CN105087502B - H9n2亚型禽流感病毒温度敏感性减毒活疫苗候选株ca‑28（ah）及其应用 - Google Patents
H9n2亚型禽流感病毒温度敏感性减毒活疫苗候选株ca‑28（ah）及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及H9N2亚型禽流感病毒温度敏感性减毒活疫苗候选株CA‑28(AH)其应用。所述毒株CA‑28(AH)，保藏号是CGMCC No.11037。该毒株可用于制备温度敏感性减毒活疫苗。本发明所述疫苗候选株CA‑28(AH)仅能在气管中低程度复制，不发生接触传播，安全性好。免疫鸡后可产生较高的HI抗体，能对我国流行的两个谱系BJ/94和Y280中的禽流感病毒提供很好的交叉保护。该疫苗候选株既可单独使用，成为H9亚型禽流感防控的有效工具，亦可与灭活疫苗联合使用，提供更为确实的免疫保护作用。将在H9亚型禽流感防控中发挥极为重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过对H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)在SPF鸡胚中逐步梯度降温培养构建广谱性H9N2亚型AIV温度敏感性减毒活疫苗的方法，主要涉及的AIV为BJ-94-like和Y280-like谱系的毒株。
背景技术
H9N2亚型禽流感病毒自1994年从我国广东省某鸡群中分离以来，很快蔓延至其它地区，并逐渐呈地方性流行，给我国养殖业造成了巨大的经济损失。除了感染家禽外，H9N2亚型禽流感病毒还能感染哺乳动物(猪和人等)。虽然H9N2亚型AIV感染人只是引起轻微的临床症状，但H9N2亚型的AIV能够与其它亚型AIV发生重组产生新型流感病毒。因此，H9N2AIV对养殖业和人类健康均有危害，是非常重要的人兽共患病病原体。
疫苗免疫是防控禽流感的有效手段。然而由于AIV的基因组是分节段的RNA，RNA聚合酶的复制具有一定的突变率，因此流感病毒能够快速发生遗传变异，导致现有灭活疫苗防控禽流感效果不理想。目前我国使用的全病毒灭活疫苗既有针对早期的毒株，如Ck/SH/F/98和Ck/SD/6/96(BJ-94-like谱系)(Li,C.,Yu,K.,Tian,G.,Yu,D.,Liu,L.,Jing,B.,Ping,J.,Chen,H.,2005.Evolution of H9N2 influenza viruses from domesticpoultry in Mainland China.Virology 340,70-83)。也有针对近期的流行株(Y280-like谱系)(Zhang,Y.,Yin,Y.,Bi,Y.,Wang,S.,Xu,S.,Wang,J.,Zhou,S.,Sun,T.,Yoon,K.J.2012.Molecular and antigenic characterization of H9N2 avian influenzavirus isolates from chicken flocks between 1998 and 2007 in China.VetMicrobiol 156,285-293.)，免疫鸡群仍不时有H9N2亚型AI的疫情爆发。实验室条件下，SPF鸡群接种早期毒株制备的灭活疫苗后，使用当前流行的H9N2亚型AIV以滴鼻方式进行攻毒，仍会发生高水平的排毒(Sun,Y.,Pu,J.,Jiang,Z.,et al.Genotypic evolution andantigenic drift of H9N2 influenza viruses in China from 1994 to 2008.VetMicrobiol,2010,146:215-225.)；而使用部分流行株制备的灭活疫苗也不能很好地保护SPF鸡只抵御H9N2病毒的攻击(刘东，宫晓，刘晓东，等.2013.H9N2亚型禽流感流行分析及疫苗毒株的筛选.中国动物检疫.2013年第30卷第6期：45-50；万晓朋，曾显营，田国彬，等.2010.H9N2亚型禽流感流行株灭活疫苗种毒的筛选.中国预防兽医学报.第32卷第4期：277-280)。因此，研制针对不同谱系H9亚型AIV毒株具有交叉保护性的疫苗迫在眉睫。
与传统的灭活疫苗相比，减毒活疫苗能够诱导机体产生黏膜免疫和细胞免疫，具有交叉保护效果好优势。而且，减毒活疫苗可通过喷雾或者饮水的方式免疫，使用更方便，大大降低了人力成本。以新城疫疫苗为例，不需注射而仅用饮水就能快速、方便地完成鸡只的大规模免疫(Senne DA,King D J,Kapczynski D R.Control of Newcastle disease byvaccination.Developments in biologicals,2004,119 165-70.)。来自具有温度 敏感特性病毒(A/Guinea Fowl/HonKong/WF10/99)的内部基因配合H5N1亚型病毒(A/Vitnam/1203/04)的HA及NA基因的重组病毒疫苗能够赋予鸡对H5N1亚型高致病性流感病毒较好的抵抗力(Song,H.,Nieto,G.R.,Perez,D.R.A new generation of modified live-attenuated avian influenza viruses using a two-strategy combination aspotential vaccine candidates[J].Journal of virology,Sep,2007,81(17):9238-48.)。因而减毒活疫苗在对禽流感防控上具有极大的应用潜力。
本研究中，我们选取A/chicken/Anhui/1/2008(AH)株(Yinbiao Zhu，Yang Yang，Wei Liu，Xin Liu，Da Yang，Zhihao Sun，Yong Ju，Sujuan Chen，Daxin Peng，XiufanLiu.Comparison of biological characteristics of H9N2 avian influenza virusesisolated from different hosts Archives of virology 2015 Jan 24.；1432-8798)，采用逐步梯度降温的方法将其置于SPF鸡胚中连续传代适应培养，获得一系列不同温度下的适应毒株。使用SPF鸡胚测定不同温度适应毒的冷适应特性(Cold-adapted，Ca)和温度敏感特性(Temperature-sensitive，Ts)。免疫鸡测定病毒毒力下降情况。免疫鸡后测定血清的抗体应答水平，观察其对不同谱系H9亚型AIV攻毒提供的保护作用。挑选出毒力致弱、免疫效力出色且具有理想保护效力的适应毒作为减毒活疫苗候选株。
发明内容
H9N2亚型AIV感染给养禽业造成了巨大的经济损失，目前主要使用H9N2亚型禽流感灭活疫苗来防控该病。由于H9N2亚型禽流感灭活疫苗只能诱导产生较高的HI抗体，不能提供细胞免疫和黏膜免疫，对易发生抗原变异的H9N2亚型AIV很难提供交叉保护，常常发生免疫失败。为了解决上述问题有必要研制出能提供细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫，产生交叉保护性的新型弱毒活疫苗。
本发明选取当前流行的Y280谱系的A/chicken/Anhui/1/2008(AH)株，采用逐步梯度降温的方法将其置于SPF鸡胚中连续传代适应培养，获得一系列不同温度下的适应毒。使用SPF鸡胚测定不同温度适应毒的冷适应特性(Cold-adapted，Ca)和温度敏感特性(Temperature-sensitive，Ts)。测定低温适应毒的毒力指标和免疫抗体产生情况，筛选出安全性好且免疫原性好的低温适应毒作为疫苗候选株，免疫鸡后评价其对不同谱系H9亚型AIV攻毒提供的保护作用，筛选出能提供交叉保护的弱毒活疫苗。
本发明提供了一株H9N2亚型禽流感病毒CA-28(AH)，其保藏号是CGMCC No.11037。
本发明还公开了所述的H9N2亚型禽流感病毒CA-28(AH)在制备温度敏感性减毒活疫苗中的应用。
本发明所述疫苗候选株CA-28(AH)仅能在气管中低程度复制，不发生接触传播，安全性好。免疫鸡后可产生较高的HI抗体，能对我国流行的两个谱系BJ/94和Y280中的禽流感病毒提供很好的交叉保护。该疫苗候选株既可单独使用，成为H9亚型禽流感防控的有效工具，亦可与灭活疫苗联合使用，提供更为确实的免疫保护作用。将在H9亚型禽流感防控中发挥极为重要的作用。
本发明菌株CA-28(AH)于2015年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为禽流感病毒，保 藏编号为CGMCC No.11037。
具体实施方式
本发明的毒株CA-28(AH)要下文中简称为CA-28。
本发明中具体的试验方案：
1.低温培养致弱病毒
用PBS将A/Chicken/Anhui/1/2008(AH)株病毒(Zhu Y,Yang Y,Liu W,etal.Comparison of biological characteristics of H9N2 avian influenza virusesisolated from different hosts,Archives of virology,2015,160:917-927)稀释成4HA单位/100μL，经尿囊腔接种4枚10日龄SPF鸡胚，置于培养箱中培养。3天后，将接种鸡胚置于4℃冰箱过夜后，收取其尿囊液并进行血凝实验。将鸡胚培育温度从37℃逐步降低到25℃，每次降低1℃。从37℃到26℃，病毒在每温度点用鸡胚传代10次，而在25℃则传代25次。之后对每个代次末次传代的病毒采取有限稀释法用鸡胚对其纯化，收集纯化后的病毒，分装后存放于-70℃冰箱。
2.低温培育毒株株冷适应及温度敏感性特性鉴定
2.1 冷适应特性(Cold-adapted)鉴定
冷适应性(Ca)是将病毒株在合适的生长温度33℃条件下和在低温26℃生长条件下在10日龄鸡胚中的复制滴度进行比较。在26℃低温条件下，如果病毒在鸡胚中的生长滴度比其在33℃下的滴度的差值在100倍以内时，那么就认为这个病毒具有冷适应特征，反之亦然。
为了鉴定低温培育毒株是否具有冷适应特性，将4个HA单位/100μL的低温培育毒株及其亲本病毒WT-AH接种鸡胚后，分别置于26℃和33℃中培养。病毒培养72小时后，收集尿囊液，并在33℃条件下测定病毒的半数感染量(EID50)。试验结果显示，在33℃下，低温培育毒株(CA-25、CA-26、CA-27和CA-28)及其亲本病毒WT-AH均能较好的生长：低温培育毒株的平均EID50值为7.5-8.0log10EID50/0.1ml；WT-AH的平均EID50值为8.0log10EID50/0.1ml。而在26℃条件下，CA-25、CA-26和CA-27的繁殖滴度比33℃下略低，为7.0-7.2log10EID50/0.1ml，而CA-28和WT-AH则完全无法复制(表1)。因此除了CA-28和WT-AH外，其它低温培育毒株均具有冷适应特性。
2.2 温度敏感特性(Temperature-sensitive)鉴定
温度敏感性(Ts)是将病毒株在合适的生长温度33℃条件下和在高温39℃生长条件下在10日龄鸡胚中的复制滴度进行比较。如果在39℃温度条件下，病毒在鸡胚中的生长滴度比其在33℃温度下的滴度降低100倍或以上时，那么就认为这个病毒具有温度敏感性特征，反之亦然。
为了鉴定低温培育毒株是否具有温度敏感特性，将4个HA单位/100μL的低温培育毒株及其亲本病毒接种10日龄SPF鸡胚，将接种后鸡胚分别放置于33℃和39℃培养。鸡胚在相应温度培养72小时后，将其置于4℃过夜后收取尿囊液，并在33℃条件下测定病毒的鸡胚半数感染量。试验结果显示，在33℃， 所有病毒均生长良好。在39℃，低温培育毒株(CA-25、CA-26、CA-27和CA-28)均不能复制，而WT-AH繁殖滴度能达到7.9log10EID50/0.1ml(表1)。因此所有低温培育毒株均具有热敏感特性。综上所述，CA-25、CA-26和CA-27同时具有冷适应性和温度敏感性，而CA-28仅具有温度敏感性。
表1 低温培育株冷适应性和温度敏感性的鉴定
3.SPF鸡致病性和传播试验
为了测定亲本病毒与低温培育毒株对鸡的致病性。55只4周龄SPF鸡，随鸡分组，每组11只，用106EID50/200μL/只的病毒量以滴鼻方式攻毒，攻毒后连续观察21天。
3.1 低温适应毒组织复制能力测定
为探究所培育低温适应毒致弱程度，将冷适应毒和亲本病毒WT-AH以1×106EID50/200μl病毒量通过滴鼻途径接种SPF鸡。病毒接种后第3天和第5天，分别采集鸡肺和气管组织，将其制成组织悬液后通过EID50来测定病毒含量。结果显示，接种病毒后第3天，亲本病毒WT-AH复制较好(5.08±0.28log10EID50/g)，CA-25、CA-26和CA-27均无法复制，而CA-28能够低程度复制(1.08±0.12log10EID50/g)，显著低于WT-AH的繁殖滴度(P<0.05)；在肺组织中，只有WT-AH能够复制。接种病毒后第5天，在气管组织中，只有亲本病毒WT-AH能够复制，而所有低温培育毒株均无法复制；在肺组织中，所有病毒均无法复制(表2)。因此，所有低温培育毒株不能在肺组织中复制，部分所有低温培育毒株可在上呼吸道复制，与野生型毒株相比具有很好的安全性。
表2.低温培育株在SPF鸡气管和肺组织复制特性
a未能检测到病毒。
3.2 病毒在鸡中的传播试验
50只SPF鸡，随机分组，10只/组，其中每组5只分别接种106EID50的病毒作为供体组，在其攻毒24小时后在同一笼中放入5只鸡作为接触组。攻毒及暴露后第3和5天分别采集攻毒组合接触组中鸡的气管和泄殖腔拭子，处理后，接种鸡胚测定排毒情况。待感染或暴露21天后，采血，测定其HI抗体效价，同时观察血清转阳现象。
结果显示亲本病毒WT-AH接种3天内显示轻度的呼吸道症状，然后恢复。攻毒后第3和5天，接种组和接触组鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子的病毒分离率高达100％，且在感染后21天，所有鸡只均发生血清转阳。而对低温培育株而言，所有接种鸡均无明显的症状，除了CA-28外，在所有接种组和接触组鸡的喉气管拭子和泄殖腔拭子中均无法分离出病毒。在接种组中，CA-28能使鸡只全部发生血清转阳(100％)，CA-27造成部分鸡血清转阳(60％)，而CA-25和CA-26不能导致鸡只血清转阳。而所有接触组中的鸡只均不发生血清转阳(表3)。因此，亲本病毒WT-AH则显示出极好的接触传播能力，而所有低温培育株均没有接触传播能力，具有很好的安全性。
表3.低温培育株在鸡中的传播试验
a接种或暴露21天后，采集鸡血清检测HI价。若HI值<4log2，则判定未发生血清转阳现象
4.免疫原性测定
为了检测低温适应毒的免疫效力，将病毒以106EID50剂量经鼻腔免疫4周龄SPF鸡后(5只/组)，每隔7天采血、分离血清、并测其HI效价，一直持续到第21天。若第21天的HI值低于8log2时，则以相同剂量和相同接种方式加强免疫一次，并在加强免疫后第7和14天分离血清并测定HI效价。
如表4所示，不同温度下培育的冷适应毒具有不同的免疫原性。在单剂量免疫后21天，CA-25和CA-26诱导的平均HI值分别为2log2和3log2。CA-27和CA-28诱导的平均HI值分别为5log2和7log2。加强免疫14天后，CA-25和CA-26的平均HI价均上升到5log2，而CA-27和CA-28的平均HI值分别提升到8log2和10log2。
表4 低温培育株免疫原性测定
a未进行加强免疫。
5.攻毒保护试验
5.1 SPF鸡单剂量免疫后用同源和异源病毒的攻击试验
免疫组的SPF鸡(10只/组)用106EID5低温培育毒株经鼻腔免疫，对照组的SPF鸡鼻腔接种灭菌PBS。免疫后21天采血、分离血清、测定HI值。同时以106EID50剂量的同型(同源病毒TX和异源病毒F98)病毒通过滴鼻方式攻毒。攻毒后第3、5和7天分别采集气管和泄殖腔棉拭子，处理棉拭子，接种SPF鸡胚，分离病毒，检测排毒情况。
攻毒保护试验结果显示(表5)，单剂量免疫后21天用同源(AH)和异源(F98)H9N2亚型禽流感病毒攻击后，CA-25和CA-26免疫组鸡只呼吸道和泄殖腔排毒率在攻毒后第3天和第5天达到100％。CA-27免疫组鸡只在攻毒后第3天的排毒率为70％-80％，低于对照组的100％，但它们之间不存在显著性差异。CA-28免疫组鸡只的排毒率在30％-50％之间，显著低于对照组(p<0.05)。
表5.SPF鸡一次免疫后攻毒保护试验
a气管拭子
b泄殖腔拭子
5.2 SPF加强免疫后用同源和异源病毒的攻击试验
SPF鸡用低温培育毒株单剂量免疫后14天，以相同免疫剂量和方式加强免疫。免疫后14天，采血、分离血清、测定HI值。同时以106EID50剂量的同型(同源病毒AH和异源病毒F98)病毒通过滴鼻方式攻毒。攻毒后第3、5和7天分别采集气管和泄殖腔棉拭子，处理棉拭子，接种SPF鸡胚，分离病毒，检测排毒情况。
试验结果显示(表6)，加强免疫14天攻毒后第3天和第5天，CA-25和CA-26的呼吸道和泄殖腔排毒率在80％-100％之间，与对照组没有显著性差异。CA-27免疫组鸡只的排毒率在30％-50之间，显著低于对照组(p<0.05)。CA-27的保护率相对一免时有所提高，达到50％以上的保护。而从CA-28免疫组鸡只的呼吸道和泄殖腔拭子中均未分离到病毒，排毒率为0％，保护率为100％。因此选择温度敏感性CA-28作为H9N2亚型禽流感病毒弱毒活疫苗候选株。
表6.SPF鸡加强免疫后攻毒保护试验
a气管拭子
b泄殖腔拭子
6 温度敏感株基因序列分析
参照试剂说明书，用Trizol(Invitrogen公司产品)法从鸡胚尿囊液中提取低温培育毒株CA-28的RNA，再使用12碱基引物(5’-AGCGAAAGCAGG-3’)将其反转录成cDNA。使用针对特定基因片段的一组通用引物(Hoffmann,E.,Stech,J.,Guan,Y.,Webster,R.G.,Perez,D.R.,2001.Universal primer set for the full-length amplification of allinfluenza A viruses.Archives of virology 146,2275-2289)及高保真Taq酶(Roche公司产品)扩增病毒的8个片段。PCR扩增后的片段经胶回收试剂盒(Axygen公司产品)纯化后，将其与克隆载体(购自Invitrogen公司)相连。挑取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。使用Lasergene软件对所得到的基因序列进行比对分析。所测得8个基因(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS)的全长序列和所编码蛋白的氨基酸序列如下表:
| 名称 | 基因全长序列 | 氨基酸序列 | |
| 1 | PB2 | SEQ ID No.1 | SEQ ID No.3 |
| 2 | PB1 | SEQ ID No.2 | SEQ ID No.4 |
| 3 | PA | SEQ ID No.5 | SEQ ID No.6 |
| 4 | HA | SEQ ID No.7 | SEQ ID No.8 |
| 5 | NP | SEQ ID No.9 | SEQ ID No.10 |
| 6 | NA | SEQ ID No.11 | SEQ ID No.12 |
| 7 | M | SEQ ID No.13 | SEQ ID No.14(M1)和SEQ ID No.15(M2) |
| 8 | NS | SEQ ID No.16 | SEQ ID No.17(NS1)和SEQ ID No.18(NS2) |
7 野生毒株(WT-AH)与温度敏感毒株(CA-28)基因组氨基酸比较分析
序列分析结果显示，温度敏感毒株的基因变异主要发生在PB2、PB1、PA和HA基因上，其余4个基因未发生变异，具体见表7。
表7.野生毒(WT-AH)及其28℃冷适应毒(CA-28)基因组氨基酸比较分析
“-”：氨基酸无任何变异。
Claims (2)
1.H9N2亚型禽流感病毒CA-28(AH)，其保藏号是CGMCC No.11037。
2.权利要求1所述的H9N2亚型禽流感病毒CA-28(AH)在制备H9N2亚型禽流感病毒温度敏感性减毒活疫苗中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20171215 Termination date: 20190923 |