CN105200017A - 一种去除a47l降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒,通过去除显性表位A47L重组痘苗病毒,从而降低痘苗病毒免疫优势的方法。以野生型痘苗病毒Western?Reserve株为载体,去除A47L基因同时插入卵清蛋白(OVA)基因,构建表达OVA的重组病毒VACV-ΔA47L-OVA,并筛选纯化。本发明去除了显性表位A47L对外源抗原免疫原性的影响,可有效降低痘苗病毒的免疫优势效应,增加外源性抗原的免疫原性,从而提高以痘苗病毒为载体的活疫苗的有效性。可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因工程及免疫领域,具体涉及一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法及病毒。
背景技术
痘苗病毒是一种大分子DNA病毒,是人类消灭天花的主要疫苗,能够引起强烈的免疫反应和超长的免疫记忆。由于活痘苗病毒作为疫苗在天花免疫中的成功应用,痘苗病毒被当做衡量一个疫苗有效与否的“金标准”,受到广泛的重视。
现阶段世界上多个以痘苗病毒为载体的,旨在预防感染性疾病以及肿瘤的重组疫苗已经进入临床测试阶段,但其中的多数均未能达到理想的免疫效果。一个重要的原因就是,在重组疫苗引发的免疫应答中,针对载体本身的反应牢固地占据着优势地位,并显著地抑制了外源性目的抗原的免疫原性,即疫苗载体的免疫优势效应。痘苗病毒自身的一些表位,尤其是一些优势表位(dominantepitope)如B8R、A47L、K3L等的存在,能够在很大程度上影响宿主针对外源抗原的免疫应答。在保持痘苗病毒感染和复制能力的前提下,去除病毒本身的一些优势表位,从而降低载体本身对外源性目的抗原的限制作用,对于提高重组疫苗的有效性势必具有非常重要的作用。
A47L是痘苗病毒上的一种重要的Db限制性的杀伤性T细胞表位。A47L位于痘苗病毒基因组的右侧末端,在正痘病毒中高度保守,而在其他非正痘病毒中缺乏相似序列。A47L在痘苗病毒感染中高转录高表达,但其功能在痘苗病毒生长和复制过程中是非必需的。
发明内容
为降低作为疫苗载体的痘苗病毒的免疫优势,提高重组痘苗病毒疫苗的安全性和有效性,本发明提供了一种重组痘苗病毒的方法,以痘苗病毒WesternReserve株为骨架,在去除A47L基因的同时插入卵清蛋白(OVA)基因,构建表达OVA的重组病毒VACV-ΔA47L-OVA,此为本发明的目的。去除痘苗病毒的优势表位A47L对外源抗原免疫原性的抑制,可有效降低痘苗病毒自身的免疫优势,增加外源性抗原(如OVA)的免疫原性。本发明生成的A47L基因缺失的重组痘苗病毒(VACV-ΔA47L),可为疫苗和基因治疗提供更为有效的载体,此为本发明的另一目的。
本发明所述的重组痘苗病毒,是将野生痘苗病毒的A47L基因替换为带有LacZ标记的OVA基因得到的重组痘苗病毒。
在本发明的实例中,所述野生痘苗病毒为野生型WR株痘苗病毒,所述的野生型WR株痘苗病毒的基因组DNA序列为GenBank号为AY243312.1的序列(VRL14-MAR-2006)。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种重组痘苗病毒的构建方法,包括如下步骤:
S1、构建质粒pSC11A47L-OVA;
S2、pSC11A47L-OVA在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组;
S3、筛选纯化获得重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)。
其中,所述步骤S1的具体步骤如下:
S11、取冻存的野生型痘苗病毒和本实验室构建的VACV-OVA病毒,使用Biomiga病毒基因组提取试剂盒,提取基因组DNA;
S12、根据野生型痘苗病毒的A47L基因及其上下游序列,设计引物,以野生型痘苗病毒基因组DNA为模板,PCR获得A47L基因的上下游同源序列臂A47LL如A47LR。
S13、将获得的上下游同源臂A47LL和A47LR通过酶切和连接的方法分别替代pSC11质粒的TKL和TKR,获得中间质粒pSCA47L。
S14、根据GenBank中OVA基因序列,设计引物,以VACV-OVA病毒基因组DNA为模板,通过PCR获得OVA基因,将获得的OVA基因插入中间质粒pSCA47L的P7.5启动子之后,得到痘苗病毒重组工具穿梭质粒pSCA47L-OVA。
其中,所述步骤S2的具体步骤如下:
待培养的CV-1细胞至80%单层时,以0.05MOI感染野生型痘苗病毒并使用Lipofectamine2000转染pSC11A47L-OVA质粒至感染细胞中,48小时后,收集病毒。
其中,所述步骤S3的具体步骤如下:
取上述收集的病毒反复冻融三次,超声破碎后感染新的CV-1细胞,并覆盖琼脂培养基;2天后,加入含有300μg/mLX-gaI的上层培养基筛选重组病毒。挑取孤立蓝斑病毒,连续单斑纯化5代。经PCR、基因测序和WesternBlot进行分子生物学鉴定无误后,进行重组病毒的体外增殖,并将最终收获的病毒采用密度梯度离心纯化,保存于-80℃。
本发明具有以下有益效果:
证实A47L为痘苗病毒本身具有的与复制和感染无关、但却显著抑制外源抗原免疫性的表位,去除A47L后,在痘苗病毒载体中插入的外源性抗原能够成功地诱导有效的细胞免疫应答,并能够产生免疫记忆,再次感染诱发的细胞免疫反应明显增强。本发明构建的去除A47L基因的重组痘苗病毒,可显著提高以痘苗病毒为载体的疫苗的有效性,为疫苗研发提供良好的方法和载体。
附图说明
图1为本发明实施例中构建的pSC11A47L-OVA质粒图谱。
图2为本发明实施例中穿梭质粒目的基因插入的检测,其中泳道A为插入质粒的目的条带OVA(1527bp),泳道B为质粒未插入目的基因产生的条带(347bp)。
图3为本发明实施例中质粒pSC11A47L-OVA酶切鉴定示意图,其中泳道A为基因错误连接的酶切结果,泳道B为目的基因正确连接的酶切结果,均与使用VectorNTI分析的酶切结果(右侧)一致。
图4为本发明实施例中重组病毒的蓝斑筛选。
图5为本发明实施例中重组病毒的密度梯度离心纯化。
图6为本发明实施例中重组病毒中的A47L基因,以A47L鉴定引物对进行PCR反应,其中泳道A和B分别为VACV-ΔA47L和VACV-ΔA47L-OVA产生的A47L缺失的条带(502bp),泳道C野生型痘苗病毒产生的A47L条带(1261bp)。
图7为本发明实施例中重组病毒中外源目的基因OVA扩增,其中泳道A显示在野生型痘苗病毒中无特异性条带产生,泳道B为VACV-ΔA47L-OVA产生的OVA条带,泳道C为VACV-OVA阳性对照。
图8为本发明实施例中外源性目的蛋白OVA的表达,其中泳道A和B分别为VACV-ΔA47L-OVA和阳性对照VACV-OVA感染细胞后表达的OVA蛋白条带,泳道C显示野生型痘苗病毒感染后细胞中无OVA蛋白表达。
图9为本发明实施例中重组病毒在BSC-1细胞中的生长曲线。
图10为本发明实施例中重组病毒在CV-1细胞中的生长曲线。
图11为本发明实施例中重组病毒诱导的初次细胞免疫应答。
图12为本发明实施例中重组病毒诱导的免疫记忆。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例
本实施例中痘苗病毒WR株在西安医学院分子病毒与病毒免疫学实验室(本实验室,下同)保藏,内嵌OVA基因的重组痘苗病毒(VACV-OVA)由申请人构建并在本实验室保藏,仅去除A47L基因未插入任何片段的重组痘苗病毒(VACV-ΔA47L)由申请人构建并在本实验室保藏。质粒pSC11由BernardMoss教授(美国NIH)惠赠,细胞株CV-1和BSC-1购自中国典型培养物保藏中心。所使用的小鼠为雌性6周龄C57BL/6小鼠,体重18-22g,购于中国预防医学科学院动物繁育中心,饲养及实验均在恒温恒湿的SPF级鼠房内进行。
主要试剂和材料:
DMEM,胎牛血清,脂质体(lipofectamine2000)转染试剂均购自Invitrogen公司,Taq酶、限制性内切酶及T4DNA连接酶均购自NEB公司,病毒基因组提取试剂盒购自Biomiga公司,质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。
步骤1、质粒pSC11A47L-OVA的构建和鉴定
将野生痘苗病毒WR株的基因组DNA序列的第152935-153939位(对应序列1的1-1005位,命名为上游同源左臂A47LL)和154628-155517位(对应序列2的1-890位,命名为下游同源右臂A47LR),分别克隆替换pSC11质粒的TKL和TKR,进而将OVA基因连接到pSC11质粒的启动子P7.5之后,得到重组质粒pSC11A47L-OVA。
具体操作如下:
1.1野生型痘苗病毒WR株基因组DNA和VACV-OVA病毒基因组DNA提取
(1)取-80℃冻存的野生型痘苗病毒和VACV-OVA病毒各200μl,4℃解冻。
(2)加入等体积的PLYbuffer,漩涡混匀,室温放置15分钟。
(3)加入0.5倍体积的无水乙醇,移液器混匀。
(4)转移裂解液至吸附柱中,13000rpm离心1分钟,将过滤柱转移至一个新的收集管中。
(5)向过滤柱中加入650μlWashbuffer,13000rpm离心1分钟,弃废液。
(6)重复洗一次,弃废液。
(7)将过滤柱放入收集管中13000rpm离心2分钟以去除残留的乙醇。
(8)过滤柱放入新的收集管中,向过滤柱中加入30-50μlDEPC水,室温静置3分钟。
(9)13000rpm离心1分钟,洗脱DNA。
(10)野生型痘苗病毒基因组DNA和VACV-OVA基因组DNA放置于-20℃备用。
1.2引物设计与合成
根据野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列设计并合成如下两对引物:
扩增A47L上游同源臂的引物对:
A47LL-F1:5’-CCCAAGCTTTGATTCCATAGGCAGTCCAG-3’(下划线之前部分为保护碱基,下划线部分为HindIII酶切位点识别序列,其后序列为GenBank:AY243312.1的第152935-152954位,即序列1的第1-20位)
A47LL-R1:5’-AACTGCAGATAAGGTGATTGGAATGGG-3’(下划线之前部分为保护碱基,下划线部分为PstI酶切位点识别序列,其后序列为GenBank:AY243312.1的第153921-153939位的反向互补序列,即序列1的第987-1005位的反向互补序列);
扩增A47L下游同源臂的引物对:
A47LR-F1:5’-TCCCCCCGGGGATGGACAGTCTATTTTCCTTAG-3’(下划线之前部分为保护碱基,下划线部分为XmaI酶切位点识别序列,其后序列为GenBank:AY243312.1的第154628-154650位,即序列2的第1-23位)
A47LR-R1:5’-TATGGCGCCTATTGATGCGAGTTCGGTATG-3’(下划线之前部分为保护碱基,下划线部分为KasI酶切位点识别序列,其后序列为GenBank:AY243312.1的第155497-155517位的反向互补序列,即序列2的第870-890位的反向互补序列)。
根据OVA基因序列设计并合成引物:
OVA-F1:5’-CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG-3’(下划线之前部分为保护碱基,下划线部分为NcoI酶切位点识别序列,其后为序列3的第1-19位)
OVA-F2:5’-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3’(下划线之前部分为保护碱基,下划线部分为XmaI酶切位点识别序列,其后为序列3的第1161-1180位的反向互补序列)。
1.3穿梭质粒pSC11A47L-OVA的构建及鉴定
(1)以步骤1.1中野生型痘苗病毒基因组DNA为模板,以步骤1.2中合成的A47L上下游同源臂引物对分别进行PCR,获得带有相应酶切位点的A47L的上下游同源臂A47LL和A47LR,以步骤1中VACV-OVA基因组DNA为模板,以步骤2中合成的OVA引物对进行PCR,获得带有相应酶切位点的OVA基因片段。
PCR扩增体系如下:DNA1μl,dNTPmix(2.5mM)5μl,正向引物F(10μM)1μl,反向引物R(10μM)1μl,10×Taqbuffer5μl,Taq酶1μl,加DEPC水至总体积50μl。
PCR扩增条件如下:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸80s,循环30次;72℃延伸5min,最后置于4℃。
PCR扩增结果:PCR产物上样电泳,A47LL为1022bp,A47LR为909bp,OVA为1200bp,切胶回收目的条带。
(2)首先用限制性内切酶HindIII和PstI对上游同源臂A47LL进行双酶切,与经同样双酶切的pSC11质粒的大片段进行连接,得到中间质粒pSC11-A,接着用限制性内切酶XmaI和KasI对下游同源臂A47LR进行双酶切,与经同样双酶切的中间质粒pSC11-A的大片段进行连接,得到中间质粒pSC11A47L,最后用限制性内切酶NcoI和XmaI对OVA基因片段进行双酶切,与经同样双酶切的中间质粒pSC11A47L的大片段进行连接,获得重组质粒,酶切和测序鉴定无误后,得到质粒pSC11A47L-OVA。
具体步骤如下:
酶切体系如下:1μg相应质粒或基因片段,2μL10xTbuffer,2μLBSA,5U相应的限制性内切酶,ddH2O定容至20μL。酶切条件37℃,3h。
酶切产物上样电泳,切胶回收线性条带;将目的条带与载体连接;
连接反应体系如下:3μL目的片段,1μL线性质粒,1μLDNA连接酶,1μL10xbuffer,定容至10μL,16℃连接过夜;
向冰上解冻的感受态DH5a中加入上述连接产物5μL,混匀后冰上静置30min;42℃热击1min;冰上放置5min后,加入500μL预热的LB培养基,摇床培养30-60min;3000rpm离心5min,弃上清;重新加入30μL新鲜LB培养基,混匀后涂布含Amp的LB固体平板;37℃培养过夜,不超过16h。挑取单克隆细菌接种到含Amp的液体培养基,摇床培养,180rpm,14h;对挑取的单克隆细菌培养物进行菌落PCR,验证外源基因OVA是否有效插入。
验证引物对:
OVA-F2:5’-GGGAAGGATCGACAGATTTG-3’
OVA-R2:5’-GCTAGTCACAATCACCACTTTC-3’
体系如下:菌液1μL,10xTaqbuffer2.5μL,dNTP2μL,Taq酶0.5μL,引物各1μL,ddH2O定容至25μL。扩增条件如下:95℃预变性5min;95℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸90s,循环30次;72℃延伸5min,置于4℃。PCR产物上样电泳,对符合要求的细菌培养物提取质粒;使用XhoI和EcoRV对上一步得到的质粒进行双酶切,上样电泳验证大小,并与VectorNTI分析预测的酶切结果进行比对。对验证正确的克隆送上海英潍捷基公司进行测序。
步骤2、痘苗病毒的重组和筛选
2.1痘苗病毒重组
(1)以T25培养瓶培养CV-1细胞至80%单层;
(2)以0.05MOI感染野生型痘苗病毒,37℃培养2小时;
(3)去除病毒液,按照转染试剂Lipofectamine2000说明书转染pSC11A47L-OVA至感染细胞中,培养48小时;
(4)收集细胞,反复冻融三次,进行超声破碎后,保存于-80℃。
2.2VACV-ΔA47L-OVA病毒的筛选
(1)用6孔板培养CV-1细胞至80%单层;
(2)取经超声破碎后的病毒悬液,做倍比稀释,感染CV-1细胞,37℃培养2小时;
(3)每孔覆盖3ml琼脂培养基,培养2天;
(4)每孔加入2ml含X-gaI的上层琼脂培养基,培养过夜;
(5)观察蓝斑产生情况,挑取孤立蓝斑进行进一步筛选,连续单斑纯化5代,至病毒纯化。
步骤3、重组病毒的鉴定和纯化
3.1重组病毒的鉴定
将上述重组痘苗病毒VACV-ΔA47L-OVA经BSC-1细胞连续传代(>10次)后,提取重组病毒DNA,使用PCR验证其中的A47L和OVA基因,并用WesternBlot验证OVA蛋白在感染细胞中的表达。
3.3.1PCR鉴定A47L和OVA基因
A47L鉴定引物:
A47L-JDF1:5’-AGTATAGGTGTATGGCATTAGCC-3’(野生型痘苗病毒第153679-153701位,即序列1的第745-767位)
A47L-JDR1:5’-AGTGACAGTGGATCTCTGAGG-3’(野生型痘苗病毒第154889-154909位的反向互补序列,即序列2的第262-282位的反向互补序列)
OVA鉴定引物:
OVA-F1:5’-CATGCCATGGATGGGCTCCATCGGCGCAG-3’
OVA-R1:5’-TCCCCCCGGGTTAAGGGGAAACACATCTGC-3’
以纯化的重组痘苗病毒的基因组DNA为模板,用上述3对鉴定引物进行PCR检测反应,同时分别设置野生型痘苗病毒和/或重组痘苗病毒VACV-OVA或VACV-ΔA47L的基因组DNA为模板的对照。
PCR扩增体系为:
PCR扩增条件为:95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,58℃退火30秒,72℃延伸90秒,循环30次;72℃延伸10分钟,最后置于4℃;
PCR结果:PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,观察条带并回收目的片段送测序。
3.1.2WesternBlot验证OVA蛋白表达
(1)小量增殖经纯化的重组痘苗病毒,至70%细胞病变时,收取细胞;
(2)离心,将上清转移至15ml离心管内,加入等体积饱和硫酸铵溶液,置于旋转摇床4℃过夜,使蛋白质充分沉淀;
(3)细胞用PBS洗两次后,加1mlRIPA裂解液混匀,摇床冰上震荡1小时,4℃/12000rpm离心10分钟,取上清置于新的1.5ml离心管中,-20℃过夜后,将上清液4℃/12000rpm离心10分钟,弃上清保留沉淀;
(4)将上述两步收获的混匀,-20℃保存备用。
按照改良的BCA蛋白定量分析试剂盒提供的蛋白定量方法,进行蛋白的定量分析。一抗采用兔抗OVA抗体,二抗采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体,暗室中进行曝光检测重组痘苗病毒的OVA蛋白表达,同时以野生型痘苗病毒为阴性对照,以VACV-OVA为阳性对照。
3.2重组病毒的纯化
取鉴定无误后的重组痘苗病毒,用BSC-1细胞进行培养增殖。将收获的病毒采用密度梯度离心进行纯化,分装后保存于-80℃。
步骤4、各项指标检测
4.1重组病毒的生物学特性
以野生型痘苗病毒和重组病毒(VACV-ΔA47L和VACV-ΔA47L-OVA)分别感染CV-1和BSC-1细胞,感染剂量为0.05MOI,培养条件为34℃/5%CO2。分别于12、24、36、48、60、72小时收获细胞,冻融3次,超声破碎后,测定滴度并绘制病毒生长曲线。
4.2细胞免疫应答反应检测
C57BL/6小鼠随机分组,每组3-4只,每只小鼠腹腔注射200μL内含滴度为106PFU的野生型或重组病毒。初次免疫应答组7天后收集小鼠脾脏细胞,抗原肽A47L或OVA257-264刺激后分别进行细胞表面分子和胞内细胞因子染色,标记CD8+和IFN-γ+细胞。免疫记忆组在初次感染病毒6周后,每只小鼠再次注射106PFU的重组病毒VACV-ΔA47L-OVA,7天后收集小鼠脾脏细胞,抗原肽刺激后标记CD8+和IFN-γ+细胞。流式细胞检测采用美国BectonDickinson公司FACScan流式细胞仪,每份样品均测定2x105细胞,采用FlowJo软件对流式结果进行分析。每实验重复三次。
结果
1、转移质粒pSC11A47L-OVA的构建与鉴定
构建成功的质粒pSC11A47L-OVA如图1所示。使用OVA-F1/R1引物对以VACV-OVA基因组DNA为模板扩增OVA基因,将其连接入线性化的中间质粒pSC11A47L载体中。使用验证引物OVA-F2/R2引物对,以PCR反应验证外源基因OVA导入情况,PCR扩增后得到大小为1527bp的产物(图2),与预期大小一致。对于成功导入的质粒,用酶切方法鉴定外源基因插入的正确性,并与使用VectorNTI分析预测的酶切结果(图3)进行比对,确定正向连接的质粒,并经测序验证无误。
2、重组病毒的鉴定
采用蓝斑筛选法连续纯化5代(图4),采用基因测序并使用PCR和WesternBlot进行分子生物学鉴定无误后,进行重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)的体外增殖,并将收获的病毒采用密度梯度离心进行纯化(图5),分装后保存于-80℃。使用PCR验证重组病毒中的A47L基因和OVA基因,并用WesternBlot验证OVA蛋白在感染细胞中的表达。检测结果表明A47L在重组病毒中稳定缺失(图6),而插入的OVA基因经多次传代后仍稳定存在(图7),其产物表达良好,表现为45kD的蛋白条带(图8)。
3、重组病毒的生物学特性
以野生型痘苗病毒和重组病毒(VACV-ΔA47L和VACV-ΔA47L-OVA)分别感染BSC-1和CV-1细胞,在不同时间收获病毒并绘制病毒生长曲线。结果表明,在同一时间点,三种病毒空斑形成的大小、形状无明显差别;VACV-ΔA47L-OVA在BSC-1和CV-1细胞中的生长曲线与对照的野生型痘苗病毒和VACV-ΔA47L均非常相似(图9、图10)。A47L基因缺失及外源OVA插入对病毒本身的生物学特性,包括空斑形成和在细胞中的繁殖复制等无明显影响。
4、重组病毒引发的免疫应答
给予C57BL/6小鼠腹腔注射106PFU剂量的重组病毒VACV-ΔA47L-OVA,7天后检测发现,相比野生病毒,针对A47L的免疫应答被消除,但重组病毒可成功诱导针对OVA的特异性细胞免疫应答(图11);在初次免疫6周后给予免疫加强,则针对OVA的免疫应答明显增强(图12)。以上结果表明,去除A47L后,其他强抗原表位包括外源性抗原,仍旧能够成功诱导初次免疫应答并具有免疫记忆效应。
综上所述,外源性OVA基因导入痘苗病毒后,对痘苗病毒的生物学特性无明显影响,且具有良好的表达;A47L缺失能够稳定传代,且对痘苗病毒的生物学特性无明显影响。去除A47L的重组病毒能够引起有效的针对OVA的细胞免疫反应和免疫记忆效应。因此,去除A47L的痘苗病毒可更好地表达外源性基因。通过去除病毒本身的抑制性表位,可望为多价抗原复制性疫苗提供更为有效的痘苗病毒载体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种去除A47L基因从而降低自身免疫优势的重组WR株痘苗病毒。
2.一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法,其特征在于,利用病毒体外重组,以OVA取代A47L,获得A47L基因缺失的重组痘苗病毒,包括如下步骤:
S1、构建质粒pSC11A47L-OVA;
S2、在CV-1细胞中与野生型痘苗病毒重组;
S3、通过多轮筛选获得重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)。
3.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法,其特征在于,在质粒pSC11中插入A47L左右侧同源序列(分别为A47LL和A47LR)及OVA,抗性筛选标记为氨苄青霉素抗性基因,同时包含重组病毒筛选标记LacZ基因。
4.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法,其特征在于,所述步骤S1的具体步骤如下:以野生型痘苗病毒的基因组DNA为模板,通过PCR获得A47L左右侧同源片段,通过酶切和连接的方法,以A47LL替代质粒pSC11的TKL片段,A47LR替代质粒pSC11的TKR片段,以VACV-OVA病毒基因组DNA为模板,通过PCR获得有合适酶切位点的OVA基因片段,通过酶切和连接的方法将OVA片段插在P7.5启动子之后。
5.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法,其特征在于,利用质粒pSC11A47L-OVA对野生型痘苗病毒进行体外重组,最终以OVA取代病毒中的A47L。
6.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法,其特征在于,所述步骤S2的具体步骤如下:培养CV-1细胞至80%单层时,以0.05MOI感染野生型痘苗病毒病毒并使用Lipofectamine2000转染pSC11A47L-OVA质粒至感染细胞中,48小时后,收集病毒。
7.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法,其特征在于,利用蓝斑筛选和密度梯度离心纯化重组病毒。
8.根据权利要求2所述的一种去除A47L降低痘苗病毒免疫优势的方法,其特征在于,所述步骤S3的具体步骤如下:取步骤S2收集的病毒冻融三次并超声破碎后感染CV-1细胞,并覆盖琼脂培养基;2天后,加入含有300μg/mLX-gal的上层培养基。挑取孤立蓝斑病毒。重复以上步骤单斑纯化5代,鉴定无误后,使用CV-1细胞进行重组病毒(VACV-ΔA47L-OVA)的体外增殖。将收获的病毒反复冻融三次,超声破碎后采用密度梯度离心纯化病毒,分装保存于-80℃。
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CN105695510A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-06-22 | 西安医学院 | 去除b8r和a47l的重组痘苗病毒及制备方法和应用 |
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