CN116286881B - 一种甘蔗梢腐病效应因子FsSCR1基因及其应用 - Google Patents

一种甘蔗梢腐病效应因子FsSCR1基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种甘蔗梢腐病效应因子FsSCR1基因及其应用，属于分子抗病技术领域。本发明通过提供甘蔗梢腐病效应因子FsSCR1基因和甘蔗抗病基因ScRSCR1，能够克服现有技术中缺少甘蔗梢腐病防治手段的问题，本发明为解析效应因子与植物免疫系统互作提供了基础，为甘蔗抗病分子育种提供了重要的基因资源。

Description

一种甘蔗梢腐病效应因子FsSCR1基因及其应用
技术领域
本发明涉及分子抗病技术领域，尤其涉及一种甘蔗梢腐病效应因子FsSCR1基因及其应用。
背景技术
甘蔗，(学名：Saccharum officinarum)，甘蔗属，多年生高大实心草本。根状茎粗壮发达，多地区广泛种植，适合栽种于土壤肥沃、阳光充足、冬夏温差大的地方。甘蔗是温带和热带农作物，是制造蔗糖的原料，且可提炼乙醇作为能源替代品。甘蔗中含有丰富的糖分、水分，还含有对人体新陈代谢非常有益的各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质。
甘蔗在整个生长过程中受真菌性、病毒性和细菌性病害等影响，其中真菌性病害以黑穗病和梢腐病最为严重。甘蔗梢腐病(Sugarcane pokkah boeng disease，PBD)是一类重要的真菌性病害，最早出现于 1896年，目前在世界各地均有发生。近年来，随着化肥的过度施用、感病品种的种植以及气候变化等因素的影响，国内甘蔗梢腐病的发生日益严重，有些感病品种的发病率高达80％以上，且呈现全年和全生育期发病的现象，给甘蔗生产造成巨大损失。近年甘蔗梢腐病研究多聚焦在梢腐病病原菌的分离鉴定，而在甘蔗育种、栽培措施和化学防治上尚无重大突破，导致甘蔗梢腐病缺乏高效绿色的防治手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘蔗梢腐病效应因子FsSCR1基因及其应用，以解决现有技术中缺少甘蔗梢腐病防治手段的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种甘蔗梢腐病致病相关基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了上述甘蔗梢腐病致病相关基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述甘蔗梢腐病致病相关基因的应用，通过沉默或敲除甘蔗梢腐病致病相关基因来降低甘蔗梢腐病病原菌的致病性。
优选的，所述沉默甘蔗梢腐病致病相关基因的方法包括以下步骤：
将甘蔗梢腐病致病相关基因克隆至PVX载体中，得到重组载体；
将所得重组载体转化至甘蔗梢腐病病原菌中，实现基因沉默。
本发明还提供了一种沉默上述甘蔗梢腐病致病相关基因的重组载体，所述重组载体包括初始表达载体和所述甘蔗梢腐病致病相关基因。
优选的，所述初始表达载体为PVX载体。
本发明还提供了一种甘蔗抗病基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述甘蔗抗病基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种检测上述甘蔗抗病基因的扩增引物，所述引物的上游5’端到3’端的序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物5’端到3’端的序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供上述甘蔗抗病基因或上述扩增引物在作物病害研究中的应用，用于作物的抗甘蔗梢腐病辅助育种。
本发明的技术效果和优点：
本发明提供了甘蔗梢腐病效应因子FsSCR1基因和甘蔗抗病基因ScRSCR1，为解析效应因子与植物免疫系统互作提供了基础，为甘蔗抗病分子育种提供了重要的基因资源。
附图说明
图1为瞬时表达叶片情况；
图2为叶片坏死面积；
图3为活性氧积累情况；
图4为基因敲除突变体构建示意图；
图5为突变体鉴定结果；
图6为致病力对比结果；
图7为酵母双杂交验证互作结果；
图8为双分子荧光互补验证互作结果。
具体实施方式
甘蔗梢腐病致病相关基因信息：
核苷酸序列：
ATGCACTTCTCCTTCATCGTCCCAGTACTCCTCTCCTCGTCGGCCCTTGGGCTCGCTGTACCCCAGGCCGAGGATTCGAATCTCATGAAACGCTTCGACGTACCAGGAGCCTCTTTGGAGGAGGGCTTCACTATCCCTGAGGATACTCCAAACGGATTCTACCGTGTTCATATCGACGACGATGGGGTTGCCCATCATACCAAGGTTGACATGAACCTTGAGCCGACAGACGAAGGCGATGGCACTTCGTCGGCCTTGGACAAGCGCCAGAGCTGGCGAGTCACCTGTGAGGGCTCCTCACTCAACCGCAATGACGCCGATCTCACAGTCAAGCTGTTGAGGGACGGGTGCGGGAGCGGCCACACTGTGCAGCCACGCGATCACTACTACGTTATCTCGGGTAGGGTGGCCAGTTACTTTTGCAACAACACCTCCGGAAGAACCACTTGCAGCGCAACCATTGTTCGCCAGCAGATCCAGGAAAGCGTGAGCAGCCGATGCGGCACTTTCAAGGCAGGCTGGGCACGGTGGGACAATTCCAATGGCCATGTTAGCGTGGGATATCAGAACGTAAACAGTCAAAACTCTTTCTGCGGCCGGAATCACTGA，如SEQ ID NO.1所示。
氨基酸序列：
MHFSFIVPVLLSSSALGLAVPQAEDSNLMKRFDVPGASLEEGFTIPEDTPNGFYRVHIDDDGVAHHTKVDMNLEPTDEGDGTSSALDKRQSWRVTCEGSSLNRNDADLTVKLLRDGCGSGHTVQPRDHYYVISGRVASYFCNNTSGRTTCSATIVRQQIQESVSSRCGTFKAGWARWDNSNGHVSVGYQNVNSQNSFCGRNH，如SEQ ID NO.2所示。
甘蔗抗病基因信息
核苷酸序列：
ATGGGCAAGTTGAAGATCACGGTGAACCTGGAGTGCGACCGCTGCAGCACCAAGATCCAGAAGGTCCTGTGCTGCATCCAAGAGAAATGCGAGTTCGTGATCGAGAAGGTGGAGTACGAGAAGGACAAGGTGACCGTTTCCGGGCCCTTCGACGCCAACAAGCTCAGCTGCTGCCTCTGGGCCAAGGCCGGTAGGATCATCAAGAACATCGAGATCGTCAAAGAAAAGGAGCCCGAGCCCAAGCCCAAGCCCAAGCCCAAGTGCAAGCTGGTATACTCGTGCCCTTATTACCCGCCGTGCCCACAGCTCGGCCCCTGCGCGGGGCCGTGCAGCTGCCCCACGCCGCCCTGCCCGCCGCCCATGCCACCGGCCTGCTCGGCTATGCCGTACCCGATGCTTGTCTGCGACTGCGAGGACAACCCGCCGTGCCCACAGCTCGGCCCCTGCGCGTGGCCGTGCAGCTGCCCCACGCAGTCCAAGCCACCGCCACCGAAACCACCGGCGTGCCAGTGCCCGGCGTGGTCGTCGTCGTGTTACTGCGGCGGCTGCCAGCCGTGCATGCCTGCGCCCAGCCCGCCCGAGCCCCCGCACTACTGCGGCGGCGGCAGCGGCTGCCAGTACCCGCCGTGCCCACAGCTCGGCCCCTGCGCGGGGCCGTGCAGCTGCCCCACGCCGCCCTGCCCGCCGCCCAAGCCACCGGCCTGCTCGGCTATGCCGTACCCGATGCTTGTCTGCGAGGACAACCCGCCGACCTGCGCCATCATGTAG，如SEQ ID NO.3所示。
氨基酸序列：
MGKLKITVNLECDRCSTKIQKVLCCIQEKCEFVIEKVEYEKDKVTVSGPFDANKLSCCLWAKAGRIIKNIEIVKEKEPEPKPKPKPKCKLVYSCPYYPPCPQLGPCAGPCSCPTPPCPPPMPPACSAMPYPMLVCDCEDNPPCPQLGPCAWPCSCPTQSKPPPPKPPACQCPAWSSSCYCGGCQPCMPAPSPPEPPHYCGGGSGCQYPPCPQLGPCAGPCSCPTPPCPPPKPPACSAMPYPMLVCEDNPPTCAIM，如SEQ ID NO.4所示。
载体：PVX载体，用于烟草叶片的瞬时表达(含有ClaI-NotI酶切位点，用于构建载体)；
pYBA1132载体用于亚细胞定位实验(含有BamHI-EcoRI酶切位点，用于构建载体)；
pGADT7载体用于酵母双杂交实验(含有BamHI-EcoRI酶切位点，用于构建载体)
pGBKT7载体用于酵母双杂交实验(含有EcoRI-SalI酶切位点，用于构建载体)；
pVYNE-nYFP和pVYCE-nYFP载体用于双分子因荧光互补实验(用Gateway的方法构建)。
菌株：甘蔗镰孢菌Fusarium sacchari(曾在如下文章中公开：(1)黄振,李慧雪,周宇明,暴怡雪,张木清,姚伟.甘蔗梢腐病病原菌Fusarium sacchari Nep1-like蛋白的筛选鉴定及功能分析[J].植物病理学报,2022,52(02):156-164.DOI:10.13926/j.cnki.apps.000489.(2)Huang,Z.；Li,H.；Zhou,Y.；Bao,Y.；Duan,Z.；Wang,C.；Powell,C.A.；Chen,B.；Zhang,M.；Yao,W.Predication of the Effector Proteins Secreted byFusarium sacchari Using Genomic Analysis and Heterogenous Expression.J.Fungi2022,8,59.https://doi.org/10.3390/jof8010059)；
大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、酵母菌株Y2H-GOLD，购自上海唯地生物技术有限公司。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1甘蔗梢腐病致病相关基因抑制BAX诱导的PCD的功能分析
将甘蔗梢腐病致病相关基因记作FsSCR1，在烟草叶片上瞬时表达PVX-GFP、PVX-GFP+PVX-BAX、PVX-FsSCR1Δsp、PVX-FsSCR1Δsp+PVX-BAX、PVX-BAX，方法如下：
1.1通过PCR扩增FsSCR1基因
利用高保真酶2×Phanta Master Mix按照以下体系进行PCR扩增，如表1所示：
表1 FsSCR1基因PCR扩增体系
2×Phanta Master Mix 25μL
Forward Primer(10μM) 1μL
Reverse Primer(10μM) 1μL
cDNA 1-5μL
ddH2O up to 50μL
PCR反应程序为：预变性95℃30s；变性95℃15s，退火60℃15s，延伸72℃30s/kb，32cycles；彻底延伸72℃，5min。
7.2目的基因纯化回收
使用1％的琼脂糖凝胶将PCR产物进行分离(130V，25min)，在紫外分析仪UVG20(上海领成)下快速切下目的片段，利用DNA纯化回收试剂盒(北京天根)回收目的片段，具体操作参考试剂盒说明书。最后以预热的ddH2O洗脱回收DNA片段，微量分光光度计测定浓度和相对吸光度(260/280)。
7.3连接克隆载体
克隆载体选用北京全式金公司的Zero Cloning Vector(TransGen)。将纯化回收的平末端DNA片段进行浓缩，按照以下体系直接与克隆载体连接，如表2所示：
表2 FsSCR1基因PCR扩增体系
载体与片段摩尔比接近1：7，轻轻混合，PCR仪控温37℃反应5-30min(根据片段长度决定)，冰上冷却备用。连接产物转至感受态细胞Top10或者Trans1-T1，挑取单菌落进行菌液PCR验证。
1.3感受态细胞的转化方法
农杆菌冻融法转化：取-80℃冻存的GV3101农杆菌感受态于冰上融化(5min)。每100μL感受态加入200ng左右的质粒DNA(实验中将100ul感受态分两次使用，每次50ul)，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。加入700μL无抗生素的LB液体培养基，28℃220rpm振荡培养2-3h。取100μL左右菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素(Kan)，20μg/mL利福平(Rif)，40μg/mL庆大霉素(Gen)的LB平板上，倒置放于28℃培养箱暗培养2-3d。
利用表3中的引物进行PCR扩增，以F.sacchari侵染中蔗1号叶片的RNA反转录产物为模板，扩增后构建至T载体，测序验证。PVX载体含有ClaⅠ-SmaⅠ-NotⅠ-SalⅠ酶切位点，选取ClaⅠ和NotⅠ酶切位点，保留了HA标签，运用In-fusion的方法进行载体构建。Bax基因由上海生工合成。根据软件预测信号肽区段，扩增FsSCR1基因去掉信号肽的区域，构建至PVX载体。
表3所用引物
本实验中所有构建的重组PVX载体均通过冻融法转化至农杆菌GV3101中。使用扩增OFR框的引物，对转化子进行阳性转化子鉴定。阳性重组农杆菌用液体LB培养基(50mg·mL-1Kan，20mg·mL-1Rif，50mg·mL-1Gen)摇菌，28℃，220rpm震荡培养24h。4000rpm，5min收集菌体，用10ml 10mM MgCl2洗涤菌液，重复三次，并调节OD600＝0.8，28℃黑暗条件下静置2h。选取4周龄大小的烟草叶片，用去掉针头的注射器在叶片背面进行渗透注射，以接种空载体和PVX-GFP的位点作为阴性对照，接种PVX-BAX的位点作为阳性对照。每个处理重复3次，接种后的植物置于温室培养，每天观察记录症状变化，7d后拍照记录。
结果如图1所示，由图1可知，FsSCR1Δsp可以抑制BAX诱导的细胞坏死；
将侵染后的叶片用无水乙醇脱色。通过ImageJ进行将坏死面积比例可视化，以侵染烟草叶片时标记的圆圈为总面积，用ImageJ计算坏死面积。通过计算两个数值的比例，判断坏死面积比例，结果如图2所示。根据结果可知，GFP+BAX和BAX位点坏死面积比例较高，但是FsSCR1nsp+BAX位点的坏死比例较低，说明FsSCR1缺失信号肽后依然可以抑制BAX诱导的细胞坏死。
3,3-二氨基联苯按(Diaminobenzidine，DAB)辣根过氧化物酶的显色底物，利用DAB染色可能检测烟草叶片中H2O2的产生。染色液配置：1mg/ml DAB。50mg DAB用ddH2O(用HCl调ddH2O至PH＝3.0)溶解，搅拌至DAB完全溶解后加入25μl Tween20，500μl Na2HPO4(终浓度10mM)，定容至50ml，取侵染2d的烟草叶片加入1mg/ml DAB染色液避光过夜染色。无水乙醇脱色后拍照记录，结果如图3所示。通过活性氧染色实验，发现单独注射GFP的位点无明显活性氧积累，GFP+BAX和BAX位点活性氧积累明显，与之相比，FsSCR1Δsp+BAX位点没有明显的活性氧积累，所以，FsSCR1Δsp可以抑制BAX诱导的活性氧积累。
实施例2甘蔗梢腐病致病相关基因构建突变体
通过PEG介导真菌遗传转化，得到了FsSCR1的基因敲除突变体，构建方法如图4所示，具体方法如下：
2.1甘蔗镰孢菌F.sacchari基因组DNA提取
采用十二烷基硫酸钠(SDS)法提取丝状真菌的基因组DNA。挑取菌丝于10mL含有氨苄青霉素的PDW液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养2-3d。
(1)以6层无菌纱布过滤菌液,10mL无菌水洗涤三次，除去杂质和培养基，之后用镊子挑取菌丝于无菌滤纸上吸干水分；准备2mL离心管放入8颗研磨钢珠，每管放入菌丝0.4g，迅速将装有样品的离心管和研磨仪转子于液氮中预冷。按照冷冻研磨仪(JXFSTPRP-24，上海净信实业发展有限公司)操作手册，研磨菌丝样品，选择参数为60Hz，90s，研磨2-3次。
(2)加入800μL SDS DNA Extraction buffer(1M Tris-HCl 10mL，0.5M EDTA-Na20.8mL，20％SDS 10mL，5M NaCl 4mL，ddH2O定容至100mL)，充分混匀。
(3)加入800μL DNA提取液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1，PH>7.8，Soribol)，充分混匀后4℃12000rpm离心10min。
(4)吸取上清到新的离心管中，加入等体积25：24：1，充分混匀，4℃12000rpm离心10min；注意上清液吸取适量，避免吸入更多杂质。
(5)吸取上清至新的离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀，4℃12000rpm离心10min。
(6)吸取上清至新的1.5mL离心管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，混匀，直至出现明显絮状沉淀，室温静置10min，4℃12000rpm离心10min。
(7)弃去上清，加入200μL体积分数75％的乙醇去除盐离子，4℃12000rpm离心2min，弃去上清后，重复一次此步骤。
(9)弃去上清，瞬时离心，吸弃残液。
(10)离心管置于超净台中干燥，待沉淀半透明时加入100μL无菌ddH2O，加入2μL5mg/mL RNase，于37℃下保温30min。
(11)最后以微量分光光度计测定DNA浓度以及在260nm和280nm处的相对吸光度(A260/A280)，DNA质量通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.2 FsSCR1基因敲除同源片段构建
利用融合PCR技术(Fusion PCR)构建同源重组DNA片段，以具有反向互补末端的引物，扩增形成具有末端反向互补区域的PCR产物，利用DNA片段末端的反向互补序列自身退火并结合，从而实现不需要酶切酶连即可将不同来源的任意DNA片段连接起来。将基因上游及基因下游片段的末端设计为反向互补末端，即可通过融合PCR简单高效地构建基因敲除载体。主要包括三轮PCR反应，以下为PCR融合具体过程：
(1)第一轮PCR反应：FsSCR1基因上下游片段、潮霉素基因Hyg片段的独立扩增。通过全基因组DNA序列查找FsSCR1基因上、下游各2000bp序列，分别设计上下游同源臂引物FsSCR1 AF/AR和FsSCR1 BF/BR，其中FsSCR1AR、FsSCR1BF分别在5'端添加接头序列。以提取的野生型甘蔗镰孢菌F.sacchari基因组DNA为模板，通过PCR分别扩增FsSCR1基因上、下游同源片段，实验室之前已经构建Hyg基因的克隆载体，以Hyg-F/Hyg-R引物特异性扩增获得Hyg片段，待扩增程序结束之后，用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将长度符合且条带单一的产物片段切胶回收。
反应体系如下表4所示：
表4第一轮PCR反应体系
2×Phanta Master Mix 25μL
Forward Primer(10μM)) 1μL
Reverse Primer(10μM) 1μL
质粒(稀释至100ng/μL) 1μL
ddH2O upto50μL
PCR反应程序为：预变性95℃30s；变性95℃15s；退火60℃15s；延伸72℃30s/kb，32cycles；彻底延伸72℃，10min。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认条带大小后切胶纯化回收目的片段。
(2)第二轮PCR反应。将上游片段、Hyg基因与下游片段按摩尔比1︰2︰1的比例混合(总DNA量不少于800ng)，不添加引物，通过15个循环复性延伸片段重叠部分完成第二轮PCR反应，获得融合片段，反应体系如下表5所示：
表5第二轮PCR反应体系
2×Phanta Master Mix 12.5μL
上游片段 3μL
Hyg基因 5μL
下游片段 3μL
ddH2O up to 25μL
PCR反应程序为：预变性95℃3min；变性95℃15s，退火60℃15s，延伸72℃6min，15cycles；彻底延伸72℃，7min。
(3)第三轮PCR反应：将上一轮PCR反应的产物，添加FsSCR1AF和FsSCR1BR引物，通过35个循环扩增融合片段，反应体系如下表6所示：
表6第三轮PCR反应体系
2×Phanta Master Mix 12.5μL
FsSCR1AF(10μM) 2μL
FsSCR1BR(10μM) 2μL
第二轮PCR产物 25μL
ddH2O up to 50μL
PCR反应程序为：预变性95℃3min；变性95℃15s，退火60℃15s，延伸72℃6min，35cycles；彻底延伸72℃，10min。融合PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认条带大小后纯化回收目的片段。
2.3PEG介导的甘蔗镰孢菌原生质体转化
通过PEG介导的原生质体转化法将融合片段转化F.sacchari原生质体，并利用潮霉素抗性筛选转化株。步骤(1)至步骤(5)为原生质体制备过程，步骤(6)至步骤(10)为原生质体的转化过程。
(1)配制酶解液。称取0.5g溶壁酶和0.1g崩溃酶，溶解于10mL稳渗剂中，使溶壁酶和崩溃酶的最终浓度分别为0.05g/mL和0.01g/mL。室温180rpm，震荡30min。随后2000rpm离心10min，吸上清，过滤除菌，现配现用。
(2)挑取平皿上的F.sacchari菌丝至10mL PDW培养基，摇菌培养至出现浑浊。将培养液转接至100mL新培养基中，再次摇菌培养至出现浑浊。用4层无菌纱布过滤，再以稳渗剂洗涤去除孢子，用灭菌的滤纸吸干菌丝中的水分，将菌丝(0.5g左右)放入酶解液中，28℃，80rpm，酶解3h。
(3)将酶解液用4层滤纸过滤，去除残余菌丝，用稳渗剂冲洗擦镜纸2次及管壁，将黏附的原生质体洗下。4℃，4000rpm离心10min。
(4)弃上清，加入10mL稳渗剂洗涤沉淀。4℃，4000rpm离心10min。
(5)弃上清，加入500μL STC buffer，重悬沉淀，镜检原生质体裂解情况，用STCbuffer重悬原生质体至5×107个/mL。(原生质体最好立即使用，或者在冰上可以存放一段时间，本实验中均在一小时内进行转化实验。)
(6)在1.5mL离心管中加入200μL原生质体，10μg含有潮霉素抗性基因的同源重组片段，吹打混匀，冰上静置20min。
(7)在离心管中缓慢滴加1mL PTC，轻轻吹打混匀，冰上静置20min。
(8)将1.5mL离心管中的液体转移至50mL离心管中，再加入5mL TB3培养基和氨苄抗生素，28℃，100rpm，过夜培养。
(9)在离心管中倒入25mL冷却快凝固的PDA培养基，加入适量提前配制的潮霉素B和氨苄青霉素溶液，使抗生素最终浓度达到100μg/mL，混匀，倒板。
(10)3d后，将长出来的单菌落转移至含有100μg/mL潮霉素B和氨苄青霉素的PDA平板，进行二次筛选。
2.4甘蔗镰孢菌转化子鉴定
将二次筛选后的转化子菌丝，于10mL含有潮霉素B和氨苄青霉素的PDW液体培养基中，28℃，220rpm摇床培养3d。收集菌丝并提取基因组DNA，进行PCR扩增鉴定。抗性转化菌株经PCR鉴定后，通过单孢分离或原生质体再生方法进行纯化。在FsSCR1基因的左臂上选择1000bp处设计引物，记为F1，在右臂1000bp处设计引物，记为R2；通过在Hyg基因内部取两处，即距离5'端处和距离3'端处，设计潮霉素抗性基因内部引物R1和F2。分别以F1+R1为引物对，进行扩增，以F2+R2为引物对，进行鉴定。若以转化子基因组DNA为模板扩增时可分别检测到对应的上游片段和下游片段，且条带单一，野生型基因组DNA为模板扩增时未检测到条带，则可以确定Hyg成功替换了FsSCR1基因，获得正确的敲除转化子，验证突变体和野生型菌株。根据潮霉素基因与FsSCR1基因内部酶切位点不同，选择MluI内切酶进行酶切PCR产物进行验证突变体，用潮霉素引物对突变体和野生型菌株进行检测，发现在突变体中可以扩增到目的条带，但是在野生型中没有条带，同样用F1/R1和F2/R2引物对验证，结果是一致的。在此基础上，回收AF/BR引物对扩增的PCR产物，用MluI内切酶进行酶切验证发现在突变体中可以切割得到两条条带，但是在野生型中只有一条带，说明突变体中潮霉素基因已经替换了目的基因，结果如图5所示。
2.5突变体菌株与野生型致病力分析
离体甘蔗叶片接种：在9cm玻璃培养皿中放置由无菌水湿润的滤纸，收集+1到+3叶的干净叶片，将叶片剪成6cm长的叶段置于培养皿上，用1ml注射器的针头在叶片两侧划出1cm的伤口；在PDA平板上生长7d的菌株，用6mm打孔器在平板中沿圆周打孔，分别打出6mm大小一致菌饼，接种在中蔗1号叶片的伤口处，28℃黑暗条件下保湿3d后，观察叶片病斑形成情况并拍照。接种实验重复3次，每次接种10叶片。利用Image J软件(Image J Software,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,USA)统计面积。结果如图6所示，由图6可知，野生型和突变体相比，突变体致病力明显减弱。
实施例3通过酵母双杂交验证FsSCR1Δsp与ScRSCR1互作
酵母双杂交：用含有pGBKT7-FsSCR1Δsp诱饵质粒的GOLD酵母菌株作为受体菌制备感受态， 将甘蔗文库质粒转入其中，涂布于含10mmol/L3-AT的SD-TLH、SD-TLHA筛选平板。
其中文库DNA转化方法如下：从SD-L平板挑取单菌种接于液体SD-L培养基50mL，30℃，225r/min，振荡培养24h。转接于YPDA液体500ml，使初始OD600为0.2，30℃，225r/min，振荡培养4-5h，至OD600达到0.6。离心收菌，室温，4000r/min，5min。用30mL无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000r/min，5min，弃上清。用20 mL 0.1mol/L LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000r/min，5min，弃上清。用10mL 0.1mol/LLiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000r/min，5min，弃上清。向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1min左右，至完全混匀。30℃水浴孵育，30min。42℃水浴热激，25min。30℃水浴复苏1h。离心收菌，室温，4000r/min，5min，弃上清，用6mL无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20μL培养物稀释后涂SD-TL平板，用于检测文库转化效率。其余涂布于含有10mmol/L 3-AT的三缺培养基SD-TLH平板上进行酵母双杂筛选，并把生长健康的单菌落点板至含10mmol/L3-AT的四缺培养基SD-TLHA上进行初次筛选，30℃恒温培养3-7d，观察菌落生长情况。将初筛平板上挑取直径大于1.5mm的单菌落再次转接至含有10mmol/L3-AT的四缺培养基SD-TLHA缺陷平板进行二次筛选。
利用酵母双杂交技术，对FsSCR1nsp和ScRSCR1进行一对一的功能验证。以53-pGBKT7+T-pGADT7为阳性对照，以pGBKT7+ScRSCR1或者pGADT7+FsSCR1nsp为阴性对照，结果如图7所示。结果显示，53-pGBKT7+T-pGADT7在SD/-Trp-Leu/X-α-gal(二缺)和SD/Ade-His-Trp-Leu/X-α-gal(四缺)均能正常生长且变蓝色，FsSCR1nsp-pGBKT7+ScRSCR1-pGADT7与阳性对照类似，可以在二缺和四缺的培养基上生长且变蓝色，说明FsSCR1nsp和ScRSCR1发生互作。分别将ScRSCR1的重金属结合区域(HMA)，蛋白-蛋白互作区域构建至pGADT7载体，进行重要功能区域鉴定。发现ScRSCR1-HMA-pGADT7+FsSCR1nsp可以在二缺和四缺培养基上生长且变蓝色，但是ScRSCR1-P1和ScRSCR1-P2与FsSCR1nsp之间没有相互作用。说明重金属结合区域是重要的互作功能区域。
实施例4通过双分子荧光互补试验验证两个蛋白互作
双分子荧光互补实验：将FsSCR1和ScRSCR1(以甘蔗抗病品种ROC22的cDNA作为扩增模板，扩增引物为表3中的ScRSCR1-F和ScRSCR1-R)分别构建到pVYNE-nYFP和pVYCE-nYFP载体，并转化至农杆菌GV3101，以水稻D3和BZR1为阳性对照，以NYFP+FsSCR1nsp和CYFP+ScRSCR1为阴性对照。选取适龄叶期的本氏烟植株，进行农杆菌介导的烟草叶片瞬时转化，注射72h后，通过荧光观察，确定FsSCR1和ScRSCR1的体内互作以及融合蛋白的亚细胞定位，具体方法为：撕取烟草叶片下表皮，将下表皮固定在载玻片上，盖上盖玻片，并用胶带固定，导致在激光共聚焦显微镜上。在共聚焦激光扫描显微镜下选择使用488nm氩激光线和505～530nm带通发射滤波器激发。在这种观察方式下，阳性对照呈强黄色荧光，阴性对照呈黑色，结果如图8所示。由图8可知，共侵染FsSCR1Δsp和ScRSCR1的烟草叶片检测到荧光，与阳性对照类似，阴性对照则没有。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种甘蔗梢腐病致病相关基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的甘蔗梢腐病致病相关基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的甘蔗梢腐病致病相关基因的应用，其特征在于，通过沉默或敲除权利要求1所述的甘蔗梢腐病致病相关基因来降低甘蔗梢腐病病原菌的致病性；
所述甘蔗梢腐病病原菌为甘蔗镰孢菌。
4.一种包含甘蔗梢腐病致病相关基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括初始表达载体和权利要求1所述甘蔗梢腐病致病相关基因；
所述初始表达载体为PVX载体。
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