CN103966256A - 马铃薯x病毒超表达及双分子荧光互补载体的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供了两种马铃薯X病毒超表达载体及一种双分子荧光互补载体的构建方法及应用。通过基因重组的方式，将马铃薯X病毒1985分离物的基因组克隆到35S启动子下游，获得的侵染性克隆通过农杆菌浸润可侵染烟草、番茄、马铃薯等茄科作物。对侵染性克隆进行改造，获得了可在寄主植物体内高效表达1种或2种外源蛋白的超表达载体，以及能鉴定蛋白互作的双分子荧光互补载体。

Description

马铃薯X病毒超表达及双分子荧光互补载体的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及马铃薯X病毒属的马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)1985分离物侵染性克隆、超表达载体及双分子荧光互补载体的构建方法及应用。

背景技术

侵染性克隆是研究植物病毒基因组功能的重要工具。利用病毒的侵染性克隆，也可以构建过量表达载体。与转基因技术相比，利用超表达载体在植物体内表达外源蛋白的技术具有操作简单、成本低、生产周期短、表达量高等优点。

双分子荧光互补（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）试验是鉴定蛋白互作的重要方法。其主要原理是编码黄色荧光蛋白（YFP）的N和C段）的基因片段分别与编码诱饵蛋白和捕获蛋白的基因融合，通过农杆菌浸润植物叶片，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。这种方法具有很高的信噪比，弱蛋白相互作用也可以检测到，但要求携带融合蛋白基因的农杆菌必须要进入同一个细胞才能检测到。

马铃薯X病毒（PVX）属于马铃薯X病毒属（Potexvirus），主要侵染烟草、番茄、马铃薯等茄科作物，在作物上部叶片产生轻花叶，是这些作物上的主要病毒之一。PVX与马铃薯Y病毒属病毒间有协生作用，一旦复合侵染会引起严重症状，导致更大损失。

PVX曾经被改造成瞬时表达载体（如pGR106等），并被广泛应用。但pGR106等载体只能表达一种蛋白。本发明研制的两种超表达载体，一种可以同时表达两种蛋白，另一种能够瞬时超量表达外源蛋白，还进一步研制了能在活体中鉴定两种蛋白互作的载体。

发明内容

本发明提供了一种马铃薯X病毒侵染性克隆的构建方法及应用，通过基因插入重组的方式，将马铃薯X病毒1985分离物的基因组克隆到35S启动子下游，获得了侵染性克隆pCaPVX100。在此基础上,将pCaPVX100改造成了三种载体：

（1）能同时表达两种蛋白的超表达载体pCaPVX440。利用该载体，可根据需要在植物细胞内同时表达两种蛋白。

（2）能用来鉴定互作蛋白的载体pCaPVX770。编码诱饵蛋白和捕获蛋白的基因分别克隆到PVX载体的两个不同多克隆位点，它们分别与YFP的N和C端融合表达。该载体保证两个候选蛋白能同时进入一个细胞，提高了鉴定互作蛋白的效率。

（3）基于基因替换策略的瞬时表达载体pCaPVX760。该载体通过农杆菌浸润的方法接种，操作简单成本低，并且能显著提高外源蛋白的表达量,短时间内能够获得大量重组外源蛋白。

本发明实施的具体技术方案是：

马铃薯X病毒侵染性克隆的构建，具体步骤如下：

a.从马铃薯X病毒侵染的烟草中提取总RNA；可采用常规提取方法获得。

b.以Oligo dT为引物反转录，分三段对马铃薯X病毒基因组进行PCR扩增。利用Overlap-PCR方法将35S启动子融合到马铃薯X病毒基因组的5′-末端前。

c.用限制性酶切的方法将全长cDNA克隆连接到pCambia0390载体，获得pCaPVX100。

d.改造pCaPVX100，在其TGB和CP基因间插入PVX CP启动子和酶切位点、TMV CP启动子和酶切位点，获得了超表达载体pCaPVX440。

e.将编码YFP N－端和C－端的基因分别克隆到pCaPVX440的两个酶切位点之后，获得了检测两种蛋白互作的BiFC载体pCaPVX770。

f.改造pCaPVX440，将CP基因替换为多克隆位点，获得了瞬时表达载体pCaPVX760。

g.将c、d、e、f中构建的载体通过农杆菌浸润接种寄主植物。

h.观察症状及检测。

采用本发明所述的技术方案，可以获得如下的技术效果：

1)侵染性克隆pCaPVX100可用农杆菌浸润接种，能稳定侵染马铃薯、烟草和番茄等植物。

2)利用超表达载体pCaPVX440可在植物中同时表达两种外源蛋白。

3)利用载体pCaPVX770可鉴定两种蛋白能否互作。

4)利用载体pCaPVX760可在短时间内获得大量的外源蛋白。

附图说明

图1为PVX超表达和BiFC载体基因组结构示意图

图2为pCaPVX100在不同寄主上的症状（上）及PCR检测结果（下）

图3为利用pCaPVX440同时表达GFP和YFP

图4为利用pCaPVX760超表达GFP的情况

图5为pCaPVX770作为BiFC载体的应用

1和3分别为含有pCaPVX770-22和pCaPVX770-20的农杆菌浸润的植株系统叶片，1中许多细胞中有黄色荧光，而3中细胞内没有黄色荧光；2为用传统BiFC方法的结果，只能在个别细胞内观察到荧光。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：

引物1－8用于PVX侵染性克隆的构建，其中引物1-4应用于5′-端片段p35S-543的扩增，引物5-6应用于中间载体544-3349的扩增，引物7和8应用于3′-端片段3350-polyA的扩增。因为9-30应用于各载体的构建。

实施例1：植物总RNA的提取

取约0.1g感染PVX的烟草植株上部叶片，液氮中充分研磨，加入1mL TRIZOL，涡旋，室温孵育5min，加入氯仿，剧烈涡旋15s，室温孵育3min，13000r/min离心15min。小心吸取上清液，加入1/2体积的异丙醇，静置10min，13000r/min离心10min。沉淀用75%乙醇洗涤，13000r/min离心5min。沉淀用50μL DEPC水回溶，-80℃保存备用。

实施例2：马铃薯X病毒侵染性克隆的构建

以实施例1中获得的病毒RNA为模板，用随机引物进行反转录。根据现有马铃薯X病毒全基因组的限制性酶切图谱，可分三部分扩增，酶切后装配为PVX全长cDNA克隆。首先，通过Overlap-PCR将35S启动子融合到片段PVX 5′非翻译区（UTR）至nt543-BamHI酶切位点的上游，发明人将该片段命名为片段p35S-543；PCR扩增543-BamHI酶切位点到3349-EcoRI酶切位点之间的这一片段，发明人将该片段命名为片段543-3349；PCR扩增3349-EcoRI酶切位点到ploy(A)尾巴这一片段，发明人将该片段命名为片段3349-polyA。

以植物总RNA为模板，用Moloney murine leukaemia virus reversetranscriptase (Promega)进行反转录，合成cDNA。反应体系如下：

混匀后42℃孵育50min，85℃孵育5min停止反应。

以所得反转录产物为模板，所有PCR均使用Phusion high-fidelity polymerase(Finnzymes)；

PCR反应体系如下：5×PCR Buffer10μL，dNTP（10mmol/L each）1.0μL，引物1和（10μmol/L）各1.0μL，模板cDNA0.5μL，Phusion聚合酶0.3μL，加ddH₂O至50.0μL。

PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。切胶回收后，使用超微量分光光度计ScanDrop250（Analytikjena，Germany）测定回收产物的核酸浓度。

将片段p35S-543，片段543-3349和片段3350-polyA三个片段连接后用SalI-SmaI双酶切后0.8%琼脂糖凝胶电泳，回收，连接到农杆菌介导的穿梭载体pCambia0390，发明人将该侵染性克隆命名为pCaPVX100（图1），序列如Seq IDNo:31所示。

实施例3：马铃薯X病毒超表达载体的制备

引物11和引物12扩增TMV质粒的CP启动子209bp，引物7(带有ApaI酶切位点)和引物14扩增一条599bp条带，引物13和引物8(带有SmaI酶切位点)扩增864bp的条带，将以上所得到的3个条带回收，混合，用引物7和引物8进行扩增，利用Overlap-PCR将TMV CP启动子插入到PVX CP启动子之间，并在TMV CP启动子前后分别插入一个多克隆位点（依次为AsisI和SacI、BstBI、MluI）。利用TGB基因上游的ApaI和3′-UTR下游的SmaI双酶切后插入到pCaPVX100相应的酶切位点之间，构建成能够同时表达两种外源基因的载体。该表达载体命名为pCaPVX440（图1），序列如Seq ID No:32所示。

实施例4：马铃薯X病毒载体为基础的双分子荧光互补载体的制备

引物15、引物16扩增TMV-CP启动子，209bp，引物18、引物19扩增质粒SPYNE中编码HA-YFP-C基因的片段，282bp；以引物15和引物19融合TMV-CP启动子与HA-YFP-C，491bp，并加入多克隆位点（SacI、BstBI、MluI）。

引物20、引物21扩增PVX-CP启动子，78bp，引物22、引物23扩增质粒SPYNE中编码c-myc-YFP-N基因的片段，498bp；以引物20和引物23融合TMV-CP与c-myc-YFP-N，576bp，并加入多克隆位点（AsiSI、XhoI）。

引物24和引物25扩增RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）3′-端477bp片段，同上述491bp和576bp以引物23和引物24进行Overlap-PCR，通过RdRp下游EcoRI酶切位点和3′-UTR下游的SmaI酶切位点进行酶切连接，构建成以马铃薯X病毒载体为基础的双分子荧光互补载体。该载体命名为pCaPVX770（图1），序列如Seq ID No:33所示。

实施例5：瞬时超表达载体的制备

引物26和引物8扩增pCaPVX4403′-端78bp，通过NheI酶切位点和3′-UTR下游的SmaI酶切位点进行酶切连接，以一个多克隆位点（NheI，NruI XhoI）替代大部分CP基因，构建成以马铃薯X病毒载体为基础的瞬时超表达载体。该表达载体命名为pCaPVX760（图1），序列如Seq ID No:34所示。

实施例6：侵染性克隆和表达载体的接种

将pCaPVX100、pCaPVX440、pCaPVX770和pCaPVX760转化农杆菌GV3101，经菌落PCR验证后，挑单斑接种于含有卡那霉素（50μg/mL）、利福霉素（50μg/mL）、四环素（5μg/mL）的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L2-（N-吗啉）-乙基磺酸（MES）（50μL）和20μmol/L乙酰丁香酮（AS）（1μL）及与上步相同抗生素的LB培养基中，于28℃振荡培养至对数生长期。离心收集菌体并重新悬浮于农杆菌菌体重悬溶液（10mmol/LMgCl₂（100mL），10mmol/L MES（1mL），0.15μmol/L AS（150μL））中，调整浓度使其OD₆₀₀为0.5左右，室温静置3小时。取1mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液待用。选取5到6周龄4-6片真叶的本氏烟植株，先用白枪头将待注射的叶片刺孔。用压力将注射器中的菌液从叶片背面刺孔处注入叶片，每株共注射2片叶片。处理完的植株放置23℃光照培养箱中培养（16小时光照/8小时黑暗交替）。

实施例7：寄主范围及外源蛋白表达检测

观察接种植物症状，用RT-PCR检测系统叶片是否发病。pCaPVX100在本氏烟（Nicotiana benthamiana）、三生烟（N.tabacum cv.Samsun）和心叶烟（N.glutinosa）、普通烟（N.tabacum）、樱桃番茄、番茄毛粉、Micro TOM番茄以及早大白马铃薯上的症状与野生型PVX一致。在接种pCaPVX100后第5天，本氏烟上部叶片表现脉明花叶症状，三生烟、新叶烟和普通烟上部叶片表现轻微花叶症状。在接种pCaPVX100后第10-20天，樱桃番茄、番茄毛粉、Micro TOM番茄以及早大白马铃薯出现花叶症状。采集系统叶片进行RT-PCR检测，结果表明pCaPVX100能系统侵染上述所有植物（图2）。

将GFP基因克隆到pCaPVX440的AsiSI位点，获得载体pCaPVX440-GFP。利用农杆菌浸润法将pCaPVX440-GFP接种本氏烟，接种后第6天表现出明显的脉明及花叶症状，在紫外灯下能观察到上部系统侵染叶片出现明显的绿色荧光，说明外源蛋白在植物体内得到稳定高效表达。

将YFP基因克隆到pCaPVX440的SacI-MluI之间，GFP基因克隆到AsiSI之间，获得载体pCaPVX440-GFP-YFP。利用农杆菌浸润法将pCaPVX440-GFP-YFP接种本氏烟，接种后第6天，在共聚焦显微镜下可从系统叶片下表皮中同时观察到黄色和绿色荧光，说明GFP及YFP同时得到了表达（图3）。

将GFP基因克隆到载体pCaPVX760的NheI-NruI之间，获得重组质粒pCaPVX760-GFP。利用农杆菌浸润法将pCaPVX760-GFP接种到本氏烟上部叶片，接种后第3天在紫外灯下观察，接种叶片上有浓绿色的绿色荧光，说明GFP在叶片上大量表达，而且荧光亮度能持续8-10天（图4）。

实施例8：双分子荧光互补载体的验证

TMV CP自身可以互作。利用引物27和引物28扩增TMV CP基因，通过酶切连接连入pCaPVX770的酶切位点MluI之间，与YFP–C端融合表达，得到pCaPVX770-20，为阴性对照。用引物29和引物30扩增TMV CP基因，通过酶切连接连入载体pCaPVX770-20的AsiSI-XhoI之间，发明人将该载体命名为pCaPVX770-22。

将pCaPVX770-20和pCaPVX770-22分别转化农杆菌后浸润本氏烟叶片。3天后取注射部位叶片的下表皮在激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光的有无。结果发现，用含pCaPVX770-20的农杆菌浸润的叶片细胞内没有黄色荧光（图5右），而用含pCaPVX770-22的农杆菌浸润的本氏烟叶片中，许多细胞中有黄色荧光（图5左）。而用传统的BiFC方法只能在个别细胞内观察到荧光（图5中）。这证明pCaPVX770可以作为双分子荧光互补载体用于活体状态下检验蛋白间的互作。

Claims (7)

1.一种马铃薯X病毒的侵染性克隆构建方法，其序列如Seq ID No:31所示。

2.权利要求1所述的载体，其特征在于可通过以下步骤获得：

(1)在马铃薯X病毒侵染的烟草中提取植物总RNA，以Oligo dT为引物进行反转录，设计引物分三段对马铃薯X病毒基因组进行PCR扩增。利用Overlap-PCR方法分别将35S启动子融合到马铃薯X病毒的5′末端。

(2)用限制性酶切的方法将全长cDNA克隆连接到pCambia0390载体，获得pCaPVX100。

3.如权利要求1所述载体，在其TGB和CP之间插入TMV CP启动子和克隆位点AsiSI，PVX CP启动子和多克隆位点(SacI、BstBI、MluI)，获得了超表达载体pCaPVX440。

4.如权利要求3所述载体，将TGB替换为TMV CP启动子+多克隆位点(SacI、BstBI、MluI)+编码HA及YFP N-端的基因，将CP替换为多克隆位点(AsiSI、XhoI)+编码myc及YFP C-端的基因，获得了双分子荧光互补载体pCaPVX770。

5.如权利要求3所述载体，将其CP替换为多克隆位点(NheI、NruI、XhoI)，获得了瞬时超表达载体pCaPVX760。

6.如权利要求3、4所述载体在表达外源蛋白方面的应用。

7.如权利要求5所述载体在鉴定蛋白互作方面的应用。