CN104195156A - 一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体及其构建方法和应用 - Google Patents
一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体及其构建方法，独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体是在含有gEL与gER的pUC19/HEK-gE重组质粒中的gEL与gER之间插入含2个CMV启动、分别位于2个CMV启动子下游的多克隆位点以及1个BGH pA信号序列的双基因表达盒获得的。本发明利用2个启动子独立表达两个外源基因，能用于构建独立表达两个外源基因的重组伪狂犬病毒。
Description
技术领域
本发明涉及属于动物病毒基因工程技术领域，具体涉及一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体及其构建方法和应用。
背景技术
狂犬病是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，简称PRV)感染猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物引起的急性传染病，猪是该病毒的贮存者和传播者。除猪以外的其它动物呈散发形式，发病后通常具有发热、奇痒及脑脊髓炎等症状，均为致死性感染。该病对猪呈爆发流行，主要导致母猪繁殖障碍和新生仔猪大量死亡。PRV一般经鼻咽部感染动物，并在感染局部的粘膜内增殖，然后经淋巴循环或神经纤维移行，一般认为病毒经神经通路到达脑而引起中枢神经功能紊乱，或在嗅球，三叉神经中建立潜伏感染。
伪狂犬病毒的基因组为线状双链DNA，长约150kb，G+C含量高达74％，整个基因组至少编码70～100个蛋白，其中胸苷激酶(Thymidine Kinase,TK)基因位于UL区，全长963bp，编码320个氨基酸，催化脱氧胸昔磷酸化。TK基因与是伪狂犬病毒的一个主要毒力基因，也与病毒的潜伏感染有关。除了TK基因外，与伪狂犬病毒毒力有关的基因还有gG、gE等。TK、gG、gE和gI基因都是病毒增殖所非必需的，缺失这些基因的病毒株与野毒株一样能正常增殖，而且不存在毒力返强的危险。但突变病毒株仍具有很好的免疫原性，接种动物后可产生有效的保护性免疫反应，但是不产生抗gG、gE、gI工糖蛋白的抗体，因此可以作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的一个标志，有利于建立无伪狂犬病感染的猪群，为最终根除该病提供有用的工具。华中农业大学在自主分离鉴定的伪狂犬病病毒强毒Ea株的基础上，通过DNA重组技术将主要毒力基因TK、非必需糖蛋白基因gG或gE、gI缺失，构建了一系列的重组突变毒株用于伪狂犬病的根除。但是目前还没有一种可以用于伪狂犬病毒的通用转移载体。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体，利用2个启动子独立表达两个外源基因，能用于构建独立表达两个外源基因的重组伪狂犬病毒。
本发明的另一目的在于提供一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体的构建方法。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体，其是在含有gEL与gER的pUC19/HEK-gE重组质粒中的gEL与gER之间插入含2个CMV启动子、分别位于2个CMV启动子下游的多克隆位点以及1个BGH pA信号序列的双基因表达盒。
作为优选的方案，本发明所述的双基因表达盒的全长基因序列为SEQ IDNO.1。
优选的，所述表达盒在gEL与gER之间的Xba Ⅰ位点插入。
本发明的方案中还包括含有所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体的宿主细胞。
本发明还提供了一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体的构建方法，其具体步骤为：
1)采用PCR法从PRV基因组DNA扩增获得同源重组臂gEL和gER；
2)将步骤1)中的再克隆至平端化消除了HindⅢ和EcoRⅠ位点的pUC19/HE载体，获得pUC19/HE-gE，然后平端化消除KpnⅠ位点，获得pUC19/HEK-gE重组质粒；
3)合成含2个CMV启动、分别位于2个CMV启动子下游的多克隆位点以及1个BGH pA信号序列的Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒；
4)将Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒克隆插入pUC19/HEK-gE重组质粒的gEL和gER之间的Xba Ⅰ位点。
上述方法，步骤3中Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒的合成方法为：利用DNAClub软件分析gEL、gER、pUC19、CMV启动子Pcmv及BGH pA信号各序列中的限制性酶切位点，合成Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA的双基因表达盒；其中，MCS1限制性酶切位点依次为：Hind Ⅲ、Spe Ⅰ、Mlu Ⅰ、EcoR Ⅴ、Bgl Ⅱ、Not Ⅰ、Bal Ⅰ、Pst Ⅰ，MCS2限制性酶切位点依次为：Sal Ⅰ、Kpn Ⅰ、Stu Ⅰ、EcoR Ⅰ、Cla Ⅰ、Hpa Ⅰ、BamH Ⅰ、Acc Ⅲ、Nru Ⅰ、Xho Ⅰ。
在本发明中，所述Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒的合成方法还包括在Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒两端引入Xba Ⅰ位点。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体中同源重组臂gEL和gER有效地与PRV基因组DNA中的同源序列发生重组；
2.本发明所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体多克隆位点在载体中均为单一酶切位点，符合多克隆位点的要求，可供外源基因的插入；
3.本发明所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体中的两个Pcmv能同时独立地有效启动位于其下游的基因的表达。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明中转移载体的构建过程及表达能力鉴定过程示意图。
图2为同源重组臂gEL和gER的扩增结果，其中A：DNA分子质量标准；B：gEL的PCR扩增产物；C：gER的PCR扩增产物。
图3为pUC19/HE-gE酶切鉴定结果，其中A：DNA分子质量标准；B：KpnⅠ+XbaⅠ双酶切结果；C：Xba Ⅰ+Sph Ⅰ双酶切结果。
图4为pUC19-gE/EGFP转染BHK细胞后的荧光观察，其中A：pUC19-gE/EGFP转然后的BHK细胞；B：pUC19/HEK-gE转染后的BHK细胞。
图5为重组病毒PRV/gE-/EGFP+感染ST细胞荧光观察，其中A：可见光下观察的细胞病变；B：紫外光下观察的细胞病变。
图6为pgE-CMV2酶切鉴定结果，其中M：DNA分子质量标准；1～3：XbaⅠ酶切结果。
图7为pgE-CMV2多克隆位点限制性内切酶单酶切鉴定结果，其中M：DNA分子量标准；1～18分别为MCS1与MCS2各限制性内切酶依次单酶切。
图8为pgE-EGFP1/DsRed2及pgE-EGFP1、pgE-DsRed2转染BHK细胞后的荧光观察，其中A：pgE-EGFP1转染后的BHK细胞；B：pgE-EGFP1/DsRed2转染后的BHK细胞；C：pgE-DsRed2转染后的BHK细胞。
图9为pgE-CMV2图谱。
具体实施方式
以下是本发明中选取的一个具体的实施例，以此来说明本发明。
实施例1
一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体，其是在含有gEL与gER的pUC19/HEK-gE质粒载体中的gEL与gER之间的XbaⅠ位点插入含2个CMV启动、分别位于2个CMV启动子下游的多克隆位点以及1个BGH pA信号序列的双基因表达盒，其具体构建过程如下：
1)采用PCR法从PRV基因组DNA扩增获得同源重组臂gEL和gER：
参考GenBank中已发表的猪伪狂犬病毒基因组序列，设计以下三对引物：
P1(SEQ ID NO.2)：5-ATTGGTACCGCTGCTGTTCGTCTCGCG-3为gEL上游引物，5′-端引入Kpn Ⅰ位点；
P2(SEQ ID NO.3)：5-GTCTCTAGAAGGGACTCGGGACCTCG-3为gEL下游引物，5′-端引入Xba Ⅰ位点；
P3(SEQ ID NO.4)：5-GTCTCTAGAATCTGGACGTTCCTGCCC-3为gER上游引物，5′-端引入Xba Ⅰ位点；
P4(SEQ ID NO.5)：5-ATTGCATGCATCACGAAGGAGCCCAGC-3为gER下游引物，5′-端引入Sph Ⅰ位点；
P5(SEQ ID NO.6):5-ATGCGGCCCTTTCTGCTGCG-3为检测gE基因的上游引物；
P6(SEQ ID NO.7)：5-TGCAGCGTGTAGAGGCCCGT-3为检测gE基因的下游引物；
以PRV基因组DNA为模板，分别用上述引物P1与P2、P3与P4进行PCR扩增，获得的PCR产物经电泳，可分别观察到957bp的gEL和1014bp的gER条带，结果见图2；将两个同源重组臂gEL与gER的PCR产物经相应限制性内切酶酶切后回收。；
2)将步骤1)中的gEL与gER再克隆至经平端化消除Hind Ⅲ与EcoR Ⅰ位点的pUC19/HE载体，再平端化消除Kpn Ⅰ位点后，获得pUC-gE-HEK重组质粒：
先后用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶切pUC19，补平后连接消除Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ位点，获得pUC19/HE；用Kpn Ⅰ与Xba Ⅰ、Xba Ⅰ与Sph Ⅰ分别双酶切gEL与gER的PCR产物，分别回收951bp的gEL和1008bp的gER；先将gEL克隆至相同酶切的pUC19/HE，获得pUC19/HE-gEL，然后将gER克隆至经相应酶切的pUC19/HE-gEL，获得重组质粒pUC19/HE-gE，酶切鉴定结果如图3；用Kpn Ⅰ酶切pUC19/HE-gE，酶切后对末端补平，然后连接，以消除载体中的Kpn Ⅰ位点，获得重组质粒pUC19/HEK-gE，其中同源重组臂gEL与gER的序列为SEQID NO.8：
acggccagtgattattcgagctcgc
gctgctgttcgtctcgcgcccggcctcgggggacgcggggtcgtacgtgctgcgggtccgcgtgaacgggaccacgga cctctttgtgctgacggccctggtgccgccgagggggcgccccgtccccacgtcgccgtccgcggacgagtgccggcc cgtcgtcggatcgtggcacgacagcctgcgcgtcgtggaccccgccgaggacgccgtgttcaccacccagcccccgcc cgagcccgagccgccgacgacccccgcgcccccccgggggaccggcgccacccccgagccccgatcggacgagg aggaggaggagggtgacgcggagacgacgacgccgacgacgaccccggcgcccgggaccctggacgcgaacggc acgatggtgctgaacgccagcgtcgtgtcgcgcgtcctgctcgccgccgccaacgccacggcgggcgcccggagccc cgggaagatagccatggtgctggggcccacgatcgtcgtcctcctgatcttcttgggcgggatcgcctgcgtggcccggc gctgcgcgcggaatcgcatctaccggccgcgacccgggcgcggatcggcggtccatgcggcgcccccgcgacgccc gccccccaaccccgtcgccggggcgcccgtcccccagcccaagatgacgttggccgagctgcgccagaagctcgcca ccatcgcagaagaacaataaaaaggtggtgtttgcataattttgtgggtggcgttttatctccgtccgcgccgttttaaacctg ggcacccccgcgagtctcgcacacaccggggttgagaccatgcggccctttctgctgcgcgccgcgcagctcctggcg ctgctggccctggcgctctccaccgaggccccgagcctctccgccgagacgaccccgggccccgtcaccgaggtccca agtccct(同源重组gEL序列)
TCTAGA(XbaⅠ位点)
atctggacgttcctgcccgtccgcggctgcgacgccgtgtcggtgaccacggtgtgcttcgagaccgcgtgccacccgg acctggtgctgggccgcgcctgcgtccccgaggccccggagatgggcatcggcgactacctgccgcccgaggtgccg cggctccggcgcgagccgcccatcgtcaccccggagcggtggtcgccgcacctgagcgtcctgcgggccacgcccaa cgacacgggcctctacgcgctgcacgacgcctcggggccgcgggccgtgttctttgtggcggtgggcgaccggccgcc cgcgccggcggacccggtgggccccgcgcgccacgagccccgcttccacgcgctcggcttccactcgcagctcttctc gcccggggacacgttcgacctgatgccgcgcgtggtctcggacatgggcgactcgcgcgagaactttaccgccacgct ggactggtactacgcgcgcgcgcccccgcggtgcctgctgtactacgtgtacgagccctgcatctaccacccgcgcgcg cccgagtgcctgcgcccggtggacccggcgtgcagcttcacctcgccggcgcgcgcgcggctggtggcgcgccgcg cgtacgcctcgtgcagcccgctgctcggggaccggtggctgaccgcctgccccttcgacgccttcggcgaggaggtgc acacgaacgccaccgcggacgagtcggggctgtacgtgctcgtgatgacccacaacggccacgtcgccacctgggact acacgctcgtcgccaccgcggccgagtacgtcacggtcatcaaggagctgacggccccggcccgggccccgggcac cccgtggggccccggcggcggcgacgacgcgatctacgcggacggcgtcacgacgccggcgccgcccgcgcgccc gtggaacccgtacggccggacgacgcccgggcggctgtttgtgctggcgctgggctccttcgtgatg(同源重组gER序列)
catgcaagctagctggcgtaatcatgt；
3)合成将含2个CMV启动、分别位于2个CMV启动子下游的多克隆位点以及1个BGH pA信号序列的Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒：
利用DNAClub软件分析gEL、gER、pUC19、CMV启动子(Pcmv)及BGH pA信号各序列中的限制性酶切位点，合成Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA的双基因表达盒，其全长序列为SEQ ID NO.1；其中，MCS1限制性酶切位点依次为：Hind Ⅲ、Spe Ⅰ、Mlu Ⅰ、EcoR Ⅴ、Bgl Ⅱ、Not Ⅰ、Bal Ⅰ、Pst Ⅰ，MCS2限制性酶切位点依次为：Sal Ⅰ、Kpn Ⅰ、Stu Ⅰ、EcoR Ⅰ、Cla Ⅰ、Hpa Ⅰ、BamHⅠ、Acc Ⅲ、Nru Ⅰ、Xho Ⅰ；
SEQ ID NO.1序列如下：
ggctctagatatacgcgttgacattgattattgacaagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatat ggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataat gacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagt acatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgg caccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtg ggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatc(Pcmv)
actggctaaccg
aagcttactagtacgcgtgatatcagatctgcggccgctggccactgcag(MCS1)
acgactgatcag
taatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcct ggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccatt gacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctatt gacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatcta cgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggat ttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaact ccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcag atc(Pcmv)
actggctaacca
gtcgacggtaccaggcctgaattcatcgatgttaacggatcctccggatcgcgactcgag(MCS2)
tcaagatcgact
gatcagcctaggctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgcc actcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtg gggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatataaaaaac gcccggcggcaaccgagcgttctgtctagaagt(BGH pA)
4)构建能独立表达双基因的重组伪狂犬病毒通用转移载体pgE-CMV2：
将合成的Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGHpA双基因表达盒克隆至pUC19/HEK-gE中gEL与gER之间的Xba Ⅰ位点，构建能独立表达双基因的重组伪狂犬病毒通用转移载体pgE-CMV2，Xba Ⅰ酶切鉴定结果见图6，表明Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGHpA双基因表达盒成功克隆至pUC19/HEK-gE中，pgE-CMV2质粒图谱见图9。
检测鉴定
1.同源重组臂gEL和gER重组效力鉴定
本发明还涉及将含EGFP的表达盒克隆至pUC19/HEK-gE的gEL和gER之间，获得pUC19-gE/EGFP，如图4所示，将该载体与PRV基因组DNA共转染能成功拯救重组PRV/gE-/EGFP+，如图5所示，证明同源重组臂能有效地与PRV基因组DNA中的同源序列进行重组。
2.pgE-CMV2多克隆位点的鉴定
利用MCS位点中的限制性内切酶逐一对其进行酶切，将酶切产物电泳后，观察酶切后片段大小，结果见图7。
图7的结果表明逐一用多克隆位点的限制性内切酶单独消化pgE-CMV2，每个限制性内切酶消化后均为单一的、大小约为6200bp的片段，表明多克隆位点的在载体中均为单一酶切位点，符合多克隆位点的要求，可供外源基因的插入。
3.pgE-CMV2特异性表达鉴定
用表1中引物扩增EGFP基因，经Spe Ⅰ与Pst Ⅰ消化后，将其克隆至pgE-CMV2的MCS1，转染BHK21细胞，确定其能被有效表达后，将DsRed基因继续克隆至MCS2，转染BHK21细胞，荧光显微镜下观察到EGFP基因和DsRed基因表达后的特异性荧光。
表1：EGFP与DsRed基因扩增引物
图8的结果表明将EGFP克隆至MCS1后，获得载体pgE-EGFP1，转染BHK21细胞后，第一位的Pcmv能有效启动EGFP的表达；然后继续将DsRed克隆至MCS2，获得载体pgE-EGFP1/DsRed2，转染BHK21细胞后，两个Pcmv能同时独立地有效启动位于其下游的基因的表达。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体，其特征在于：其是在含有gEL与gER的pUC19/HEK-gE重组质粒中的gEL与gER之间插入含2个CMV启动子、分别位于2个CMV启动子下游的多克隆位点以及1个BGH pA信号序列的双基因表达盒。
2.根据权利要求1所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体，其特征在于：所述双基因表达盒的全长基因序列为SEQ ID NO.1。
3.根据权利要求1所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体，其特征在于：所述表达盒在gEL与gER之间的Xba Ⅰ位点插入。
4.含有如权利要求1-3任一项所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体的宿主细胞。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的独立表达双基因的伪狂犬病毒通用转移载体的构建方法，其特征在于，其具体步骤为：
1)采用PCR法从PRV基因组DNA扩增获得同源重组臂gEL和gER；
2)将步骤1)中的再克隆至pUC19载体，并经酶切补平消除Hind Ⅲ、EcoRⅠ及Kpn Ⅰ获得pUC19/HEK-gE重组质粒；
3)合成将含2个CMV启动、分别位于2个CMV启动子下游的多克隆位点以及1个BGH pA信号序列的Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒；
4)将Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒克隆插入pUC19/HEK-gE重组质粒的gEL和gER之间。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤1)的具体过程如下：以细胞培养物中抽提的PRV基因组DNA作模板，PCR扩增出两个同源重组臂gEL和gER，经相应限制性内切酶消化后先后定向克隆至经酶切补平消除HindⅢ和EcoR Ⅰ位点的pUC19/HE，获得pUC19/HE-gE，经平端化消除Kpn Ⅰ位点，获得pUC19/HEK-gE重组质粒。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤3中)Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒的合成方法为：利用DNAClub软件分析gEL、gER、pUC19、CMV启动子Pcmv及BGH pA信号各序列中的限制性酶切位点，合成Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA的双基因表达盒；其中，MCS1限制性酶切位点依次为：Hind Ⅲ、Spe Ⅰ、Mlu Ⅰ、EcoRⅤ、Bgl Ⅱ、Not Ⅰ、Bal Ⅰ、Pst Ⅰ，MCS2限制性酶切位点依次为：Sal Ⅰ、KpnⅠ、Stu Ⅰ、EcoR Ⅰ、Cla Ⅰ、Hpa Ⅰ、BamH Ⅰ、Acc Ⅲ、Nru Ⅰ、Xho Ⅰ。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，上述合成方法还包括在Pcmv+MCS1+Pcmv+MCS2+BGH pA双基因表达盒两端引入Xba Ⅰ位点。
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| CN108486147A (zh) * | 2018-03-28 | 2018-09-04 | 浙江理工大学 | 同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法与应用 |
| CN108486147B (zh) * | 2018-03-28 | 2021-09-21 | 浙江理工大学 | 同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法与应用 |
| CN116875621A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-10-13 | 浙江大学 | 一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法 |
| CN116875621B (zh) * | 2023-07-18 | 2024-03-29 | 浙江大学 | 一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法 |
| CN117384277A (zh) * | 2023-12-05 | 2024-01-12 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种人源IgA抗体重链表达质粒及应用 |
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