CN1529714A - 免疫原性减弱的经修饰α干扰素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及尤其是用于对人施用的、特别是用于治疗的多肽。所述的多肽是经修饰的多肽，其中，所述的修饰使得上述多肽在施用于人体时引起免疫应答的倾向减弱。本发明特别涉及对人α干扰素，且特别是α2干扰素(IFNα2)的修饰，所述修饰导致产生的蛋白质在体内应用时基本无免疫原性或免疫原性低于任何未修饰的对应物。

Description

免疫原性减弱的经修饰α干扰素
发明领域
本发明涉及尤其是用于对人施用的、特别是用于治疗的多肽。所述的多肽是经修饰的多肽，其中，所述的修饰使得上述多肽在施用于人体时引起免疫应答的倾向减弱。本发明特别涉及对人干扰素，特别是人α2干扰素(IFNα2)进行修饰以产生IFNα2蛋白变体，该变体在体内使用时基本上无免疫原性，或比未经修饰的相应蛋白的免疫原性低。本发明还涉及来自上述未经修饰蛋白的T-细胞表位肽，由此可以构建免疫原性减弱的修饰IFNα2变体。
发明背景
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗小鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45：879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.135：1530-1535]。对于单克隆抗体，已发展了多种技术以试图减弱HAMA应答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多情况下，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2：449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 68：1417-1420]。
抗体不是唯一一类作为治疗剂施用的可引起免疫应答的多肽分子。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫应答。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)5：1353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)318：1409-1413)等。
诱导免疫应答的主要因素是在蛋白中存在可经由MHC II类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。这种潜在的T-细胞表位通常定义为任何能够与MHC II类分子结合的氨基酸序列。可测定此种T-细胞表位以建立MHC结合。隐含地，＂T-细胞表位＂是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过与TCR相互作用而激活这些T-细胞以促进T-细胞应答。但是，通常都知道，可以将某些被发现可以结合MHC II类分子的肽保留在蛋白质序列中，因为此类肽在最终蛋白质所施用至的生物体内被识别为“自己”。
已知这些T-细胞表位肽中的某些可在肽、多肽或蛋白的细胞内降解过程中释放出来，随后由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递以引发T-细胞激活作用。对于MHC II类分子呈递的肽，然后这种T-细胞激活作用可，例如通过直接刺激B细胞产生抗体而引起抗体应答。
MHC II类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，也是本发明的主要集中点。但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用，因此本发明同样适用于它们。MHC II类DR分子由α和β链组成，它们的C-末端插入并穿过细胞膜。虽然结合沟可容纳最多11个氨基酸，但每一异源-二聚体具有一个能结合长度在9至20个氨基酸之间的肽的配体结合结构域。配体结合结构域由α链的1至85位氨基酸和β链的1至94位氨基酸组成。最近证实DQ分子具有同源结构，预期DP家族的蛋白质亦非常相似。人类已知存在DR同种型的约70种不同的同种异型，对于DQ已知存在30种不同的同种异型且对于DP已知存在47种不同的同种异型。每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟[Brown等人，自然(Nature)(1993)364：33；Stern等人(1994)自然(Nature)368：215]。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫应答的能力方面有最大的灵活性。在配体结合结构域内有相当多的多态性，其中在不同地理人群和种族群体中具有不同的＂家族＂。该多态性影响肽结合结构域的结合特性，因此DR分子的不同＂家族＂将对具有不同序列特性的肽存在特异性，虽然可能存在一些重叠。该特异性决定了Th-细胞表位的识别(II类T细胞应答)，其最终负责驱动对B细胞表位的抗体应答，其中所述B细胞表位存在于Th-细胞表位所来自的同一蛋白质上。这样，个体对蛋白质的免疫应答很大程度上受T细胞表位识别的影响，其随个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性而改变。因此，为了在世界人群中鉴定蛋白质或肽中的T细胞表位，就可能希望考虑到尽可能多样的HLA-DR同种异型集合的结合特性，由此覆盖尽可能高的世界人口百分率。
针对治疗性蛋白(如本发明的目的蛋白)的免疫应答通过MHC II类肽呈递途径进行。其间外来蛋白经吞噬和加工后与DR、DQ或DP型MHC II类分子结合以进行呈递。MHC II类分子由专门抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞等表达。通过MHC II类肽复合体与T细胞表面的关联性T-细胞受体的相互作用，及与某些其他共同受体，如CD4分子的交联结合可诱导T-细胞进入激活状态。上述激活作用可导致细胞因子释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞产生抗体或激活T杀伤细胞形成完整的细胞免疫应答。
肽与给定的MHC II类分子结合以备在APC表面呈递的能力依赖于多种因素，最主要的是肽的一级结构。这影响其蛋白酶剪切倾向及其在MHC II类分子的肽结合隙中的结合亲和性。在APC表面的MHC II类/肽复合体向能识别如下决定簇的特定T-细胞受体(TCR)呈递一个结合面，其中所述决定簇由肽和MHC II类分子的暴露残基共同提供。
本领域中有鉴定能结合MHC II类分子的合成肽的方法(例如WO98/52976和WO00/34317)。这种肽不是在所有情况下都行使T细胞表位的功能，特别是在体内会受加工途径和其他现象的影响。T-细胞表位鉴定是表位清除的第一步。鉴定及从蛋白中去除潜在T-细胞表位先前已有公开。本领域中已有检测T-细胞表位的方法，通常是通过计算机手段在经实验确定的T-细胞表位中扫描公认的序列基元，或利用计算机技术预测MHC II类结合肽，特别是DR-结合肽。WO98/52976和WO00/34317中公开了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threadingapproaches)。这些教导中，通过在人源或非人源治疗性抗体或非抗体蛋白的一级序列中进行明智的氨基酸替代以去除预测的T-细胞表位。
此外，利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合物(该复合物能与来自于人或受试实验动物外周血液样品中的T-细胞克隆相结合)的技术也在本领域中有所应用[Kern，F.等(1998)Nature Medicine 4：975-978；Kwok，W.W.等(2001)TRENDS in Immunology 22：583-588]，这些技术也可以用于表位鉴定策略中。
根据上述描述，由此可能期望鉴定、去除或至少减少给定的原则上具有治疗价值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-细胞表位。
这些具治疗价值的分子之一是IFNα2。该分子为激活的巨嗜细胞所表达的一种重要糖蛋白细胞因子。该蛋白质具有抗病毒活性，并在与表达细胞中的α干扰素受体结合后刺激产生至少两种酶，一种蛋白激酶和一种寡腺苷酸合成酶。成熟的IFNα2蛋白质为165个氨基酸的单一多肽，由188个氨基酸前体蛋白质通过翻译后加工从氨基末端切除23个氨基酸的信号序列而产生。已知存在几种不同亚型的人IFNα2，其一级氢基酸序列之间存在微小的差异。这样IFNα2a和IFNα2b仅在成熟的蛋白质链的23位存在一个残基的差异，IFNα2a为赖氨酸而IFNα2b为精氨酸。尽管本发明的内容指向IFNα2b，但可以看到对于所有实践的目的，可认为IFNα2a序列是可与本发明的主题IFNα2b亚型进行互换的。IFNα2(a、b)的氨基酸序列(以单字母代码表示)如下所示：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMR(R，K)ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVL
HEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSI
LAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE
该蛋白质作为广谱的抗病毒、抗增生和免疫调节剂具有显著的临床重要性。IFNα2的重组物和其他制备物已用于治疗人类的多种癌症和病毒性适应症[见综述，Sen，G.G.和Lengyel P，(1992)，生物化学杂志(J.Biol.Chem).267：5017-5020]。但是，尽管对大量的病人具有非常显著的治疗益处，已记录到在一些病人中出现对治疗的抵抗，且已证实该抵抗的一个重要机制是在治疗病人血清中产生了可检测数量的中和抗体[Quesada，J.R.等(1985)临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncology)3：1522-1528；Stein R.G.等(1988)出处同上；Russo，D.等(1996)出处同上；Brooks M.G.等(1989)Gut30：1116-1122]。尽管人体内源产生至少一级结构相同的分子，但在这些病人中仍引起了对治疗性干扰素的免疫应答。
其他人已提供了修饰的IFNα2a和应用方法[US，4,496,537；US，5,972,331；US，5,480,640；US，5,190,751；US，4,959,210]，但这些方法旨在提高IFNα2a的商业生产。这些教导并没有认识到T-细胞表位对所述蛋白免疫原性的重要性，也不能据此联想到按照本发明的方案以特异的、可控制的方式直接影响所述蛋白的性质。
但是，一直存在对具有改进的性质的IFNα2a类似物的需要。所需要的改进包括用于表达和纯化所述治疗剂的可供选择的方案和形式，以及尤其是所述蛋白生物学性质的改善。特别需要改进的是在施用于人体时在体内的特性。在这方面，非常需要提供对人体具有减弱的或没有诱导免疫应答潜力的IFNα2a。
发明概述及内容
本发明提供了经修饰的人α干扰素，且特别是α2型干扰素，此处称为＂IFNα2＂，其中，通过减少或去除大量潜在的T-细胞表位的方式对该因子的免疫学特性进行修饰。
本发明公开了在IFNα2一级序列内鉴定到的由于具有与MHC II类分子结合的可能性而是潜在T-细胞表位的序列。这一内容特别涉及具有165个氨基酸残基的人IFNα2蛋白。
本发明还公开了在基本上不影响生物学活性的前提下在所述分子的一级序列中可以根据本发明通过特定的氨基酸替代、添加或缺失进行改变的特定位点。在只有同时丧失生物学活性才能去掉免疫原性的情况下，可通过在所述蛋白的氨基酸序列中做进一步的改造以恢复所述的活性。
本发明还公开了生产这种修饰分子的方法，尤其是鉴定为减少或去除免疫原性位点而需要改变的T-细胞表位的方法。
预期本发明的蛋白在人体中的循环时间会延长，因此对慢性或复发性疾病，如IFNα2的多种适应症特别有益。本发明提供了预期可显示改进的体内特性的经修饰IFNα2蛋白质。这些经修饰的IFNα2分子可应用于药物组合物中。
总之，本发明涉及下述内容：
●一种经修饰的分子，其具有人α2干扰素(IFNα2)的生物学活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子；
●相应的分子，其中，所述的免疫原性丧失通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位(优选一个T细胞表位)而实现，和/或通过减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量而实现；
●相应的分子，其中，所述原本存在的T-细胞表位是MHC II类配体或表现出经MHC II类分子呈递后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列；
●相应的分子，其中，该配体或肽序列为13聚体(mer)或15mer的肽；
●相应的分子，其中该肽序列选自如图1中所示的肽序列；
●相应的分子，其中在任何原本存在的T细胞表位中1-9个氨基酸残基，优选地1个氨基酸残基发生了改变；
●相应的分子，其中，氨基酸残基的改变为在特定位点处向原本存在的氨基酸残基添加另外的氨基酸残基或用另外的氨基酸残基替代原本存在的氨基酸残基或将原本存在的氨基酸残基缺失，优选为替代；
●相应的分子，其中，按图2所示进行了一个或多个氨基酸残基的替代，并且还任选地如表3中所示进行了一个或多个氨基酸残基替代以减少能够结合源自所述分子的肽的MHC同种异型的数目；
●相应的分子，其中进行了额外的进一步改变，如替代、添加或缺失，以恢复所述分子的生物学活性；
●相应的修饰分子，其中氨基酸的改变参照同源蛋白质序列或参照insilico建模技术进行；
●修饰分子，该修饰分子具有人α2干扰素(IFNα2)的生物学活性且在体内应用时基本无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性的未修饰分子，所述修饰分子可以通过改变一级序列中的一个或多个氨基酸以(i)除去一个或多个T细胞表位(所述表位源自原本的未修饰分子且为MHC II类配体或表现出经MHC II类分子呈递后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列)和/或(ii)减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量而获得，其中所述修饰分子在以下源自野生型IFNα2的一级序列的连续氨基酸残基链中的一个或多个位置处包含改变：
(a)ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH(R1)，
(b)FNLFSTKDSSAAWDE(R2)，
(c)KEDSILAVRKYFQRITLY(R3)；
●相应的分子，其中所述改变为1-9个氨基酸残基的替代；
●相应的分子，其中所述替代在R1、R2、和R3链，优选地R2和R3，且更优选地R3链的一个或多个氨基酸残基处进行；
●相应的分子，其中在R1、R2和R3链的序列之外，还存在一个或多个氨基酸残基的替代；
●相应的分子，其包含的氨基酸残基替代发生在野生型分子的一个或多个位置：24、26、27、38、55、63、64、66、67、76、84、85、89、103、110、111、116、117、119、122、123、126、128、129、130、153位，优选地位一个或多个以下的位置：26、27、38、63、85、89、103、110、111、116、117、122、123、126、128、153位，更优选地103、110、111、116、117、122、123、126、128、153位；
●优选的实施方案，其中所述替代发生在选自26、27、38的一个或多个位置以及选自103、110、111、116、117、122、123、126、128、153的一个或多个位置，或备选地，选自63、85、89以及选自103、110、111、116、117、122、123、126、128、153的一个或多个位置；
●相应的分子，其中所述替代发生在图4所示的一个或多个位置；
●相应的分子，其中所述替代为L26P、F27S、F38E和/或I63T、Y85S、Y89D、Y89E、Y89N和/或V103E、L110G、M111T、M111S、M111E、I116S、I116Q、L117G、L117A、Y122E、Y122Q、F123H、I126A、L128A、L153S；
●优选的相应分子，其中所述替代为L26P、F27S、F38E和/或I63T、Y85S、Y89D、Y89E、Y89N和/或V103E、LI10G、M111T、M111S、M111E、I116S、I116Q、L117G、L117A；
●修饰分子，该修饰分子具有人α2干扰素(IFNα2)的生物学活性且在体内应用时基本无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性的未修饰分子，所述修饰分子可以通过替代一级序列中的一个或多个氨基酸以(i)除去一个或多个T细胞表位(所述表位源自原本的未修饰分子且为MHC II类配体或表现出经MHC II类分子呈递后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列)和/或(ii)减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量而获得，其中所述替代在野生型IFNα2a和IFNα2b分子中的一个或多个位置处进行，相应于选自以下的组中的至少一个：
(i)I24P、L26P、F27S、F38E、V55A，
(ii)I63T、L66A、F67D、F67E、W76H、F84D、F84E、Y85S、Y89D、Y89E、Y89N，
(iii)序列R3中的任何位置；
●相应的分子，其在序列R3内进行了一个或多个以下替代：V103E、LI10G、L110S、M111T、M111S、M111E、I116S、I116Q、L117G、L117A、V119A、Y122Q、Y122E、Y122H、F123H、I126A、L128A、Y129N、L130G、L130、L153S，优选Y122E、Y122Q、F123H、I126A、L128A，且任选地还包含导致免疫原性进一步降低的其它额外氨基酸残基改变(优选替代)；
●具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，其由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFN
LFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKX1X2QRX3TX4
YLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE，
其中X0为R、K；
X1为Y、E、Q；
X2为F、H；
X3为I、A；且
X4为L、A；
由此排除了同时X1＝Y、X2＝F、X3＝I及X4＝L的情况(该序列与野生型IFNα2对应)；
●具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，所述干扰素由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFN
LFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPX1X2KEDSX3X4AVRKX5X6QRX7T
X8YLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSX9STNLQESLRSKE，
其中X0为R、K；
X1为L、S、G，
X2为M、T、S、E，
X3为I、S、Q，
X4为L、G，
X5为Y、E、Q；
X6为F、H；
X7为I、A；
X8为L、A；及
X9为L、S
由此排除同时X1＝L、X2＝M、X3＝I、X4＝L、X5＝Y、X6＝F、X7＝I、X8＝L且X9＝L的情况；
●具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，所述干扰素由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQX1X2
NX3X4STKDSSAAX5DETLLDKX6X7TELX8QQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRI
TLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE，
其中X0为R、K；
X1为I、T；
X2为F、D、A；
X3为L、A；
X4为F、D、E；
X5为W、H；
X6为F、D、E；
X7为Y、S且
X8为Y、D、E、N；
由此排除同时X1＝I、X2＝F、X3＝L、X4＝F、X5＝W、X6＝F、X7＝Y且X8＝Y的情况；
●具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，所述干扰素由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQX1F
NLFSTKDSSAAWDETLLDKFX2TELX3QQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITL
YLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE，
其中X0为R、K；
X1为I、T；
X2为Y、S及
X3为Y、D、E、N；
由此排除同时X1＝I、X2＝Y及X3＝Y的情况；
●具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，所述干扰素由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISX1X2SCLKDRHDFGX3PQEEFGNQFQKAETIPX4LHEMIQQ
IFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRIT
LYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE，
其中X0为R、K；
X1为L、P，
X2为F、S，
X3为F、E且
X4为V、A
由此排除同时X1＝L、X2＝F、X3＝F及X4＝V的情况；应当指出，在以上公式中指出的所有排除情况意在且应该包括现有技术中已知的所有未去免疫的IFNα2形式；
●相应的经修饰的IFNα2序列，其中特别是通过如在权利要求书中指出的联合而进行额外的替代；
●相应的经修饰的IFNα2序列，其中额外的替代优选地在R1和/或R2和/或R3(其中R1、R2、R3的定义如以上所指出)部分序列的一个或多个位置进行；
●用于编码上述和下述的修饰IFNα2的DNA序列；
●药物组合物，其包含如上定义的具有IFNα2生物学活性的经修饰分子，并可任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；
●用于生产上述和下述具有IFNα2生物学活性的修饰分子的方法，所述方法包括以下步骤：(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通过任意方法，包括利用体外或in silico技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；(iii)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或in silico技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定，或通过肽-MHC复合体与T细胞的结合来确定；(iv)通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体；和(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)；
●相应的方法，其中步骤(iii)通过在任何原本存在的T-细胞表位中替代、添加或缺失1-9个氨基酸残基，或通过参照同源蛋白质序列和/或in silico建模技术来进行；
●相应的方法，其中步骤(ii)是通过下述步骤进行的：(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；(b)然后由所选择的区域中顺序抽取预定统一大小且至少由3个氨基酸残基组成的重叠氨基酸残基片段；(c)通过对存在于抽样氨基酸残基片段中的每个疏水氨基酸残基侧链赋值求和，计算每一抽样片段的MHC II类分子结合分值；和(d)根据计算出的该片段的MHC II类分子结合分值鉴定至少一个适于修饰的片段，以在基本上不减弱所述肽的治疗功效的前提下改变肽的整体MHC II类结合分值；
●相应的方法，其中步骤(c)通过下述步骤利用经改进而包含了12-6范德华配体-蛋白能量排斥项和配体构象能量项的Bhm评分函数(scoring function)进行，所述步骤为(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；(2)提供所述MHC II类分子模型的容许肽主链(allowedpeptide backbone)的第二数据库；(3)从第一数据库中筛选模型；(4)从第二数据库中筛选容许肽主链；(5)鉴定在每个抽样片段中存在的氨基酸残基侧链；(6)确定存在于每个抽样片段中的所有侧链的结合亲和性值；以及对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)到(5)；
●肽分子，其为由13个连续的氨基酸残基组成的T细胞表位，具有潜在MHC II类结合活性且从未修饰的IFNα2的一级序列产生，并选自如图1、图6a-c中所示的肽序列；
●由15个、优选地至少9个连续氨基酸残基组成的肽分子，其具有潜在MHC II类结合活性且从未修饰的IFNα2的一级序列产生，并选自R1、R2、R3部分序列中之任一个或选自图7；
●由9-15个连续氨基酸残基组成的肽分子，其具有潜在MHC II类结合活性且从未修饰的IFNα2的一级序列产生，其中所述分子在细胞增殖生物试验中的刺激指数为至少1.8，优选地为1.8-2，更优选地＞2，其中所述指数通过将肽刺激后细胞增殖的得分值除以未接受肽刺激的对照细胞的增殖得分值而获得，其中细胞增殖的测定可根据标准方法通过任何适宜手段进行，见实施例中更为详细的描述；
●相应的具有所述刺激指数数值的肽分子，其由图6或7中所示的任何序列组成；
●相应的具有所述刺激指数数值的肽分子，其包含至少9个连续氨基酸残基，其中所述连续氨基酸残基来自权利要求中定义的IFNα2部分序列R1、R2、R3中的任一个；
●相应肽分子的用途，用于制备IFNα2，该IFNα2体内应用时基本无免疫原性或免疫原性低于具有相同的生物学活性或可接受程度的降低生物学活性的任何未修饰分子；
●药物组合物，其由以下和以上及图中所示具有IFNα2的生物学活性的合成肽序列，及任选地药学可接受载体、稀释剂或赋形剂组成。
术语＂T细胞表位＂根据本发明的理解是指这样的氨基酸序列，其可以结合MHC II类分子、可刺激T细胞和/或也可在与MHC II类的复合体中结合(不必可测得地活化)T细胞。
此处及后附权利要求中所用的术语“肽”是指包含两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸之间通过肽键(定义见下)相连。肽的生物生产中涉及20种不同的天然氨基酸，任意数量的所述氨基酸可按任意的顺序连接形成肽链或环。用于生物生产肽中的天然氨基酸全部具有L-构型。可应用常规的合成方法利用L-氨基酸、D-氨基酸或两种不同构型的氨基酸的各种组合制备合成肽。一些肽仅包含少量的氨基酸单元。例如含有不到10个氨基酸单元的短肽有时被称作“寡肽”。其他的包含大量氨基酸残基，例如达100个或更多个氨基酸残基的肽称作“多肽”。习惯上将含有3个或3个以上氨基酸的任何肽链看作“多肽”，而通常将“寡肽”视为特定类型的短“多肽”。因而本文所提到的“多肽”应理解为也包括“寡肽”。而且，所提到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。不同的氨基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，多肽的数量以及可形成的不同蛋白的数量实际上是无限的。“α碳(Cα)”是肽链的碳-氢(CH)组分中的碳原子。“侧链”是Cα的侧基，其可包含简单的或复杂的基团或部分，且具有与所述肽的大小相比可显著变化的外形大小。
本发明可应用于与此处公开的IFNα2分子具有基本上相同的一级氨基酸序列的任何IFNα2分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法获得的并且可以含有多于或少于165个氨基酸残基的IFNα2分子。
IFNα2蛋白，诸如从其它哺乳动物源鉴定的那些，共有本公开的许多肽序列并且共有许多这样的肽序列，其具有与公开的列表中的序列实质上相同的序列。因此，此类蛋白质序列同样在本发明的范围内。
本发明是为了克服实际应用中存在的下述问题，即将可溶性蛋白引入自体生物中可引发免疫应答，产生可与所述可溶性蛋白相结合的宿主抗体。其中该现象的一个显著例子是IFNα2的临床应用。尽管这一蛋白是内源产生的，但许多接受IFNα治疗的病人都会产生针对它的抗体[Russo，D.等(1996)出处同上；Stein，R.等(1988)出处同上]。本发明寻求的解决之路是，提供施用给人类宿主时引起免疫应答的倾向发生改变的IFNα2蛋白质。根据此处描述的方法，本发明人已经发现并如今公开了含关键T细胞表位的IFNα2分子区域，所述T细胞表位驱动对该自体蛋白质的免疫应答。
本发明中形成经修饰的IFNα2的总的方法包括下述步骤：
(a)确定多肽或其中一部分的氨基酸序列；
(b)通过任意方法，包括利用体外或in silico技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；
(c)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或in silico技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定。构建此序列变体以避免由所述的序列变体产生新的潜在T-细胞表位，否则所述的新的潜在T细胞表位又通过此种方式进行修饰以基本上减弱或消除T-细胞表位活性；和
(d)根据已知的重组技术通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体。
对于步骤(b)中对潜在T-细胞表位的鉴定可依照本领域已公知的方法进行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317中也公开了适当的方法，并优选用于鉴定从IFNα2a衍生的肽对MHC II类分子的结合倾向。
在实施例1公开了另一种非常有效的通过计算鉴定T-细胞表位的方法，它是本发明的优选实施方案。
实践中，可以制备多种IFNα2蛋白变体然后检测所需的免疫和功能特征。最优选通过重组DNA技术生产所述的变体蛋白，但也可以利用其他的方法，包括化学合成IFNα2片段。
涉及165个氨基酸残基的人IFNα2a蛋白序列的根据上述方案中步骤(b)的分析结果示于图1。
涉及本发明的经修饰分子的根据上述方案中步骤(c)和(d)的设计和构建结果示于图2和3。
本发明涉及IFNα2类似物，其中，在可以导致所述蛋白中一个或多个潜在T细胞表位的活性明显减弱或从所述蛋白中去除一个或多个潜在的T-细胞表位活性的位点替代了至少一个氨基酸残基。对于表1中鉴定的任何潜在的MHC II类配体，特定位点的一个或多个氨基酸替代可产生当作为治疗剂施用于人宿主时具有减弱的潜在免疫原性的IFNα2分子。
最优选提供这样的IFNα2分子，其氨基酸修饰(例如，替代)在母体分子最具免疫原性的区域进行。此处本发明人发现，人类IFNα2分子最具免疫原性的区域限定在R1、R2和R3三个区域，其分别包含氨基酸序列：ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH；FNLFSTKDSSAAWDE和KEDSILAVRKYFQRITLY。本发明主要优选的实施方案包含这样的IFNα2分子，对于该分子而言，表1的MHC II类配体以及与以上R1、R2或R3序列元件之任一个全部或最少9个氨基酸残基对齐的肽序列被改变以致消除了结合或否则减少了所述肽能结合的MHC同种异型的数目。
本发明的优选实施方案包括图4中的特定替代。特别优选的是提供包含图4中所示多个替代的修饰IFNα2分子。优选的修饰组合将包含对免疫原性区域R1、R2和R3之每一个的修饰，且特别优选包含对R2和R3的修饰，但该优选并不意在限定可考虑的替代组合的范围。
为消除T细胞表位，优选地，在预计可以实现基本上减弱或去除T-细胞表位活性的肽序列中的适当位点进行氨基酸替代。实践中，合适的位点优选相应于在MHC II类结合沟所提供的口袋之一中进行结合的氨基酸残基。
最优选的是在所述肽的称作P1或P1锚的位置改变在裂缝的第一口袋内的结合。公认地，肽的P1锚残基和MHC II类结合沟的第一口袋之间的结合相互作用的质量是整个肽的总结合亲和性的主要决定因素。在所述肽的这一位置的适当替代是替代为不易容纳到所述口袋中的残基，例如替代为更亲水的残基。所述肽中处于如下位置的氨基酸残基也被认为是落入本发明的范围内，所述位置为与MHC结合裂缝的其他口袋区域结合的位置。
可以理解，由给定的潜在T-细胞表位内的单一氨基酸替代导致该表位去除的路线是最优选的。也可以在单一表位内进行组合替代，例如，这可能对于单独定义的表位间彼此重叠的情况特别适宜。此外，在给定的表位内的单氨基酸替代或在一个表位内的组合氨基酸替代也可以在非对应于MHC II类结合沟的＂口袋残基＂的位置，而是在所述肽序列内的任意位点上进行。替代可参照同源结构或由本领域已知的in silico技术产生的结构方法进行，也可以根据本发明分子的已知结构特征进行。所有此类替代均落入本发明的范围内。
也可以考虑在上面所鉴定的肽之外进行氨基酸替代，特别是与在所列肽内进行的替代相结合的情况下。例如可以考虑利用某种改变恢复变体分子的结构或生物学活性。这种补偿性的改变和在IFNα2多肽中缺失或添加特定的氨基酸残基以得到具有所需活性的变体的改变，以及在任何本发明公开的肽中进行的改变均落入本发明的范围内。
本发明的范围涉及经修饰的IFNα2，含有上述经修饰的IFNα2蛋白或经修饰的IFNα2蛋白片段的组合物及其相关的组合物应认为均落入本发明的范围内。另一方面，本发明涉及编码经修饰的IFNα2实体的核酸。另一方面本发明涉及利用经修饰的IFNα2蛋白对人进行治疗的方法。
附图简述
本发明将由以下的实施例(但不仅限于此)进行说明。实施例涉及到下列图表。之后氨基酸残基以单字母代码表示。
图1提供了人IFNα2a中具有潜在人MHC II类结合活性的肽序列。
图2提供了导致人IFNα2a的T细胞表位去除的替代(WT＝野生型残基)。
图3提供了其它替代，所述替代导致相应于一种或多种MHC同种异型的潜在T细胞表位被除去。
图4提供了人IFNα2a中的优选替代(WT＝野生型残基，MUT＝所需的残基)。
图5的表格提供了IFNα2的13-mer合成肽序列，所述合成肽序列应用实施例2中的MHC II类体外结合试验进行分析。
图6显示了针对各MHC同种异型的体外MHC肽结合试验的结果。对各受试的MHC同种异型，a)显示的肽具有高结合亲合力(参考竞争肽的抑制作用为0％)；对各受试的MHC同种异型，b)显示的肽具有中等的结合亲合力(参考竞争肽的抑制作用为0-50％)；对各受试的MHC同种异型，c)显示的肽具有低结合亲合力(参考竞争肽的抑制作用为50-100％)；及d)显示的肽对受试MHC同种异型不发生可检测水平的结合。
图7的表格提供了IFNα2的15-mer肽序列，所述肽序列应用实施例3中的体外人幼稚T细胞试验进行分析。表中显示了肽ID#和N末端肽残基在IFNα2序列内的位置。
图8显示了来自响应IFNα肽刺激的6个个体的累积刺激指数。20个筛选供体中有6个对来自IFNα序列的51个15mer肽中的一个或多个的刺激产生应答。据对各个肽的应答划分出3个截然不同的区域，区域3含有最具免疫原性的肽#38和#39(箭头)。包括对照肽C32(DRBI-限制的)和C49(DP-限制的)用以比较。每一矩形条内的交叉影线表示各供体所起的作用。
图9显示了IFNα内的免疫原性区域，以及详细显示了来自这些区域的能够刺激人幼稚T细胞的肽序列。
图10提供的表格显示能够促进人幼稚T细胞的体外增殖的IFNα肽。对5个供体，记录到对来自主要表位区域R1、R2和R3的多个重叠肽的应答。对3个供体，记录到对来自R1、R2和R3的单个合成肽的应答。
图11提供的表格显示了在IFNα肽的应答和不应答供体中MHC II类等位基因的频率。a＝分子为具有DR等位基因的供体的数目，分母为体外对所述肽显示出T细胞增殖的供体数目(应答供体的总数目＝6)。b＝供体人群中等位基因的频率。对于记录到的应答为2或小于2的肽未予评估。所有应答供体的DRB1*14测试为阴性。DRB1*14同种异型在20个受试供体中的频率为1.5％。对给定肽的同种异体限制(Allorestriction)由供体人群中等位基因的频率和表达相同等位基因的应答供体的数目来确定。如果肽与任何特定等位基因关联(即，同种异体限制)，则显示的百分数将预期大于人群中此等位基因的频率。
图12的表格提供了在特定MHC II类同种异型竞争结合试验中15-mer合成肽的IC50值。(a)MHC II类肽竞争结合试验，以测定IFNα肽对DRB1*0101的相对结合亲合力，所述IFNα肽能够促进体外人幼稚T细胞增殖。IFNα肽在10μM生物素化的流感血凝素307-319存在的条件下与固定的HOM-2细胞孵育。将对生物素化肽的最大结合造成受到50％抑制的竞争肽的浓度记作IC50。包括流感103-115作为高亲合力对照。IC50≤20μM＝高亲合力，IC50＝20-100μM＝中亲合力，IC50≥100μM＝低亲合力。(b)MHC II类肽竞争结合试验，以测定IFNα肽对DRB1*0701的相对结合亲合力，所述IFNα肽能够促进体外人幼稚T细胞增殖。IFNα肽在10μM生物素化的破伤风毒素828-840存在的条件下与固定的MOU(MANN)细胞进行孵育。将对生物素化肽的最大结合造成50％抑制的竞争肽的浓度记作IC50。包括破伤风毒素828-840用作高亲合力对照。IC50≤20μM＝高亲合力，IC50＝20-100μM＝中亲合力，IC50≥100μM＝低亲合力。(c)MHC II类肽竞争结合试验，以测定IFNα肽对DRB1*0401的相对结合亲合力，所述IFNα肽能够促进体外人幼稚T细胞增殖。IFNα肽在50μM生物素化的流感血凝素307-319存在的条件下与固定的WT-51细胞进行孵育。将对生物素化肽的最大结合造成50％抑制的竞争肽的浓度记作IC50。包括流感103-115用作高亲合力对照。IC50≤20μM＝高亲合力，IC50＝20-100μM＝中亲合力，IC50≥100μM＝低亲合力。
图13提供的表格详述了IFNα内的替代，所述替代提供了在实施例7的抗增殖试验中保留活性的分子。WT＝野生型残基；#＝残基编号；Mut＝执行的突变。表位区域指示出相对于免疫原性表位区域R1、R2或R3而言替代所发生的位置。
图14提供了所选突变IFNα2分子的抗增殖效果的代表数据。试验根据实施例7中的方法进行。
a)图显示了在免疫原性表位R1内具有替代的分子的活性。
b)图显示了在免疫原性表位R2内具有替代的分子的活性。
c)图显示了在免疫原性表位R3内具有替代的分子的活性。
图15中提供的各图显示了各供体对IFNα合成肽的应答。包括来自对照肽C32(DRB 1-限定的)和C49(DP-限定的)的数据用以比较。在相关图中标出了免疫原性区域R1、R2、R3。阳性刺激指数的阈值＝2。
以下实施例中本发明得以更为详细地描述，所述描述不应理解为对本发明的限定或限制。
实施例
有多种因素对决定蛋白或多肽的总体结构起重要作用。首先是肽键，即将氨基酸连接在一起形成链的键，它是一种共价键。这种键是平面结构的，实质上是一种取代的酰胺。“酰胺”指含-CONH-基团的一组有机化合物中的任何一个化合物。
连接相邻氨基酸的Cα的平面肽键如下所示：
由于O＝C和C-N原子位于一个相对刚性的平面中，所以不会发生沿这些轴的自由旋转。因此，图中虚线所示的平面有时被称作“酰胺”平面或“肽平面”，肽主链中的氧(O)、碳(C)、氮(N)和氢(H)原子位于其中。Cα原子位于酰胺平面中相对的角上。由于肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上不发生旋转，所以多肽链包含一系列连接Cα原子的平面肽键。
第二个对决定多肽或蛋白的整体结构或构象起重要作用的因素是绕共有Cα键的每一酰胺平面的转角。此后术语＂转角＂和＂扭转角＂是等同的术语。假定O、C、N和H原子保留在酰胺平面中(这通常是一种正确的假设，尽管在一些构象中这些原子会轻微的偏移平面)，这些转角确定了N和R多肽主链构象，即相邻残基之间的结构。这两个转角称为φ和ψ。因此，一套φi和ψi角(其中，脚标i代表多肽链中的特定残基)有效地规定了多肽链的二级结构。在文献中定义了用于确定φ和ψ角的惯例，即在给定的多肽中酰胺平面形成0度角的参考点，以及哪个角是φ角，哪个角是ψ角的定义。参见Ramachandran等，Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)，285-94页，这些页中的内容在此引入作为参考。
本发明的方法可应用于任何蛋白，并部分基于下述发现，即人MHCII类分子结合沟的主要口袋1锚定位点对特定氨基酸侧链具有设计好的特异性。这一口袋的特异性由MHC II类分子β链第86位的氨基酸的身份来确定。这一位点位于口袋1的底部并决定可容纳于这一口袋中的氨基酸侧链的大小。Marshall，K.W.，J.Immunol.，152：4946-4956(1994)。如果这一残基是甘氨酸，则所有的疏水性脂肪族和芳香族氨基酸(疏水性脂肪族氨基酸是：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸，芳香族氨基酸是：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容纳于所述的口袋中，优选芳香族侧链。如果这一口袋残基是缬氨酸，则该氨基酸的侧链伸到口袋中并限制了可容纳的肽侧链的大小，所以只有疏水性脂肪族侧链可容纳进去。因此在氨基酸残基序列中，无论哪里发现了带有疏水性脂肪族或芳香族侧链的氨基酸，即有存在MHC II类限制性T-细胞表位的可能性。但是，如果所述的侧链是疏水性脂肪族侧链，其与T-细胞表位相关的可能性约是芳香族侧链的两倍(假定1型口袋近似平均地分布于全球种群中)。
将本发明具体化的计算机方法描绘出肽区域包含T-细胞表位的可能性，该方法如下：(1)扫描预定长度肽片段的一级序列，并鉴定存在的所有疏水性脂肪族和芳香族侧链。(2)对疏水性脂肪族侧链赋予比芳香族侧链高的值；优选两倍于赋予芳香族侧链的值，例如，给疏水性脂肪族侧链赋值为2，给芳香族侧链赋值为1。(3)将所述肽中的预定统一长度的每一重叠氨基酸残基片段(窗口)中确定存在的值总和起来，再将某一特定片段(窗口)的总值赋予该片段(窗口)中间位置的某个单个氨基酸残基，优选赋予处于抽样片段(窗口)中间点的氨基酸。将这一过程对每一抽样的重叠氨基酸残基片段(窗口)重复进行。因此，所述肽的每一氨基酸残基均被赋予了一个值，该值与T-细胞表位存在于此特定片段(窗口)中的可能性相关。(4)用按照上述步骤3中的描述计算、赋予的值对被评估的整个氨基酸残基序列的氨基酸坐标作图。(5)序列中具有预定值(例如该值为1)的所有部分均被认为可能包含T细胞表位，并且在需要时可进行修饰。在这一方面本发明提供了通用的方法，由此可描述可能包含T-细胞表位的肽区域。在这些区域中对所述的肽进行修饰有可能改变MHC II类的结合特性。
依照本发明的另一方面，可利用更复杂的计算方法更精确地预测T-细胞表位，该方法考虑了肽与MHC II等位基因模型之间的相互作用。根据这一方面，对肽中存在的T细胞表位的计算预测考虑到：基于所有已知MHC II类分子的结构构建至少42个MHC II类等位基因模型；使用这些模型计算鉴定T细胞表位的方法；对每一模型构建肽主链文库以允许在相关肽主链α碳(Cα)位置具有已知的变异性；在肽和MHC II类分子间相互作用关键的位置处，对与每一模型对接(dock)的每一主链，相对于20种氨基酸替代物中每一种构建氨基酸侧链构象文库；以及将这些主链和侧链构象文库与评分函数结合用于选择与特定MHC II类分子对接的特定肽的最佳主链和侧链构象并得出该相互作用的结合分值。
MHC II类分子模型可从Brookhaven蛋白数据库(＂PDB＂)中的许多类似的结构出发通过同源建模推导得出。它们可通过使用引入了模拟退火算法的半自动同源建模软件(Modeller，Sali A.& Blundell TL.，1993.J.Mol Biol 234：779-815)并结合用于能量最小化的CHARMm力场(购自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)来制备。也可以应用其他的建模方法。
本发明的方法与下述的其他计算方法有着显著的不同，这些方法在于：利用从实验中得来的关于一小组MHC II类分子结合沟中每一位点的每一种氨基酸选项的结合数据文库(Marshall，K.W.等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1(3)：157-162)(1995)；或利用类似的实验结合数据以定义所述的沟中特定结合口袋类型的结合特性(同样利用相对小的MHC II类分子亚组)然后将这一口袋文库中的口袋类型进行‘混合和匹配’以人工构建更“实际的”MHC II类分子(Sturniolo T.等，Nat.Biotech，17(6)：555-561(1999)。这两种现有方法的主要缺陷在于实验的复杂性和需要合成大量的肽变体造成仅有少量的MHC II类分子可通过实验扫描。因此第一种已知的方法仅能预测少量的MHC II类分子。第二种已知的方法还假设在不同II类等位基因的背景下在一个分子中衬有类似氨基酸的口袋将具有相同的结合特性，故其另外的缺陷在于，仅仅可“实际地”地构建出那些包含口袋文库中所包含的口袋的MHC II类分子。利用本发明的建模方法可推导出任意数量和类型的MHC II类分子的结构，因此可特异性地选择等位基因以代表全球种群的特征。此外，扫描的MHC II类分子的数量可通过构建更多的模型而增加而无需通过复杂的实验获得额外的数据。利用主链文库使得被扫描的各种肽在与特定的MHC II类分子结合时其Cα原子位置处可进行变化。这也与上述现有技术中的计算机方法不同，在那些方法中依赖于利用简化的肽主链来扫描结合在特定口袋中的氨基酸。这些简化的主链不可能代表在“真正的”肽中存在的主链构象，从而导致对肽结合的预测不准确。本发明的主链文库是通过叠加蛋白数据库中所有与MHC II类分子结合的肽的主链，并考虑到位于结合沟内的11个氨基酸的每个氨基酸的Cα原子之间的均方根(RMS)差而构建的。尽管该文库可来自少量合适的可获得的小鼠和人的结构(当前为13种)，但为了允许存在甚至更大变异的可能性，将每一C＂-α位点的RMS数提高50％。然后确定每一氨基酸的平均Cα位置，围绕这一点划一个球，其半径等于在该位置的RMS差加50％。该球体代表所有可允许的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸残基的Cα，等同于结合沟中11个残基的位置2)起运作，将所述的球三维网格化，网格内的每个顶点作为该氨基酸的Cα的可能位置。将后续的酰胺平面(相应于与后续氨基酸的肽键)移动到这些Cα的每一个上面，将φ和ψ角以设定的间隔逐步地转动以便于安置后续的Cα。如果后续的Cα落入对这一Cα而言‘可被允许的位置球’中，则此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外则所得的二肽不能被接受。对每一后续Cα位置均重复这一过程，使肽从所述的口袋1Cα‘种子’开始生长，直到全部9个后续的Cα的位置均根据之前Cα的所有可能排列确定下来。然后对口袋1前的单个Cα重复上述步骤1次以上以构建定位于结合沟内的主链Cα位置文库。
生成的主链数目取决于几种因素：‘可被允许的位置球’的大小；对口袋1位点处′最初的球′网格化的细度；用于定位后续Cα的φ和ψ角逐步旋转的细度。利用这一程序可以构建大的主链文库。主链文库越大越可能发现对MHC II类分子结合沟内的特定肽而言的最适主链。鉴于和结合结构域的氨基酸可能存在冲突，所以不是所有的主链均适合于与所有MHC II类分子模型‘对接’(docking)，故对每个等位基因建立亚文库以包含适合被该等位基因容纳的主链。利用所述的主链文库并结合MHC II类分子模型可以构建出由与每一容许主链对接的每一MHC II类分子结合沟的每一位点中的每一氨基酸的容许侧链构象所组成的详尽数据库。可以利用简单的立体重叠函数构建这一数据组，其中，主链与MHC II类分子对接，氨基酸侧链在所需位置被嫁接到主链上。将侧链上可旋转的键以设定的间隔逐步旋转，记录下依赖于该键的原子的最终定位。将所述原子与结合沟侧链原子间的相互作用记录下来，根据下述的标准确定是否接受这些位置：如此定位的所有原子的重叠总量不能超过预定值。因此，构象搜索的严谨度是在键的逐步旋转中所用的间隔及对总重叠的预定限度的函数。如果已知特定的口袋是刚性的，则后一值可较小，但若已知口袋侧链的位置相对灵活则严谨度可放松。这样便可以模拟结合沟口袋内灵活性的变化。针对与每一MHC II类分子对接后每一主链的所有位点上的所有氨基酸重复这种构象搜索以建立详尽的侧链构象数据库。
用适当的数学表达式评价MHC II类分子模型与肽配体构象的结合能量，所述的肽配体构象需通过扫描上述的主链/侧链构象大数据库根据经验获得。这样，通过对每一长度在9-20个氨基酸范围内变化(尽管对于每一次扫描长度是一定的)的可能肽进行下述计算，可以扫描蛋白以搜索潜在的T-细胞表位：选择MHC II类分子及适合于该分子的肽主链，将相应于所需肽序列的侧链移植到其上。对于氨基酸的每一容许构象(由上述数据库获得)，收集与主链上特定位点的特定侧链相关的原子身份和原子间距数据。沿主链对每一侧链重复此过程，利用评分函数推导肽得分。保留该主链的最佳得分，对所选模型的每一容许主链重复该过程。比较所有容许主链的得分，最高的得分被认为是该MHC II类模型中所需肽的得分。对每一模型用从扫描的蛋白得到的所有可能肽重复上述过程，列出肽相对于模型的得分。
在本发明中，用于结合亲和力计算的每种配体都是选自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配体为来自已知序列的肽、多肽或蛋白的长度为约9到20个氨基酸的选定氨基酸链。此后术语“氨基酸”和“残基”视为等同的术语。将移植到选自上述主链文库的主链上的待检测肽中的连续氨基酸形式的配体，通过肽主链上C＂-α原子坐标定位到来自MHC II类分子模型库的MHC II类分子的结合裂缝中，并从容许构象的数据库中选择每一侧链的容许构象。相关的原子身份和原子间距也可以从这一数据库获得并用于计算肽结合分数。将对MHC II类结合口袋具有高亲和力的配体作为侯选者标记出来用于定点诱变。在标记的配体中(也由此在目的蛋白中)进行氨基酸替代，然后用评分函数重新测定以确定使结合亲和力降低到预定的阈值以下的变化。这些变化即可引入到目的蛋白中以去除T-细胞表位。肽配体与MHC II类分子结合沟的结合涉及非共价键相互作用，其包括但不限于：氢键、静电相互作用、疏水(亲脂)相互作用和范德华相互作用。它们被包括在下面将详细描述的肽评分函数中。应当理解，氢键是非共价键，其可在极性或带电的基团之间形成，由被两个其他原子共享的氢原子构成。氢供体中的氢带正电荷，而氢受体带有部分负电荷。为肽/蛋白相互作用的目的，氢键供体可以是连接氢的氮，或连接在氧或氮上的氢。氢键受体原子可以是没有连接氢的氧、没有连接氢并具有一或两个连接的氮或仅有一个连接的硫。某些原子，如连接了氢的氧或亚胺氮(如C＝NH)，既可以是氢受体也可以是氢供体。氢键的能量在3-7Kcal/mol，大大强于范德化键，但弱于共价键。氢键具有高度的方向性，且当供体原子、氢原子和受体原子共线时最强。静电键是在带有相反电荷的离子对间形成的，根据库仑定律这种相互作用的强度与原子间距离的平方成反比。离子对间的最佳距离是约2.8。在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、组氨酸或赖氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之间形成静电键。该键的强度依赖于电离基团的pKa和介质的介电常数，尽管其与氢键的强度类似。
亲脂相互作用是蛋白和肽配体之间发生的有利疏水-疏水相互作用。这种相互作用通常出现在埋于结合沟口袋中的肽的疏水性氨基酸侧链间，以使它们不暴露在溶剂中。将疏水残基暴露于溶剂中是非常不利的，因为周围的溶剂分子将被迫在彼此间形成氢键而形成笼状结构。所致的熵值降低是非常不利的。亲脂性原子可以是既非极性又不是氢受体的硫和非极性的碳原子。
范德华键是相距3-4的原子间的非特异性的力。它比氢键和静电键弱、特异性低。原子周围的电荷分布随时间变化，并且在任何瞬间电荷分布均是不对称的。这种瞬间的电荷不对称性诱导临近原子中的类似不对称性。在范德华接触距离中所导致的原子之间的吸引力达到最大，而在约1到2处迅速消失。相反，当原子间隔的距离小于此接触距离时，由于原子外部的电子云重叠使不断增强的斥力成为主导。尽管与静电和氢键相比，此吸引力相对较弱(约0.6Kcal/mol)，但所述斥力对于决定肽配体是否能与蛋白成功结合可能非常重要。
在一个实施方案中，利用Bhm评分函数(SCORE1方法)评估结合常数(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)：243-256(1994)，该文献在此全文引入作为参考)。在另一个实施方案中，用评分函数(SCORE2方法)评估结合亲和力作为配体含有T-细胞表位的指示物(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)：309-323(1998)，该文献在此全文引入作为参考)。但是上述文献中描述的Bhm评分函数是用于评估下述情况中配体对蛋白的结合亲和力的，即已知所述的配体可成功地与所述蛋白结合，且蛋白/配体复合物的结构已解析，这一结构已列于蛋白数据库(＂PDB＂)中。因此，利用已知的阳性结合数据对评分函数作了发展。为了区分阳性和阴性的结合体，需向方程中加入排斥项。此外，可通过以成对的方式计算亲脂相互作用，而非利用上述Bhm函数中基于面积的能量项来进行更理想的结合能量评估。因此，在一个优选实施方案中，用经修饰的Bhm评分函数评估结合能。在经修饰的Bhm评分函数中，在评估蛋白和配体之间的结合能(ΔGbind)时考虑了下述参数：由于配体的平移和转动熵的整体损失造成的结合能减低(ΔG0)；理想氢键的贡献(ΔGhb)，其中至少一个配对物是中性的；无扰离子相互作用的贡献(ΔGionic)；亲脂配体原子和亲脂受体原子之间的亲脂相互作用(ΔGlipo)；由于配体中内在自由度的冻结，即绕每一C-C键的旋转自由度降低而造成的结合能损失(ΔGrot)；蛋白和配体之间相互作用的能量(EVdW)。考虑到这些项给出等式1：
(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)
其中N是对于特定项符合的相互作用的数目，在一个实施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常数，其值分别为：5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb项依照等式2计算：
Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcs
f(ΔR，Δα)是罚函数，其解决氢键自理想情况的巨大偏离，其依照等式3计算：
f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)
其中：
如果ΔR＜＝TOL        则f1(ΔR)＝1，或者
如果ΔR＜＝0.4+TOL    则f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者
如果ΔR＞0.4+TOL      则f1(ΔR)＝0
并且：
如果Δα＜30°        则f2(Δα)＝1，或者
如果Δα＜＝80°      则f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者
如果Δα＞80°        则f2(Δα)＝0
TOL是氢键键长＝0.25中所能允许的偏差
ΔR是H-O/N氢键键长与理想值＝1.9的偏差
Δα是氢键键角∠N/O-H..O/N与180°理想值的偏差
f(Nneighb)区分蛋白表面的凹凸部分，并因此赋予口袋中的极性相互作用比蛋白表面的极性相互作用更高的权重。这一函数根据下述等式4计算：
f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5
Nneighh为蛋白中与任意给定蛋白原子之间的距离小于5的非氢原子的数量。
Nneighb，0是常数＝25
fpcs是考虑到每氢键的极性接触表面面积的函数，由此可以区分强和弱的氢键，其值由下述的标准确定：
当Apolar/NHB＜102时    fpcs＝β
当Apolar/NHB＞102时    fpcs＝1
Apolar是极性蛋白-配体接触面的大小
NHB是氢键的数目
β是常数＝1.2
由于假定了相同的几何相关性，在实施经修饰的Bhm评分函数时，离子相互作用的贡献ΔGionic用与上述有关氢键的类似方式计算。
Nlipo项按下述的等式5计算：
Nlipo＝∑lLf(rlL)
根据下述标准，对于所有亲脂配体原子l和所有亲脂蛋白原子L，计算f(rlL)：
当rlL＜＝R1时      f(rlL)＝1
当R2＜rlL＞R1时    f(rlL)＝(rlL-R1)/(R2-R1)
当rlL＞＝R2时      f(rlL)＝0
其中：R1＝rl vdw+rL vdw+0.5
      R2＝R1+3.0
rl vdw是原子l的范德华半径
rL vdw是原子L的范德华半径
Nrot项是氨基酸侧链中可旋转的键的数目，其被视为无环的sp3-sp3及sp3-sp2键的数目。末端-CH3或-NH3的旋转未考虑进去。
最终，项Evdw依照如下等式6计算：
Evdw＝ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12-(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)，
其中：ε1和ε2是取决于原子身份的常数
r1 vdw+r2 vdw是范德华原子半径
r是原子对间的距离。
关于式6，在一个实施方案中，ε1和ε2常数被赋予如下原子值，分别为：C：0.245，N：0.283，O：0.316，S：0.316(即分别对于碳、氮、氧和硫原子)。对于式5和6，给予范德华半径如下原子值，分别为C：1.85，N：1.75，O：1.60，S：2.00。
应当理解上述等式中所有预定的值和给定的常数都是在现有的对蛋白配体相互作用的理解局限内具体相对于此处所用的计算类型确定的。因此，随着这种评分函数的进一步精练，这些值和常数也会因此而改变，任何能在蛋白和配体结合能的评估方面给出所需结果的适宜数值均可使用，而且，其也落入本发明的保护范围内。
如上所述，所述的评分函数应用于由上述侧链构象、原子身份和原子间距数据库中提取的数据。为本说明书的目的，该数据库中包含的MHC II类分子数是42个模型加上4个已解析的结构。从上述描述中可清楚地了解到，本发明的计算构建方法的模块性质意味着，可简单地添加新的模型，并利用肽主链文库和侧链构象搜索功能进行扫描以创建其它的可通过上述的肽评分函数处理的数据集。这使得被扫描的MHC II类分子库可以很容易地增加，或者如果可以获得相关数据，则可以替换结构和相关数据以创建现有等位基因的更精确的模型。
本发明的预测方法可以相对于包含大量已通过实验确定了其对不同MHC II类分子的亲和力的肽的数据集进行校准。将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值，已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都得以正确的预测。
应当理解，尽管上述评分函数与现有的一些复杂方法相比相对简单，但计算进行得非常迅速。还应当理解的是，其目的并不在于计算出对接到所选择的MHC II类蛋白结合沟内的每种肽的真正结合能本身。根本的目的在于获得相对的结合能数据以助于根据所选蛋白的一级结构(即氨基酸序列)预测T-细胞表位的定位。相对高的结合能或结合能高于选定的阈值意味着在配体中存在T-细胞表位。然后可以将所述配体进行至少一轮氨基酸替代，并再次计算结合能。由于计算可迅速进行，对肽序列的这些操作可在现有成本划算的计算机硬件上于程序用户界面中互动进行。由此不需要对计算机硬件进行大量投资。
本领域的技术人员应当了解，也可使用其他软件达到相同的目的。特别是可以使用能将配体对接入蛋白结合位点的更复杂的软件，并与能量最小化相结合。对接软件的例子包括：DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161：269-288(1982))，LUDI(Bhm，H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8：623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3：300-308(1995))。分子建模和操作软件的例子包括：AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用这些计算方法将严重限制本发明方法的信息吞吐量，这是由于进行必要的计算所需的处理时间导致的。但是可行的方式为，将这些方法作为‘二级筛选’以获得关于通过本发明的方法发现为‘阳性结合体’的肽的更精确的肽结合能计算值。用于复杂的分子机械或分子动力学计算的处理时间的限制性是由进行所述计算的软件设计和目前计算机硬件技术的限制共同确定的。可以预期在将来，随着编写更高效的代码和计算机处理器速度的不断提高，在更易控制的时间框架内进行上述计算是可行的。有关用于大分子的能量函数的其他信息和有关在折叠蛋白结构内发生的多种相互作用的考虑可参考下述文献：Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4：187-217(1983)，有关蛋白-配体一般相互作用的信息参见：Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)：31-47(1988)，这些文献均全文引入作为参考。其他有用的背景资料也可参见Fasman，G.D.编，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New York，ISBN：0-306 4313-9。
以下的实施例更详细地描述了本发明。
实施例2
对IFNα2的165个氨基酸的序列大致利用实施例1的方法以in silico方式进行分析。产生一组57个13-mer的合成肽并分析其体外结合人MHCII类分子的能力。这些肽序列显示在图5中。
MHC II类合成肽结合试验应用具有已知HLA-DR同种异型的人B类淋巴母细胞进行。细胞用多聚甲醛固定并与单独生物素标记的肽或加上未生物素标记的竞争肽一起孵育以测定IC50值。与肽孵育后，裂解细胞，用抗HLA-DRα-链的单克隆抗体LB3.1捕获MHC II类分子。用链霉亲合素过氧化物酶检测结合的经生物素标记的肽，结合肽的数量用发光读出器定量。
进行竞争结合试验时，使未生物素标记的测试肽在有生物素标记的竞争肽存在下与固定的细胞一起孵育。
用简单的(非竞争性)结合试验，预先测定出竞争肽对特定目的同种异型的IC50数值。IC50数值为阻止50％标记肽进行结合的未经生物素标记的肽的浓度。对于每一等位基因，生物素标记肽的浓度通过实验确定为测定的其ED50(给出一半最大应答的肽浓度)的至少六分之一，以确保通过此抑制作用主要地测量竞争肽的结合特征。
EBV转化的人B类淋巴母细胞系从ECACC(Salisbury，UK)获得。HOM-2细胞用于DRB1*0101结合试验；WT51细胞用于DRB1*0401结合试验且MOU(MANN)细胞用于DRB1*0701结合试验。鼠杂交瘤LB3.1从美国典型培养物保藏中心ATCC(Virginia，USA)获得。增强化学发光(ECL)试剂购自Amersham Pharmacia(Amersham，UK)。RPMI 1640培养基、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素从Life Technologies(Paisley，UK)获得。OptiplatesTM从Packard(Pangbourne，England)获得。生物素标记的肽从Babraham Technix(Cambridge，England)获得，而未生物素标记的肽从Pepscan Systems(Lelystad，The Netherlands)获得。Prosep A从Millipore(Watford，UK)获得。DAB、PMSF、碘乙酰胺、苯甲脒、亮抑酶肽、抑胃酶肽、PBS片、DMSO、BSA、链霉亲和素过氧化物酶缀合物及其他所有化学药品来自Sigma化学公司(Poole，UK)。
类淋巴母细胞在加有10％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基内于37℃/5％CO2的潮湿空气中培养。
LB3.1杂交瘤细胞在加有10％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基内于37℃/5％CO2的潮湿空气中培养，且从培养上清中纯化LB3.1抗体。上清用0.22μM滤膜过滤，然后每450ml中加入50ml pH为8.0的1M Tris以形成0.1M-缓冲溶液。然后将此经缓冲的上清4℃过夜通过3ml PROSEP A柱子并用25ml的PBS洗涤。
用8ml pH为3.0的0.1M柠檬酸盐洗脱LB3.1抗体，且将每0.5ml级分收集入500μl的1M Tris-HCl(pH8.0)中。用分光光度计(A280nm)测定每一级分中的蛋白质含量。将级分合并并用3.5K截断值的Slide-A-Lyser(Pierce)在800ml PBS中进行透析。LB3.1的纯度的核定应用还原的SDS-PAGE，随后用考马斯兰染色完成。
对每一肽/同种异型组合的结合试验在96孔平底OptiplatesTM中重复3次进行，每孔应用2×106个细胞。细胞用RPMI-1640洗涤两次，然后用0.5％多聚甲醛/PBS冰上固定30min。用RPMI-1640洗涤两次后，细胞与如下物质进行孵育：生物素标记的肽；生物素标记的肽+未生物素标记的竞争肽；或无肽。孵育时应用肽结合缓冲液(100mM柠檬酸盐/磷酸盐pH4.5、5mM EDTA、1mM PMSF、100μM亮抑酶肽、1mM碘乙酰胺、100μM抑胃酶肽A、1mM苯甲脒)，37℃进行24h。离心收集细胞，然后移出80μl上清替换为80μl/孔的NP40裂解缓冲液(0.5％NP40、150mMNaCl、1mM PMSF、100μM亮抑酶肽、1mM碘乙酰胺、100μM抑胃酶肽A、1mM苯甲脒、50mM Tris-HCl(pH8.0))。细胞在4℃孵育45分钟，然后离心获得清亮的裂解物。预先包被的96孔试验平板的每个孔加入50μl(三个/样本)裂解物，孔内还含50μl PBS/5％BSA。在所有试验中，预包被已在前夜进行，其中试验平板在4℃用100μl/孔的抗II类抗体LB3.1进行预处理，所述LB3.1在PBS中稀释成20μg/ml。除去过量的抗体，然后平板用250μl/孔的PBS/5％BSA室温封闭2小时。每一平板用PBS/1％Tween洗涤7次，且在加入细胞裂解物前每孔加入50μl的PBS/5％BSA/0.5％NP40。
加入裂解物后，平板在4℃孵育2小时，然后用PBS/0.1％Tween洗涤7次。每孔加入100μl的在PBS/5％BSA/0.1％Tween中1∶1000稀释的链菌素和素过氧化物酶，并在4℃孵育平板1小时。
平板用PBS/0.1％Tween洗涤7次，将100μl的化学发光底物(Amersham Pharmacia)加入到每一孔内。平板用Perkin Elmer MicroBetaTriLux平板读取器进行读数，且结果以CPS给出。
在竞争分析中：生物素标记的肽的最大结合定义为在缺乏竞争肽时的结合(CPS)，而抑制作用由如下公式定义：
％抑制＝100×[(无竞争者时的CPS)-(有竞争者时的CPS)]/[无竞争者时的CPS]
对生物素标记的肽的最大结合造成50％抑制的竞争肽浓度记作IC50。
对图5所列出的13-mer肽进行的结合试验描述在图6a-d中。除图6d中所示的肽外，所有肽显示出可与一种或多种受试人MHC II类同种异型发生结合相互作用。
实施例3
MHC、肽和T细胞受体(TCR)间的相互作用为T细胞识别的抗原特异性提供了结构基础。T细胞增殖试验测试肽与MHC的结合以及TCR对MHC/肽复合体的识别。
本发明的体外T细胞增殖试验涉及刺激外周血单核细胞(PBMC)，所述PBMc包含抗原呈递细胞(APC)和T细胞。应用合成肽抗原，及在一些实验中应用全蛋白质抗原体外进行刺激。刺激引起的T细胞增殖应用3H-胸苷(3H-Thy)进行测定，且通过闪烁计数洗涤后的固定细胞来估定掺入的3H-Thy。
从National Blood Service(Addenbrooks医院，Cambridge，UK)获得来自存储不到12小时的人血液的白细胞层。Ficoll-paque从AmershamPharmacia Biotech(Amersham，UK)获得。用于培养原代人淋巴细胞且含L-谷氨酰胺、50μg/ml链霉素、10μg/ml庆大霉素和0.1％人血清白蛋白的无血清AIM V培养基来自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽来自Eurosequence(Groningen，The Netherlands)和Babraham Technix(Cambridge，UK)。
对白细胞层轻度离心从血浆和血小板中分离出红细胞和白细胞。移除并弃去最上层(含血浆和血小板)。红细胞和白细胞在磷酸盐缓冲液(PBS)中1∶1稀释，而后铺到15ml ficoll-paque(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根据生产商推荐的条件离心，从血清+PBS/ficoll paque界面收获PBMC。PBMC与PBS混合(1∶1)且通过离心收集。移除并弃去上清，将PBMC沉淀重悬于50ml PBS中。再次离心沉淀细胞，并弃去PBS上清。细胞用50ml AIM V培养基重悬，并在此时间点用台盼蓝染色排除法计数细胞并评估细胞活力。再次离心收集细胞并弃去上清。细胞以每毫升3×107个的密度重悬并低温保存。储存介质为90％(v/v)热灭活AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。将细胞转移到可调冷冻容器(Sigma)中并置于-70℃过夜。需要使用时，在水浴中37℃快速融解细胞，然后转移到10ml预温的AIMV培养基中。
将PBMC以2×105每孔的密度置于96孔平底板中，并用蛋白质和肽抗原进行刺激。在以3H-Thy(Amersham-Phamacia，Amersham，UK)脉冲之前在37℃孵育PBMC 7天。对于本研究，通过3aa增长方式制备重叠的合成肽(15mer)以覆盖IFNα的完整序列。肽标识号(ID#)和序列在图7中给出。每一种肽相对于分离自20个初次用于实验的供体的PBMC单独进行筛选。在每一供体试验中应用两个先前已经显示有免疫原性的对照肽和一个非回忆强抗原KLH。
本研究中应用的对照抗原如下：
肽 序列
C-32 生物素-PKYVKQNTLKLAT流感血凝素307-319
C-49 KVVDQIKKISKPVQH衣原体HSP60肽
KLH 全蛋白质来自匙孔血蓝蛋白
将肽溶解在DMSO中，终浓度为10mM，然后这些原溶液以1/500稀释于AIM V培养基中(终浓度为20μM)。将肽加入到96孔平底板中，在100μl中得到2和20μM的终浓度。融解的PBMC的活力用台盼蓝染色排除法确定，然后以2×106个细胞/ml密度重悬细胞，并将100μl(2×105PBMC/孔)转移到含肽的每个孔内。对于每个肽浓度重复测试三个孔的培养物。平板在含5％CO2的潮湿空气中37℃孵育7天。在收获到过滤垫上之前细胞用1μl Ci 3H-Thy/孔脉冲18-21小时。用Wallac微板β顶板计数器(Perkin Elmer)测定CPM数值。结果表示为刺激指数，所述指数用以下公式确定：
在此试验中将2或更大的刺激指数记为阳性刺激。用T细胞增殖试验对IFNα序列中的T细胞表位进行作图，结果鉴定出R1、R2、R3三个免疫原性区域。这是由6个供体中的T细胞增殖确定的，所述供体对这些区域的一个或多个中的肽产生应答。区域3被认为含有潜在的优势免疫T细胞表位，因为在6个对IFNα肽反应的供体中有4个记录到了增殖。区域1和2在某些个体中诱导T细胞增殖。应答个体的累积应答数据在图8中显示，且来自各应答者的数据总结在图9中。对于各供体的刺激指数在图15中显示。在图10中显示了IFNα的表位数据，并指出了R1、R2、R3以及各肽/供体应答。
实施例4
对于实施例3中使用的所有PBMC样本的组织类型分析，应用商售试剂系统(Dynal，Wirral，UK)完成。试验利用供应商推荐的方案和标准辅助试剂及琼脂糖电泳系统进行。对于DRB 1等位基因，在20个受试供体中同种异型的覆盖率为70％。组织分型的结果用于评估携带特异MHC II类等位基因的IFNα2肽应答者的频率。通过供体群中等位基因的频率和表达同样等位基因的应答供体的数目来确定给定肽的同种异型限制。如果肽与任何特定等位基因关联，则所述频率(表示为百分数)预期大于群体中等位基因的频率。此分析的结果在图11中给出。一般而言小样本数目使得不可能进行严格的统计学检验，但此数据指出来自定义为R3的表位区域的肽与DRB4*01同种异型可能相关。
实施例5
应用含有源自主要免疫原性区域的序列的合成肽进行MHC肽结合试验，所述免疫原性区域为应用实施例3中的生物试验鉴定到的区域。在这些试验中，测试合成的15-mer肽与生物素标记的竞争肽竞争结合三种MHC同种异型的能力。
试验大致如实施例2中所详细描述的方式进行，且IC50数值由结合曲线计算，所述结合曲线从竞争者与测试肽的6个浓度比例产生。
每个测试肽/同种异型组合的IC50数值在图12a-12c中显示。这些数据表明能够在体外生物试验中刺激T细胞增殖的肽可能为低或高亲合力MHC II类配体。
实施例6
我们应用常规重组DNA技术制备了许多修饰IFNα2分子。从人胎盘DNA中克隆野生型IFNα2b基因，此基因既用作对照试剂，也用作通过定点诱变获得修饰IFNα2b基因的模板。将野生型和修饰型基因插入到真核表达载体中，且使重组IFNα2蛋白质与人免疫球蛋白恒定区结构域作为融合蛋白质表达。
从瞬时转染的人胚肾细胞中制备重组蛋白质且用实施例7中所详述的方法进行分析。简言之，用聚合酶链反应(PCR)从人胎盘DNA(Sigma，Poole，UK)中扩增野生型IFNα2b基因。此基因不含内含子且易于应用正向和反向引物OL177和OL178方便地进行扩增，所述引物含限制性位点以利于克隆，见如下所示：
OL177(EcoRI)
5′CCGGAATTCGCTAGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCC-3′
OL178(XhoI/BamHI)
5′-CCGGGATCCCTCGAGCTATTATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAG-3′
550bp的PCR产物用EcoRI和BamHI切割并克隆入pLITMUS28载体(NEB，UK Ltd.)中。通过对多个阳性克隆进行分析证实序列为干扰素α2b的序列。为从人胚肾细胞中获得表达，将野生型基因重新克隆到pd-Cs载体[Lo，等(1998)，蛋白质工程(Protein Engineering)11：495]中。pd-Cs载体指导含人免疫球蛋白恒定区结构域的融合蛋白质表达。克隆到该载体中是应用PCR和引物OL232及OL178实现的。这些引物提供了可应用酶XmaI和BamHI的克隆位点，如下所示：
    OL232(XmaI)
    5′CTGTCCCCGGGTAAATGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCC 3′
    OL178(XhoI/BamHI)
    5′-CCGGGATCCCTCGAGCTATTATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAG-3′
530bp的PCR产物用XmaI和BamHI消化，用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化并转移到准备好的pd-Cs中，所述pd-Cs的IFN(L)序列已用XmaI和BamHI移除。筛选出阳性克隆并通过序列分析证实了IFNα2b序列。含野生型IFNα2b基因的载体pd-Cs命名为pCIFN5。
以pCIFN5为模板用诱变PCR进行单一或多个密码子突变以产生修饰的IFNα2基因。用重叠PCR将两个突变的干扰素半序列组合起来。然后，应用XmaI和BamHI将片段克隆入中间载体(pGEM-T EASY载体；Promega，UK)以在按如上所述方式转入pd-Cs来源的表达载体前进行序列分析。
在分别的反应中应用侧翼引物OL235和OL234，及特异诱变(错配)引物和pCIFN5模板DNA进行诱变。
    OL234：5’-CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC
    OL235：5’-CACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC
应用Expand HI保真PCR试剂(Roche，GmbH)进行反应，且反应条件为以下的循环：
94℃/2′+25个循环×94℃/30＂，60℃/30＂，72℃/30＂+72℃/10′
通过PCR在反应中将这些独立反应的产物连接起来，所述反应由引物OL235和OL234及15个上述PCR循环驱动。
用商售试剂盒系统(Qiagen凝胶提取试剂盒)凝胶纯化PCR产物。用T/A克隆系统将产物克隆入pGEM-T EASY载体(Promega，UK)，且对每一例都测定多个克隆的序列以确认成功导入所需的突变。
所需的克隆用BamHl和Xmal消化，然后将纯化产物连入准备好的pd-Cs载体。克隆用大肠杆菌XLl-Blue细胞(Strategene Europe)进行且培养条件为供应者推荐条件。对所有最终载体制备物进行序列确认，所述序列确认中应用OL261和OL234作为测序引物。
    OL261 5′-GGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAG 3′
    OL234：5′-CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC 3′
应用HEK293人胚肾细胞系作为表达宿主以获得对修饰的IFNα2人IgFC融合蛋白质的表达。应用高纯度CONCERT中型制备系统制备用于转染的所有DNA，其中的操作步骤由供应商提供(Invitrogen，Paisley，UK)。在使用前对DNA进行过滤除菌，并用A260测量进行定量。将浓度调整为0.5-1.0μg/μl。
用于瞬时表达时，HEK293生长在D-MEM glutamax培养基(Invitrogen，Paisley，UK)中，该培养基中补加有10％FCS和250μg/ml的遗传霉素。转染前，用胰酶处理收集细胞并用PBS洗涤。两轮洗涤后，细胞放入新鲜培养基中，密度为4×105细胞/ml，然后加入预先用聚-l-赖氨酸处理(以保证细胞贴壁良好)的多孔皿中。一般地，向48孔平板的每个孔内加入2×105个细胞，平板于37℃/5％CO2条件下过夜孵育。
转染前，更换每个孔的培养基然后加入转染混合物。应用lipofectamine试剂及供应者提供的操作指南(Invitrogen，Paisley，UK)进行转染。简言之，对于每一构建的表达载体，按每孔制备含lipofectamine、OPTI-MEM(Invitrogen，Paisley，UK)和0.8μg DNA的转染混合物。将转染混合物加入到细胞中后孵育细胞4-6个小时。培养基用0.5ml新鲜培养基更换且细胞在37℃/5％CO2条件下孵育。48小时后取样用于进行抗-FCELISA和Daudi细胞增殖试验分析。7天后收获培养基并保存于4℃用于按如上作进一步的分析。
用商售ELISA系统及供应者提供的操作指南(R & D systems，UK)测试培养基中存在的IFNα2。在一些情况中应用ELISA检测IFNα融合蛋白的人免疫球蛋白恒定区结构域。在此试验中鼠抗人IgG Fc制备物(Sigma，Poole，UK)用作捕获试剂。IFNα-HuFc融合体参照标准曲线定量，所述曲线应用人IgG参考制备物(Sigma)的系列稀释物制成。结合的IFNα-FC融合体或参考蛋白质应用抗人IgG过氧化物酶缀合物(Sigma)和Sigma OPD比色底物进行检测。
对HEK293条件培养基中的IFNα进行数量估定之后，条件培养基直接用于测试修饰的IFNα的功能活性，所述测试应用实施例7中详述的抗增殖试验进行。
实施例7
测试本发明的修饰干扰素分子抑制人B淋巴瘤细胞系Daudi生长的能力。方法大致如先前文献描述[Mark，D.F.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5662-5666]，其中涉及将Daudi细胞与测试干扰素一起孵育。测试分子的抗增殖效果应用可溶性染料底物进行检测，所述染料底物在存在细胞增殖时发生颜色改变。导致的颜色改变用分光光度计测量，而任何抗增殖效果的计算都参考在未处理的对照细胞和用标准干扰素制备物处理的细胞中记录下的颜色改变进行。
简言之，Daudi细胞(ATCC#CCL-213)用RPMI 1640培养基培养，所述培养基补充有100单位/ml青霉素/100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺和20％胎牛血清(FBS)。所有培养基和补充物来自Gibco(Paisley，UK)。试验前一天，将细胞换入新鲜培养基中，密度为0.9×106/ml，且第二日换入除含10％(v/v)FBS外与以上所述培养基相同的新鲜培养基中。细胞密度调整为2×105细胞/ml。
将测试和对照干扰素制备物稀释在含10％FBS的RPMI中。将稀释液加入96孔平底板，每孔100μl，且所有样本设三个重复试验。一般每一平板横向排列成倍系列稀释物。
阳性对照孔也一式三份地包括在内，其中干扰素标准物(NIBSC，SouthMimms，UK)的起始浓度为10000pg/ml。也包括仅含100μl培养基(无干扰素)的对照孔。每孔加入100μl的细胞，且平板在37℃5％CO2条件下孵育72小时。
用Aqueous One试剂系统和供应商推荐的方案(Promega，Southampton，UK)评估增殖。简言之，将40μl Aqueous One试剂加入到所有孔内并混合底物。平板在37℃孵育一小时，然后转移到平板读数装置上以测定吸光度。在490nm处读数。490nm的平均吸光度在Y轴上对应于沿X轴的加入的干扰素标准物浓度作图。
用如实施例6中详细描述的ELISA技术测定干扰素的浓度。产生的校准曲线用于确定每一测试样本的ED50值。
根据以上方法对多种经修饰的IFNα2分子进行分析，结果在图14中显示。结果表明在IFNα2序列内存在氨基酸替代时保留了抗增殖特性。

Claims (70)

1.一种经修饰的分子，其具有人α2干扰素(IFNα2)的生物学活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子。
2.权利要求1的分子，其中，所述的免疫原性丧失通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位和/或通过减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量而实现。
3.权利要求2的分子，其中，去除了一个T细胞表位。
4.权利要求2-4中任意一项的分子，其中，所述原本存在的T-细胞表位是MHC II类配体或表现出经MHC II类分子呈递后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列。
5.权利要求4的分子，其中，所述配体或肽序列为13mer或15mer的肽。
6.权利要求5的分子，其中，所述肽序列选自如图1中所示的肽序列。
7.权利要求2-6中任意一项的分子，其中，在任何原本存在的T细胞表位中1-9个氨基酸残基发生了改变。
8.权利要求7的分子，其中一个氨基酸残基发生了改变。
9.权利要求7或8的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是用其他的氨基酸残基在特定的位置替代原本存在的氨基酸残基。
10.权利要求9的分子，其中，按表2所示进行一个或多个氨基酸残基的替代。
11.权利要求10的分子，其中，另外还按表3所示进行一个或多个氨基酸残基的替代以减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量。
12.权利要求9的分子，其中，按表3所示进行一个或多个氨基酸的替代。
13.权利要求7或8的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是在特定的位置缺失原本存在的氨基酸残基。
14.权利要求7或8的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是在特定的位置向原始序列中添加氨基酸残基。
15.权利要求7-14中任意一项的分子，其中，通过进一步的改变恢复所述分子的生物学活性。
16.权利要求15的分子，其中，进一步的改变是替代、添加或缺失特定的氨基酸。
17.权利要求7-16中任意一项的修饰分子，其中，所述氨基酸的改变是参照同源蛋白序列进行的。
18.权利要求7-16中任意一项的修饰分子，其中，所述氨基酸的改变是参照in silico建模技术进行的。
19.权利要求7-16中任意一项的修饰分子，其中，所述氨基酸的改变是参照IFNα2衍生肽或IFNα2蛋白质对T细胞的刺激或结合而进行的。
20.修饰分子，其具有人α2干扰素(IFNα2)的生物学活性且在体内应用时基本无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性的未修饰分子，所述修饰分子可以通过改变一级序列中的一个或多个氢基酸以(i)除去源自原未修饰分子且为MHC II类配体或表现出经MHC II类分子呈递后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列的一个或多个T细胞表位，和/或以(ii)减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量而获得，其中所述修饰分子在以下源自野生型IFNα2的一级序列的连续氨基酸残基链中的一个或多个位置处包含改变：
(a)ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLH(R1)，
(b)FNLFSTKDSSAAWDE(R2)，
(c)KEDSILAVRKYFQRITLY(R3)。
21.权利要求20的分子，其中所述改变为1-9个氢基酸残基的替代。
22.权利要求21的分子，其中所述替代在R1、R2、和R3链的一个或多个氨基酸残基位置进行。
23.权利要求21的分子，其中所述替代在R2和R3链的一个或多个氨基酸残基位置进行。
24.权利要求21的分子，其中所述替代在R3链的一个或多个氨基酸残基位置进行。
25.权利要求19-24中任意一项的分子，其中在R1、R2和R3链的序列之外，还存在一个或多个氨基酸残基的替代。
26.权利要求19-25中任意一项的分子，其包含的氨基酸残基替代发生在野生型分子的一个或多个位置：24、26、27、38、55、63、64、66、67、76、84、85、89、103、110、111、116、117、119、122、123、126、128、129、130、153位。
27.权利要求25的分子，其包含的氨基酸残基替代发生在野生型分子的一个或多个位置：26、27、38、63、85、89、103、110、111、116、117、122、123、126、128、153位。
28.权利要求27的分子，其中所述替代发生在选自26、27、38的一个或多个位置。
29.权利要求27的分子，其中所述替代发生在63、85或89位。
30.权利要求27的分子，其中所述替代发生在选自103、110、111、116、117、122、123、126、128、153的一个或多个位置。
31.权利要求27的分子，其中所述替代发生在选自26、27、38的一个或多个位置以及63、85或89位。
32.权利要求27的分子，其中所述替代发生在选自26、27、38或者选自63、85、89的一个或多个位置以及选自103、110、111、116、117、122、123、126、128、153的一个或多个位置。
33.权利要求26的分子，其中所述替代发生在图4所示的一个或多个位置。
34.权利要求28的分子，其中所述替代选自L26P、F27S、F38E。
35.权利要求29的分子，其中所述替代选自I63T、Y85S、Y89D、Y89E、Y89N。
36.权利要求30的分子，其中所述替代选自V103E、L110G、M111T、M111S、M111E、I116S、I116Q、L117G、L117A、Y122E、Y122Q、F123H、I126A、L128A、L153S。
37.修饰分子，其具有人α2干扰素(IFNα2)的生物学活性且在体内应用时基本无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性的未修饰分子，所述修饰分子可以通过替代一级序列中的一个或多个氨基酸以(i)除去源自原未修饰分子且为MHC II类配体或表现出经MHC II类分子呈递后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列的一个或多个T细胞表位，和/或以(ii)减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量而获得，其中所述替代在野生型IFNα2a或IFNα2b分子的一个或多个位置处进行，相应于选自以下的组中的至少一个：
(i)I24P、L26P、F27S、F38E、V55A，
(ii)I63T、L66A、F67D、F67E、W76H、F84D、F84E、Y85S、Y89D、Y89E、Y89N，
(iii)序列R3中的任何位置，包括L153S。
38.权利要求37的分子，其中在序列R3内进行了一个或多个以下替代：
V103E，L110G，L110S，M111T，M111S，M111E，I116S，I116Q，L117G，L117A，
V119A，Y122Q，Y122E，Y122H，F123H，I126A，L128A，Y129N，L130G，L130，
L153S
39.权利要求38的分子，其中进行了一个或多个以下替代：
Y122E，Y122Q，F123H，I126A，L128A.
40.权利要求36-39中任意一项的分子，其中还进行了额外替代。
41.具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，其由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMI
QQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRK
X1X2QRX3TX4YLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE，
其中X0为R、K；
X1为Y、E、Q；
X2为F、H；
X3为I、A；且
X4为L、A；
由此排除了同时X1＝Y、X2＝F、X3＝I及X4＝L的情况。
42.具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，所述干扰素由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMI
QQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPX1X2KEDSX3X4AV
RKX5X6QRX7TX8YLKEKKYSPCAWEVVEAEIMRSFSX9STNLQESLRSKE，
其中X0为R、K，
X1为L、S、G，
X2为M、T、S、E，
X3为I、S、Q，
X4为L、G，
X5为Y、E、Q，
X6为F、H，
X7为I、A，
X8为L、A，及
X9为L、S
由此排除同时X1＝L、X2＝M、X3＝I、X4＝L、X5＝Y、X6＝F、X7＝I、X8＝L且X9＝L的情况。
43.具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，所述干扰素由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMI
QQX1X2NX3X6STKDSSAAX5DETLLDKX6X7TELX8QQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSIL
AVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE，
其中X0为R、K；
X1为I、T；
X2为F、D、A；
X3为L、A；
X4为F、D、E；
X5为W、H；
X6为F、D、E；
X7为Y、S且
X8为Y、D、E、N；
由此排除同时X1＝I、X2＝F、X3＝L、X4＝F、X5＝W、X6＝F、X7＝Y且X8＝Y的情况。
44.具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，所述干扰素由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMI
QQX1FNLFSTKDSSAAWDETLLDKFX2TELX3QQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAV
RKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE，
其中X0为R、K；
X1为I、T；
X2为Y、S及
X3为Y、D、E、N；
由此排除同时X1＝I、X2＝Y及X3＝Y的情况。
45.具有减低免疫原性的经修饰的人α2干扰素(IFNα2)，所述干扰素由以下序列组成：
CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRX0ISX1X2SCLKDRHDFGX3PQEEFGNQFQKAETIPX4LHE
MIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAV
RKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE，
其中X0为R、K；
X1为L、P，
X2为F、S，
X3为F、E且
X4为V、A
由此排除同时X1＝L、X2＝F、X3＝F及X4＝V的情况。
46.权利要求41的经修饰的IFNα2序列，其中还进行了额外替代。
47.权利要求46的经修饰的IFNα2序列，其还含有根据权利要求43的替代。
48.权利要求46的经修饰的IFNα2序列，其还含有根据权利要求44的替代。
49.权利要求47或48的经修饰的IFNα2序列，其还含有根据权利要求45的替代。
50.权利要求42的经修饰的IFNα2序列，其还含有额外替代。
51.权利要求50的经修饰的IFNα2序列，其还含有根据权利要求43的替代。
52.权利要求50的经修饰的IFNα2序列，其还含有根据权利要求44的替代。
53.权利要求50或51的经修饰的IFNα2序列，其还含有根据权利要求45的替代。
54.权利要求1的经修饰的IFNα2序列，其中在R1和/或R2和/或R3部分序列内的一个或多个位置进行额外的替代，其中R1、R2、R3的定义如权利要求19中的定义。
55.用于编码权利要求1-54中任意一项的经修饰IFNα2的DNA序列。
56.药物组合物，其包含如上任一项权利要求定义的具有IFNα2生物学活性的经修饰分子，以及任选地药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
57.用于生产如上任一项权利要求定义的具有IFNα2生物学活性的修饰分子的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；
(ii)通过任意方法，包括利用体外或in silico技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；
(iii)设计新的序列变体，其中，经鉴定的潜在T-细胞表位内有一个或多个氨基酸经过修饰，由此基本上减弱或去除了所述T-细胞表位的活性，这一效果可由体外或in silico技术或生物学试验通过所述肽与MHC分子的结合来确定，或通过肽-MHC复合体与T细胞的结合来确定；
(iv)通过重组DNA技术构建所述序列变体，并检测所述的变体以便鉴定一个或多个具有所需性质的变体；和
(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)。
58.权利要求57的方法，其中步骤(iii)通过在任何原本存在的T-细胞表位中替代、添加或缺失1-9个氨基酸残基进行。
59.权利要求57的方法，其中所述改变参照同源蛋白质序列和/或in silico建模技术来进行。
60.权利要求57-59中任意一项的方法，其中步骤(ii)是通过下述步骤进行的：(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；(b)由所选择的区域中顺序抽取预定统一大小且至少由3个氨基酸残基组成的重叠氨基酸残基片段；(c)通过对存在于抽样氨基酸残基片段中的每个疏水氨基酸残基侧链赋值求和，计算每一抽样片段的MHC II类分子结合分值；和(d)根据计算出的该片段的MHC II类分子结合分值鉴定至少一个适于修饰的片段，以在基本上不减弱所述肽的治疗功效的前提下改变肽的整体MHC II类结合分值。
61.权利要求60的方法，其中步骤(c)通过下述步骤利用经改进而包含了12-6范德华配体-蛋白能量排斥项和配体构象能量项的Bhm评分函数进行，所述步骤为(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；(2)提供所述MHC II类分子模型的容许肽主链的第二数据库；(3)从第一数据库中筛选模型；(4)从第二数据库中筛选容许肽主链；(5)鉴定在每个抽样片段中存在的氨基酸残基侧链；(6)确定存在于每个抽样片段中的所有侧链的结合亲和性值；以及对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)到(5)。
62.由13个连续的氨基酸残基组成的肽分子，其具有潜在MHC II类结合活性且从未修饰的IFNα2的一级序列产生，并选自图1、图6a，6b，6c中所示的肽序列。
63.由15个连续氨基酸残基组成的肽分子，其具有潜在MHC II类结合活性且从未修饰的IFNα2的一级序列产生，并选自权利要求19所述R1、R2、R3部分序列之任一个。
64.权利要求63的肽分子，其选自图7。
65.由至少9个连续氨基酸残基组成的肽序列，其选自权利要求62-64中定义的T细胞表位肽。
66.由9-15个连续氨基酸残基组成的肽分子，其具有潜在MHC II类结合活性且从未修饰的IFNα2的一级序列产生，其中所述分子在细胞增殖生物试验中的刺激指数为至少1.8，其中所述指数通过将肽刺激后细胞增殖的得分值除以未接受肽刺激的对照细胞的增殖得分值而获得，其中细胞增殖的测定可根据标准方法通过任何适宜手段进行。
67.权利要求66的肽分子，其由图6或7中所示的序列组成。
68.权利要求66的肽分子，其包含至少9个连续氨基酸残基，其中所述连续氨基酸残基来自权利要求19中定义的IFNα2部分序列R1、R2、R3中的任一个。
69.权利要求62-68中任意一项的肽的用途，用于制备修饰的IFNα2分子，该分子体内应用时基本无免疫原性或免疫原性低于具有相同的生物学活性或可接受程度的降低生物学活性的任何未修饰分子。
70.药物组合物，其由权利要求62-68中任意一项所述的合成肽序列，及任选地药学可接受载体、稀释剂或赋形剂组成。
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