CN114410594B - 一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用 - Google Patents

一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114410594B
CN114410594B CN202111487158.2A CN202111487158A CN114410594B CN 114410594 B CN114410594 B CN 114410594B CN 202111487158 A CN202111487158 A CN 202111487158A CN 114410594 B CN114410594 B CN 114410594B
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
ldt3
virus
infectious bronchitis
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111487158.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114410594A (zh
Inventor
刘胜旺
李慧昕
韩宗玺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbin Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN202111487158.2A priority Critical patent/CN114410594B/zh
Publication of CN114410594A publication Critical patent/CN114410594A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114410594B publication Critical patent/CN114410594B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/20064—Methods of inactivation or attenuation by serial passage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用，属于生物医药技术领域。为了克服传染性支气管炎病毒分离株、疫苗株不能在体外细胞中有效增殖复制的缺陷。本发明提供一种适应鸡胚成纤维细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒株，提供一种适应非洲绿猴肾细胞系复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒株，通过在体外原代细胞和传代细胞系中连续传代、筛选获得能够有效感染体外细胞并在细胞中大量增殖复制的鸡传染性支气管炎病毒。体外细胞适应传染性支气管炎病毒可作为传染性支气管炎病毒感染细胞的研究模型探索病毒侵染细胞相关机制，同时可用于鸡传染性支气管炎疫苗、诊断制剂等所需病毒的体外增殖候选毒株，具有重要的实际应用价值。

Description

一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一类鸡的重要的急性呼吸道传染病，是除高致病性禽流感和新城疫之外世界各国养禽业面临的最重要的疫病，IBV几乎在所有家禽密集养殖的地区存在和流行，每年给养禽业造成重大经济损失，是世界各国养禽业面临的重大问题。该病的危害主要表现在4个方面：1)可引起雏鸡的发病和死亡，有的毒株死亡率高达80％以上，给养禽业造成直接的经济损失；2)IBV的感染可造成细菌、支原体以及其他病原微生物的继发感染和混合感染，引起较高的发病率和死亡率，而且混合感染引发的气囊炎，可使肉鸡在加工过程中被淘汰；3)IBV的感染可引起肉鸡增重减缓和饲料利用率降低；4)引起蛋鸡产蛋数量和蛋的品质下降。传染性支气管炎感染鸡后，病毒原发和主要的增殖部位为呼吸道上皮细胞，因此该病初期发病的主要特征是病鸡咳嗽、打喷嚏、气管啰音。随着病程的发展，病毒进一步呈现出更加广泛的组织嗜性，但不同病毒株往往呈现出不同的致病性。根据IBV感染后期病毒对组织的亲嗜性、损害的主要器官，将该病分为不同的致病型，主要包括呼吸型、肾型、肠型、生殖型等，从已有的研究中我们也发现往往同一病毒可能造成一种或/和多种病理损伤，仅依据临床和组织学变化对IB作出客观判断存在很大难度。IB的致病型仅仅是病毒致病的临床病症，与病毒的抗原性、血清型以及免疫保护型无直接相关性。
有效的检测和免疫接种是防治该病的最有效手段。目前商品化的IBV疫苗有弱毒活疫苗和灭活疫苗，抗体检测依赖基于全病毒抗原或保守蛋白核衣壳蛋白N的ELISA抗体检测试剂盒。其中IBV灭活疫苗、活疫苗以及诊断制剂所用全病毒抗原均由培养增殖的病毒制备。目前培养传染性支气管炎病毒抗原几乎均依赖鸡胚生产系统。众所周知，包括传染性支气管炎病毒在内的禽冠状病毒在不驯化情况下均不能有效在体外细胞系或原代细胞中增殖复制，因此IBV的体外培养方式较少，鸡胚活体培养是目前IBV的基础研究和应用研究中的主要体外培养方式。IBV可以在9-11日龄的鸡胚尿囊腔和尿囊膜中良好增值，病毒在鸡胚中培养5天后可以看到胚体变小、鸡胚蜷曲如弹丸样、羊膜增厚紧贴胚体等特征性症状，该方法广泛应用于IBV的鉴定。自然毒初次接种鸡胚，往往需要在鸡胚尿囊腔内盲传几代，病毒适应鸡胚后才能表现出明显的临床症状。一直以来，人们通过在SPF鸡胚中连续传代致弱，用来生产IBV的弱毒疫苗，例如全球广泛使用的H120和H52就是经典M型强毒珠分别在鸡胚传代120次和52次得到，然而，这种培养方式周期较长，大量鸡胚的使用不仅带来高昂的费用同时也存在对环境污染的威胁。此外，鸡胚是一个多细胞混杂的生物个体，不利于IBV致病性研究，封闭的腔室环境也不便于对IBV生物学特性的深入研究和病毒的拯救。该培养方式在某种程度上限制了IBV的基础性研究，从而影响新疫苗的研发进度。气管环培养(TOC)可以用于多种呼吸道病原的研究，第一株人冠状病毒(HCo V)的分离就是利用人胚气管环完成的。此后，该培养方式引起禽病研究者的重视，气管环培养在研究NDV持久性感染、毒株的分离和致病性研究上发挥了重要作用。由于TOC灵敏可观的实验效果，使其逐渐成为研究IBV感染的一个体外模型。根据纤毛的完整性和摆动与否判断IBV的有无，成为鉴定传染性支气管炎的金标准，TOC的气管环来源于19-20日龄的鸡胚的气管环，据报道在测定IBV的滴度和分离病毒时9日龄的鸡胚气管环也能拥有相同敏感度。一般，选择19日龄的鸡胚，保持了组织活性又便于操作，从鸡胚中取出气管环放于细胞培养基中培养并接种IBV至第三天利用显微镜可观察到完整的纤毛产生损伤且摆动停滞。然而，这种方法却存在很大的缺陷，气管环培养只对传统的呼吸型IBV敏感，对其他类型肾型和腺胃型毒株不敏感，有时新城疫病毒或鸡腺病毒的感染也会造成纤毛摆动停滞，从而容易产生假阳性结果，同时气管环制备成本较高，制备工艺复杂。体外传代细胞系是培养病毒最为经济，方便且稳定的培养方式，且细胞培养一般不存在鸡胚可能存在的潜在的其他病原污染情况，成分比较单一，确保增殖病毒的纯净性。然而，相比于其他冠状病毒，IBV并不容易适应体外细胞培养。
由于IBV存在众多型，但缺乏不同类型的适应体外细胞的毒株，这严重限制了对其他类型传染性支气管炎病毒疫苗研发生产的应用型研究以及对变异机制的基础性研究。因此，筛选培育获得适应体外细胞或细胞系的IBV病毒株一直是IBV研究领域迫切需要解决的重要问题。
发明内容
本发明的目的是为了克服传染性支气管炎病毒分离株、疫苗株的情况下不能在体外细胞中有效增殖复制的缺陷。
本发明提供了一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus)，所述鸡传染性支气管炎病毒的命名为LDT3/03CEF adapted株，于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCCNO.22387；或所述鸡传染性支气管炎病毒的命名为LDT3/03Vero adapted株，于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC NO.22386。
进一步地限定，所述LDT3/03CEF adapted株与亲本强毒tl/CH/LDT3/03株核酸同源率99％；所述LDT3/03Vero adapted株与亲本强毒tl/CH/LDT3/03株核酸同源率99％。
上述的鸡传染性支气管炎病毒在建立用于评价鸡传染性支气管炎病毒侵染细胞后对细胞代谢、转录和免疫的动物模型中的应用。
本发明提供一种疫苗组合物，所述组合物含有疫苗上可接受的载体和上述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株或其衍生病毒。
进一步地限定，所述疫苗组合物为单价疫苗、二价疫苗或多价疫苗。
进一步地限定，所述鸡传染性支气管炎病毒含量为≥106.5TCID50/0.1ml。
上述的鸡传染性支气管炎病毒或上述的疫苗组合物在制备用于预防或治疗急性呼吸道性传染病是鸡传染性支气管炎药物。
本发明提供一种制备鸡传染性支气管炎病毒的减毒株的方法，所述方法包括如下步骤：在鸡胚成纤维细胞中，对LDT3/03CEF adapted株进行传代培养，从而获得减毒毒株；或在非洲绿猴肾细胞中，对LDT3/03Vero adapted株进行传代培养，从而获得减毒毒株。
有益效果：本发明以我国主要流行的鸡传染性支气管炎病毒典型代表毒株tl/CH/LDT3/03株为母本病毒，血清型和基因型显著不同于以往广泛研究和应用的经典血清型毒株。通过病毒适应性传代技术，在体外原代细胞(CEF)和传代细胞系(Vero)中连续传代、筛选获得能够有效感染体外细胞并在细胞中大量增殖复制的鸡传染性支气管炎病毒。本发明获得的2株体外细胞适应传染性支气管炎病毒可作为研究传染性支气管炎病毒体外感染机制和制备传染性支气管炎病毒方法，用于鸡传染性支气管炎疫苗、诊断制剂等所需病毒的体外增殖候选毒株，具有重要的实际应用价值。
生物材料保藏
鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus)的命名为LDT3/03CEFadapted株，于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC NO.22387，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus)的命名为LDT3/03Veroadapted株，于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC NO.22386，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为培育的细胞适应病毒LDT3/03Vero adapted株、亲本强毒tl/CH/LDT3/03株和常规疫苗株H120株感染Vero细胞后的病变图；A是tl/CH/LDT3/03株感染Vero细胞，B是H120株感染Vero细胞，C是LDT3/03Vero adapted株感染Vero细胞，D是Vero细胞对照；
图2为培育的细胞适应病毒LDT3/03CEF adapted株、亲本强毒tl/CH/LDT3/03株和常规疫苗株H120株感染CEF细胞后的病变图；A是tl/CH/LDT3/03株感染CEF细胞，B是H120株感染CEF细胞，C是LDT3/03CEF adapted株感染CEF细胞，D是CEF细胞对照；
图3为培育的细胞适应病毒LDT3/03CEF adapted株、亲本强毒tl/CH/LDT3/03株和常规疫苗株H120株感染CEF细胞后的免疫荧光图；A是tl/CH/LDT3/03株感染CEF细胞，B是H120株感染CEF细胞，C是LDT3/03CEF adapted株感染CEF细胞，D是CEF细胞对照；
图4为培育的细胞适应病毒LDT3/03Vero adapted株、亲本强毒tl/CH/LDT3/03株和常规疫苗株H120株感染Vero细胞后的免疫荧光图；A是tl/CH/LDT3/03株感染Vero细胞，B是H120株感染Vero细胞，C是LDT3/03Vero adapted株感染Vero细胞，D是Vero细胞对照；
图5为LDT3/03CEF adapted株的生长动力学特性图，其中横坐标是时间，纵坐标是病毒滴度；
图6为LDT3/03Vero adapted株的生长动力学特性图，其中横坐标是时间，纵坐标是病毒滴度；
图7为表2LDT3/03CEF adapted P20与亲本病毒tl/CH/LDT3/03基因组序列比较(A、B和C)；
图8为表3LDT3/03Vero adapted P25与亲本病毒tl/CH/LDT3/03基因组序列比较(A、B和C)；
图9为表4LDT3/03CEF adapted P40代与LDT3/03CEF adapted株基因组序列比较(A、B、C、D和E)；
图10为表5LDT3/03CEF adapted P50代与LDT3/03CEF adapted株基因组序列比较(A、B、C、D和E)；
图11为表6LDT3/03Vero adapted P40代与LDT3/03Vero adapted株基因组序列比较(A、B、C、D和E)；
图12为表7LDT3/03Vero adapted P50代与LDT3/03Vero adapted株基因组序列比较(A、B、C、D、E和F)。
具体实施例
本发明制备的体外细胞适应毒株LDT3/03CEF adapted和LDT3/03Vero adapted适应株的母本病毒tl/CH/LDT3/03株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离鉴定和保存(已记载在文献：Shengwang Liu,Jianfei Chen,Jinding Chen,Xiangang Kong,YuhaoShao,Zongxi Han,Li Feng,Xuehui Cai,Shoulin Gu,Ming Liu.Isolation of avianinfectious bronchitis coronavirus from domestic peafowl(Pavo cristatus)andteal(Anas).Journal of General Virology,2005,86(3):719-725中)。
亲本强毒tl/CH/LDT3/03株GenBank:KT852992.1。
单抗4F10见文献：Zongxi Han,Fei Zhao,Yuhao Shao,Xiaoli Liu,XiangangKong,Yang Song,Shengwang Liu.Fine level epitope mapping and conservationanalysis of two novel linear B-cell epitopes of the avian infectiousbronchitis coronavirus nucleocapsid protein.Virus Research,2013,171:54–64。
CK/CH/LHLJ/04V株为自主分离毒株：Shengwang Liu,Xiaonan Zhang,LiyangGong,Baolong Yan,Chengren Li,Zongxi Han,Yuhao Shao,Huixin Li,XiangangKong.Altered pathogenicity,immunogenicity,tissue tropism and 3'-7kb regionsequence of an avian infectious bronchitis coronavirus strain after serialpassage in embryos.Vaccine,2009；27(34):4630-4640。
H120株为目前市场广泛应用的商品化疫苗株。
M41为传染性支气管炎病毒公认的模式病毒，为IBV发现以来第一种血清型典型毒株，广泛称之为Mass型病毒。我们开展有关该病毒的文章详见Lingfeng Chen,TingtingZhang,Zongxi Han,Xiangang Kong,Shengwang Liu.Molecular and antigeniccharacteristics of Massachusetts genotype infectious bronchitis coronavirusin China.Veterinary Microbiology，2015；181(3-4):241-251。
4/91株为欧洲流行的IBV毒株的弱毒疫苗株，与我国流行的毒株有较大差异，基因型和血清型显著不同。我们研究的相关文章详见：Tingting Zhang,Zongxi Han,QianqianXu,Qiuling Wang,Mengying Gao,Wei Wu,Yuhao Shao,Huixin Li,Xiangang Kong,Shengwang Liu.Serotype shift of a 793/B genotype infectious bronchitiscoronavirus by natural recombination.Infection,Genetics and Evolution.2015,32:377-87。
实施例1.
一、LDT3/03CEF adapted适应株的培育
1)tl/CH/LDT3/03在鸡胚成纤维细胞上的适应：按常规方法制备鸡胚成纤维细胞，当细胞长成单层后，将具有自主知识产权的鸡传染性支气管炎病毒tl/CH/LDT3/03的尿囊液经无血清DMEM做10倍稀释，接种鸡胚成纤维细胞，于37℃孵育1h，PBS洗3遍，换含2％FBSDMEM生长维持液，于37℃、5％CO2条件继续培养，每日观察细胞病变。培养72h，收获含有病毒的细胞悬液，-70℃保存，留待继续传代使用。按照上述方法，连续将病毒在鸡胚成纤维细胞上传代，直到肉眼可见明显蚀斑，且在显微镜下观察到细胞病变，获得鸡胚成纤维细胞适应株LDT3/03CEF adapted。
2)LDT3/03CEF adapted适应株的连续传代：在获得能够感染鸡胚成纤维细胞并引起细胞病变的鸡胚成纤维细胞适应株LDT3/03CEF adapted后，将病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代到F20代，传代方法同上。病毒感染CEF引起的细胞病变如图1所示，其中鸡胚成纤维细胞适应株LDT3/03CEF adapted株感染后能够引起明显的细胞病变，而同时感染CEF的亲本病毒tl/CH/LDT3/03株以及常规的活疫苗株H120株均不引起细胞病变，与未感染病毒的CEF对照细胞一致结果如图2所示。
3)LDT3/03CEF adapted适应株毒价测定：将LDT3/03CEF adapted适应株F20代在鸡胚成纤维细胞上测定病毒的滴度。用无血清DMEM对LDT3/03CEF adapted适应株F20代毒进行10倍倍比稀释，选取4个稀释度(10-4～10-7)各接种于鸡胚成纤维细胞单层，每个稀释度接种8孔，每孔接种0.1mL，37℃孵育培养，每天观察细胞变化，7d后计数细胞病变数，采用Reed-Muench方法计算病毒的TCID50，结果显示LDT3/03CEF adapted株的效价为105.6TCID50/0.1mL。
4)间接免疫荧光鉴定病毒：应用间接免疫荧光鉴定获得的LDT3/03CEF adapted适应株，将LDT3/03CEF adapted适应株接种鸡胚成纤维细胞单层，当出现细胞病变时，弃掉培养液，用4％多聚甲醛固定细胞，使用自主制备的抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体(4F10)作为一抗，使用商品化FITC标记的抗鼠IgG作为二抗，荧光显微镜下观察，细胞病变是否出现特异性荧光，同时将亲本病毒tl/CH/LDT3/03株以及常规的活疫苗株H120株感染CEF细胞以及正常对照细胞作为对照同步进行间接免疫荧光。结果如图3所示，LDT3/03CEFadapted适应株感染细胞后出现明显的特异性荧光，而亲本病毒tl/CH/LDT3/03株以及常规的活疫苗株H120株感染CEF细胞均未出现明显的特异性荧光，与未感染病毒的CEF对照细胞一致。
二、LDT3/03Vero adapted适应株的培育：
1)tl/CH/LDT3/03在Vero细胞上的适应：按常规方法传代Vero细胞，当细胞长成单层后，将具有自主知识产权的鸡传染性支气管炎病毒tl/CH/LDT3/03的尿囊液经无血清DMEM做10倍稀释，接种Vero细胞，于37℃孵育1h，PBS洗3遍，换含2％FBS DMEM生长维持液，于37℃、5％CO2条件继续培养，每日观察细胞病变。培养72h，收获含有病毒的细胞悬液，-70℃保存，留待继续传代使用。按照上述方法，连续将病毒在Vero细胞上传代，传代到F11代时，在显微镜下可观察到细胞病变，获得Vero细胞适应株LDT3/03Vero adapted。
2)LDT3/03Vero adapted适应株的连续传代：在获得能够感染Vero细胞并引起细胞病变的Vero细胞适应株LDT3/03Vero adapted后，将病毒在Vero细胞上连续传代到F25代，传代方法同上。其中Vero细胞适应株LDT3/03Vero adapted株感染后能够引起明显的细胞病变，而同时感染Vero细胞的亲本病毒tl/CH/LDT3/03株以及常规的活疫苗株H120株均不引起细胞病变，与未感染病毒的Vero对照细胞一致。
3)LDT3/03Vero adapted适应株毒价测定：将LDT3/03Vero adapted适应株F25代在Vero细胞上测定病毒的滴度。用无血清DMEM对LDT3/03Vero adapted适应株F25代毒进行10倍倍比稀释，选取4个稀释度(10-4～10-7)各接种于Vero细胞单层，每个稀释度接种8孔，每孔接种0.1mL，37℃孵育培养，每天观察细胞变化，7d后计数细胞病变数，采用Reed-Muench方法计算病毒的TCID50，结果显示LDT3/03Vero adapted株的效价为106.1TCID50/0.1mL。
4)间接免疫荧光鉴定病毒：应用间接免疫荧光鉴定获得的LDT3/03Vero adapted适应株，将LDT3/03Vero adapted适应株接种Vero细胞单层，当出现细胞病变时，弃掉培养液，用4％多聚甲醛固定细胞，使用具有自主知识产权的抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体(4F10)作为一抗，使用商品化FITC标记的抗鼠IgG作为二抗，荧光显微镜下观察，细胞病变是否出现特异性荧光，同时将亲本病毒tl/CH/LDT3/03株以及常规的活疫苗株H120株感染Vero细胞以及正常对照细胞作为对照同步进行间接免疫荧光。结果如图4所示，LDT3/03Vero adapted适应株感染细胞后出现明显的特异性荧光，而亲本病毒tl/CH/LDT3/03株以及常规的活疫苗株H120株感染Vero细胞均未出现明显的特异性荧光，与未感染病毒的Vero对照细胞一致。
三、LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株的复制动力学
1)LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株感染和取样：将LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株病毒液以0.01M.O.I.剂量分别接种生长良好的CEF细胞和Vero细胞，于37℃孵育1h，PBS洗3遍，换含2％FBS DMEM生长维持液，于37℃、5％CO2条件继续培养，分别于培养后12h、24h、36h、48h、60h、72h收获含有病毒的细胞悬液，同时将亲本强毒株tl/CH/LDT3/03株在CEF和Vero细胞传代的第5代(F5)、第10代(F10)、第15代(F15)、第20代(F20)以及Vero细胞传代的第25代(F25)同步进行病毒感染和取样，置-70℃保存备用。
2)病毒滴度测定：取不同时间收获的细胞培养病毒液，用无血清DMEM分别进行10倍倍比稀释，选取合适稀释度，各接种于CEF细胞和Vero细胞单层，每个稀释度接种8孔，每孔接种0.1mL，37℃孵育培养，每天观察细胞变化，7d后计数细胞病变数，采用Reed-Muench方法计算病毒的TCID50，结果如图5和图6所示，显示随着病毒在CEF和Vero细胞传代次数增加，病毒增殖能力越强，病毒滴度越高，达到峰值的时间越短。分别传代后的LDT3/03CEFadapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株增殖病毒效价更加稳定。
四、LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株的致弱评价及其基因特征
1)LDT3/03CEF adapted株和LDT3/03Vero adapted株的致弱评价：40只1日龄的SPF鸡随机分为4组(每组10只)，分别将4组鸡饲养于4个负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。在3日龄时，第1组雏鸡用LDT3/03CEF adapted适应株(105.6TCID50)进行接种，每只滴鼻100μL；第2组雏鸡用LDT3/03Vero adapted适应株(感染剂量，那就是105.5TICD50)进行接种，每只滴鼻100μL；第3组雏鸡作为亲本强毒对照组，每只滴鼻100μL tl/CH/LDT3/03株(105.56EID50)病毒液；第4组雏鸡作为空白对照组，每只滴鼻100μL细胞培养液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检。结果LDT3/03CEFadapted株和LDT3/03Vero adapted株未见明显发病和死亡(见表1)，观察结束剖检也未见气管出血，肾脏肿大等特异性病理变化，与接种细胞培养液后的空白对照SPF鸡一致。而亲本强毒攻毒组对SPF雏鸡发病率均为100％，死亡率为4/10。发病鸡表现为精神沉郁、缩脖、拱背、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等症状。病死鸡剖检可见气管出血，两侧肾脏肿大，纹理清晰，外观呈现典型的“花斑肾”，有尿酸盐沉积，部分鸡只盲肠扁桃体肿大、出血。
表1 LDT3/03CEF adapted株和LDT3/03Vero adapted株对SPF雏鸡的致病力
Figure BDA0003397063240000061
Figure BDA0003397063240000071
2)LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株基因特征：通过RT-PCR反应扩增得到了LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株基因，进行基因克隆及序列测定，并对这两株细胞适应毒株分别与亲本强毒株tl/CH/LDT3/03株(GenBank Accession NO.KT852992)基因组核苷酸及推导氨基酸序列进行对比分析。两株细胞适应毒株与亲本强毒株基因组的差异见表2和表3，包括基因1ab、1a、S、3c、M和N基因区段均有不同程度的核苷酸突变或缺失，这些基因的变化是病毒能够适应细胞以及毒力致弱密切相关的重要因素。
LDT3/03CEF细胞适应毒株，将病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代到F20代，进行保藏，与亲本强毒tl/CH/LDT3/03株序列(亲本强毒tl/CH/LDT3/03株GenBank:KT852992.1)进行多重比对，本发明CEF细胞适应毒株(LDT3/03CEF adapted株)与亲本强毒tl/CH/LDT3/03株核酸同源率99％。
LDT3/03Vero细胞适应毒株，将病毒在Vero细胞上连续传代到F25代，进行保藏，与亲本强毒tl/CH/LDT3/03株序列进行多重比对，本发明Vero细胞适应毒株(LDT3/03Veroadapted株)与亲本强毒tl/CH/LDT3/03株核酸同源率99％。表2LDT3/03CEF adapted P20与亲本病毒tl/CH/LDT3/03基因组序列比较如图7所示；表3LDT3/03Vero adapted P25与亲本病毒tl/CH/LDT3/03基因组序列比较如图8所示。
五、稳定性：LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株的传代及其基因特征变化
1)LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株的传代培养：将LDT3/03CEF adapted适应株病毒在CEF细胞上连续传代到F50代，将LDT3/03Vero adapted适应株病毒在Vero细胞上连续传代到F50代。两株细胞适应株传代培养的每一代病毒感染相应的细胞后均能够引起明显的细胞病变，说明适应细胞后的病毒保持稳定感染细胞的特性。收集不同代次病毒，–70℃保存备用。
2)LDT3/03CEF adapted株和LDT3/03Vero adapted株传代子代病毒的毒力评价：50只1日龄的SPF鸡随机分为5组(每组10只)，分别将5组鸡饲养于5个负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。在3日龄时，第1组和第2组雏鸡用LDT3/03CEF adapted适应株的子代病毒第40代次(105.5TCID50)和第50代次(105.6TCID50)进行接种，每只滴鼻100μL；第3组和第4组雏鸡用LDT3/03Vero adapted适应株的子代病毒第40代次(106.2TCID50)和第50代次(106.4TCID50)进行接种，每只滴鼻100μL，第5组雏鸡作为空白对照组，每只滴鼻100μL细胞培养液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡群的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检。结果LDT3/03CEF adapted株和LDT3/03Vero adapted株子代病毒感染鸡后均未见明显发病和死亡，观察结束剖检也未见气管出血，肾脏肿大等特异性病理变化，与接种细胞培养液后的空白对照SPF鸡一致。
3)LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株传代后不同代次基因组的变化：通过RT-PCR反应扩增得到了代表LDT3/03CEF adapted适应株传代后子代毒的第40代和第50代病毒全基因组基因，然后进行基因克隆及序列测定，并对第40代和第50代病毒基因序列与传代之前的LDT3/03CEFadapted适应株进行对比分析，结果两株细胞适应毒株与亲本强毒株的差异见表4-表7，包括基因1ab、1a、S、3a、3b、3c、M和N基因区段均有不同程度的核苷酸突变或缺失，这些基因的变化率保持在1％以内，这些基因的变化并未影响病毒对感染相应细胞的特性。表4LDT3/03CEF adapted P40代与LDT3/03CEF adapted株基因组序列比较如图9所示；表5LDT3/03CEF adapted P50代与LDT3/03CEF adapted株基因组序列比较如图10所示；表6LDT3/03Vero adapted P40代与LDT3/03Vero adapted株基因组序列比较如图11所示；表7LDT3/03Vero adapted P50代与LDT3/03Vero adapted株基因组序列比较如图12所示。
4)传染性支气管炎病毒传代特点：LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Veroadapted适应株为冠状病毒，其复制特点呈现典型的冠状病毒特征，具有其特殊性，在病毒复制增殖过程中依赖于病毒自身的RNA聚合酶,该聚合酶缺乏校正功能,因此病毒传代和增殖过程中呈现基因突变是该类病毒的常见想象，本发明LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株传代后子代病毒基因组的变异率维持在1％以内，并保持病毒的复制特点和弱毒特性。
六、LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株免疫效力评价
1)免疫效力评价试验：30只5日龄SPF鸡随机分为3组(每组10只)，分别饲养于负压隔离器中，雏鸡自由采食及饮水。其中第1组雏鸡使用LDT3/03CEF adapted适应株(105EID50)进行免疫接种，每只滴鼻100μL；第2组雏鸡使用LDT3/03Vero adapted适应株(105.5EID50)进行免疫接种，每只滴鼻100μL，另外1组则作为对照组，每只滴鼻100μL细胞培养液。并于免疫后20天，对每组采集血清进行特异性抗体检测，具体方法按照病毒中和抗体检测方法进行，中和抗体在表8中。
2)临床保护评价：并于免疫后20天，将3组雏鸡用同源亲本强毒tl/CH/LDT3/03(105.5EID50/0.1ml)进行滴鼻攻击，每只100μL；攻毒后，每日观察、记录鸡群的发病情况、死亡情况。结果如表8所示，3组试验鸡中LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株免疫的2组鸡均未呈现任何临床症状，也未出现死亡，中和抗体平均效价达到1/1024和1/2048，而对照组则全部发病，其中2只死亡，对照鸡中和抗体效价为0。可见LDT3/03CEFadapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株免疫原性良好，对亲本强毒具有很好的保护作用。
3)对雏鸡气管的排毒保护评价：上述步骤2)中攻毒后第5天，将3组鸡采集咽拭子，加入无菌生理盐水，经震荡、过滤除菌后接种9日龄SPF鸡胚，培养7天后根据鸡胚呈现侏儒胚、矮小胚以及其他传染性支气管炎病毒特异性鸡胚病变情况，判定咽拭子排毒情况，结果结果如表9所示，LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株免疫组鸡咽拭子排毒分别为1/10和0/10，对照组则10/10排毒，可见2株细胞适应毒株免疫后激发良好的免疫反应，对亲本毒株具有良好的免疫保护作用。
表8 LDT3-A的免疫效力评价
Figure BDA0003397063240000081
表9对雏鸡气管排毒的保护效果
Figure BDA0003397063240000091
实施例2.
一、LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株单价疫苗、二价疫苗和多价疫苗的制备
疫苗原液制备：取LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株，经无血清DMEM做10倍稀释，分别接种生长良好的CEF细胞和Vero细胞，于37℃孵育1h，PBS洗3遍，换含2％DMEM生长维持液，于37℃、5％CO2条件继续培养，分别于培养后48h收获含有病毒的细胞悬液，在2-8℃保存，同时做无菌检验，同时测得病毒含量应≥106.5TCID50/0.1ml。
单价和二价活疫苗制备：(1)单价疫苗制备时，将经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒培养液混合后再与蔗糖明胶保护剂按8.5：1(病毒液：保护剂)配苗，冻干保护剂以40℃-50℃为宜(8％明胶、40％蔗糖保护剂，经115℃高压灭菌40分钟，放4℃保存，72小时内用完)。在添加过程中应不断摇动病毒液，充分混合均匀后，即为疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封，即制备获得单价活疫苗，置-15℃以下保存。(2)二价疫苗制备时，将新城疫疫苗弱毒La Sota株增殖后经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒培养液与LDT3/03CEF adapted适应株增殖病毒液或LDT3/03Vero adapted适应株增殖病毒液混合后再按照以上胚苗方案制苗。
灭活疫苗制备：(1)单价疫苗制备时，经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒培养液混合后，加入甲醛溶液灭活，使其终浓度为0.2％，随即充分摇匀。然后置37℃摇床中灭活，16小时后灭活完毕，灭活后的病毒液置2～8℃保存，应不超过2个月。将注射用94份白油和6份司班-80混合后，加入2％硬脂酸铝，高压灭菌后作为油相备用。将灭活的病毒液按照6％比例加入吐温-80充分振摇使吐温完全溶解后作为水相，取油相3份置胶体磨内，开动电机搅拌，然后徐徐加入1份水相，开始计时，乳化间隙为10，4000r/m乳化8分钟即可。在乳化终止前加入1％的硫柳汞防腐剂，其终浓度为万分之一。将乳化合格疫苗分装于灭菌疫苗瓶内，加盖密封，即制备获得灭活疫苗，置2～8℃保存。(2)二价疫苗制备时，将新城疫疫苗株增殖后经无菌检验和病毒含量以及灭活检验合格的病毒培养液与LDT3/03CEF adapted适应株增殖病毒液或LDT3/03Vero adapted适应株增殖病毒液混合后再按照以上制苗方案制苗。(3)三价疫苗制备时，将新城疫疫苗株和减蛋综合征疫苗株分别增殖后经无菌检验、病毒含量以及灭活检验合格的病毒培养液与LDT3/03CEF adapted适应株增殖病毒液或LDT3/03Vero adapted适应株增殖病毒液混合后再按照以上制苗方案制苗。
二、LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株制备疫苗的安全性验证：
1.试验用疫苗：按照实施例2的活疫苗制备方法制备LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株单价活疫苗，批号分别为：202001、202002。1000羽份/瓶。制备LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株与新城疫疫苗株La Sota株的二价活疫苗，批号分别为：202001-2、202004-2。1000羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-15℃以下保存，有效期为12个月。同时按照实施例2的灭活疫苗制备方法制备LDT3/03CEFadapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株单价灭活疫苗，批号分别为：202003、202004。制备LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株分别与新城疫疫苗株La Sota株的二价灭活疫苗，批号分别为：202003-2、202004-2。制备LDT3/03CEFadapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株分别与新城疫疫苗株La Sota株和减蛋综合征疫苗株的三价灭活疫苗，批号分别为：202003-3、202004-3。500羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-2～8℃保存，有效期为12个月。
2.活疫苗安全性验证：将1～4组(10只/组)1～2日龄SPF雏鸡分别接种202001、202002、202001-2、202002-2批次活疫苗，每只滴鼻接种10个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第5组1～2日龄SPF鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫后持续观察各组鸡临床表现，记录发病和死亡情况。观察结束后剖检各组鸡，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变如：部分发病鸡气管、鼻窦内有浆液性或卡他性分泌物，或肾脏出现肿胀，出现典型的“花斑肾”变化。
3.活疫苗毒力返祖安全性验证：取15只5日龄SPF鸡经滴鼻途径接种202001批次疫苗(LDT3/03CEF adapted适应株)，每只剂量5×106.5EID50，置负压隔离器中饲养观察，于接种后5天取5只剖杀，无菌取气管，研磨并以PBS制成匀浆，冻融3次后，以6000rpm离心5min，上清经0.22μm的滤膜进行过滤除菌。应用9～10日龄SPF鸡胚对过滤液进行病毒含量测定。然后进行下一代次的鸡体传代，接种剂量为0.5ml/只。剩余10只鸡接种后持续观察20天，观察有无临床症状和死亡情况。第20天剖检，观察有无病理变化。按以上方法持续在鸡体再传4代，每次传代均设10只同日龄的对照鸡，鸡体传代最后一代经RT-PCR核酸扩增测定S1蛋白基因序列。按照以上方案接种202002批次疫苗，验证LDT3/03Vero adapted适应株毒力返祖安全性。
4.灭活疫苗安全性验证：将1～6组(5只/组)1～2月龄SPF雏鸡分别接种202003、202004、202003-2、202004-2、202003-3、202004-3批次疫苗，每只胸部肌肉注射接种2个使用剂量(约1.0ml)。第7组5日龄SPF鸡每只胸部肌肉注射1.0ml灭菌生理盐水。免疫后持续观察各组鸡临床表现，记录发病和死亡情况。观察14天后剖检注射部位观察疫苗吸收情况。
5.实验结果如表10所示：(1)活疫苗安全试验：4批活疫苗免疫组免疫20日后，与空白对照组一致，均未出现甩头、精神萎靡，羽毛松乱等传染性支气管炎临床症状，在观察期内0/10发病，解剖也未发现肾脏肿大，“花斑肾”特异病变，各组表现均正常。表明LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株制备的单价活疫苗以及与新城疫疫苗毒株联合制备的二价活疫苗免疫鸡后均是安全的。
表10鸡传染性支气管炎活疫苗安全性试验数据
Figure BDA0003397063240000101
(2)活疫苗毒力返祖安全性验证结果如表11所示：结果发现在每代病毒接种的所有试验鸡在观察的20天内均未发现鸡只出现传染性支气管炎病毒感染的临床症状，如精神沉郁、缩脖、拱背、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等。每一代在接种后第20天剖杀，未发现气管环状出血病变，也未见肾脏有“花斑肾”、尿酸盐沉积等特异性病理变化，202001批疫苗和202002批疫苗的鸡体传代第5代病毒分别与LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Veroadapted适应株种毒经S1蛋白基因测序序列一致。以上结果说明LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株制备的疫苗株在鸡体中增殖传代毒力不会出现返强现象，遗传特性稳定，适合应用于IB疫病的防控。
表11鸡体传代1～4的观察结果
Figure BDA0003397063240000111
(3)灭活疫苗安全试验：202003、202004、202003-2、202004-2、202003-3、202004-3批次疫苗免疫鸡观察14日后，与空白对照组一致，在观察期内各组表现均正常，均未出现不良反应。剖检观察注射部位也未见肉芽肿等明显炎症反应，疫苗吸收良好。表明无论是LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株制备的单价灭活疫苗还是分贝与新城疫疫苗株制备的二价联合疫苗以及与新城疫疫苗和减蛋综合征疫苗制备的三价灭活疫苗免疫鸡后均是安全的。
三、LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株制备疫苗的免疫效力验证
1.试验用疫苗：按照实施例2的活疫苗制备方法制备LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株单价活疫苗，批号分别为：202001、202002。1000羽份/瓶。制备LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株与新城疫疫苗株La Sota株的二价活疫苗，批号分别为：202001-2、202004-2。1000羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-15℃以下保存，有效期为12个月。同时按照实施例2的灭活疫苗制备方法制备LDT3/03CEFadapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株单价灭活疫苗，批号分别为：202003、202004。制备LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株分别与新城疫疫苗株La Sota株的二价灭活疫苗，批号分别为：202003-2、202004-2。制备LDT3/03CEFadapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株分别与新城疫疫苗株La Sota株和减蛋综合征疫苗株的三价灭活疫苗，批号分别为：202003-3、202004-3。500羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-2～8℃保存，有效期为12个月。
2.用法与用量：活疫苗按瓶签标注羽份用生理盐水稀释，用滴管吸取疫苗，每只鸡滴鼻一滴(约0.03～0.05ml)。灭活疫苗用注射器肌肉内注射0.3-0.5ml/只。
3.活疫苗效力验证：将1～4组(10只/组)5日龄SPF雏鸡分别接种202001、202002、202001-2、202002-2批次活疫苗，每只滴鼻接种1个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第5组5日龄SPF鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫后20日，1-5组鸡滴鼻方法攻击ck/CH/LDL/140520(105.5EID50)株强毒，攻毒后5天每组随机采集10个咽拭子，同时持续观察各组鸡临床表现，记录发病和死亡情况。经处理后的咽拭子接种9日龄SPF鸡胚，根据鸡胚感染情况并结合RT-PCR方法判定免疫和非免疫鸡感染强毒后病毒分泌情况，表12为病毒阳性率。同时，将6～7组(10只/组)30日龄SPF雏鸡分别接种202001-2、202002-2批次活疫苗，每只滴鼻接种0.01个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第8组30日龄SPF鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫后14日，6-8组鸡肌肉注射方法攻击新城疫北京株(104.05ELD50)株强毒，持续观察各组鸡临床表现，记录发病和死亡情况，观察14日。
4.灭活疫苗效力验证：将1～6组(5只/组)1月龄SPF雏鸡分别接种202003、202004、202003-2、202004-2、202003-3、202004-3批次疫苗，每只胸部肌肉注射接种1个使用剂量(约0.5ml)。第7组5日龄SPF鸡每只胸部肌肉注射0.5ml灭菌生理盐水。免疫后28日，3组鸡肌肉注射方法攻击ck/CH/LDL/140520(105.5EID50)株强毒，攻毒后5天捕杀各组鸡，每只鸡无菌采集气管，经匀浆处理后的气管组织上清液接种9日龄SPF鸡胚，根据鸡胚感染情况并结合RT-PCR方法判定免疫和非免疫鸡感染强毒后病毒分泌情况，表14为病毒阳性率。将8～11组(5只/组)30日龄SPF雏鸡分别接种202003-2、202004-2、202003-3、202004-3批次灭活疫苗，每只滴鼻接种0.01个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第12组30日龄SPF鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫后14日，8-12组鸡肌肉注射方法攻击新城疫北京株(104.05ELD50)株强毒，持续观察各组鸡临床表现，记录发病和死亡情况，观察14日。将13～14组(5只/组)30日龄SPF雏鸡分别接种202003-3、202004-3批次灭活疫苗，每只滴鼻接种0.01个使用剂量(约0.03～0.05ml)。第12组30日龄SPF鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫后28日，各组鸡静脉采血，分离血清测定每只鸡血清中减蛋综合征病毒HI抗体效价。
实验结果，活疫苗免疫效力：2批活疫苗免疫组免疫20日后，以强毒攻击，其中生理盐水对照组全部发病，均出现甩头、精神萎靡，羽毛松乱等传染性支气管炎临床症状，在观察期内有10/10发病，其中2/10死亡，解剖发现均有肾脏肿大，“花斑肾”特异病变。而疫苗免疫组均正常。通过检测攻强毒后5d采集的咽拭子，结果其中202002批次免疫组10只咽拭子中有1只阳性，202002批未检测出IBV病毒，而对照组鸡咽拭子的检测结果均为阳性，表明LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株制备的活疫苗免疫鸡后能够对同源强毒产生良好的免疫保护反应。详细结果见表12，咽拭子病毒阳性率体现的就是活疫苗免疫组和对照组攻强毒后病毒分泌情况。
表12鸡传染性支气管炎单价活疫苗和二价活疫苗针对ck/CH/LDL/140520强毒免疫效力试验数据
Figure BDA0003397063240000131
表13鸡传染性支气管炎和新城疫二价活疫苗针对新城疫强毒免疫效力试验数据
Figure BDA0003397063240000132
灭活疫苗免疫效力：6批灭活疫苗免疫组免疫28日后，以IBV ck/CH/LDL/140520强毒攻击，通过检测攻强毒后5d采集气管样品，结果其中202004和202003-3批次免疫组5只气管样品中有1只阳性，其它批次疫苗均未检测出IBV病毒，而对照组鸡气管样品的检测结果均为阳性，表明LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株制备的单价、二价和多家灭活疫苗免疫鸡后能够对同源强毒产生良好的免疫保护反应。详细结果见表14，攻毒鸡气管病毒阳性率数据体现的就是灭活疫苗免疫组和对照组攻强毒后病毒分泌情况。二价疫苗和三价疫苗对新城疫的保护率均为全部保护，详细结果见表15；三价疫苗免疫后减蛋综合征病毒HI抗体平均值均大于10log2，这对于减蛋综合征具备完全保护能力，详细结果见表16
表14鸡传染性支气管炎单价灭活疫苗、二价灭活疫苗以及三价灭活疫苗针对ck/CH/LDL/140520强毒免疫效力试验数据
Figure BDA0003397063240000133
表15鸡传染性支气管炎与新城疫的二价灭活疫苗以及鸡传染性支气管炎与新城疫、减蛋综合征三价疫苗针对新城疫强毒免疫效力试验数据
Figure BDA0003397063240000134
Figure BDA0003397063240000141
表16鸡传染性支气管炎与新城疫、减蛋综合征三价疫苗针对减蛋综合征免疫效力试验数据
Figure BDA0003397063240000142
结果表明，毒株LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株制备成单价、二价活疫苗和单价、二价及三价灭活疫苗主动免疫保护率均达到80％以上，说明本发明毒株对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力。
实施例3.LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株作为细胞感染模型验证病毒感染机制
1)病毒感染细胞模型：将CEF细胞和Vero细胞按1×106/孔的细胞数铺板6孔板。病毒接种时，取其中一个孔，胰酶消化后计细胞数确定病毒上样量。PBS清洗六孔板三遍。每孔加入2ml含1MO I病毒的无血清培养基。6孔板置37℃孵育，1小时后，弃去病毒液，用预冷PBS清洗3遍，换无血清培养基继续培养。对照组未感染病毒，其他操作与感染组一致。在感染后不同时间点收取感染细胞样品。
2)样本制备：收取上清置-70℃冰箱保存；收取蛋白样品时，用预冷的PBS清洗细胞三遍，弃去PBS后，每孔加入200μl 1×SDS蛋白上样缓冲液裂解细胞，转移至EP管，水浴煮沸作用5分钟，12000rpm离心5分钟，取上清液用于SDS-PAGE。RNA提取时，向IBV感染后不同时间的6孔Vero细胞和CEF细胞培养板中每孔加入800μl TRIZOL试剂，轻轻晃动，室温静置3-5分钟，细胞完全裂解后，将裂解液转移至无RNA酶EP管中，震荡使其充分裂解，再加入200μl氯仿，震荡15秒，室温静置10分钟，12000rpm，4℃离心15分钟后，将上层水相转移到新的无RNA酶EP管中，再加入等量异丙醇，-20℃沉淀1小时；12000rpm，4℃离心15分钟，弃去上清，加入75％的乙醇1ml，抽提并12000rpm，4℃离心15分钟，弃去上清，晾干即得。
3)验证病毒入细胞机制：以CME抑制剂CPZ、Cav ME抑制剂Nystatin和巨胞饮抑制剂Amiloride预处理CEF细胞和Vero细胞30分钟，再以LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株分别感染CEF细胞和Vero细胞，8小时后收细胞，以Western blot检测IBV病毒N蛋白的表达量。与对照预处理组相比，在感染细胞后8小时，CME抑制剂CPZ预处理导致IBV N蛋白的表达量显著减少；而Cav ME抑制剂Nystatin预处理组和巨胞饮抑制剂Amiloride预处理组，IBV N蛋白的表达量与对照预处理组相比，均没有明显的差别。结果说明CPZ能有效地阻断IBV通过CME入胞，而Nystatin和Amiloride对IBV入胞没有抑制作用，提示IBV通过CME进入细胞。为了证实以上结果，分别以三种药物预处理CEF细胞和Vero细胞30分钟，以1MOI的LDT3/03CEF adapted适应株和LDT3/03Vero adapted适应株冰毒分别感染CEF细胞和Vero细胞2小时，收集RNA样品，用荧光定量RT-PCR检测三种药物对病毒基因组入胞的抑制作用。结果与未处理对照组相比，CPZ预处理抑制CME，明显抑制病毒基因组的入胞(p＜0.05)，且随着浓度的增加，抑制效果增强；而Nystatin预处理组和Amiloride预处理组的病毒基因组入胞水平没有明显的降低。以上结果证实IBV依赖于网格蛋白内吞途径入胞。
对比例1.
1)CK/CH/LHLJ/04V株以及H120株在分别鸡胚成纤维细胞上的不能有效适应增殖：按常规方法制备鸡胚成纤维细胞，当细胞长成单层后，将自主分离获得的的鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LHLJ/04V株以及常规弱毒疫苗株的尿囊液分别接种鸡胚成纤维细胞，于37℃孵育1h，PBS洗3遍，换含2％DMEM生长维持液，于37℃、5％CO2条件继续培养，每日观察细胞病变。培养72h，收获细胞悬液，-70℃保存，留待继续传代使用。按照上述方法，连续将盲传代的培养液在鸡胚成纤维细胞上传代，在显微镜下观察，均未能观察到细胞病变，不能够获得鸡胚成纤维细胞适应株。
2)间接免疫荧光鉴定病毒：为了确证病毒是否在CEF细胞中复制，应用间接免疫荧光鉴定每个代次的培养物。将CK/CH/LHLJ/04V株和H120株连续传代25代次的鸡胚成纤维细胞培养物分别接种鸡胚成纤维细胞单层，于37℃孵育1h，PBS洗3遍，换含2％DMEM生长维持液，于37℃、5％CO2条件继续培养，培养72小时，弃掉培养液，用4％多聚甲醛固定细胞，使用自主制备的抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体(4F10)作为一抗，使用商品化FITC标记的抗鼠IgG作为二抗，荧光显微镜下观察，细胞病变是否出现特异性荧光，同时将LDT3/03CEFadapted适应株感染CEF细胞以及正常对照细胞作为对照同步进行间接免疫荧光。
结果CK/CH/LHLJ/04V株、H120株培养物接种的CEF细胞与未感染病毒的CEF对照细胞均没有观察到特异性荧光，而LDT3/03CEF adapted适应株感染细胞后出现明显的特异性荧光，表明无论是随机分离的野毒株CK/CH/LHLJ/04V株还是一般情况下常规应用的弱毒疫苗株H120株通过同样的适应性培养，并没有获得能够在CEF细胞中有效增殖复制的病毒株。
对比例2.
1)M41株以及4/91株在Vero细胞上的适应不能有效适应增殖：按常规方法传代Vero细胞，当细胞长成单层后，将Mass型鸡传染性支气管炎病毒典型强毒株M41株和弱毒疫苗株4/91株的尿囊液分别经无血清DMEM做10倍稀释，分别接种Vero细胞，于37℃孵育1h，PBS洗3遍，换含2％DMEM生长维持液，于37℃、5％CO2条件继续培养，每日观察细胞病变。培养72h，收获细胞悬液，-70℃保存，留待继续传代使用。按照上述方法，连续在Vero细胞上盲传代到20代时，在显微镜下可观察，均未能观察到细胞病变，不能够获得鸡胚成纤维细胞适应株。
2)间接免疫荧光鉴定病毒：为了确证病毒是否在Vero细胞中复制，应用间接免疫荧光鉴定每个代次的培养物。将M41株以及4/91株盲传代到20代时的Vero细胞培养物接种Vero细胞单层，于37℃孵育1h，PBS洗3遍，换含2％DMEM生长维持液，于37℃、5％CO2条件继续培养，培养72小时，弃掉培养液，用4％多聚甲醛固定细胞，使用具有自主知识产权的抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体(4F10)作为一抗，使用商品化FITC标记的抗鼠IgG作为二抗，荧光显微镜下观察，细胞病变是否出现特异性荧光，同时将LDT3/03Vero adapted适应株感染Vero细胞以及正常对照细胞作为对照同步进行间接免疫荧光。
结果M41株、4/91株培养物接种的Vero细胞与未感染病毒的Vero对照细胞均没有观察到特异性荧光，而LDT3/03Vero adapted适应株感染细胞后出现明显的特异性荧光，表明无论是传统的Mass型典型强毒M41株还是引进欧洲的常规弱毒疫苗株4/91株通过同样的适应性培养，并没有获得能够在Vero细胞中有效增殖复制的病毒株。

Claims (6)

1.一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitisvirus)，其特征在于，所述鸡传染性支气管炎病毒的命名为LDT3/03CEF adapted株，于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCCNO.22387；或所述鸡传染性支气管炎病毒的命名为LDT3/03Vero adapted株，于2021年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC NO.22386。
2.权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒在建立用于评价鸡传染性支气管炎病毒侵染细胞后对细胞代谢、转录和免疫的动物模型中的应用。
3.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的鸡传染性支气管炎病毒的减毒株。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为单价疫苗、二价疫苗或多价疫苗。
5.权利要求3或4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述鸡传染性支气管炎病毒含量为≥106.5TCID50/0.1ml。
6.权利要求3或4所述的疫苗组合物在制备用于预防鸡传染性支气管炎药物中的应用。
CN202111487158.2A 2021-12-07 2021-12-07 一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用 Active CN114410594B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111487158.2A CN114410594B (zh) 2021-12-07 2021-12-07 一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111487158.2A CN114410594B (zh) 2021-12-07 2021-12-07 一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114410594A CN114410594A (zh) 2022-04-29
CN114410594B true CN114410594B (zh) 2023-05-16

Family

ID=81264620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111487158.2A Active CN114410594B (zh) 2021-12-07 2021-12-07 一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114410594B (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101514334B (zh) * 2009-03-23 2011-03-23 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用
CN101948812B (zh) * 2010-08-26 2012-06-27 国家兽用生物制品工程技术研究中心 嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒强毒疫苗株及其应用
CN102851257A (zh) * 2012-08-27 2013-01-02 上海启盛生物科技有限公司 一种鸡传染性支气管炎病毒减毒疫苗株及其应用
CN102994460B (zh) * 2012-12-31 2015-11-11 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株
CN103146654B (zh) * 2013-03-25 2014-07-30 浙江诺倍威生物技术有限公司 一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114410594A (zh) 2022-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. Characterization of a novel live attenuated infectious bronchitis virus vaccine candidate derived from a Korean nephropathogenic strain
US8277814B2 (en) Avian Astrovirus
CN111632137B (zh) 猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用
CN102220287B (zh) 鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用
CN107988170B (zh) 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用
CN104099301B (zh) 柯萨奇病毒a16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法
CN101514334A (zh) 鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株及其应用
CN103849632B (zh) 鸡传染性支气管炎弱毒株s1基因及其弱毒株和应用
CN112779193B (zh) 一株滑液囊支原体强毒株及其应用
JP2017212976A (ja) Ｉｂ−ｑｘ様株に由来する伝染性気管支炎ワクチン
CN114525261B (zh) 一种猪流行性腹泻、猪轮状病毒二联灭活疫苗及其制备方法
CN103937753B (zh) H9n2亚型禽流感病毒毒株及其灭活疫苗和应用
CN106929480B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒株及其应用
CN111647568A (zh) 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株反向遗传疫苗株及其应用
CN108949700B (zh) 一种山羊副流感病毒3型js14-2株及其应用
CN114410594B (zh) 一种适应细胞复制增殖的鸡传染性支气管炎病毒及其应用
CN105039270B (zh) H9n2亚型禽流感冷适应减毒株及其应用
CN116121202A (zh) 一种柯萨奇病毒b组1型毒株及应用
CN110819599B (zh) 一种预防台湾型传染性支气管炎的疫苗株
CN112807424A (zh) 牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗及其制备方法
CN103160475A (zh) 一种肠道病毒71型病毒株及其用途、疫苗和制备方法
CN112717128A (zh) 一种预防手足口病的联合疫苗及其制备方法和应用
CN106754744B (zh) 一种血清4型的ⅰ群禽腺病毒毒株及其应用
KR20200061508A (ko) 약독화된 조류메타뉴모바이러스 주 및 이를 포함하는 백신 조성물
CN103397002A (zh) 禽传染性支气管炎病毒的致弱方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant