CN106282128B - 一株通过细胞低温传代和药物筛选致弱的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株通过细胞低温传代和药物筛选致弱的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株及其应用。该弱毒疫苗株是在一株猪伪狂犬病病毒变异株(命名为HeN1株，其微生物保藏编号为CGMCC NO.6656)的基础上，首先通过在Vero细胞上低温传代筛选获得了在US区存在包括gI、gE、Us9、Us2及部分反向重复序列在内的大片段缺失的病毒，然后进一步通过药物筛选致使其TK基因部分缺失。该基因缺失弱毒疫苗株命名为PRV TP株，其微生物保藏编号为CGMCC NO.12300。本发明的弱毒疫苗株可制备成活疫苗或灭活疫苗(单苗或联苗)等，都可有效预防猪伪狂犬病，也可将其制备成诊断或治疗猪伪狂犬病的试剂。本发明的猪伪狂犬病弱毒疫苗株PRV TP株具有安全性好、保护效率高、利于鉴别诊断等优点。

Description

一株通过细胞低温传代和药物筛选致弱的猪伪狂犬病病毒基 因缺失弱毒疫苗株及其应用
技术领域
本发明涉及一株猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，还涉及该疫苗株在预防及治疗猪伪狂犬病中的应用，本发明属于医药技术领域。
背景技术
猪伪狂犬病(Porcine Pseudorabies,PR)是由猪伪狂犬病病毒(PorcinePseudorabies Virus,PRV)引起的一种急性传染病。哺乳仔猪感染伪狂犬病毒均出现发热及神经症状，死亡率几乎高达100％。一般情况下，成年猪感染不会出现明显发病现象，仅见打喷嚏、咳嗽、体温升高等轻微症状；妊娠母猪感染伪狂犬病病毒可导致出现流产、死胎、产弱仔和木乃伊胎；公猪感染可引起睾丸鞘膜炎。该病具有高度的传染性，极易通过空气、接触经呼吸道传播。
伪狂犬病是规模化猪场的常规免疫防控对象，一直得到了很好的控制。预防猪伪狂犬病的疫苗主要有自然缺失弱毒疫苗和基因工程缺失疫苗，目前在市场上广泛使用是自然缺失弱毒疫苗。自然缺失弱毒疫苗是通过非猪源细胞或鸡胚的连续传代，或在某些诱变剂的存在下，用低于或高于通常的培养温度在细胞培养物上连续传代获得,其基因组的内部存在着多处的点突变以及一些基因的缺失，它是一种自然的基因缺失疫苗。从20世纪60年代开始，一些国家用不同的方法培育了几株伪狂犬病弱毒疫苗株，有匈牙利的Bartha株(Bartha K61株)；罗马尼亚的Bucharest株、TK200株和BUK株；北爱尔兰的NFA-4株；保加利亚的MK25株；法国的Alfolt-26株；前苏联的VAGK-2株等，其中在国内广泛使用的是BarthaK61株。
但2011年下半年以来，有多个使用常规疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似伪狂犬病流行的现象。我们从现地分离到病毒，命名为PRV HeN1株，通过血清中和试验和绵羊的免疫接种试验证实，在国内广泛使用的PRV疫苗株Bartha K61株免疫猪产生的中和抗体不能有效中和新分离的病毒PRV HeN1株，而且免疫Bartha K61的绵羊也不能完全抵抗PRV HeN1株的攻击。gE基因的序列分析表明，2012年分离的新流行毒株之间同源性很高，与以往发表的国内外gE基因序列相比处于一个相对独立的分支中，证实新流行毒株为PRV变异株，因此急需开发新的安全有效的PRV疫苗以应对新流行的毒株。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株猪伪狂犬病弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对于PRV变异株具有良好的保护效力。
本发明的目的之二是提供一种预防或诊断及治疗猪伪狂犬病的疫苗组合物或试剂。
本发明的上述目的分别是通过以下技术方案来实现的：
本发明利用一株分离自发病猪体的PRV变异株HeN1株(微生物保藏编号为CGMCCNO.6656，已记载在公开号为CN102994458A，公开日为2014-04-02，发明名称为“猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用”的专利申请中)，首先通过在Vero细胞上低温传代筛选获得了在US区存在包括gI、gE、Us9、Us2和部分反向重复序列在内的大片段缺失的病毒，然后进一步通过药物筛选致使其TK基因部分缺失。该基因缺失毒株命名为PRV TP株，与现有文献报道的PRV基因缺失株的缺失位置存在差异。利用对PRV敏感的小鼠、绵羊对其安全性进行了评价，结果表明PRV TP株对小鼠的半数致死量(LD50)为105.17TCID50，而本实验室之前构建的基因工程缺失毒rPRV-gE--EGFP+(微生物保藏编号为CGMCC NO.6657，已记载在公开号为CN102994458A，公开日为2014-04-02，发明名称为“猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用”的专利申请中)对小鼠的LD50为103.32TCID50。6-8月龄绵羊接种107.0TCID50的PRV TP株不引起发病和死亡，而接种106.0TCID50的rPRV-gE--EGFP+毒株可导致部分羊发病和死亡，说明PRV TP株比rPRV-gE--EGFP+毒株具有更高的安全性。将PRV TP株免疫仔猪可以提供对PRV变异株(PRV HeN1株)的完全保护，而现在广泛使用的Bartha K61株仅能提供对变异株的部分保护。上述结果表明本发明中获得的基因缺失病毒是一株具有良好安全性和免疫保护效力的弱毒株，可以作为弱毒疫苗使用。
本发明通过细胞低温传代和药物筛选致弱获得的一株猪伪狂犬病病毒(PorcinePseudorabies Virus，PRV)基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：在其UL区的TK基因存在独有的716bp缺失，TK基因的具体缺失位置为nt59391-60106，参照亲本毒基因组序列GenBank登录号为KP098534.1，缺失后TK基因核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
如本发明所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：其US区存在包括gI、gE、Us9、Us2及部分反向重复序列在内的大片段缺失，US区具体的缺失位置为nt121392-126327，参照亲本毒基因组序列GenBank登录号为KP098534.1，缺失后的部分Us区核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
如本发明所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：其gC基因及其侧翼序列为SEQ ID NO:3所示。
在本发明中，所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，命名为PRV TP，分类命名为伪狂犬病病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCCNo.12300，保藏时间为2016年5月25日。
进一步的，本发明还提出了一种用于治疗或预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，其由以上任一项所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株和药学上可接受的佐剂组成。
更进一步的，本发明还提出了所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株在制备预防或治疗猪伪狂犬病药物中的用途。以及所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株在制备诊断或检测猪伪狂犬病试剂中的用途。
本发明的弱毒疫苗株可制备成活疫苗或灭活疫苗(单苗或联苗)等，都可有效预防猪伪狂犬病，也可将其制备成诊断或检测猪伪狂犬病的试剂。本发明的猪伪狂犬病弱毒疫苗株PRV TP株具有安全性好、保护效率高、利于鉴别诊断等优点。
附图说明
图1为PRV HeN1 F135代噬斑克隆的PCR鉴定结果；
注：23号克隆为阴性；
图2为TK基因部分缺失毒株的PCR筛选结果；
注：以TKup2/TKLow2为引物，预计扩增产物大小为1406bp，3号克隆扩增大小为690bp；
图3为PRV TP株Us区缺失片段的PCR鉴定结果；
注：每组PCR产物上样顺序为(模板)HeN1 F5代、TP株、阴性对照；
图4为PRV TP株US区具体缺失位置的PCR鉴定结果；
注：以HeU121353/HeL126636为引物扩增TP株基因组，上样顺序为水对照、TP株，TP株扩增出大小约为500bp的片段；
图5为不同PRV毒株gC基因的PCR鉴定结果；
注：1、2、3泳道为引物Bartha gCup/Bartha gCLow扩增产物，4、5、6泳道为引物HeN1 gCup/HeN1 gCLow扩增产物，上样顺序均为TP株、Bartha K61株及阴性对照；
图6为PRV TP株与Bartha株gC基因特征性区域示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1、猪伪狂犬病病毒TP株的获得及分子特征鉴定
将猪伪狂犬病病毒HeN1株(该病毒株已记载在公开号为CN102994458，发明名称为“猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用”的专利申请中，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为CGMCC NO.6656。)的F10代接种长成良好单层的Vero细胞，将细胞培养箱的温度调至35℃，培养2-3天后收毒，冻融一次继续传代。当病毒在此温度上适应，能够在48h左右使80％以上细胞发生病变时，将培养箱温度降低1-2℃，以此类推，逐步降低培养温度至28℃。
当病毒传代至120代时开始进行噬斑克隆，具体方法是：将收获的病毒液进行1:106倍稀释后，按六孔细胞培养板每孔接种1mL病毒液的量接种Vero细胞，在37℃感作1h后吸出病毒液，铺上含1％低熔点琼脂糖的培养液，待48h左右出现明显噬斑时挑取单个噬斑，提取病毒基因组，利用一对扩增部分gE基因片段(672bp)的引物，以病毒基因组为模板扩增病毒的gE基因，确定该基因是否缺失。通过这种方法，在不同代次进行噬斑克隆。在F135代筛选到一个gE基因PCR检测为阴性的噬斑(图1，23号)。将该病毒(F135-23)纯化后进一步在LM-TK-细胞上进行药物筛选，方法是在细胞培养液中加入终浓度为40mg/L的BrdU，经过5代药物筛选后进行有限稀释和噬斑克隆，利用一对扩增TK基因的引物对各克隆进行PCR鉴定，获得一株TK基因部分缺失的病毒(图2，3号)。测序表明该病毒TK基因缺失716bp，TK基因的具体缺失位置为nt59391-60106(参照亲本毒基因组序列GenBank登录号为KP098534.1)，缺失后TK基因核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。通过对gE基因两侧设计引物进行PCR检测表明，在US区gI、gE、US9、US2序列均扩增不到，而gI上游的gG、gD基因存在(图3)，利用1条位于gD基因中的上游引物HeU121353和1条位于反向重复序列中的下游引物HeL126636以TP株基因组为模板进行PCR扩增，获得了一大小约为500bp的片段(图4)，测序显示Us区具体的缺失位置为nt121392-126327(参照亲本毒基因组序列GenBank登录号为KP098534.1)。将该毒株命名为PRV TP株。超离纯化TP株病毒，提取其基因组利用高通量Illumina HiseqTM2500测序仪进行全基因组测序，结果显示，与亲本毒HeN1株相比，TP株仅存在这两处大片段缺失。现有疫苗株Bartha K61株Us区也存在大片段缺失，包括部分gI、gE、US9、部分US2序列，与TP株存在差异，为了进一步与其进行鉴别，根据Bartha株基因组序列和HeN1株基因组序列分别在其gC基因外侧设计了1对扩增其gC基因的引物：Bartha gCup/Bartha gCLow以及HeN1gCup/HeN1 gCLow。利用这两对引物对两株病毒基因组进行PCR扩增表明，Bartha gCup/Bartha gCLow只能扩增出Bartha K61株的gC基因，而HeN1 gCup/HeN1 gCLow只能扩增出TP株的gC基因(图5)，测序表明TP株的gC基因与Bartha K61株的gC基因相比存在21bp连续碱基的插入(图6)，TP株的gC基因及其侧翼序列如SEQ ID NO:3所示。
将获得的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株PRV TP，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，微生物保藏号是：CGMCC No.12300。
实施例2、猪伪狂犬病病毒TP株(PRV TP，CGMCC No.12300)对易感动物的安全性评价
1)猪伪狂犬病病毒TP株对Balb/c小鼠的致病力试验
7-8周龄的Balb/c小鼠55只，每笼5只。将PRV TP株和rPRV-gE--EGFP+毒株(微生物保藏编号为CGMCC NO.6657)分别稀释为102.0-106.0TCID50/0.2mL，每个稀释度的病毒接种5只小鼠(1笼)，每只0.2mL。另5只小鼠作为阴性对照。接种后每天观察并记录小鼠的死亡情况，结果如表1所示，计算两株病毒对小鼠的半数致死量LD50。结果表明PRV TP株对小鼠的半数致死量(LD50)为105.17TCID50，而rPRV-gE--EGFP+对小鼠的LD50为103.32TCID50。
表1 不同毒株对Balb/c小鼠的致病力比较
2)猪伪狂犬病病毒TP株对绵羊的致病力试验
6-8月龄绵羊21只，PRV抗体检测为阴性，随机分为6组，其中1组2只羊为阴性对照，1组3只羊接种105.0TCID50的亲本强毒株PRV HeN1株F5代，另4组每组4只羊分别接种106.0、107.0TCID50的PRV TP株和rPRV-gE--EGFP+毒株，接种后每天观察绵羊的发病和死亡情况，结果如表2所示，从接种后第5天开始，强毒株PRV HeN1株F5代接种的3只羊陆续发病、死亡，发病羊表现为瘙痒、角弓反张等神经症状；rPRV-gE--EGFP+毒株106.0TCID50接种组发病和死亡1只，107.0TCID50接种组4只羊全部发病并死亡；而高剂量接种PRV TP株的两组羊在整个观察期(14天)均没有出现发病和死亡。
表2 不同毒株对绵羊的致病力比较
通过接种对PRV易感的Balb/c小鼠和绵羊的致病力试验说明PRV TP株具有高度的安全性。
实施例3、猪伪狂犬病病毒TP株对仔猪的免疫保护效力试验
经抗体检测为PRV阴性的21日龄仔猪15头，随机分为3组，每组5头。A组每头肌肉注射1头份(每头份病毒含量为105.0TCID50)的PRV Bartha K61疫苗，B组每头肌肉注射1头份(每头份病毒含量为105.0TCID50)的PRV TP株，C组作为攻毒对照。免疫后14天攻毒，每头猪接种2mL含106.0TCID50的PRV HeN1株F5代。免疫后每周采血分离血清，利用IDEXX试剂盒检测抗PRV gB、gE抗体，攻毒后14天内每日测量体温、观察临床反应，结果如表3所示。结果显示免疫后1周大部分猪产生了抗gB抗体，免疫后2周所有猪抗体阳转，抗gE抗体为阴性。TP株免疫组攻毒后所有猪均未出现明显的临床症状，采食、饮水、活动均正常；Bartha K61株免疫组有1头猪出现明显症状，表现为发热、食欲减退、精神萎靡、喜卧、最后出现抽搐并死亡；对照猪全部发病并死亡。说明PRV TP株免疫仔猪对PRV变异株PRV HeN1具有良好的免疫保护效果。
表3 PRV TP株与Bartha K61株免疫效果比较

Claims (6)

1.一株猪伪狂犬病病毒（Porcine Pseudorabies Virus，PRV）基因缺失弱毒疫苗株，命名为PRV TP，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCC No. 12300。
2.如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：在其UL区的TK基因存在独有的716 bp缺失，TK基因的具体缺失位置为nt59391-60106，参照亲本毒基因组序列GenBank登录号为KP098534.1，缺失后TK基因核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：其US区存在包括gI、gE、Us9、Us2及部分反向重复序列在内的大片段缺失，US区具体的缺失位置为nt121392-126327，参照亲本毒基因组序列GenBank登录号为KP098534.1，缺失后的部分Us区核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：其gC基因及其侧翼序列为SEQ ID NO:3所示。
5.一种用于治疗或预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，其特征在于：由权利要求1 -4任一项所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株和药学上可接受的佐剂组成。
6.权利要求1-4任一项所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株在制备预防或治疗猪伪狂犬病药物中的用途。
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