CN108486147A - 同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法，以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒外壳蛋白基因启动子序列的载体，通过这2个植物病毒的基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达。本发明的同时表达2个非融合蛋白的植物病毒TRV2e2在国际上首次报道；该病毒在本氏烟不引起明显的症状，携带2个外源基因后能系统性扩展至整个植株，并在同一个细胞中表达2个外源蛋白。

Description

同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体包括在整个植物中同时表达2种非融合外源蛋白的植物病毒表达载体构建方法与应用。
背景技术
植物病毒基因组一般较小，易于进行分子生物学操作,且病毒侵染寄主的过程简单，因此利用植物病毒载体表达外源基因在生物技术领域具有潜在的应用优势。植物病毒正日益成为重组蛋白表达系统的备选方案，而未来植物病毒表达载体的发展方向将会是利用谷类、豆类等粮油经济农作物来作为生物反应器生产可食用疫苗。与植物转基因生产外源蛋白相比，植物病毒表达系统具有以下优势：第一、病毒增殖水平较高，可使伴随的外源基因高水平表达；其次、病毒增殖速度快，外源基因在很短时间可达最大量的积累；第三、病毒基因组小，易于进行遗传操作，适于大规模商业操作；第四、宿主范围广，扩大基因工程的宿主范围；第五、病毒颗粒易于纯化，可显著降低下游生产成本。
植物作为生物反应器生产“分子医药”技术具有高效、可量化和成本低的特点，以植物产生的重组药用蛋白也不受细菌毒素和动物病原体的干扰；并且作为真核生物，植物表达系统能够通过翻译后修饰如糖基化、剪切信号肽等方式来产生人类和医药相关的蛋白。植物病毒表达系统非常适合用来生产药用蛋白，已有大量的植物病毒用于表达病毒粒子表面展示短多肽。目前已有大量植物病毒成功地应用疫苗的生产，如烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、豇豆花叶病毒(Cowpea mosaic virus,CPMV)，苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)，马铃薯病毒X(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)等众多的植物病毒。TMV和PVX表达载体是目前最常用的植物病毒表达载体，广泛地应用于表达药用蛋白以及蛋白的生物学功能研究。
构建一个理想的植物病毒载体所选择的病毒应具有如下特点：(1)病毒基因组小，易于遗传操作并已构建成侵染性克隆；(2)病毒基因组的结构和功能清楚且能高水平复制和翻译，具有外源基因表达的有效启动子，改造过的病毒能局部和系统运动；(3)弱毒株系，在寄主植物中不引起症状反应或轻微的症状反应；(4)病毒携带外源基因后在寄主中能遗传稳定存活；(5)寄主范围广。不同的病毒其基因组结构和功能不同，构建病毒外源蛋白表达载体的策略也不同。
基于植物病毒构建表达外源蛋白的载体可通过缺失替换、基因插入、亚基因组翻译和表位表达等方式获得。外源基因替换病毒复制的非必需基因是目前构建植物病毒瞬时表达载体的最常用的手段；直接将外源基因插入到病毒基因组而不需要缺失病毒基因，但这种方法对外源基因的大小有限制，并且在寄主植物中病毒很容易发生重组造成外源蛋白的基因丢失；在病毒整个基因组中合适区域例外插入一个同属病毒的亚基因启动子序列获得植物病毒表达载体能系统性的侵染整个植物，但是该载体在多次病毒转接后容易发生目的蛋白基因丢失现象。表位表达载体是用来生产免疫原性肽和蛋白，将外源基因的开放阅读框与病毒的开放阅读框融合，由于外源蛋白和病毒蛋白共同表达而避免在寄主中外源插入的基因序列缺失；在植物病毒表位表达载体系统中，外源蛋白一般设计成与病毒的外壳蛋白相融合，从而使得外源蛋白裸露在病毒粒子表面。改造过病毒粒子对生产新型疫苗有着潜在的吸引力，由于改造过的病毒粒子易于纯化，并且抗原肽显露在表面能极大的提高它的免疫原性。多肽表达系统包括将完整的外源基因引入病毒基因组并在侵染的植物中快速高效地表达，抗原表位展示技术是通过植物病毒来大规模生产医用疫苗最有效的方法之一。
植物病毒表达载体多为表达单个外源蛋白，目前越来越多的植物病毒用于构建表达多个外源蛋白的载体。利用病毒自身蛋白水解酶的特性将外源基因插入P1/HC-Pro及NIb/CP的马铃薯病毒A(Potato virus A,PVA)三基因表达载体，基于大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)双基因表达载体。PVA和SMV均属于马铃薯Y病毒属(Potatovirus Y,PVY)成员，PVY属病毒的整个基因组分布在1条RNA分子上，编码一个大的多功能多聚蛋白，并通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白水解加工成有功能的单个蛋白，如P1、Hc-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIaPro、NIb和CP等蛋白。通过将绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein,GFP)基因插入到PVA的5'端非编码区和P1基因间区域、海肾荧光素酶(Ranilla luciferase,Rluc)基因克隆P1和Hc-Pro基因间区域和在以及葡糖醛酸酶(Glucuronide,GUS)基因插入到NIb和CP间区域获得在寄主植物中同时表达GFP、Rluc和GUS载体pGLU。改造后的PVA载体pGLU侵染寄主植物后先翻译出多聚体大蛋白，再由P1蛋白和辅助蛋白HC-Pro等水解酶将该大蛋白切割成众多小蛋白，最终获得目的蛋白GFP、Rluc和GUS。在P1/HC-Pro和NIb/CP间插入外源蛋白序列是PVY属病毒构建表达多个外源蛋白的最常用的策略，目前成功地应用于构建基于菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、烟草脉斑驳病毒(Tobacco veinmottling virus,TEMV)等植物病毒的外源蛋白表达载体。基于PVY属病毒成员的基因组反应策略而构建的的多基因表达载体是等量表达多个外源目的蛋白，并且所表达的目的蛋白的两端均含有来源于病毒蛋白的氨基酸残基，而目的蛋白携带其它蛋白的氨基酸残基可能影响其生物学功能。
植物病毒表达载体中，利用手足口病病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)肽酶2A自我切割活性从病毒的一个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)中表达外源蛋白的技术成功地应用于构建CPMV、扁豆花叶病毒(Bean pod mottle virus，BPMV)以及烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)外源蛋白表达载体。通过肽酶2A的核苷酸序列将病毒蛋白ORF的3'端与外源蛋白ORF的5'端相连接，经改造后的病毒接种寄主植物后将融合外源蛋白的病毒蛋白翻译出来，并在肽酶2A的作用下，水解成病毒蛋白和外源蛋白；如利用TRSV载体pT2C2AGFP表达GFP，在本氏烟中能有效地表达5种含有GFP的蛋白(MP-GFP-2A-CP、MP-GFP-2A、GFP-2A-CP、GFP-2A和GFP)，但4种融合蛋白(MP-GFP-2A-CP、MP-GFP-2A、GFP-2A-CP和GFP-2A)为主要成分，而游离的GFP含量极少。在BPMV的MP/L-CP之间插入肽酶2A的碱基序列而构建的表达2个外源基因的载体pBPMV-IV-5V能有效地同时表达GFP和除草剂抗性蛋白BAX，但是大部分的目的蛋白以MP-GFP、GFP-2A、BAX-L-CP和BAX-2A等融合蛋白的形式存在植物中。
烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV))是烟草脆裂病毒属(Tobravirus)的典型成员，寄主范围十分广泛，能侵染超过50种单子叶和双子叶家族的400多种植物。TRV基因组由2条RNA分子组成；RNA1能够在寄主植物中独立复制和系统性移动，包含着决定在烟草中的病害类型和系统侵染等遗传因子。RNA1有四个开放阅读框，分别编码一个134kDa、通读的翻译策略产生的194kDa蛋白、29kDa蛋白和16kDa蛋白，29kDa蛋白与16kDa蛋白通过亚基因组翻译策略获得；RNA2编码CP、27kDa的2b蛋白和18kDa的2c蛋白，2b和2c蛋白也是通过亚基因翻译策略获得。由于TRV引起寄主症状反应相对温和以及寄主范围广泛，TRV已被应用于构建病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)载体和表达单个外源蛋白载体。
目前国内外利用植物病毒编码多聚蛋白的水解酶特性或FMDV肽酶2A自我切割构建的多个蛋白的表达载体，其根本原理就是将多个外源蛋白基因与病毒基因构建在同一个ORF中，重构的病毒侵染植物后，产生一个大蛋白，并在病毒水解酶或FMDV肽酶2A的作用下，产生目的外源蛋白，因此在植物中所产生的外源蛋白均包含一段来源于非目的蛋白的氨基酸残基，而靶标蛋白的N端或C端携带其它蛋白的氨基酸残基可能干扰其生物学功能；在寄主植物中同时表达2个或以上的非融合外源蛋白的病毒载体还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法与应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法：以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒(Pea early browning virus,PEBV)外壳蛋白(coat protein,CP)基因启动子序列的载体，通过这2个植物病毒的基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达。
作为本发明的同时表达两个外源蛋白载体pTRV2e2的构建方法的改进，该方法依次包括以下步骤：
1)、以TRV基因组RNA2的T-DNA侵染性克隆pYL156为载体，构建缺失TRV的2b基因并含有多克隆位点(Multiple clone site,MCS1)的重组质粒pTRV2e1；
2)、在pTRV2e1插入PEBV的CP基因亚基因组启动子序列和多克隆位点MCS2获得载体pTRV2e2；
3)、PCR扩增gfp基因序列并通过双酶切连接至质粒pTRV2e1，获得载体pTRV2e1-gfp；
4)、以质粒pTRV2e1-gfp为模板，PCR扩增、双酶切克隆至质粒pTRV2e2中，获得载体pTRV2e2-MCS1-gfp；
5)、PCR扩增rfp基因序列并通过双酶切克隆至pTRV2e2-MCS1-gfp，获得到载体pTRV2e2-rfp-gfp；所述载体pTRVe2-rfp-gfp农杆菌转化后，并与农杆菌pTRV1混和接种于本氏烟中，病毒TRVe2-rfp-gfp在同一个寄主细胞中能有效地同时表达GFP和RFP。
作为本发明的同时表达两个外源蛋白载体pTRV2e2的构建方法进一步改进，该方法还依次包括以下步骤：
6)、提取病毒TRVe2-rfp-gfp侵染的植物叶片的总蛋白用于Western blot分析，TRVe2-rfp-gfp侵染的本氏烟的总蛋白中能特异性检测到GFP和RFP；
7)、PCR分别扩增大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)XEG1和Avh52基因序列，通过不同内切酶分别克隆到载体pTRV2e2，获得表达载体pTRV2e2-XEG1-MCS2、pTRV2e2-XEG1-Avh52和pTRV2e2-MCS1-Avh52；
8)、病毒TRVe2-XEG1-MCS2侵染引起本氏烟产生细胞坏死坏死，而TRVe2-XEG1-Avh52侵染的植株同时表达XEG1与Avh52后则呈现轻微坏死；
9)、在病毒TRVe2-XEG1-Avh52侵染的本氏烟中Western blot能同时检测到XEG1与Avh52。
本发明还同时提供了如上述方法构建所得外源蛋白表达载体pTRV2e1和pTRV2e2的用途：病毒TRVe1和TRVe2在寄主植物中不引起明显的症状；携带2个外源基因病毒TRVe2后能系统性扩展至整个植株，并在同一个细胞中表达2个外源蛋白。
基于TRV基因组RNA2所编码CP、2b和2c是由3条病毒RNA分子所翻译而来，本发明将RNA2中的2b和2c蛋白的ORF同时缺少，在2b基因的启动子序列后引入多克隆位点和豌豆早枯病毒(Pea early browning virus,PEBV)的CP基因的启动子序列而获得载体pTRV2e2，在病毒TRVe2侵染植物中基因组RNA2复制后产生3条RNA分子，即全长的RNA2、含2b基因启动子序列的亚基因组RNA和PEBV的CP基因的启动子序列的亚基因组RNA。本发明通过病毒TRVe2的RNA2中2个亚基因组来驱动外源蛋白表达而获得2个非融合蛋白，该技术是国内外首次报道。
本发明的技术方案具体如下：
1、以TRV基因组RNA2的T-DNA侵染性克隆pYL156为载体，构建缺失TRV的2b基因并含有多克隆位点(Multiple clone site,MCS1)的重组质粒pTRV2e1，在pTRV2e1插入PEBV的CP基因亚基因组启动子序列和多克隆位点MCS2获得载体pTRV2e2(实施例1)。
2、pTRV2e1和pTRV2e2分别转入到农杆菌GV3101后，并与农杆菌pTRV1共同浸润接种于本氏烟，病毒TRVe1和TRVe2在寄主植物中引起轻微的症状反应(实施例1、3-5)。
3、在载体TRVe2中MCS1中插入红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)基因和MCS2中插入绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)获得pTRV2e2-rfp-gfp，病毒农杆菌接种结果表明，病毒TRVe2-rfp-gfp快速和高效地同时在整个植物中表达GFP和RFP，在寄主植物的系统叶同一个细胞中激光共聚焦显微镜同时观察到绿色荧光和红色荧光(实施例2-4和6)。
4、分别提取病毒TRV侵染的本氏烟中总蛋白，蛋白电泳、转膜与GFP/RFP抗体杂交检测，在病毒pTRV2e2-rfp-gfp侵染的植株中能同时GFP和RFP(实施例7)。
5、PCR分别扩增XEG1和Avh52基因序列，通过不同内切酶分别克隆到载体pTRV2e2，获得表达载体pTRV2e2-XEG1-MCS2、pTRV2e2-XEG1-Avh52和pTRV2e2-MCS1-Avh52(实施例7)。
6、pTRV2e2-XEG1-MCS2、pTRV2e2-XEG1-Avh52和pTRV2e2-MCS1-Avh52分别转入到农杆菌GV3101后，并与农杆菌pTRV1共同浸润接种于本氏烟，病毒TRVe2-XEG1-MCS2侵染引起本氏烟产生细胞坏死坏死，而TRVe2-XEG1-Avh52侵染的植株同时表达XEG1与Avh52后则呈现轻微坏死(实施例3、4和8)。
7、分别提取病毒TRV侵染的本氏烟中总蛋白，蛋白电泳、转膜与HA标签抗体杂交检测，在病毒TRVe2-XEG1-Avh52侵染的本氏烟中Western blot能同时检测到XEG1与Avh52(实施例7、8)。
综上所述，本发明采用病毒蛋白的亚基因翻译策略，基于TRV构建在本氏烟整个植株中同时表达2个非融合的外源蛋白的载体。
基于烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156，本发明公开一种利用2个植物病毒基因组启动子驱动2外源基因在整个植物中同时表达的载体pTRV2e2的构建方法。病毒TRVe2在本氏烟中无明显的症状反应；携带2个外源基因的病毒TRVe2-rfp-gfp在接种的非接种叶片的同时表达绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein,GFP)和红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)；并进一步同通过病毒TRVe2在本氏烟中同时表达大豆疫霉XEG1和Avh52验证载体pTRV2e2能同时表达2个外源蛋白。本明国际上首次利用亚基因组翻译策略构建同时表达2个非融合蛋白的植物病毒载体pTRV2e2，携带2个外源基因的病毒TRVe2能系统性侵染整个寄主植物，并且2个外源基因在同一个细胞中同时表达。
本发明的技术优势(有益效果)主要为：本发明的同时表达2个非融合蛋白的植物病毒TRV2e2在国际上首次报道；该病毒在本氏烟不引起明显的症状，携带2个外源基因后能系统性扩展至整个植株，并在同一个细胞中表达2个外源蛋白。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为TRV2相关载体构建示意图；
图2为TRV2相关表达外源蛋白载体构建示意图；
图3为TRV在本氏烟中5天引起的症状反应对比图；
图3中，Mock为健康植物对照，TRV为TRV1与pYL156农杆菌混和物接种、TRVe1为TRV1与TRV2e1农杆菌混和物接种、TRVe2为TRV1与TRV2e2农杆菌混和物接种；
图4为重组病毒TRV在本氏烟中表达GFP/RFP后的荧光表型图；
图5为病毒TRVe2-rfp-gfp在同一个寄主细胞中同时表达GFP和RFP的示意图；
图6为病毒TRVe2-rfp-gfp在同一个寄主细胞中同时表达GFP和RFP的示意图；
图6中，Mock为健康植物，Rubisco为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulosebisphosphate carboxylase oxygenase，Rubisco)的大亚基，用于确定植物总蛋白的上样量。
图7利用TRVe2表达载体分析Avh52抑制XEG1引起细胞坏死反应的对比图；
图8 Western blot检测TRVe2-XEG1-Avh52侵染植物中的XEG1和Avh52；
图8中，Rubisco为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose bisphosphatecarboxylase oxygenase，Rubisco)的大亚基，用于确定植物总蛋白的上样量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、TRV表达载体的构建
以质粒pYL156为模板，通过引物对P1/P2进行PCR扩增，目的产物割胶回收后经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切，同时用HindⅢ/EcoRⅠ对pYL156进行双酶切，割胶回收载体，与上一步所得酶切PCR产物片段连接及转化，获得重组质粒pTRV2e1。P1和P2引物序列分别为cccAAGCTTGCATGCCTGCAG(AAGCTT为HindⅢ酶切位点)和cGAATTCtctagaCTCGAGacgcgtAAGCCACTTCCTAAGTAATTCGTGCcTTGCGAAACTCAAATGC(GAATTC为EcoRⅠ，tctaga为XbaⅠ，CTCGAG为Xho I和acgcgt为MluⅠ)。
PCR扩增的体系为：5×Q5reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mM)3.2μL，P1/P2(10μM)各2μL，模板pYL156 10ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，56℃15s，72℃60s，35个循环，72℃5min。
豌豆早枯病毒(Pea early browning virus,PEBV)外壳蛋白CP基因启动子序列为：gcacacaaggttaaaaacgctgtagtaatacatgcgcaagaacaggctgagcatcttgttctggggtttcacactatctttagagaaagtgttaagttaattaagttatcttaattaagagcataattatactgatttgtctctcgttgatagagtctatcattctgttactaaaaatttgacaactcggtttgctgacctactggttactgtatcacttacccgagttaacgagatct，通过人工合成并克隆于载体pUC57中(pUC57-PEBV CP)。以载体pUC57-PEBVCP为模板，通过引物对P3/P4进行扩增得到PEBV CP的启动子序列，目的片段割胶回收，经MluⅠ/SmaⅠ双酶切清洁回收后，并克隆至pTRV2e1中，获得克隆pTRV2e2。引物P3和P4分别为CGacgcgtGCACACAAGGTTAAAAACGCTGTAG(acgcgt为MluⅠ)和tccCCCGGGccatggGGTACCggatccTCACTGAGGTGCCTCGATG(CCCGGG为SmaⅠ，NcoⅠ，GGTACC为KpnⅠ和ggatcc为BamHⅠ)。
PCR扩增的体系为：5×Q5reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mM)3.2μL ，P3/P4(10μM)各2μL，模板pUC57-PEBV CP 10ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，55℃15s，72℃20s，35个循环，72℃5min。载体pYL156(基因登录号为AF406991)、载体pTRV2e1和pTRV2e2示意图如图1所示，载体pYL156的详细信息见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF406991。
pYL156载体从5′-3′依次含有一段左臂T-DNA序列(left border,LB)、2个花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus,CaMV)启动子序列(2×35S)、TRV2基因组5′非编码区、外壳蛋白(Coat protein,CP)基因、含N端110个氨基酸的2b基因(Truncated 2b)、多克隆位点(multiple clone site,MCS)、TRV2基因组3′非编码区、人工合成的顺式切割核酶序列(synthesized cis-cleaving ribozyme sequence,Rz)、胭脂碱合成酶终止子(nopalinesynthaseterminator,NOS)右臂的T-DNA序列(right border,RB)。pTRV2e1载体MCS1中包含EcoRⅠ、XbaⅠ、Xho I和MluⅠ限制性内切酶的酶切位点；pTRV2e2载体中MCS1酶切位点为EcoRⅠ、XbaⅠ、Xho I和MluⅠ和MCS2酶切位点为SmaⅠ、NcoⅠ、KpnⅠ和BamHⅠ，PEBV CP pro为豌豆早枯病毒(Pea early browning virus,PEBV)外壳蛋白(coat protein,CP)基因启动子序列。
实施例2、表达GFP和RFP的pTRV2e载体构建
gfp基因大小为720bp，序列为：atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaagcggcacgacttcttcaagagcgccatgcctgagggatacgtgcaggagaggaccatcttcttcaaggacgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgagggagacaccctcgtcaacaggatcgagcttaagggaatcgatttcaaggaggacggaaacatcctcggccacaagttggaatacaactacaactcccacaacgtatacatcatggccgacaagcaaaagaacggcatcaaagccaacttcaagacccgccacaacatcgaagacggcggcgtgcaactcgctgatcattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaatag。
采用引物对P5/P6进行PCR扩增，gfp基因目的产物割胶回收，经EcoRⅠ/MluⅠ双酶切后清洁回收，并连接至质粒pTRV2e1中，连接产物转化到大肠杆菌中获得载体pTRV2e1-gfp。引物P5和P6的序列分别为GgaattcATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG(gaattc为EcoRⅠ)和CGacgcgtCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG(acgcgt为MluⅠ)；PCR扩增的体系为：5×Q5reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mM)3.2μL，P5/P6(10μM)各2μL，gfp基因模板10ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，57℃15s，72℃30s，35个循环，72℃5min。
以质粒TRV2e1-gfp为模板，通过引物对P7/P8进行PCR扩增，目的产物割胶回收，经BamHⅠ/SmaⅠ双酶切后清洁回收，并克隆至质粒pTRV2e2中获得载体pTRV2e2-MCS1-gfp。引物对P7/P8序列分别为CGggatccATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTG(ggatcc为BamHⅠ)和TCCcccgggCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATG(CCCGGG为SmaⅠ)；PCR扩增的体系为：5×Q5reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mM)3.2μL，P7/P8(10μM)各2μL，gfp基因模板10ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，57℃15s，72℃30s，35个循环，72℃5min。
rfp基因大小为711bp，序列为：atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaa。
通过引物对P9/P10进行rfp基因的PCR扩增，目的产物割胶回收，经EcoRⅠ/MluⅠ双酶切后清洁回收，并克隆至pTRV2e2-MCS1-gfp获得到载体TRV2e2-rfp-gfp。引物对P9/P10序列分别为GgaattcATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG(gaattc为EcoRⅠ)和CGacgcgtTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC(acgcgt为MluⅠ)；PCR扩增的体系为：5×Q5reactionbuffer 8μL，dNTP(2.5mM)3.2μL，P9/P10(10μM)各2μL，rfp基因模板10ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，57℃15s，72℃30s，35个循环，72℃5min。载体pTRV2e1-gfp、pTRV2e2-MCS1-gfp和pTRV2e2-rfp-gfp示意图如图2所示。
pTRV2e1-gfp载体通过EcoRⅠ/MluⅠ双酶切将gfp基因克隆pTRV2e1获得，TRV2e2-MCS1-gfp通过BamHⅠ/SmaⅠ双酶切将gfp基因克隆pTRV2e1获得，在载体TRV2e2-MCS1-gfp通过EcoRⅠ/MluⅠ双酶切将rfp基因获得pTRV2e2-rfp-gfp。
实施例3、TRV2相关载体的农杆菌转化、活化和扩大培养
取100uL农杆菌GV3101感受态细胞于冰上预冷1.5mL灭菌离心管中，并分别各自加入100ng质粒pTRV2e1、pTRV2e2、pTRV2e2-MCS1-gfp和pTRV2e2-rfp-gfp，并轻微吹打混匀，冰上放置30min；42℃水浴1min后置于液氮1min，再冰上放置2min；加入500uL不含抗生素LB液体培养基，在28℃、220rpm摇床中震荡培养3-4h；分别取以上4种菌体培养液100uL均匀涂布于含(30mg/L Rifampicin、50mg/L Gentamycin和50mg/L Kanamycin)LB固体平板中，在28℃培养箱中培养12～16h。分别挑取以上pTRV2e1、pTRV2e2、pTRV2e2-MCS1-gfp和pTRV2e2-rfp-gfp单菌落以及零下80℃冰箱保存20uL农杆菌pTRV1和pYL156甘油菌于含(30mg/LRifampicin，50mg/L Gentamycin和50mg/L Kanamycin)2mL的LB液体培养基，28℃摇床震荡培养12～16h。
分别取pTRV2e1、pTRV2e2、pTRV2e2-MCS1-gfp、pTRV2e2-rfp-gfp、pTRV1和pYL156农杆菌菌液50uL于5mL含10mmol/L MES、200mmol/L acetosyringone、30mg/L Rifampicin、50mg/L Gentamycin和50mg/L Kanamycin的LB液体培养基中，在28℃、220rpm摇床中震荡培养12～16h；分别取2mL扩大培养均液5000rpm离心5min，弃上清，用5ml浸润接种缓冲液(10mmol/L MgCl2，10mmol/L MES和200mmol/L acetosyringone)悬浮菌体，5000rpm离心5min，弃上清，最后用浸润接种缓冲液将各个菌体浓度调至OD600为0.2。
实施例4、农杆菌浸润接种本氏烟
分别取实施例3中的OD600为0.2的pTRV2e1、pTRV2e2、pTRV2e2-MCS1-gfp、pTRV2e2-rfp-gfp和pYL156农杆菌菌液5mL与5mL浓度为0.2OD600的pTRV1农杆菌混和，由此获得5个病毒接种组合；农杆菌混和物在室温黑暗预处理4h，通过无针头1mL灭菌注射器浸润5-7叶期本氏烟叶片背部，所有接种植物置于25℃、光照期16h黑暗8h植物生长室培养。农杆菌pTRV1与pYL156混和物接种植物后命名为TRV、农杆菌pTRV1与pTRV2e1混和物接种植物后命名为TRVe1，农杆菌pTRV1与pTRV2e1-gfp混和物接种植物后命名为TRVe1-gfp，农杆菌pTRV1与pTRV2e2-MCS1-gfp混和物接种植物后命名为TRVe2-MCS1-gfp，农杆菌pTRV1与pTRV2e2-rfp-gfp混和物接种植物后命名TRVe2-rfp-gfp。
实施例5、TRV引起本氏烟症状反应
农杆菌混和液TRV(pTRV1+pYL156)、TRVe1(pTRV1+pTRV2e1)、TRVe2(pTRV1+pTRV2e2)分别浸润接种本氏烟，5天后寄主植物的症状反应如图3所示，病毒TRVe1和TRVe2侵染的寄主植物不表现出明显的症状反应，与对照Mock接种的植株表型相一致；TRV侵染引起寄主植物的浸润接种叶和系统叶产生坏死表型。本发明所构建的TRV重组病毒TRVe1和TRVe2在植物中的症状反应非常轻，有利于其在植物中高效大量的表达目的蛋白。
实施例6、TRV在植物中表达GFP和RFP后荧光现象观察
表达载体pTRV2e1是通过缺少pYL156中2b基因编码区域而获得，利用2b基因亚基因组启动子驱动外源蛋白表达，pTRV2e2载体中除了病毒自身2b基因启动子还携带豌豆早枯病毒(Pea early browning virus,PEBV)外壳蛋白(coat protein,CP)基因启动子序列。为了确定pTRV2e1和pTRV2e2载体中的亚基因组启动子能否驱动外源蛋白的表达，分别构建载体pTRV2e1-gfp和pTRV2e2-MCS1-gfp，并将农杆菌pTRV2e1-gfp和pTRV2e2-MCS1-gfp分别与农杆菌pTRV1混和接种于本氏烟中。浸润接种2天，在暗室中用长波型手提便携式紫外灯(Black Ray model B 100AP/R,Upland,USA)下能明显观察到本氏烟接种叶上出现绿色荧光；5天病毒TRVe1-gfp和TRVe2-MCS1-gfp均系统性侵染本氏烟，使得寄主植物的上部非接种叶产生绿色荧光表型，用携带Wratten过滤器15的柯达照相机所拍摄的TRV侵染的植物荧光照片如图4所示。除了TRVe1对照接种植物，其它均可以在系统叶上看到较明显的绿色荧光。病毒TRVe1-gfp和TRVe2-MCS1-gfp均能有效地表达GFP，并且TRVe2-MCS1-gfp侵染寄主中绿色荧光强度明显高于TRVe1-gfp，这表明PEBV CP基因启动子驱动外源蛋白GFP表达的能力强于TRV自身的2b基因启动子。
pTRV2e2-rfp-gfp和与pTRV1农杆菌混和物浸润接种于本氏烟中，5天病毒侵染植株的系统叶呈现亮黄色表型(图4)，系统叶片置于激光共聚焦显微镜观察的结果如图5所示，在本氏烟同一个细胞中能同时观察到绿色荧光和黄色荧光，这表明载体TRVe2-rfp-gfp能有效地同时表达GFP和RFP。
实施例7、Western blot分析本氏烟中病毒TRV表达的GFP和RFP
分别取TRVe1、TRVe1-gfp、TRVe2-MCS1-gfp和TRVe2-rfp-gfp侵染寄主植物系统叶0.1g，加液氮研磨至粉末状后，加入200μL含2％β-巯基乙醇的PBS缓冲液(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，2mmol/L KH2PO4)研磨至均一状液体；吸取200μL研磨液至1.5mL离心管，加入等量2×loading buffer(1mol/L pH 6.8Tris·HCl，10％β-巯基乙醇，20％SDS，20％甘油，0.01％溴酚蓝)，95℃水浴煮10min，10000rpm离心5min取上清，Bradford法测植物总蛋白浓度。
配制15％分离胶和5％浓缩胶，根据各个样品蛋白浓度确定上样量，在蛋白电泳缓冲液(0.025mol/L Tris，0.25mol/L Glycine，0.1％SDS)中线70V电泳30min，再100V电泳1.5h；将硝酸纤维素膜在蛋白转膜缓冲液(39mmol/L Glycine，48mmol/L Tris，0.0037％SDS，20％甲醇)浸泡10min，通过半干恒流法(100mA，30min)将蛋白转移至硝酸纤维素膜中，以丽春红对蛋白膜进行染色，来确定转膜情况。
蛋白膜放入含5％脱脂奶粉TBS缓冲液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl)，在水平摇床50rpm/min封闭1h；在含5％脱脂奶粉TBS缓冲液中，按照1︰10000比例加入GFP或RFP抗体(Sigma,USA)，水平摇床50rpm/min孵育1h；用含0.1％Tween-20的TBS缓冲液洗膜3次后放入5％脱脂奶粉TBS缓冲液中，加入辣根过氧化物酶标记的GFP或RFP抗体(Abcam，USA)，水平摇床50rpm/min孵育1h；0.1％Tween-20的TBS缓冲液洗膜3次后再TBS洗一次，滤纸吸干蛋白膜，膜正面加0.3mL化学HRP显色底物(Thermo Fisher Scientific，USA)，室温放置5min，暗室压片显影并拍照记录。
TRVe1、TRVe1-gfp、TRVe2-MCS1-gfp和TRVe2-rfp-gfp侵染本氏烟系统叶的总蛋白的Western blot分析的结果如图6所示；在对照接种Mock和TRVe1侵染样品中均检测不到目的蛋白GFP和RFP，TRVe1-gfp、TRVe2-MCS1-gfp和TRVe2-rfp-gfp植株系统叶中均能特异性地检测到GFP，TRVe2-rfp-gfp侵染的本氏烟的总蛋白中能检测到GFP和RFP。因此病毒TRVe2能在整个植物中同时表达2个外源蛋白。
实施例8、表达大豆疫霉菌2个蛋白的TRVe2载体构建
大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)的XEG1蛋白是一激发子，引起本氏烟产生细胞坏死现象，而本氏烟中表达P.soja的效应蛋白Avh52后则抑制XEG1引起的细胞坏死症状。本发明构建pTRV2e2-XEG1-MCS2、pTRV2e2-XEG1-Avh52和TRV2e2-MCS1-Avh52载体用于分析Avh52抑制XEG1引起的细胞坏死表型。XEG1蛋白240个氨基酸组成，基因序列为：atgaagggattcttcgccggtgtcgtcgctgctgccaccctcgcggtcgcctccgctggagactactgcggccagtgggactgggccaagagcactaactacatcgtgtacaacaacctctggaacaagaacgccgccgcatcgggcagccaatgcacgggcgtcgacaagatcagcggctccaccatcgcctggcacacgtcgtacacctggacgggaggcgcggccacggaggtcaagtcgtactcgaacgccgcgctggtcttctccaagaagcagatcaagaacatcaagtcgatccccaccaagatgaagtactcgtactcgcactcctcgggcacgttcgtcgctgacgtgtcgtacgacctgttcacgagctccaccgccagcggcagcaacgagtacgagatcatgatctggctggccgcgtacggcggcgccggcccgatctccagcacgggcaaggccatcgccaccgtcaccatcggcagcaacagcttcaagctgtacaagggcccgaacggcagcaccaccgtcttctcgttcgtcgccaccaagaccatcaccaacttctcggccgacctgcagaagttcctgagctacctcaccaagaaccagggcctgccttccagccagtacctcatcacgctcgaggccggcacggagccgttcgtgggcacgaacgccaagatgaccgtatcctcgttctcggctgcggtcaactag；Avh52蛋白由122氨基酸组成，基因大小为369bp，基因序列为：atgcgccttacttccatccttgtgctggtgatcgccgccactttccataccaccggcactgcgctcacgttgaccaaggattccaaagccgggattgccaacggagattcgcccgctagtggcgacttcatcgacgcgaacagcgctcggctactgcgtcgggtcgaaaaagataaagtcgattacgagcaagacgaacagaggagctttggagccctcaaggatgcagtgaagaagctgaatcccgtcactgctgtgaagaaattttttaaacagagggctagacggaagaaagtgatccagaccgcgaggaatgccgatgacaacttggcgtgggcgatgaggaaggtttataatgaggccaactga。通过引物对P11(GgaattcATGAAGGGATTCTTCGCCGGTG，gaattc为EcoRⅠ)和P12(CGacgcgtCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGTTGACCGCAGCCGAGAACG，下划线为HA标签序列，agcggt为MluⅠ)进行PCR扩增获得XEG1，并通过双酶切克隆到载体pTRV2e2中，获得pTRV2e2-XEG1-MCS2；PCR扩增的体系为：5×Q5reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mM)3.2μL，P9/P10(10μM)各2μL，XEG1基因模板10ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，56℃15s，72℃30s，35个循环，72℃5min。通过引物对P12(CGggatccATGCGCCTTACTTCCATCCTTG，ggatcc为BamHⅠ)和P13(TCCcccgggCTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGTTGGCCTCATTATAAACCTTCC，下划线为HA标签序列，cccggg为SmaI)进行PCR扩增获得Avh52，并通过双酶切分别克隆到载体pTRV2e2和pTRV2e2-XEG1-MCS2，获得pTRV2e2-MCS1-Avh52和pTRV2e2-XEG1-Avh52；PCR扩增的体系为：5×Q5reaction buffer 8μL，dNTP(2.5mM)3.2μL，P9/P10(10μM)各2μL，Avh52基因模板10ng，Q5polymerase(1U/μL)0.4μL，ddH2O补足至40μL；PCR反应程序为：98℃3min，98℃10s，56℃15s，72℃15s，35个循环，72℃5min。
实施例9、病毒表达TRVe2表达XEG1和Avh52后症状反应与蛋白杂交检测
载体pTRV2e2-XEG1-MCS2、pTRV2e2-MCS1-Avh52和pTRV2e2-XEG1-Avh52的农杆菌转化、活化与扩大培养的实验步骤同实施例3，病毒TRVe2-XEG1-MCS2、TRVe2-Avh52-MCS2和TRVe2-XEG1-Avh52农杆菌接种的方法同实施例4。病毒农杆菌浸润结果如图7所示，接种2天，病毒TRVe2-MCS1-gfp和TRVe2-Avh52-MCS2侵染不引起细胞坏死反应，而TRVe2-XEG1-MCS2侵染的本氏烟叶片呈现细胞坏死反应，在TRVe2-XEG1-Avh52侵染的本氏烟中轻微的坏死症状反应，这表明，Avh52能抑制XEG1引起的本氏烟坏死反应。在病毒TRVe2-MCS1-gfp、TRVe2-XEG1-MCS2、TRVe2-XEG1-Avh52和TRVe2-Avh52-MCS2侵染的36h，分别采集病毒浸润接种的区域样品，并提取总蛋白用于Western blot检测；XEG1和Avh52的检测抗体为anti-HA-tag(Sigma，USA)，样品总蛋白的提取、SDS-PAGE电泳、转膜、蛋白杂交与化学发光检测的具体方法同实施例7，蛋白杂交结果如图8所示，结果表明：在TRVe2-Avh52-MCS2侵染本氏烟中能同时检测到XEG1和Avh52蛋白，本实施例进一步证实病毒TRVe2能同时表达2个外源蛋白。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江理工大学
浙江大学
<120> 同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccaagcttg catgcctgca g 21
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgaattctct agactcgaga cgcgtaagcc acttcctaag taattcgtgc cttgcgaaac 60
tcaaatgc 68
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgacgcgtgc acacaaggtt aaaaacgctg tag 33
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcccccgggc catggggtac cggatcctca ctgaggtgcc tcgatg 46
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaattcatg agtaaaggag aagaactttt cactg 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgacgcgtct atttgtatag ttcatccatg ccatg 35

Claims (4)

1.同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法，其特征是：以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒外壳蛋白基因启动子序列的载体，通过这2个植物病毒的基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达。
2.根据权利要求1所述的同时表达两个外源蛋白载体pTRV2e2的构建方法，其特征是依次包括以下步骤：
1)、以TRV基因组RNA2的T-DNA侵染性克隆pYL156为载体，构建缺失TRV的2b基因并含有多克隆位点的重组质粒pTRV2e1；
2)、在pTRV2e1插入PEBV的CP基因亚基因组启动子序列和多克隆位点MCS2获得载体pTRV2e2；
3)、PCR扩增gfp基因序列并通过双酶切连接至质粒pTRV2e1，获得载体pTRV2e1-gfp；
4)、以质粒pTRV2e1-gfp为模板，PCR扩增、双酶切克隆至质粒pTRV2e2中，获得载体pTRV2e2-MCS1-gfp；
5)、PCR扩增rfp基因序列并通过双酶切克隆至pTRV2e2-MCS1-gfp，获得到载体pTRV2e2-rfp-gfp；所述载体pTRVe2-rfp-gfp农杆菌转化后，并与农杆菌pTRV1混和接种于本氏烟中，病毒TRVe2-rfp-gfp在同一个寄主细胞中能有效地同时表达GFP和RFP。
3.根据权利要求2所述的同时表达两个外源蛋白载体pTRV2e2的构建方法，其特征是还依次包括以下步骤：
6)、提取病毒TRVe2-rfp-gfp侵染的植物叶片的总蛋白用于Western blot分析，TRVe2-rfp-gfp侵染的本氏烟的总蛋白中能特异性检测到GFP和RFP；
7)、PCR分别扩增大豆疫霉菌XEG1和Avh52基因序列，通过不同内切酶分别克隆到载体pTRV2e2，获得表达载体pTRV2e2-XEG1-MCS2、pTRV2e2-XEG1-Avh52和pTRV2e2-MCS1-Avh52；
8)、病毒TRVe2-XEG1-MCS2侵染引起本氏烟产生细胞坏死，而TRVe2-XEG1-Avh52侵染的植株同时表达XEG1与Avh52后则呈现轻微坏死；
9)、在病毒TRVe2-XEG1-Avh52侵染的本氏烟中Western blot能同时检测到XEG1与Avh52。
4.如权利要求1～2任一方法构建所得外源蛋白表达载体pTRV2e1和pTRV2e2的用途，其特征是：病毒TRVe1和TRVe2在寄主植物中不引起明显的症状；携带2个外源基因病毒TRVe2后能系统性扩展至整个植株，并在同一个细胞中表达2个外源蛋白。
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