CN102888383B - 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株 - Google Patents

一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株 Download PDF

Info

Publication number
CN102888383B
CN102888383B CN201210128876.5A CN201210128876A CN102888383B CN 102888383 B CN102888383 B CN 102888383B CN 201210128876 A CN201210128876 A CN 201210128876A CN 102888383 B CN102888383 B CN 102888383B
Authority
CN
China
Prior art keywords
prv
puc19
gene
virus
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201210128876.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102888383A (zh
Inventor
邵定勇
黄红亮
陈瑞爱
韩静芳
唐兆新
谢小雨
任常宝
梁桂益
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Wens Dahuanong Biotechnology Co Ltd
Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co ltd
Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co ltd, Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co ltd
Priority to CN201210128876.5A priority Critical patent/CN102888383B/zh
Publication of CN102888383A publication Critical patent/CN102888383A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102888383B publication Critical patent/CN102888383B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明分离了一株猪伪狂犬病毒GDXX株，并以该分离株为母本，通过分子生物学手段，依次缺失胸腺嘧啶核苷酸激酶（TK）基因和gE基因，获得重组病毒PRV/TK－/gE－。以该重组病毒为疫苗毒株研制生产安全高效的猪用伪狂犬活疫苗。

Description

一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株
技术领域
本发明涉及伪狂犬病毒技术领域，具体地讲，涉及一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株及其制备方法，以及用含该重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的基因工程疫苗。
背景技术
伪狂犬病毒(Psedorabies virus，PRV)属于疱疹病毒(Herpesviridac)α疱疹病毒亚科(Alphaher-pesririnae)水痘病毒属(Varicello virus)的疱疹病毒I型(Porcine herpesvirus TypeI)，能引发猪的严重疾病。同时，猪既是伪狂犬病毒的贮存者，也是伪狂犬病毒的传染源，控制猪伪狂犬病不仅对养猪业本身，而且对其它动物的养殖也有着十分重要的意义。疫苗免疫接种是预防控制与消灭伪狂犬病的根本措施。
早期的猪伪狂犬疫苗主要是弱毒疫苗和灭活疫苗。
早期弱毒疫苗都是通过非猪源细胞的反复传代，或鸡胚接种传代，或在某些致突变剂的存在下，在高于通常培养温度的条件下在细胞培养物上反复继代获得。目前常用的猪伪狂犬病弱毒疫苗有匈牙利Bartha-K/61株、罗马尼亚BC株、美国的BUK株和Norden株，其它如MK-21、MK-35、ALFORT-26、NIA-4等。弱毒疫苗(天然基因缺失疫苗)虽然在伪狂犬病免疫防制方面有一定的效果，但是其毒力返强的可能性很大，并能导致疾病的流行。未经充分致弱或过度致弱的疫苗株不仅不能诱导满意的免疫保护反应，反而可能引起疾病及免疫抑制；弱毒疫苗可建立潜伏感染，并存在散毒的危险，而且部份接种猪虽然血清中存在中和抗体，但带毒期却可持续数年。
灭活疫苗是将强毒株在BHK-21、IBRS-2等细胞上培养，用甲醛灭活制得，它克服了弱毒疫苗的缺点。但灭活疫苗用量大，有时导致注射部位肿胀等不良反应。
此后，随着对伪狂犬病毒研究的深入，特别随着是分子生物学理论和技术的进步，从上世纪80年代初开始，世界各国相继启动了伪狂犬基因缺失疫苗的研究。伪狂犬病基因缺失疫苗是利用基因工程技术在PRV基因组中插入或缺失一段序列，致使PRV的某些基因(特别是一些毒力基因)不能表达，从而使PRV的毒力减弱，同时又保持其较强的免疫原性。
第一代基因缺失疫苗主要是缺失TK基因。TK基因是伪狂犬病毒主要的毒力基因，其编码的胸腺嘧啶核苷激酶是核酸代谢中的重要酶类，催化脱氧胸腺嘧啶核苷的磷酸化反应，合成dTMP。虽然TK是核苷酸代谢的重要酶类，其缺失对病毒的生长有一定的影响，但并非病毒DNA复制所必需的基因。TK缺失不仅不影响病毒的免疫原性，而且还极大地降低了病毒的毒力。此外，TK缺失突变株毒力返强的可能性很低。总之，TK是伪狂犬病毒最重要的毒力基因之一，目前构建的伪狂犬病毒基因工程疫苗大多为TK缺失突变株。
第一代基因缺失疫苗的代表毒株有BUK-d13，NIA-3，ADV-783，Begonia等毒株。其中BUK-d13是世界上第一个获得批准使用的基因工程缺失疫苗株，它是以PPV BUK株为起始材料，通过缺失TK基因序列的148bp而获得。BUK疫苗株是将其亲本病毒通过鸡胚细胞传代800代以上获得的，其US区的gE基因存在缺失。因此，BUK-d13除了TK基因缺失外，还有来自BUK疫苗株的gE缺失。该毒株在细胞培养物上，即使在含有HAT的选择条件下也不能回复为TK+。
第二代基因缺失疫苗是在TK缺失疫苗的基础上发展起来的，如TK-/gE-，TK-/gC-，TK-/gG-等，它们比TK缺失的疫苗更优越。原来的TK缺失疫苗只能采用核酸杂交、限制性内切酶指纹图谱、空斑放射自显影等技术同野毒株区别。第二代基因缺失疫苗除TK缺失外，在编码非必需糖蛋白的基因内引入一个新的缺失，或插入一个报告基因，这样得到的突变株不能产生缺失糖蛋白，免疫动物后不能产生相应抗体，因此可以通过血清学方法将免疫按种猪与自然感染野毒的猪相互区别。
Marchioli C C等和Van Zijl M等分别构建了缺失TK和gG基因的PRV疫苗株和缺失TK和gE基因的疫苗株(783株)。Mettenleiter T C等报道，在建立表达PRV gD基因细胞系的基础上，从PRV的BamHI-7片段中缺失了5.1kb的片段(含有gG、gD、gE、gI基因的编码序列)，构建出了PRV的gG-/gD-/gE-/gI-的四基因缺失株PRV 376株。
颜其贵等构建了PRV Fa gI-/gD-基因缺失株，小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一定的免疫原性。周复春等构建了一系列基因缺失株(PRV Ea TK-、TK-/LacZ+、TK-/gG-/LacZ+等)。
Liu Z等将LacZ基因表达试剂盒插入到PRV Ea株基因组的gE区，通过蓝斑筛选和纯化，得到了TK-/gE-/LacZ+PRV。利用LacZ基因处的EcoRI酶切位点来消化PRV Ea TK-/gE-/LacZ+基因组DNA，并与质粒pFBBS在PK-15细胞上进行共转染。经过蚀斑纯化得到了TK-/gE-/gD-PRV。通过小鼠试验表明，此TK-/gE-/gD-PRV的毒力明显减弱。
目前国内有两种猪伪狂犬基因缺失苗已获新兽药证书并投放市场，即四川农大郭万柱教授主持研发的猪伪狂犬活疫苗(S215株)和华中农业大学陈焕春教授主持研发的的猪伪狂犬活疫苗(HB98株)。
第三代基因缺失疫苗是以第一、第二代基因缺失苗作为载体，表达其它病毒抗原性基因，从而可以防治多种疾病。此项研究目前正是该领域的热点问题之一。其首要问题是解决安全性和免疫效果的难关，但其前景受到普遍看好。
在欧美等发达国家，得利于PRV基因缺失苗和相应鉴别诊断方法的应用，该病已得到控制或根除；但在发展中国家，该病仍频繁发生，严重制约了这些国家和地区养猪业的健康发展。就我国的实际情况看，PRV在我国的根除显然不是一个短期能实现的目标，PRV基因缺失苗在现在及将来更长一段时间内都会有广阔的市场前景。而且随着我国养殖科技化程度的逐步提高和伪狂犬根除计划的逐步开展，对PRV疫苗的需求也会更加旺盛。目前国内市场上虽然存在数种猪伪狂犬基因缺失苗，但进口疫苗售价高昂，而国产疫苗品质并不尽如人意，市场对于物美价廉的高品质国产疫苗的需求极为迫切。
发明内容
为此，本发明分离了和鉴定了猪伪狂犬病毒株，命名为PRV-GDXX，并以猪伪狂犬病毒GDXX株为母本，通过分子生物学手段，依次缺失胸腺嘧啶核苷酸激酶(PRV TK)基因和gE基因，获得重组病毒PRV/TK-/gE-，以该重组病毒为疫苗毒株研制生产安全高效的猪用伪狂犬活疫苗。
本发明的技术方案如下：一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株，该病毒株的保藏名称为：猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK-/gE-；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2012年3月1日；保藏号为：CCTCC V201212
所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的构建方法，包括如下步骤：
(1)分离和鉴定猪伪狂犬病毒株，命名为PRV-GDXX；
(2)TK缺失用转移载体的构建  以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物扩增TK同源重组左臂LTK；和右臂RTK；用EcoRI酶切pUC19，补平后连接转化，获得消除EcoRI位点的pUC19/E；同样方法消除HindIII，获得质粒PUC19/HE；以KpnI/XbaI双酶切LTK和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LTK；再以XbaI/SphI酶切RTK和pUC19/HE-LTK，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-TK；消除pUC19/HE-TK中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK-TK；用XbaI酶切pUC19/HEK-TK，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得TK缺失用转移载体pUC19-TK/EGFP。
(3)gE缺失用转移载体构建  以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物对扩增gE同源重组左臂LgE和右臂RgE；以KpnI/XbaI双酶切LgE和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LgE；再以XbaI/SphI酶切RgE和pUC19/HE-LgE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-gE；消除pUC19/HE-gE中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK-gE；用XbaI酶切pUC19/HEK-gE，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得gE缺失用转移载体pUC19-gE/EGFP；
(4)TK缺失重组病毒拯救
转染：在六孔细胞培养板上培养BHK21细胞，待BHK21细胞长满90％时进行转染；取PRV-GDXX病毒基因组约3ug，与约1ug转移质粒pUC19-TK/EGFP混合后转染，同时设仅含转移质粒的对照组；
鉴定：PRV-GDXX基因组与pUC19-TK/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况；转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/EGFP。将PRV/TK-/EGFP基因组与pUC19-TK/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK-；
(5)TK/gE双基因缺失重组病毒拯救
转染：在六孔细胞培养板上培养BHK-21细胞，待BHK-21细胞长满90％时进行转染；取PRV/TK-病毒基因组约3ug，与约1ug转移质粒共转染，同时设仅含转移质粒的对照组；
鉴定：PRV/TK-基因组与pUC19-gE/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/gE-/EGFP；将PRV/TK-/gE-/EGFP基因组与pUC19-gE/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK-/gE-。
附图说明
图1、伪狂犬病毒gE基因CDS序列PCR扩增电泳图，其中M为DL2000；1为PCR产物；
图2、TK缺失转移载体构建示意图；
图3、gE缺失转移载体构建示意图；
图4、左右重组臂PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，其中A：DL-2000  B：左重组臂PCR扩增产物(LTK)  C：右重组臂PCR扩增产物(RTK)；
图5、左右重组臂PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；A：DL-2000  B：左重组臂PCR扩增产物(LgE)  C：右重组臂PCR扩增产物(RgE)；
图6、纯化后重组病毒感染ST细胞荧光观察；A：纯化后PRV/TK-/EGFP感染ST细胞  B：纯化后PRV/TK-感染ST细胞；
图7、重组病毒感染ST细胞荧光观察；A：PRV/TK-/gE-/EGFP感染ST细胞  B：PRV/TK-/gE-感染ST细胞；
图8、重组病毒PCR检测；A：DL-2000 Marker  B：REGFP和FEGFP引物扩增PRV/TK-/gE-/EGFP病毒基因组  C：RgE和FgE引物扩增PRV/TK-/gE-/EGFP病毒基因组D：RgE和FgE引物扩增PRV/TK-/gE-病毒基因组；
图9、PRV-GDXX、PRV/TK-和PRV/TK-/gE-感染ST细胞的增殖曲线；
图10、首次免疫后四周免疫猪的全病毒抗体水平；
图11、第二次免疫后二周免疫猪的全病毒抗体水平；
图12、第二次免疫后四周免疫猪的全病毒抗体水平。
具体实施方式
除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而不应理解为对本发明的限制。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的权利要求范围之内。
在本申请中，如无特别说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握的常规技术。这些技术在下了文件中有详细描述：Sambrook等人编著的MolecularCloning：Alaboratory Mannual，第二版(1989)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgin编著，1984)；Immnochemical Methods in Cell AndMolecular Biology(Academic Press，London)。
实施例一 猪伪狂犬病毒GDXX株的分离和鉴定
1材料与方法
1.1试验材料
2007年6月，广东省新兴县某猪场发生疑似伪狂犬感染病例，我们从可疑病料提取病猪脑组织；
PRV阳性血清，PRV阴性血清和PRV强毒(GDXX株)、BHK21细胞由本实验室保存。
1.2病料处理
无菌取病猪脑部与PBS(0.1M，pH7.2)以1∶5(V/V)制成匀浆，反复冻融3次，3000rpm离心15min，取上清加双抗，37℃作用18h，经0.45um滤膜除菌，得到病料滤液，保存备用。
1.3Bab1/c小鼠接种试验与结果
取10只6周龄Ba1b/c小鼠，其中4只腹腔注射病料滤液0.2ml/只，另4只背部脊柱附近皮下注射病料滤液0.2ml/只。接种后观察小鼠的采食、饮水、精神状况和临床表现。
小鼠接种病料滤液后12小时，表现精神沉郁、扎堆，其中2只出现后肢麻痹，可能是病毒侵入神经所致；48小时后4只小鼠被毛逆立；60小时后6只小鼠死亡，72小鼠后全部小鼠死亡。
1.4细胞接种试验与细胞病变观察结果
接种0.5ml病毒滤液于长成单层的BHK21细胞，连续观察，直至出现细胞病变为止。
病料滤液接种BHK21细胞后18小时后出现明显细胞病变：细胞肿胀，变圆，逐步空泡化，48小时后细胞脱落。
1.5分离毒的毒价测定
BHK21细胞在96孔板上长成单层。分离病毒做10倍系列稀释(10-1-10-10)，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml，同时设两孔空白对照。记录各个梯度的病变数，连续观察5天。Karver法计算出分离毒的TCID50。
不同稀释度的病毒在96孔板BHK21细胞单层出现CPE，结果见表3，计算该病毒毒价为107.5TCID50/0.1ml。
表3 分离毒的毒价测定结果
1.6微量中和试验鉴定分离毒(固定病毒稀释血清法)
将PRV阴性血清与阳性血清分别进行10倍系列稀释(10-1-10-10)。加入等量200TCID50分离毒，37℃感作1小时。分别接种96孔板单层PK-15细胞，每孔0.1ml，每个稀释度接种8孔，设1孔空白对照和1孔标准强毒对照(200TCID50)。记录各个梯度的细胞病变数，连续观察5天。
PRV阳性血清能特异性中和分离毒，抑制细胞病变，说明所分离的病毒为伪狂犬病毒。
1.7PRV gE基因CDS序列扩增
设计PRV gE基因CDS序列扩增引物及反应条件见表1和表2，扩增产物克隆后测序：
表1 引物序列表
表2 gE基因CDS扩增PCR反应体系及反应条件
1％琼脂糖电泳鉴定PCR结果如图1，测序结果表明扩增片段长1734bp，与genebank上登录的gE CDS序列同源性为97-99％。
2结果与分析
本申请人从广东省新兴县某猪场病猪脑组织提取病科滤液。将该病毒滤液接种Ba1b/c小鼠出现神经症状，死亡率100％；接种BHK21细胞，18小时后细胞变圆、空泡化；猪的伪狂犬病毒阳性血清能特异性地中和该分离病毒。PRV gE基因引物能扩增1734bp gE基因CDS序列，测序结果证实该病毒为猪伪狂犬病毒，其与genebank上登录的gE CDS序列同源性为97-99％。本试验结果说明，我们分离到一株野生猪伪狂犬强毒，命名为广东新兴株(GDXX)。该毒株是我们进行下一步基因缺失活疫苗研制的母本毒株。
实例二 猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE
双基因缺失株PRV/TK-/gE-的构建及其生物学特性研究
本申请人以猪伪狂犬病毒GDXX株(PRV-GDXX)为母本，通过分子生物学手段依次缺失TK、gE基因，构建了一株重组伪狂犬病毒PRV/TK-/gE-，并对该重组病毒的部分生物学特性进行了系统研究。现将试验结果报告如下：
1、材料与方法
1.1、材料
1.1.1、病毒和细胞
猪伪狂犬病毒GDXX株(PRV-GDXX)，BHK21细胞、ST细胞由本实验室保存。
1.1.2、质粒和菌株
pcDNA3/EGFP由中山大学程家森博士惠赠；pUC19载体与DH5α菌株由本实验室保存。
1.1.3、工具酶和其它试剂
LA Taq DNA聚合酶、EcoRI、HindIII、BamHI、KpnI、SspI、StuI、XbaI、SphI、Agarose GEL DNA Purification Kit、DNA Ligation Kit、BKL Kit、Dephospharylation Kit购置TaKaGDXX公司。LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司。胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司。
1.2、基因扩增
1.2.1、病毒增殖及病毒基因组提取
BHK21细胞按常规方法培养，以5-10PFU/细胞感染病毒，当细胞病变(CPE)达90％左右收获病毒；病毒基因组提取方法简述如下：收集病变细胞后，用裂解缓冲液(含0.2mg/ml蛋白酶K)重悬细胞，37℃孵育至清亮，裂解物用酚、酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，取上清加2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min，15000rpm离心10min，70％乙醇洗涤DNA沉淀，干燥后将沉淀溶于TE，-20℃保存备用。
1.2.2、引物及基因扩增
参考PRV全基因组序列(BK001744)，合成系列引物，用于扩增TK同源重组的左、右臂，用于鉴定TK基因缺失和EGFP插入的引物。引物序列及预期PCR产物的大小见表3。
表3 用于扩增TK基因同源臂和检验TK基因缺失及插入的PCR引物
TK缺失用转移载体构建中各种PCR反应体系与反应条件：
参考PRV全基因组序列(BK001744)，合成系列引物，用于扩增gE同源重组的左、右臂，用于鉴定gE基因缺失和EGFP插入的引物。引物序列及预期PCR产物的大小见表4。
表4 用于扩增gE基因同源臂的检验gE基因缺失及插入的PCR引物
gE缺失中各种PCR反应体系与反应条件：
1.3、转移载体构建
TK缺失用转移载体构建  以PRV-GDXX基因组为模板，用FLTK和RLTK引物对扩增同源重组左臂LTK；用FRTK和RRTK引物对扩增同源重组右臂RTK。用EcoRI酶切pUC19，补平后连接转化，获得消除EcoRI位点的pUC19/E；同样方法消除HindIII，获得质粒PUC19/HE。以KpnI/XbaI双酶切LTK和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LTK。再以XbaI/SphI酶切RTK和pUC19/HE-LTK，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-TK。消除pUC19/HE-TK中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK-TK。用XbaI酶切pUC19/HEK-TK，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得另一转移质粒pUC19-TK/EGFP。TK缺失用转移载体构建示意图见图2。
gE缺失用转移载体构建  以PRV-GDXX基因组为模板，用FLgE和RLgE引物对扩增同源重组左臂LgE；用FRgE和RRgE引物对扩增同源重组右臂RgE。用EcoRI酶切pUC19，补平后连接转化，获得消除EcoRI位点的pUC19/E；同样方法消除HindIII，获得质粒PUC19/HE。以KpnI/XbaI双酶切LgE和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LgE。再以XbaI/SphI酶切RgE和pUC19/HE-LgE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-gE。消除pUC19/HE-gE中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK-gE。用XbaI酶切pUC19/HEK-gE，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得另一转移质粒pUC19-gE/EGFP。TK缺失用转移载体构建示意图见图3。
1.4、重组病毒拯救
1.4.1 TK缺失重组病毒拯救
转染：重组病毒拯救在六孔细胞培养板上进行，待BHK21细胞长满90％时进行转染。取PRV-GDXX病毒基因组约3ug，与约1ug转移质粒pUC19-TK/EGFP混合后转染，详细方法参见LipofectamineTM 2000说明书。同时设仅含转移质粒的对照组。
鉴定：PRV-GDXX基因组与pUC19-TK/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功。重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/EGFP。将PRV/TK-/EGFP基因组与pUC19-TK/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK-。
1.4.2 TK/gE双基因缺失重组病毒拯救
转染：重组病毒拯救在六孔细胞培养板上进行，待BHK-21细胞长满90％时进行转染。取PRV/TK-病毒基因组约3ug，与约1ug转移质粒共转染，详细方法参见LipofectamineTM 2000说明书。同时设仅含转移质粒的对照组。
鉴定：PRV/TK-基因组与pUC19-gE/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功。重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/gE-/EGFP。将PRV/TK-/gE-/EGFP基因组与pUC19-gE/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK-/gE-。
1.5、重组病毒噬斑纯化及鉴定
常规方法进行重组病毒噬斑纯化。当筛选PRV/TK-/EGFP时，在荧光显微镜下挑选带绿色荧光的噬斑。当筛选PRV/TK-时，在荧光显微镜下挑选无荧光的噬斑。在每一轮噬斑实验中按文献方法直接以细胞培养物为模板进行PCR筛选。在筛选PRV/TK-/EGFP时，每轮噬斑纯化使用两套引物：FEGFP和REGFP，FTK和RTK。待所有噬斑均出现绿色荧光后，随机挑取100个噬斑，做PCR鉴定。在筛选PRV/TK-时，每轮噬斑纯化仅用FTK和RTK引物筛选。待所用噬斑均无绿色荧光后，随机挑取100个噬斑，做PCR筛选、鉴定。
当筛选PRV/TK-/gE-/EGFP时，在荧光显微镜下挑选带有荧光的噬斑。当筛选PRV/TK-/gE-时，在荧光显微镜下挑选无荧光的噬斑。在每一轮噬斑均直接以细胞培养物为模板进行PCR筛选。在筛选PRV/TK-/gE-/EGFP时，每轮噬斑纯化使用两套引物：FEGFP和REGFP，FgE和RgE。待所有噬斑均出现绿色荧光后，随机挑取100个噬斑，做PCR筛选、鉴定。在筛选PRV/TK-/gE-时，每轮噬斑纯化仅用FgE和RgE引物筛选。待所用噬斑均无绿色荧光后，随机挑取100个噬斑，做PCR筛选、鉴定。
1.6、重组病毒的遗传稳定性检测
将筛选获得的PRV/TK-/gE-重组病毒在BHK21细胞上连续传代，每5代提取病毒基因组DNA，用FTK/RTK和FgE/RgE引物进行PCR检测，对PCR进行测序。
1.7、病毒体外增殖曲线测定
以相同数量ST细胞接种6孔细胞培养板，37℃培养至80-90％融合，将PRV-GDXX、PRV/TK-和PRV/TK-/gE-以2PFU/cell接种，接种后第6h、12h及之后每12h收集病毒样品，直至接种后120h，然后对收集的病毒样品按常规方法测定TCID50。
1.8、病毒对家兔的致病性试验
分别以不同剂量的PRV-GDXX株和PRV/TK-/gE-株皮下接种健康家兔。共分10组，每组4只。每日观察并记录家兔死亡情况，直至接种后6日。
2、结果
2.1、同源重组臂扩增
2.1.1 LTK和RTK的PCR扩增
用FTKL/RTKL和FTKR/RTKR两对引物扩增TK基因同源重组臂LTK(959bp)和RTK(977bp)，PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，参见图4，结果均与预期一致。
2.1.2 LgE和RgE的PCR扩增
用FLgE/RLgE和FRgE/RRgE两对引物扩增gE基因两同源重组臂LgE(954bp)和RgE(953bp)，PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，参见图5，结果均与预期一致。
2.2、转移质粒的构建
在构建转移载体时，所有中间克隆经PCR和酶切鉴定后，均进行序列测定(TaKaRa公司)，结果与预期一致。经序列测定，验证正确的转移质粒pUC19-TK/HEK、pUC19-TK/EGFP、pUC19-gE/HEK和pUC19-gE/EGFP用质粒小量提取试剂盒各提取10管保存备用，各约100ug。
2.3、重组病毒鉴定及纯化
TK缺失重组病毒鉴定及纯化结果  纯化后PRV/TK-/EGFP病毒感染ST细胞后可在荧光显微镜下观察到特异性荧光，参见图6。提取病毒基因组，用FEGFP和REGFP引物，能扩增到条带大小为197bp的特异性条带，FTK和RTK引物对扩增阴性。纯化后PRV/TK-病毒感染ST细胞后无荧光，FTK和RTK引物扩增条带大小557bp。
TK/gE缺失重组病毒鉴定及纯化结果PRV/TK-/gE-/EGFP病毒感染BHK21后可见荧光，用FEGFP和REGFP引物对扩增条带大小197bp；FgE和RgE引物对扩增阴性。PRV/TK-/gE-病毒感染BHK21后无荧光，FTK和RTK引物对扩增条带大小387bp。结果见图7、8。
2.4、重组病毒的遗传稳定性
用FTK/RTK引物对检测重组病毒TK基因缺失，各代次病毒目的片段长度557bp，FTK/RTK引物对扩增PRV-GDXX基因组条带大小为754bp；用FgE/RgE引物对检测重组病毒gE基因缺失，各代次病毒目的片段长度387bp，FgE/RgE引物对扩增PRV-GDXX基因组条带大小为578bp；与预期一致，测序结果无变化。TK缺失见序列一，gE缺失见序列二。
序列一
XX  TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCGTACTGGCGCACTCTGTTCGACACGGACACGGTGGCCGGTATTTACGATGCC
F0  TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG**********************************************
F5  TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG**********************************************
F10 TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG**********************************************
F15 TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG**********************************************
F20 TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG**********************************************
F25 TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG**********************************************
XX  CAGACCCGGAAGCAGAACGGCAGCCTGAGCGAGGAGGACGCGGCCCTCGTCACGGCGCAGCACCAGGCCGCC
F0  ********************************************************************
F5  ********************************************************************
F10 ********************************************************************
F15 ********************************************************************
F20 ********************************************************************
F25 *******************************************************************
XX  TTCGCGACGCCGTACCTGCTGCTGCACACGCGCCTGGTCCCGCTCTTCGGGCCCGCGGTCGAGGGCCCGCCCG
F0  *******************************************************************
F5  *******************************************************************
F10 *******************************************************************
F15 *******************************************************************
F20 *******************************************************************
F25 *******************************************************************
XX  AGATGACGGTC*********GTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F0  **********AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F5  **********AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F10 **********AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F15 **********AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F20 **********AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F25 **********AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
序列一：*表示缺失，黑色部分是相同序列，红色部分表示不同序列。测序结果显示PRV/TK-/gE-(GDXX株，XX表示)TK基因较PRV-GDXX缺失207bp，但重组病毒TK基因比PRV-GDXX多出一个10bp的重组印迹。
序列二
XX  CGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACCTCTCCACCGAGGCCGGCGACGATGACCTCGAC
F0  CGTCACCGAGGTCCC*****************************************************
F5  CGTCACCGAGGTCCC*****************************************************
F10 CGTCACCGAGGTCCC*****************************************************
F15 CGTCACCGAGGTCCC*****************************************************
F20 CGTCACCGAGGTCCC*****************************************************
F25 CGTCACCGAGGTCCC*****************************************************
XX  GGCGACCTCAACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCCTCCCTGAGGGAGGCACCCCCGG
F0  ********************************************************************
F5  ********************************************************************
F10 ********************************************************************
F15 ********************************************************************
F20 ********************************************************************
F25 *******************************************************************
XX  CCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCCACGGCGCCGTGGTGGCCGGG
F0  *******************************************************************
F5  *******************************************************************
F10 *******************************************************************
F15 *******************************************************************
F20 *******************************************************************
F25 *******************************************************************
XX  *************ATCTGGACGTTCCTGG
F0  AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
F5  AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
F10 AAGTCCCTTCTAGAATCTGGACGTTCCTGG
F15 AAGTCCCTTCTAGAATCTGGACGTTCCTGG
F20 AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
F25 AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
序列二：*表示缺失，黑色部分是相同序列，红色部分表示不同序列。测序结果显示PRV/TK-/gE-(GDXX株，XX表示)gE基因较PRV-GDXX缺失207bp，但重组病毒gE基因比PRV-GDXX多出一个14bp的重组痕迹。
2.5、体外增殖
体外增殖曲线结果见图9。结果显示TK、gE基因缺失不影响PRV病毒在ST细胞上的增殖，各个时间段上的病毒滴度无明显差异。
2.6、病毒对家兔的毒力
PRV-GDXX株接种后约36小时表现接种部位瘙痒、烦躁不安等症状，此后相继死亡。而PRV/TK-/gE-接种后72小时才偶见接种处瘙痒症状，并未见死亡。家兔接种伪狂犬病毒死亡情况统计结果见图5
表5 家兔接种伪狂犬病毒死亡情况统计
-/4表示无死亡；1/4表示4只家兔中有一只死亡，余类推。
3、小结与讨论
3.1 重组病毒PRV/TK-/gE-基因缺失
TK基因较PRV-GDXX缺失207bp，但重组病毒TK基因比PRV-GDXX多出一个10bp的重组印迹。gE基因较PRV-GDXX缺失207bp，但重组病毒gE基因比PRV-GDXX多出一个14bp的重组痕迹。重组痕迹的发生机理不明。TK、gE基因特定缺失及重组痕迹是重组病毒PRV/TK-/gE-与其它伪狂犬株相区分的特殊分子标记。
3.2 TK/gE缺失对细胞增殖的影响
文献报道TK、gE均为伪狂犬病毒非必需基因，本研究进一步证实了这一点。TK、gE缺失不影响重组病毒在ST细胞上的增殖特性，PRV/TK-、PRV/TK-/gE-和PRV-GDXX在各时间段的增殖滴毒几乎完全一致。
3.3 TK、gE基因缺失的遗传稳定性
重组病毒PRV/TK-/gE-中两种基因缺失非常稳定。病毒在ST细胞上传25代后，其遗传稳定未见任何变化。
3.4 TK/gE缺失对病毒毒力的影响
本研究中，用重组病毒PRV/TK-/gE-接种对伪狂犬病毒最为敏感的家兔，即使接种量高达107.0TCID50，家兔仍不死亡。说明TK、gE缺失大幅度降低了病毒毒力，可以进行猪伪狂犬活疫苗的研究。
实例三 重组病毒PRV/TK-/gE-最小免疫剂量研究
1、材料与方法
1.1、疫苗  本室研制的PRV/TK-/gE-基因缺失疫苗，每瓶的病毒含量为107.0TCID50。
1.2、试验动物  1日龄仔猪、70日龄育肥猪和母猪，伪狂犬病毒抗体阴性。
1.3、实验方案
将研制的基因缺失疫苗用稀释液稀释成每毫升病毒含量分别为106.0TCID50、105.0TCID50和104.0TCID503个不同的浓度，然后分别肌肉注射接种1日龄仔猪，育肥猪和母猪，每组8头，每头1ml。首次免疫后4周，以同样剂量加强免疫一次。二免后4周采血测定中和抗体，确定最小免疫剂量。
2、结果
2.1、新生仔猪的最小免疫剂量测定
将3种免疫剂量的疫苗经肌肉注射免疫1日龄仔猪，二免后4周采血测定伪狂犬病毒的中和抗体水平，结果见表6，105.0TCID50的中和抗体水平明显高于104.0TCID50组和106.0TCID50组，因此选择105.0TCID50为最小免疫剂量。
表6 新生仔猪肌肉注射疫苗二免后4周的中和抗体水平
2.2、育肥猪最小免疫剂量的确定
将3种免疫剂量的疫苗经肌肉注射免疫经肌肉注射70日龄猪，二免后4周采血测定伪狂犬病毒的中和抗体水平，结果见表7，105.0TCID50的中和抗体水平明显高于104.0TCID50组和106.0TCID50组，因此选择105.0TCID50为最小免疫剂量。
表7 育肥猪肌肉注射疫苗二免后4周的中和抗体水平
2.3、母猪的最小免疫剂量的确定
将3种免疫剂量的疫苗经肌肉注射免疫经肌肉注射母猪，二免后4周采血测定伪狂犬病毒的中和抗体水平，结果见表8，105.0TCID50的中和抗体水平明显高于104.0TCID50组和106.0TCID50组，因此选择105.0TCID50为最小免疫剂量。
表8 母猪肌肉注射疫苗二免后4周的中和抗体水平
3、讨论
不同阶段猪免疫剂量测定结果表明，在伪狂犬病的免疫中，二免后4周采血测定伪狂犬病毒的中和抗体，105.0TCID50的中和抗体水平明显高于104.0TCID50组和106.0TCID50组，因此选择105.0TCID50为最小免疫剂量。
实例4 重组病毒PRV/TK-/gE-免疫效果比较试验
将重组病毒PRV/TK-/gE-与6种市售伪狂犬基因缺失苗进行免疫效果比较，现将试验结果汇报如下。
1、材料与方法
1.1、实验动物与疫苗
将49头30日龄伪狂犬阴性健康小猪分成7个组，每组7头。7个试验组分别记为PRV/TK-/gE-组、进口疫苗1-2组、国产疫苗1-4组。另设4头对照。
1.2、免疫程序
30日龄首次免疫，4周后每组随机选3头猪第二次免疫。疫苗免疫剂量1头份。PRV/TK-/gE-免疫剂量105.0TCID50。
1.3、采血及抗体测定
首次免疫后4周及第二次免疫后2、4周全群采血测定抗体。
A，用IDDXX gE鉴别诊断ELISA试剂盒测定gE抗体，判断疫苗鉴别诊断能力；判断标准为：S/N值小于或等于0.60为gE抗体阳性，大于0.7为阴性，两者之间为可疑。
B，用科前公司全病毒ELISA试剂盒测gB抗体，判断首次免疫后疫苗阳转率和全病毒抗体水平；判定标准为：S/N值小于或等于0.6为阳性，大于0.7为阴性，两者之间为可疑。
C，用BHK21细胞测定血清中和抗体。
试剂盒检测只用于首次采血，第二、三次采血只检测中和抗体。
1.4、攻毒
第二次免疫后4周，用108.0TCID50的PRV-GDXX株强毒进行攻毒保护试验。
2、结果
抗体测定结果见表9-表15。
表9 PRV/TK-/gE-抗体测定结果
表10 国产疫苗1组抗体测定结果
0.87，全病毒抗体阴性。0.2，鉴别诊断阳性，说明有野毒感染。
表11 国产疫苗2组抗体测定结果
表12 国产疫苗3组抗体测定结果
表13 国产疫苗4组抗体测定结果
表14 进口疫苗1组抗体测定结果
表15 进口疫苗2组抗体测定结果
三、分析与讨论
1、疫苗鉴别诊断能力
GDXX猪伪狂犬鉴别诊断试剂盒血清检测结果表明，市用疫苗全部缺失gE基因，能通过对gE抗体的检测区分疫苗免疫猪和野毒感染猪。
2、疫苗免疫效果比较
2.1、一次免疫后4周抗体阳转率比较及野毒田间感染保护效果分析
全病毒抗体测定结果表明，除国产疫苗1组有一头猪抗体阴性(抗体阳转率为6/7)外，其余各组抗体阳转率均为100％，说明疫苗免疫后群体免疫情况良好。
免疫猪除国产疫苗1组有一头感染野毒(gE抗体阳性，红色标记)外，其余猪均为gE抗体阴性，未受野毒感染，说明疫苗免疫在一般田间试验条件下能有效保护猪免受野毒感染。
2.2、一次免疫后4周全病毒阻断ELISA抗体水平比较
一次免疫后4周全病毒阻断ELISA抗体的平均值比较见图10，全病毒抗体水平的排序为：进口疫苗2＞进口疫苗1＞PRV/TK-/gE-＞国产疫苗2＞国产疫苗1＞国产疫苗3＞国产疫苗4。有文献认为这种全病毒阻断ELISA抗体水平与疫苗中和抗体水平相关。
2.3、一次免疫后中和抗体水平比较
一次免疫后6周中和抗体的水平仍然不高，PRV/TK-/gE-平均中和抗体水平达到6.62，其余疫苗中和抗体水平基本为0。
一次免疫后8周，PRV/TK-/gE-平均中和抗体水平达到31.28，显著高于其它疫苗，其余疫苗抗体水平依然较低。
某些厂家宣称疫苗一次免疫后4周中和抗体效价平均在20，甚至30以上，与本试验结果不符。本次实验结果说明，仔猪伪狂犬一次免疫效果不确实。即使对自家苗5.0或进口疫苗1，依然建议二次免疫，因为PRV/TK-/gE-抗体水平高峰出现在首免后8周，存在较长的免疫空白期。进口疫苗1虽然能一直维持一定的抗体水平，但与二次免疫抗体水平有明显差距。
2.4、二次免疫中和抗体水平比较
二次免疫后2周中和抗体比较结果见图11。二次免疫后2周中和抗体水平排序为：进口疫苗1＞PRV/TK-/gE-＞国产疫苗1＞进口疫苗2＞国产疫苗2＞国产疫苗4＞国产疫苗3。
二次免疫后4周中和抗体比较结果见图12。二次免疫后4周中和抗体水平排序为：PRV/TK-/gE-＞进口疫苗1＞国产疫苗2＞进口疫苗2＞国产疫苗1＞国产疫苗4＞国产疫苗3。
二免后2周中和抗体与二免后4周中和抗体结果比较显示：
PRV/TK-/gE-抗体水平从37.77显著上升至50.51，国产疫苗2抗体水平从17.13上升至20.48，略有上升。国产疫苗3、4组抗体水平始终较低。其余疫苗抗体水平均有一定程度下降，其中国产疫苗1组抗体水平从37.25显著下降至8.45。该结果表明，PRV/TK-/gE-二免后能长时间维持较高抗体水平。
2.6、攻毒保护
用PRV-GDXX强毒攻击实验猪，攻毒剂量108.0TCID50/头。对照组1头出现腹泻，4头解剖均可见肾脏针尖样出血、肝出现灰白色斑点。疫苗免疫组无明显临床病变，但中和抗体低于10以下者解剖可见肾脏针尖样出血或/和肝脏灰白色斑点。
3小结
A，目前市售的各种伪狂犬活疫苗都具有鉴别诊断能力。PRV/TK-/gE-也具有鉴别诊断能力。
B，疫苗免疫后，抗体阳转率基本为100％，在一般田间试验条件下能有效保护猪免受野毒感染。
C，PRV/TK-/gE-一次免疫后8周能诱导高水平中和抗体。其它疫苗一次免疫中和抗体基本为0。为了达到有效免疫保护，应以两次免疫为好。推荐免疫程序：1月龄首免，4周后二免，免疫剂量105.0TCID50。
D，二次免疫能有效诱导中和抗体。PRV/TK-/gE-在二免后2周诱导的中和抗体水平仅低于进口疫苗1组，在二免后4周诱导的中和抗体水平远高于所有疫苗。
E，从攻毒保护试验结果看，中和抗体达到10以上，能有效保护对仔猪108.0TCID50GDXX株强毒的攻击。
F，目前市售的伪狂犬疫苗，特别是部分国产疫苗在质量上可能存在一定的问题。市场需要安全高效的伪狂犬基因缺失疫苗。
实施例五、猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失疫苗的制备
我们构建了PRV/TK-/gE-双基因缺失株，生物学特性测定表明，该突变株具有很好的安全性和稳定性，是较为理想的疫苗候选毒株。我们以该缺失株为材料，进行了疫苗的制备，获得了伪狂犬病基因缺失疫苗。现将结果报道如下。
1、材料与方法
1.1、病毒与细胞
伪狂犬病毒GDXX野毒株、PRV/TK-/gE-双基因缺失株，ST细胞等，均由本室保存、提供。
1.2、弱毒疫苗的制备
1.2.1、疫苗病毒的增殖
将生产用毒种5×104倍稀释后接种已长成单层的ST细胞，吸附1h后，加入1000ml含2％胎牛血清的DMEM培养液，置37℃温室中转瓶培养，转速为6转/小时。待80％细胞病变后，反复冻融2次，收获病毒，测定TCID50。病毒液置-20℃保存。
1.2.2、保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃ 30min)。
1.2.3、疫苗病毒混悬液的配比
将病毒液与保护剂按一定的体积充分混合，分装至灭菌的青瓶中，每瓶装量2.6ml。按常规方法冻干。
1.2.4、冻干后疫苗病毒液效价的测定
随机抽取5瓶疫苗，用DMEM溶解至冻干前的体积，测定TCID50，以了解保护剂和冻干条件对疫苗中的病毒是否产生影响。
1.2.5、疫苗检验
按国家规程进行。
2、结果与分析
2.1、冻干前后病毒TCID50的比较
PRV/TK-/gE-在ST细胞中扩大培养后，测定其TCID50，按每头份105.25TCID50配制疫苗，每瓶20头份。冻干苗用DMEM稀释测定其TCID50，结果记录于表16，分析表16可知在冻干前后TCID50差异不显著，冻干损失较小。
表16 疫苗病毒液在冻干前后的滴度
2.2疫苗无细菌及外源病毒污染。
3、小结
通过TCID50的测定证实疫苗在冻干前后的毒价无显著变化，说明冻干条件是可行的。同时疫苗检测无细菌和外源病毒污染，可以进行下一步安全性及免疫效果研究。
实施例六、猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失疫苗的制备
我们对试制的猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失疫苗对猪的安全性和免疫效力进行了系统研究，现将试验结果汇报如下：
1、材料与方法
1.1、试验动物
50头1月龄仔猪，24头妊娠60日母猪，伪狂犬中和抗体阴性。
1.2、试验方案
免疫方法：每头猪打耳号，随机分组。颈部肌肉注射免疫。分组及接种疫苗情况见表17，免疫剂及采血程序见表18，检测/监控项目与目的见表19。
表17 分组及接种疫苗
表18 免疫剂及采血程序
表19 检测/监控项目与目的：
注：免疫前后3天测体温。
1.3、抗体检测
A，用IDDXX gE鉴别诊断ELISA试剂盒测定gE抗体，判断疫苗鉴别诊断能力；判断标准为：S/N值小于或等于0.60为gE抗体阳性，大于0.7为阴性，两者之间为可疑。
B，用科前公司全病毒ELISA试剂盒测gB抗体，判断首次免疫后疫苗阳转率和全病毒抗体水平；判定标准为：S/N值小于或等于0.6为阳性，大于0.7为阴性，两者之间为可疑。
C，用BHK21细胞测定血清中和抗体。
2、结果与分析
2.1、疫苗免疫抗体检测结果及分析
见表20-21。①疫苗免疫后4周gB抗体100％阳性，即免疫后抗体阳转率100％；②疫苗免疫后4周，虽然gB抗体阳性，但gE抗体阴性，说明GDXX株TK/gE双基因缺失疫苗具有鉴别诊断能力；③不论采用1头份或10头份免疫仔猪和母猪，一次免疫4周后中和抗体水平为0，一次免疫8周后中和抗体大于30，说明一次免疫需要较长时间才能诱导高水平中和抗体；二免后4周中和抗体水平大于50，说明两次免疫效果较好；④1头份免疫和10头份免疫中和抗体水平相当，说明无大剂量免疫的必要；⑤哨兵猪在整个试验阶段抗体阴性，说明疫苗不会发生水平传播，安全性高。
表20 仔猪抗体检测结果
注：以上数值均为平均值。-表示未测。
表21 母猪抗体检测结果
2.2、
母源
抗体
结果及分析
母源抗体检测结果见表22。试验结果表明仔猪全部获得高水平母源抗体。其中1头份免疫母猪所产仔猪母源抗体在7日龄时最高，随后逐步下降，在42日龄时接近临界点，在49日龄后抗体水平阴性。10头份免疫组因为只免疫1次，仔猪母源抗体(gB ELISA抗体水平明显较高)，且在14日龄时抗体水平趋近临界值，说明母猪也应两次免疫。
表22 仔猪母源抗体检测结果
2.3、疫苗免疫后临床表现
见表23，疫苗免疫后，仔猪和母猪均无异常临床表现；10倍量免疫也不诱导异常表现；母猪免疫后产仔数无明显差异。试验结果表明，疫苗对猪安全性良好。
表23 母猪生产成绩
测序模板：猪伪狂犬广东新兴株(XX)基因组，猪伪狂犬广东新兴株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK-/gE-不同代次基因组，F0表示原始毒株，F5表示第五代毒株，F10表示第10代毒株，F15表示第15代毒株，F20表示第20代毒株，F25表示第25代毒株。
测序公司：宝生物工程(大连)有限公司
扩增引物：ATGCGCATCCTCCGGATCTACCT，TTCCGCCTCAGAAGCCATAGAGC
结果分析：PRV/TK-/gE-(XX株)TK基因较PRV-XX缺失207bp，但重组病毒TK基因比PRV-XX多出一个10bp的重组印迹。该缺失稳定，25代内未见任何变化。
测序模板：猪伪狂犬广东新兴株(XX)基因组，猪伪狂犬广东新兴株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK-/gE-不同代次基因组，F0表示原始毒株，F5表示第五代毒株，F10表示第10代毒株，F15表示第15代毒株，F20表示第20代毒株，F25表示第25代毒株。
测序公司：宝生物工程(大连)有限公司
扩增引物：ATGCGGCCCTTTCTGCTGCG，TGCAGCGTGTAGAGGCCCGT
结果分析：PRV/TK-/gE-(XX株)gE基因较PRV-XX缺失205bp，但重组病毒gE基因比PRV-XX多出一个14bp的重组印迹。该缺失稳定，25代内未见任何变化。
序列一
XX  TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCGTACTGGCGCACTCTGTTCGACACGGACACGGTGGCCGGTATTTACGATGCC
F0   TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F5   TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F10  TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F15  TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F20  TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F25  TGTACGTGCCCGAGCCGATGGCG* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
 
XX  CAGACCCGGAAGCAGAACGGCAGCCTGAGCGAGGAGGACGCGGCCCTCGTCACGGCGCAGCACCAGGCCGCC
F0   * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F5   * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F10  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F15  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F20  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F25  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
 
XX  TTCGCGACGCCGTACCTGCTGCTGCACACGCGCCTGGTCCCGCTCTTCGGGCCCGCGGTCGAGGGCCCGCCCG
F0   * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F5   * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F10  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F15  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F20  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F25  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
 
XX  AGATGACGGTC* * * * * * * * *GTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F0   * * * * * * * * * * AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F5   * * * * * * * * * * AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F10  * * * * * * * * * * AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F15  * * * * * * * * * * AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F20  * * * * * * * * * * AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
F25  * * * * * * * * * * AATCTCTAGAGTCTTTGACCGCCACCCGGTG
序列一：*表示缺失，黑色部分是相同序列，红色部分表示不同序列。测序结果显示PRV/TK-/gE-（GDXX株，XX表示）TK基因较PRV-GDXX缺失207bp，但重组病毒TK基因比PRV-GDXX多出一个10bp的重组印迹。
 
测序模板：猪伪狂犬广东新兴株（XX）基因组，猪伪狂犬广东新兴株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK-/gE-不同代次基因组，F0表示原始毒株，F5表示第五代毒株，F10表示第10代毒株，F15表示第15代毒株，F20表示第20代毒株，F25表示第25代毒株。
测序公司：宝生物工程（大连）有限公司
扩增引物：ATGCGCATCCTCCGGATCTACCT，TTCCGCCTCAGAAGCCATAGAGC
结果分析：PRV/TK-/gE-（XX株）TK基因较PRV-XX缺失207bp，但重组病毒TK基因比PRV-XX多出一个10bp的重组印迹。该缺失稳定，25代内未见任何变化。
 
序列二
XX  CGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACCTCTCCACCGAGGCCGGCGACGATGACCTCGAC
F0   CGTCACCGAGGTCCC* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F5   CGTCACCGAGGTCCC* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F10  CGTCACCGAGGTCCC* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F15  CGTCACCGAGGTCCC* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F20  CGTCACCGAGGTCCC* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F25  CGTCACCGAGGTCCC* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
 
XX  GGCGACCTCAACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCCTCCCTGAGGGAGGCACCCCCGG
F0   * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F5   * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F10  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F15  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F20  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F25  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
 
XX  CCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCCACGGCGCCGTGGTGGCCGGG
F0   * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F5   * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F10  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F15  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F20  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
F25  * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
 
XX  * * * * * * * * * * * * *ATCTGGACGTTCCTGG
F0   AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
F5   AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
F10  AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
F15  AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
F20  AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
F25  AAGTCCCTTCTAGA ATCTGGACGTTCCTGG
 
序列二：*表示缺失，黑色部分是相同序列，红色部分表示不同序列。测序结果显示PRV/TK-/gE-（GDXX株,XX表示）gE基因较PRV-GDXX缺失207bp，但重组病毒gE基因比PRV-GDXX多出一个14bp的重组痕迹。
 
测序模板：猪伪狂犬广东新兴株（XX）基因组，猪伪狂犬广东新兴株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK-/gE-不同代次基因组，F0表示原始毒株，F5表示第五代毒株，F10表示第10代毒株，F15表示第15代毒株，F20表示第20代毒株，F25表示第25代毒株。
测序公司：宝生物工程（大连）有限公司
扩增引物：ATGCGGCCCTTTCTGCTGCG，TGCAGCGTGTAGAGGCCCGT
结果分析：PRV/TK-/gE-（XX株）gE基因较PRV-XX缺失205bp，但重组病毒gE基因比PRV-XX多出一个14bp的重组印迹。该缺失稳定，25代内未见任何变化。

Claims (3)

1.一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株，其特征在于，该病毒株的保藏名称为：猪伪狂犬病毒GDXX株TK/gE双基因缺失病毒PRV/TK-/gE-；保藏单位：中国典型培养物保藏中心 ；保藏日期：2012年3月1日；保藏号为：CCTCC V201212；所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的制备方法包括如下步骤：
（1）分离和鉴定猪伪狂犬病毒株，命名为PRV-GDXX；
（2）TK缺失用转移载体的构建
以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物扩增TK同源重组左臂LTK；和右臂RTK;用EcoRI酶切pUC19，补平后连接转化，获得消除EcoRI位点的pUC19/E；同样方法消除Hind，获得质粒PUC19/HE;以KpnI/XbaI双酶切LTK和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LTK;再以XbaI/SphI酶切RTK和pUC19/HE-LTK，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-TK;消除pUC19/HE-TK中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK-TK;用XbaI酶切pUC19/HEK-TK，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得TK缺失用转移载体pUC19-TK/EGFP;
（3） gE缺失用转移载体构建 
以PRV-GDXX基因组为模板，设计PCR引物对扩增gE同源重组左臂LgE和右臂RgE；以KpnI/XbaI双酶切LgE和pUC19/HE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-LgE；再以XbaI/SphI酶切RgE和pUC19/HE-LgE，回收相应片段连接，获得质粒pUC19/HE-gE；消除pUC19/HE-gE中的KpnI位点，即为转移质粒pUC19/HEK-gE；用XbaI酶切pUC19/HEK-gE，补平；同时依次用SspI和StuI酶切pcDNA3/EGFP，补平；将补平后的两片段连接转化，获得gE缺失用转移载体pUC19-gE/EGFP；
（4） TK缺失重组病毒拯救
转染：在六孔细胞培养板上培养BHK21细胞，待BHK21细胞长满90%时进行转染；取PRV-GDXX病毒基因组约3ug，与约1ug转移质粒pUC19-TK/EGFP混合后转染，同时设仅含转移质粒的对照组；
鉴定：PRV-GDXX基因组与pUC19-TK/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况；转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/EGFP;
将PRV/TK-/EGFP基因组与pUC19-TK/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK-；
（5）TK/gE双基因缺失重组病毒拯救
转染：在六孔细胞培养板上培养BHK-21细胞，待BHK-21细胞长满90%时进行转染；取PRV/TK-病毒基因组约3ug，与约1ug转移质粒共转染，同时设仅含转移质粒的对照组；
鉴定：PRV/TK-基因组与pUC19-gE/EGFP共转染48小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况；
转染细胞裂解后盲传两代，仍有细胞病变和绿色荧光，初步判断重组病毒拯救成功；重组病毒经噬斑纯化和PCR鉴定，命名为PRV/TK-/gE-/EGFP；将PRV/TK-/gE-/EGFP基因组与pUC19-gE/HEK共转染，细胞裂解物盲传两代，出现无绿色荧光细胞病变可初步判断重组病毒拯救成功，经同样方法纯化、鉴定，获得重组病毒PRV/TK-/gE-。
2.包含如权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株的基因工程疫苗。
3.如权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株在制备猪伪狂犬病毒基因工程疫苗上的应用。
CN201210128876.5A 2012-04-27 2012-04-27 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株 Active CN102888383B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210128876.5A CN102888383B (zh) 2012-04-27 2012-04-27 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201210128876.5A CN102888383B (zh) 2012-04-27 2012-04-27 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102888383A CN102888383A (zh) 2013-01-23
CN102888383B true CN102888383B (zh) 2015-03-18

Family

ID=47532067

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201210128876.5A Active CN102888383B (zh) 2012-04-27 2012-04-27 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102888383B (zh)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105368791A (zh) * 2014-02-21 2016-03-02 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN104130982A (zh) * 2014-04-30 2014-11-05 肇庆大华农生物药品有限公司 一种重组伪狂犬病病毒及其构建方法和应用
CN104195156A (zh) * 2014-08-12 2014-12-10 肇庆大华农生物药品有限公司 一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体及其构建方法和应用
CN105200015B (zh) * 2015-09-09 2019-04-12 河南农业大学 一种猪伪狂犬病毒株
CN105368797A (zh) * 2015-09-09 2016-03-02 河南农业大学 一种表达猪细小病毒vp2基因的重组猪伪狂犬病毒株
CN106834236A (zh) * 2016-02-23 2017-06-13 南京农业大学 猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用
CN106282128B (zh) * 2016-08-03 2019-05-14 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一株通过细胞低温传代和药物筛选致弱的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株及其应用
CN108251382B (zh) * 2016-12-29 2021-08-20 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
CN107137705B (zh) * 2017-05-08 2018-01-23 广东渔跃生物技术有限公司 猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的生产方法
CN107815441B (zh) * 2017-08-31 2020-05-12 浙江大学 一种ⅱ型伪狂犬病毒减毒株及其制备方法和应用
CN107828741B (zh) * 2017-11-07 2021-01-12 江苏省农业科学院 伪狂犬病病毒双基因缺失弱毒株及其应用
CN109750005A (zh) * 2018-12-26 2019-05-14 河南农业大学 一种猪伪狂犬病重组病毒株及其构建方法
CN109735564B (zh) * 2018-12-26 2023-04-21 河南农业大学 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY-gE-/TK-的构建方法和应用
CN109628416A (zh) * 2018-12-26 2019-04-16 河南农业大学 一种表达猪圆环病毒2型orf2基因重组猪伪狂犬病病毒株及其构建方法
CN109735510B (zh) * 2018-12-26 2023-02-17 河南农业大学 一种猪伪狂犬病病毒变异株HN-QYY、HN-QYY-gE-及其构建方法和应用
CN111172321B (zh) * 2020-01-02 2021-04-23 中国检验检疫科学研究院 鉴别非洲猪瘟感染与免疫的荧光pcr检测试剂盒
CN112626038B (zh) * 2021-02-04 2023-01-10 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 伪狂犬病毒FB株gE/gI基因缺失株的构建及其作为疫苗的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1244692C (zh) * 2003-09-08 2006-03-08 华中农业大学 一种伪狂犬病TK－/gE－/gI－基因缺失标志活疫苗及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN102888383A (zh) 2013-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102888383B (zh) 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE双基因缺失株
Decaro et al. Characterisation of canine parvovirus strains isolated from cats with feline panleukopenia
Le Gros et al. Field efficacy trial of a novel HVT-IBD vector vaccine for 1-day-old broilers
CN102994458B (zh) 猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用
CN103923884B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN109439634B (zh) 伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其应用
CN104826103B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒疫苗
CN104877972B (zh) 一种重组猪伪狂犬病毒gE/gI双基因缺失株及其应用
CN101186902B (zh) 伪狂犬病病毒sa215和伪狂犬病毒多基因缺失疫苗及其制备方法
CN104830810B (zh) 一种重组猪伪狂犬病毒TK/gE/gI三基因缺失株
CN113862230A (zh) 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用
CN100503816C (zh) 一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株及应用
CN104130982A (zh) 一种重组伪狂犬病病毒及其构建方法和应用
CN107384874A (zh) 伪狂犬病毒流行株gI/gE基因缺失突变株及构建和应用
CN104059889B (zh) 伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用
CN103627678A (zh) 一种猪伪狂犬病病毒变异株prv-zj01及应用
Di Martino et al. Assembly of feline calicivirus-like particle and its immunogenicity
CN104928260B (zh) 一种牛传染性鼻气管炎病毒ibrv-jn03分离株及其应用
CN102776220B (zh) 布鲁氏菌病a19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定
Zheng et al. Prevalence of feline calicivirus and the distribution of serum neutralizing antibody against isolate strains in cats of Hangzhou, China
CN106929485A (zh) 伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用
CN105695423B (zh) 表达传染性法氏囊病毒vp2基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用
CN110305852A (zh) 表达猪流行性腹泻病毒s1基因重组伪狂犬病病毒的构建
CN101914502B (zh) Ⅰ型犬腺病毒弱毒疫苗株及其应用
CN102952785B (zh) 猪伪狂犬病毒、疫苗组合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20160612

Address after: 527400 Yunfu City, Xinxing County Province, the new town of North East embankment road, No. 6

Patentee after: GUANGDONG WENS DAHUANONG BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

Patentee after: Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co., Ltd.

Address before: 526000 Guangdong Province Wang Zhaoqing City Economic Development Zone Industrial Park abundance

Patentee before: Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co., Ltd.

Patentee before: Guangdong Dahuanong Animal Health Products Co., Ltd.