CN111471689A - 一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因及其应用 - Google Patents

一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因及其应用，属于遗传育种技术领域。本发明针对感病大豆植株根内胞囊线虫雌虫数目多，且目前常规抗病操作难度大，技术成本高的问题，提供了一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，采用发根农杆菌K599介导的遗传转化方法，将pCSXN1250‑GmRSCN16‑1重组质粒转入感病东农50植株并诱导发根，混合接种大豆胞囊线虫1号、3号和4号生理小种，证实GmRSCN16‑1基因对大豆胞囊线虫病具有明显抗性。本发明可用于选育抗胞囊线虫病大豆品种。

Description

一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因及其应用
技术领域
本发明属于遗传育种技术领域，具体涉及一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因及其应用。
背景技术
在世界范围内，大豆连作现象广泛存在，在大豆连作的种植地区，其土壤内和根内的胞囊数目会随种植年限的增加而增加。在土壤中施用药剂处理种子虽防治效果明显，但其用药量非常大，长期使用，容易使线虫产生抗药性，且对环境污染极大。关于此病害的防治，最为有用的办法是栽种和选育对其不敏感的大豆品种。在选育抗病品种时，常规育种手段耗时，需7年到10年左右，而且要求有较大面积的育种田，耗费大量的人力物力。
发明内容
针对感病大豆植株根内胞囊线虫雌虫数目多，且目前常规抗病操作难度大，技术成本高的问题，本发明提供了一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了含有上述基因的重组载体。
进一步地限定，所述重组载体为含有SEQ ID NO：1所示基因的pGM-T载体或pCSXN1250载体。
本发明还提供了上述的基因在大豆抗胞囊线虫病育种中的应用。
进一步地限定，所述应用是指构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组载体，转化大豆获得转基因植株。
进一步地限定，所述基因通过PCR扩增获得，所用上游引物为GmRSCN16-1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物为GmRSCN16-1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；扩增所用DNA模板为东农L-10cDNA。
进一步地限定，所述构建重组载体所用载体为pCSXN1250。
进一步地限定，所述重组载体通过农杆菌介导转化大豆。
进一步地限定，所述大豆为东农50。
进一步地限定，所述农杆菌为发根农杆菌K599。
有益效果
利用遗传转化实现抗病基因的直接导入可使大豆品种快速获得对胞囊线虫病的抗性。由于具有功能明确的抗大豆胞囊线虫病基因相对较少，因此，利用分子手段筛选及鉴定有效的抗病基因，对抗病品种的选育便显得尤为重要。
本发明采用发根农杆菌K599介导的遗传转化方法，将pCSXN1250-GmRSCN16-1重组质粒转入感病东农50植株并诱导发根，混合接种大豆胞囊线虫1号、3号和4号生理小种，可有效地减少植株根内胞囊线虫雌虫数目，证实GmRSCN16-1基因对大豆胞囊线虫病具有明显抗性，是一个抗胞囊线虫病的基因，具有较好抗胞囊线虫病的特点，该基因能够克服现有技术抗病操作难度大、技术成本高等缺点，对提高选育优良抗胞囊线虫病品种的效率有着重要的意义：利用胞囊线虫抗性基因可有效的缩减育种年限，并且节省人力物力，成本低，实验所用时间短，减少农药的使用量，降低其对环境的危害。
同时，本发明提供的发根农杆菌K599介导的遗传转化方法，说明发根农杆菌介导的遗传转化对于大豆根部性状研究，尤其是根部病害抗性基因的功能研究是快速且行之有效的方法。综上所述，本发明获得的基因GmRSCN16-1对大豆胞囊线虫病有明显抗性，利用该基因能够更加细微的筛选品种抗病性、快速选育出优质抗病品种，提高育种效率，大大改善品种质量，克服了传统育种的选种需耗费大量人力物力、年限长、施药对土地环境有污染等缺点，能够有效改善大豆胞囊线虫病对大豆的影响，此外，通过该基因能够了解更多其同源基因，为大豆抗SCN分子育种提供理论依据。
附图说明
图1东农L-10根部RNA电泳检测。左为M：2000marker，从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，右为东农L-10根部RNA。
图2基因扩增产物电泳结果，其中，M：2000marker，从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，1：目的基因。
图3单酶切结果，其中，M1：2000marker，从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；M2:15000marker，从上到下：15000bp，10000bp，7500bp，5000bp，2500bp，1000bp，250bp；1：pCSXN1250空载体质粒；2：pCSXN1250空载体质粒单酶切；3：Sma I和Xho I双酶切pCSXN 1250-GmRSCN16-1产物。
图4含有pCSXN1250-GmRSCN16-1的重组质粒的发根农杆菌菌液PCR检测结果，其中，M:2000marker，从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-10为10个不同单克隆菌液的PCR产物的电泳检测结果。
图5东农50发根植株阳性根PCR检测结果，M：2000marker，从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；4-23：选取的200株发根植株进行PCR鉴定的结果；1：以ddH2O为阴性对照；2：含有pCSXN1250空载体的东农50发根植株为对照；3：以pCSXN1250-GmRSCN16-1质粒为阳性对照；目的条带长度300bp左右。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、限制性内切酶，连接酶等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，相应的使用或制备方法均参照产品说明书进行。
本发明所述的大豆品种L-10，记载在：胡海波.重组自交系群体对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性与主要农艺性状的相关分析.大豆科学,2012,31(5):000793-795，公众可从东北农业大学获得。
大豆品种东农50，记载在：滕卫丽.大豆抗花叶病遗传,细胞超微结构分析及基因定位.博士学位论文.东北农业大学.2006，公众可从东北农业大学获得。
大豆胞囊线虫1号生理小种采集自黑龙江省农科院大庆分院实验病圃；3号生理小种采集自伊春大豆连作地块；4号生理小种采自黑龙江省安达地区。
以上三个生理小种记载在：董丽民,许艳丽,李春杰,et al.黑龙江省大豆胞囊线虫胞囊密度和生理小种鉴定[J].中国油料作物学报,2008,30(1):108-111.由东北农业大学大豆研究所采集并分离保存，公众可从东北农业大学获得。
pCSXN1250空载体记载在：李梦婷,谭文雍,孙铭阳,et al.具有除草剂抗性的TA克隆植物表达载体的构建[J].基因组学与应用生物学,2016,34(11).东北农业大学大豆研究所保存，公众可从东北农业大学获得。
实施例1.提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因的获得。
本实施例所述提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过如下方法克隆获得。
1)东农L-10根部RNA提取：
取生长10d的东农L-10根部组织提取RNA，Trizol法提取：
(1)向装有样品的1.5ml的离心管中加入少许液氮，快速、充分研磨至粉末状；
(2)向管中加入1mLTrizol提取液，涡旋30s，震荡混匀，室温静止5min；
(3)向管中加入200μL氯仿，用力震荡，涡旋30s，充分转化，室温静止5min；
(4)4℃，12000rpm离心15min；
(5)吸取上清于新的1.5离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静止10min；
(6)4℃，12000rpm离心10min；
(7)弃上清，加1ml75％无水乙醇溶液，清洗沉淀；
(8)4℃，12000rpm离心5min；
(9)弃上清，等待充分干燥，加入20-30μL DEPC水溶解RNA；
(10)取3μL进行2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，剩余RNA于-80℃保存。
并经琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，18S和28S RNA带型清晰，紫外分光光度计检测OD260/OD280比值在1.9～2.0之间，说明RNA完整性好、纯度高。
2)将步骤1)获得的RNA反转录制备cDNA。
根据TIANScript RT Kit的程序进行反转录：
(a)冰上操作，在离心管中加入以下成分：
Figure BDA0001955007490000041
(b)70℃加热5min后迅速于冰上冷却2min。将离心管仍置于冰上，并加入以下成分：
5×First-Strand Buffer 4μL
RNasin 0.5μL
TIANScript M-MLV 1μL
(c)上述反应体系于42℃温浴50min；95℃，5min终止反应，冰上放置，所得cDNA进行下步实验。
3)抗病基因的克隆
以东农L-10的根部cDNA为模板，用设计好的基因特异引物进行PCR的方法克隆目的基因，具体方法：利用上游引物GmRSCN16-1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物GmRSCN16-1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，以上述获得的cDNA为模板，进行PCR扩增，体系如下：
Figure BDA0001955007490000042
反应程序：94℃ 5min；38个循环：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min；72℃ 7min，4℃保存。PCR反应后每个样品中抽取8μL，利用1％琼脂糖凝胶电泳分析结果，PCR扩增产物长度与所预期的产物长度一致(图2)，-20℃保存。
4)使用E.Z.N.A胶回收试剂盒回收PCR产物，获得目的基因片段。
5)PCR产物的连接、转化和阳性克隆的鉴定及测序。
PCR产物经回收纯化后，按照TIANGEN公司的PGM-T克隆试剂盒的步骤，将上述得到的纯化产物与PGM-T克隆载体进行连接，16℃过夜连接。转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，以每个单克隆的菌液为模板，采用与克隆所用相同的引物进行菌液PCR。反应条件与克隆基因相同。每个反应取出8μL进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将PCR阳性克隆菌液，送往博仕生物公司测序。目的基因命名为GmRSCN16-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2.GmRSCN16-1在大豆育种中的应用。
1.构建植物过表达载体pCSXN1250-GmRSCN16-1。
(1)抗性基因全长序列的获得，经PCR扩增及产物回收纯化、连接、转化和阳性克隆的鉴定及测序获得抗性基因GmRSCN16-1，具体方法参照实施例1所述。
(2)质粒DNA的提取
使用E.Z.N.A.质粒小提试剂盒，提取质粒。
(3)pCSXN1250空质粒载体的线性化及线性化质粒的胶回收。
pCSXN1250空载体经XcmΙ酶进行单酶切，37℃1h。将单酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收线性化的质粒载体DNA。该载体是实现TA克隆的表达载体，单酶切产物直接连接目的基因即可获得重组质粒，测序时辨别正反向
(4)植物表达载体与目的片段的连接。
将步骤1)中目的基因的PCR产物纯化，并将该产物与上述纯化后的线性化载体片段通过T4连接酶进行连接，获得重组质粒。所述连接方法、条件参照产品说明书进行。
(5)转化TOP10感受态细胞和阳性克隆的鉴定
重组质粒转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑选重组子的平板(即固体培养基)为含有50mg/L Kan(卡那霉素)的LB固体培养基，37℃培养过夜。挑选在含Kan的培养基上能够正常生长的单菌落，进行菌液PCR，提取阳性菌液的质粒，命名为pCSXN1250-GmRSCN16-1，通过PCR鉴定确定所需要的目的基因已经连接到pCSXN1250载体上，具体方法：利用上游引物GmRSCN16-1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物GmRSCN16-1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，以上述获得的阳性质粒为模板，进行PCR扩增，体系如下：
Figure BDA0001955007490000061
反应程序：94℃ 5min；38个循环：94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min；72℃ 7min，4℃保存。PCR结果如图4。
2.发根农杆菌介导的遗传转化
(1)发根农杆菌的培养
发根农杆菌转化与阳性克隆鉴定：
制备发根农杆菌K599感受态细胞。具体方法：
1)将冰冻的20ml农杆菌K599甘油菌置于室温，过夜。
2)次日早晨制作64000倍农杆菌K599稀释液，吸取5μl 64,000倍稀释菌液涂于LB平板上，在28℃下孵育1-3天。
3)一旦平板上长出单菌落，挑取一个克隆加入到20mlLB液体培养基中28℃过夜悬浮培养。
4)向2500mLLB液体培养基中接种9ml农杆菌菌液，农杆菌培养浓度OD600nm在0.5-1，离心机和离心管要4℃预冷，菌液培养完成后冰浴15-30min。
5)4℃下4000g离心15min。
6)尽量将上清液移除，用500ml预冷的灭菌去离子水重悬菌体，4000g离心15min。
7)尽量将上清液移除，用250ml预冷的灭菌去离子水重悬菌体，4000g离心15min。
8)尽量将上清液移除，用10ml预冷的10％甘油重悬菌体，将重悬的菌体合并到1个50ml的离心管中，4000g离心15min。
9)尽量将上清液移除，用2-3ml预冷的10％甘油重悬菌体，细胞浓度应在1×1010-3×1010细胞/ml，即获得可用于电转化的农杆菌K599感受态细胞。
采用电转化法将重组质粒pCSXN1250-GmRSCN16-1转化发根农杆菌感受态细胞。使用含有pCSXN1250-GmRSCN16-1的重组质粒的发根农杆菌菌液为模板和和实例2(5)中提及的方法进行PCR，经电泳鉴定，为发根农杆菌K599阳性菌。
(2)发根农杆菌的侵染
取播种后3d的东农50用于侵染，此时种子刚刚萌发，子叶仍然显露出黄色。用1ml的注射器吸取用无菌去离子水重悬的发根农杆菌K599阳性菌，在子叶节处注射。用针头小心刺穿，不要将子叶碰掉，用注射器推出几滴菌液，并用沾有菌液的针头在伤口处来回几次，使菌液在伤口处分布均匀。用无菌滤纸吸干多余的菌液，将侵染后的植株置于培养箱中培养，光照模式为day/night＝16h/8h，温度模式为day/night＝28℃/25℃；湿度为75％。
(3)不定根的诱导及移栽
侵染后约7天左右，将子叶节处有根状物突起的植株从蛭石中取出，在蒸馏水中沿突起下部约1cm处剪断，将地上部分插入装有无菌水中继续培养，诱导生根。
转基因阳性根的鉴定：
将选取的50株发根植株，设置以pCSXN1250-GmRSCN16-1质粒为阳性对照，以ddH2O为阴性对照，pCSXN1250空载体的东农50发根植株为空白对照，由于该目的基因存在内含子，可以以目的基因克隆时所用引物为检测引物，进行PCR鉴定(图5)，结果获得20株含有目的基因的发根植株。
(4)采用国际上常用的品红染色法进行候选基因功能鉴定
将20株带有转基因阳性根的植株及作为对照的20株含有pCSXN1250空载体的植株移栽入含有大豆胞囊线虫1号、3号和4号生理小种混合的砂土混合物中，15d后取根洗净，经漂白、染色后在20×光学显微镜下观察计数，每株取10个根进行计数，计算出每株雌虫的平均数(表1)，并进行成对t检验(表2)。
表1植株根部雌虫平均数
Figure BDA0001955007490000071
表2成对t检验结果
Figure BDA0001955007490000072
Figure BDA0001955007490000081
通过表1可知，转基因阳性根雌虫数目平均值为2.97个/cm，阴性对照根部雌虫数目平均值为8.77个/cm。根据表2成对样本t检验的结果，在P＝0.05和0.01水平上双尾t值分别为2.09和2.86，双尾P值(Sig)为6.86×10-18，因此可得出在雌虫指数上，转基因阳性根部与阴性对照根部存在着极显著差异，并可证实GmRSCN16-1基因对大豆胞囊线虫病有明显抗性，有效地减少植株根内胞囊线虫雌虫数目。
核苷酸序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 351
<212> DNA
<213> GmRSCN16-1 基因
<400> 1
atggctgcta agattctcgc aaacttgatt gtgatgggtg gaggaatctt ggcaagagca 60
gttgttcagg catatcgtca agcgcttact aatgcctcaa aaaatggtgt tgcacaagag 120
acaattcaaa atactatccg cagagctagc aaggtgatga cggagcaaga ggctcgacgg 180
attcttggtg ttacagagga aactccctgg gaggagatta tcaagaaata tgacaattta 240
tttgagaata atgctaagaa tgggagtttc tacctccagt ccaaagttca tcgggccaag 300
gaatgtctag aggcagttca acaaggcaag agtcagggta cccctagttg a 351
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 上游引物GmRSCN16-1-F
<400> 2
atggctgcta agattctcgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 下游引物GmRSCN16-1-R
<400> 3
tcaactaggg gtaccctgac tc 22

Claims (10)

1.一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.含有权利要求1所述基因的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为含有权利要求1所述基因的pGM-T载体或pCSXN1250载体。
4.权利要求1所述的基因在大豆抗胞囊线虫病育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，构建含有SEQ ID NO：1所示基因的重组载体，转化大豆获得转基因植株。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因通过PCR扩增获得，所用上游引物为GmRSCN16-1-F，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物为GmRSCN16-1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；扩增所用DNA模板为东农L-10cDNA。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述构建重组载体所用载体为pCSXN1250。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组载体通过农杆菌介导转化大豆。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述大豆为东农50。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述农杆菌为发根农杆菌K599。
CN201910063788.3A 2019-01-23 2019-01-23 一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因及其应用 Active CN111471689B (zh)

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