物所铺的板上挑选4个菌落并在含100μg/ml氨苄青霉素的5ml 2YT液体培养基中37℃剧烈振荡培养过夜。用Qiagen Mini-Prep试剂盒从各1.5ml培养物中制备质粒DNA。用引物Seq ID No.18对各质粒样品进行DNA测序。从4个一组中挑选序列正确的一个质粒保存以备通过转染进行活性和表达水平的分析。
在此相同的一般步骤后对I1208、I1209和M1210进行突变。用于各氨基酸的引物如下：
    I1208：
    SEQ ID No.18：  GGACACATTAGAGATTITCA               (基因nt.3463-3482)
    SEQ ID No.19：  CAGTAATCTGTGCATCTGAT               (基因nt.3949-3930)
    SEQ ID No.20：  CTGAGAGATGTAGAGGCT                 (基因nt.3675-3658)
    SEQ ID No.27：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTgccATCATGT              (I1208A)
    SEQ ID No.28：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTaccATCATGT              (I1208T)
    SEQ ID No.29：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTgacATCATGT              (I1208D)
    SEQ ID No.30：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTaacATCATGT              (I1208N)
    I1209：
    SEQ ID No.18：  GGACACATTAGAGATTTTCA               (基因nt.3463-3482)
    SEQ ID No.19：  CAGTAATCTGTGCATCTGAT               (基因nt.3949-3930)
    SEQ ID No.20：  CTGAGAGATGTAGAGGCT                 (基因nt.3675-3658)
    SEQ ID No.31：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCgccATGTATA           (I1209A)
    SEQ ID No.32：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCtgcATGTATA           (I1209C)
    SEQ ID No.33：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCgacATGTATA           (I1209D)
    SEQ ID No.34：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCaacATGTATA           (I1209N)
    SEQ ID No.35：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCcccATGTATA           (I1209P)
    M1210：
    SEQ ID No.18：  GGACACATTAGAGATTTTCA               (基因nt.3463-3482)
    SEQ ID No.19：  CAGTAATCTGTGCATCTGAT               (基因nt.3949-3930)
    SEQ ID No.20：  CTGAGAGATGTAGAGGCT                 (基因nt.3675-3658)
    SEQ ID No.36：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCgccTATAGTC        (M1210A)
    SEQ ID No.37：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCaagTATAGTC        (M1210K)
    SEQ ID No.38：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCaacTATAGTC        (M1210N)
    SEQ ID No.39：  AGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCcagTATAGTC        (M1210Q)
如上所述，在24孔聚-L-赖氨酸平板中将已通过序列分析证实的各突变克隆一式两份转染入HEK293细胞中。转染在37℃/5％CO2中进行48小时。合并各转染的平行试样上清并如上所述检测因子VIII的活性。还用配对的抗因子VIII抗体ELISA试剂盒(Affinity Biologicals)检测上清中的因子VIII表达水平。修改此检测法使其有效地对组织培养上清物质进行定量，步骤如下：将捕捉抗体以1/100稀释于pH9.6的碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液中，按100μl/孔加入Dynex Immulon4 96孔ELISA平板中。此平板在4℃放置过夜。用洗涤缓冲液(含0.1％Tween20的Tris缓冲盐水[TBS：25mMTris，137mM NaCl，3mM KCl，在25℃pH7.4])将孔洗4次，100μl/次，将双份100μl等分试样的平行稀释标准品和组织培养上清加入各个孔中。标准品是已对照因子VIII活性的国际标准(Chromogenix)定量的冻干血浆样品。按制造商说明书将一小瓶血浆重溶于1ml水中。参考所附数据表显示的血浆中因子VIII活性水平，然后添加样品稀释缓冲液(含1％w/v的牛血清白蛋白)进行100％稀释(1IU/ml)。然后用样品稀释缓冲液将其1/4稀释得到100％的ELISA标准。然后再用样品稀释缓冲液对其进行进一步的稀释得到代表75％、50％、25％和5％的标准。用样品稀释缓冲液1/4稀释组织培养上清。平板在室温放置2小时后用洗涤缓冲液漂洗4次，100μl/孔。在每个孔中加入100μl已缀合辣根过氧化物酶的抗体并室温放置1小时。如前文所述漂洗平板，然后在每个孔中加入100μl底物(现配的TMB/过氧化物溶液：Sigma目录号T0440)。将平板室温放置15分钟后加入终止液(2M硫酸)。在Anthos HTII平板阅读器上用450nm波长的滤片对平板进行读数。
活性值及表达水平的比较显示了所有对F1207的改变都导致了无表达从而无活性。I1208突变成A产生与未修饰的因子VIII相似的表达和活性，而突变成T和N则导致25％和50％的活性损失。对于I1209来说，只有突变成C才使突变体的表达和活性与未修饰的因子VIII相似。所有对于M1210的改变都导致了具明显活性的蛋白质表达，其中具K和N的蛋白与未修饰的因子VIII无差别。因此，I1208A、I1209C、M1210K和M1210N是用于去除肽10内T细胞表位的有用突变。
肽8中氨基酸的诱变(表2)
肽8包含两个有可能作为结合II型MHC分子的主要锚定位点的氨基酸：I1011和M1013(按B结构域缺失的成熟序列进行编号)。因此这两个残基也是突变的靶残基，突变成除了可能是主要锚定位点的残基之外的残基。与其它物种(狗、小鼠和大鼠)的因子VIII序列比较的结果显示，在狗的因子VIII中，M1013是K。K也被证实对于肽10的M1210诱变来说它是最好的置换残基。因此只将M1013突变成K，并与在I1011处不可能形成主要锚定位点的所有氨基酸(即A、C、D、E、K、N、P、Q、R、S、T)相结合。
用本领域技术人员众所周知的已建立的方法通过交迭PCR进行诱变。肽8位于因子VIII核苷酸序列中被PflM1和PspOMI限制性位点所限定范围的片段内。合成用于扩增此片段的PCR引物(下文的Seq ID No.40和SeqID No.41)，它们相应于紧邻此区域外侧的序列。对于M1013K和I1011X的诱变，合成的内部引物如下所述：
SEQ ID No.40：    ATGAGACCAAAAGCTGGT                  (基因nt.3026-3043)
SEQ ID No.41：    AGGCATTGATTGATCCG                   (基因nt.3559-3543)
SEQ ID No.42：    ATTGCAGGGAGCCCTGCAGT                (基因nt.3087-3068)
SEQ ID No.43：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGaagGAAGA            (M1013K)
SEQ ID No.44：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgccCAGaagGAAGA    (I1011A，M1013K)
SEQ ID No.45：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATtgcCAGaagGAAGA    (I1011C，M1013K)
SEQ ID No.46：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgacCAGaagGAAGA    (I1011D，M1013K)
SEQ ID No.47：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATgagCAGaagGAAGA    (I1011E，M1013K)
SEQ ID No.48：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATggcCAGaagGAAGA    (I1011G，M1013K)
SEQ ID No.49：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcacCAGaagGAAGA    (I1011H，M1013K)
SEQ ID No.50：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaagCAGaagGAAGA    (11011K，M1013K)
SEQ ID No.51：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaacCAGaagGAAGA    (I1011N，M1013K)
SEQ ID No.52：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcccCAGaagGAAGA    (I1011P，M1013K)
SEQ ID No.53：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcagCAGaagGAAGA    (I1011Q，M1013K)
SEQ ID No.54：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATcgcCAGaagGAAGA    (I1011R，M1013K)
SEQ ID No.55：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATagcCAGaagGAAGA    (I1011S，M1013K)
SEQ ID No.56：    ACTGCAGGGCTCCCTGCAATaccCAGaagGAAGA    (I1011T，M1013K)
用与上述肽10诱变相同的常规步骤进行诱变，不同处在于5’片段长度为62bp及3’片段长为492bp。此连接片段长为534bp，用PspOMI和PflMI消化后克隆入同样酶切消化的pCIF8。
对于各个突变来说选择一个序列正确的克隆并如上所述分析它们的活性和表达水平，但不同之处在于转染以三份平行形式进行，且各上清单独分析以便评估表达/活性中的变化。
对以上突变体的表达水平和活性的比较结果显示单独的M1013K突变与未修饰的因子VIII非常相似。此外，含M1013K加上I1011A、E、P、S或T的联合突变体也与未修饰的因子VIII无差别。因此这些突变可用于去除与肽8相关的T细胞表位。
肽P7中氨基酸的诱变(表2)
肽7包含一个有可能作为结合II型MHC分子的主要锚定位点的氨基酸：V823(按B结构域缺失的成熟序列进行编号)。因此这个残基也是突变的靶残基，突变为不可能是主要锚定位点的残基(即A、C、D、E、K、N、P、Q、R、S、T)。
如前文所述用已建立的方法通过交迭PCR进行诱变。肽7位于因子VIII核苷酸序列中被AvrII和PflM1限制酶位点所限定范围的766bp片段内。合成用于此片段扩增的PCR引物(下文的Seq ID No.57和Seq ID No.58)，它们相应于紧邻此区域外侧的序列。对于V823X的诱变，合成的内部引物如下所述：
    SEQ ID No.57：    CGAGGACAGTTATGAAG                 (基因nt.2214-2230)
    SEQ ID No.58：    AGTGGGATCTTCCATCTG                (基因nt.3108-3091)
    SEQ ID No.59：    ATGTGGGGAGCTACTCATCCC             (基因nt.2523-2503)
    SEQ ID No.60：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATgccCTAAGAAACAG          (V823A)
    SEQ ID No.61：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATtgcCTAAGAAACAG          (V823C)
    SEQ ID No.62：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATgacCTAAGAAACAG          (V823D)
    SEQ ID No.63：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATgagCTAAGAAACAG          (V823E)
    SEQ ID No.64：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATgggCTAAGAAACAG          (V823G)
    SEQ ID No.65：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATcacCTAAGAAACAG          (V823H)
    SEQ ID No 66：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATaagCTAAGAAACAG          (V823K)
    SEQ ID No.67：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATaacCTAAGAAACAG          (V823N)
    SEQ ID No.68：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATcccCTAAGAAACAG          (V823P)
    SEQ ID No.69：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATcagCTAAGAAACAG          (V823Q)
    SEQ ID No 70：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATcgcCTAAGAAACAG          (V823R)
    SEQ ID No.71：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATagcCTAAGAAACAG          (V823S)
    SEQ ID No.72：    GGGATGAGTAGCTCCCCACATaccCTAAGAAACAG          (V823T)
用与肽10诱变相同的常规步骤(见上文)进行诱变，不同处在于5’片段长度为310bp及3’片段长为606bp。此连接片段长为894bp，用AvrII和PflMI消化后克隆入同样酶切消化的pCIF8。
对于各个突变来说选择一个序列正确的克隆并如上所述分析它们的活性和表达水平，转染以双份平行形式进行并在检测前合并上清。
对以上突变体的表达水平和活性比较的结果显示多种改变都基本上未影响表达水平和活性。这些数据见图7。V823改变成A、D、E、G、H、N、P、S或T所产生的突变体具有至少与野生型因子VIII相同的表达和活性。因此这些突变可用于去除与肽7相关的T细胞表位。
实施例3
合成含有突变的FVIII来源肽并用离体试验检测它们所保持的促进T细胞增殖的能力。所说的肽是15聚体的序列，且是为检测I1011A或I1011T与M1013K联合替代而设计的。用原先显示对野生型肽序列有响应的4个PBMC供体样品测试所说的肽。在所有的案例中所检测的突变肽都不能以SI＞2.0刺激增殖。包括供体同种异型详情和肽序列在内的此试验结果如图8所示。
在96孔平底板中以2×106个PBMC/孔的密度用蛋白质和肽抗原刺激PBMC。在加入3H-胸苷前将PBMC在37℃孵育7天。产生了具有所述替代的肽，并相对于分离自原先已显示对FVIII P8肽序列有响应的4个健康供体的PBMC，对各个肽进行分别筛选。在各供体试验中使用了来自流感血凝素的对照肽和有效的非回忆型抗原匙孔血蓝蛋白(KLH)。
将肽溶于DMSO中至终浓度10mM，然后将这些贮液以1/500稀释于AIMV培养基中(终浓度20μM)。将肽加入平底96孔板中，于100μl中达终浓度2μM和20μM。用台盼蓝染料排除法估计已融化的PBMC的存活力，然后以2×106个细胞/ml的密度重悬细胞，分别将100μl(2×105个PBMC/孔)转移入含有肽的各个孔中。对于每一种肽浓度检测三份平行孔培养物。平板在潮湿的5％CO2空气中37℃孵育7天。在收获至滤垫上之前用1μCi 3H-Thy/孔脉冲细胞18-21个小时。用Wallac小平板β顶平板计数器(Perkin Elmer)测定CPM值。结果表示为刺激指数，通过用测试肽的CPM值除以未处理孔中的CPM值而计算得到。刺激指数大于2被认为是阳性增殖。

Claims (16)

1.与未修饰的人因子VIII相比包含特异改变的氨基酸残基、在体内使用时基本上无免疫原性或免疫原性较未修饰亲本分子低且具有基本上相同的生物学特异性和活性的经修饰人因子VIII分子，其中所述已改变的氨基酸残基引起一个或多个在亲本未修饰分子中担当II型MHC结合配体并刺激T细胞的T细胞表位的减少或消除。
2.依照权利要求1的经修饰因子VIII分子，其中所述改变是在表1所描述的亲本分子中存在的一个或多个连续氨基酸残基序列内的一个或多个位置进行的。
3.依照权利要求2的经修饰因子VIII分子，其中所述改变是在表2所描述的亲本分子中存在的一个或多个连续氨基酸残基序列内的一个或多个位置进行的。
4.依照权利要求1-3之任一项的经修饰因子VIII分子，其中所述改变是1-9个氨基酸残基的替代。
5.依照权利要求4的经修饰因子VIII分子，其中表1所描述的序列中的下列位置的一个、多个或所有氨基酸残基已经被替代：
197、198、199、201、202、407、411、412、419、515、517、613、617、636、637、638、639、823、1011、1013、1208、1209、1210、1254、1255、1257、1262、1264、1268、1119、1120、1121、1122、1123。
6.依照权利要求3的经修饰因子VIII分子，其中在表2的肽P10中进行了下列氨基酸残基替代的一个、多个或所有：
I1208A、I1208T、I1208N；
I1209C；
M1210K、M1210N。
7.依照权利要求3的经修饰因子VIII分子，其中在表2的肽P8中进行了下列氨基酸残基替代的一个、多个或所有：
M1013K；
I1011A、I1011C、I1011D、I1011E、I1011G、I1011H、I1011K、I1011P、I1011Q、I1011R、I1011S、I1011T。
8.依照权利要求3的经修饰因子VIII分子，其中在表2的肽P7中进行了下列氨基酸残基替代的一个、多个或所有：
V823A、V823D、V823E、V823G、V823H、V823N、V823P、V823S、V823T。
9.依照权利要求1-8之任一项的经修饰因子VIII分子，其中当作为完整蛋白质在人T细胞的经诱导细胞增殖生物学测定中被测试时其展示的刺激指数(SI)小于使用来自相同供体的细胞平行测试的亲本分子且小于2，其中所述指数为用蛋白质刺激后评价的细胞增殖值除以未接受蛋白质的对照细胞中评价的细胞增殖值，并且其中细胞增殖是通过任何适宜方法测量的。
10.编码权利要求1-9之任一项所定义的因子VIII分子的DNA序列。
11.包含上述权利要求之任一项的经修饰因子VIII分子的药物组合物，其任选还包含药学可接受载体、稀释剂或赋形剂。
12.由表1选择的、由未修饰人因子VIII的一级序列生成且具有潜在II型MHC结合活性的肽分子，其中所述肽分子在细胞增殖生物学测定中具有大于1.8的刺激指数，其中所述指数为用肽刺激后评价的细胞增殖值除以未接受肽的对照细胞中评价的细胞增殖值，并且其中细胞增殖是通过任何适宜方法测量的。
13.通过氨基酸替代由权利要求12的肽分子衍生的经修饰肽分子，其缺少或具有降低的潜在II型MHC结合活性，表现为刺激指数低于2，其中所述指数为用肽刺激后评价的细胞增殖值除以未接受肽的对照细胞中评价的细胞增殖值，并且其中细胞增殖是通过任何适宜方法测量的。
14.编码权利要求12或13的肽的DNA序列。
15.依照权利要求13的肽在制造权利要求1所定义的经修饰因子VIII分子中的用途。
16.依照权利要求12的肽在制造用于降低因子VIII在患者体内的免疫原性的疫苗中的用途。
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