CN106699857A

CN106699857A - 植物抗病毒新靶标PsbO1的筛选与应用

Info

Publication number: CN106699857A
Application number: CN201710104953.6A
Authority: CN
Inventors: 李向东; 耿超; 李亦晴; 田延平
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2017-02-25
Filing date: 2017-02-25
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，提供了一种植物抗病毒的新靶标。以烟草脉带花叶病毒侵染性克隆为基础，通过免疫沉淀和质谱法筛选到光系统Ⅱ放氧复合体蛋白PsbO1，利用反转录PCR扩增获得PbsO1基因。经免疫共沉淀和双分子荧光互补证明，PsbO1可与烟草脉带花叶病毒6K2互作。降低PsbO1基因的表达可使感病植物产生对烟草脉带花叶病毒和马铃薯Y病毒的抗性。

Description

植物抗病毒新靶标PsbO1的筛选与应用

技术领域

本发明涉及植物抗病毒基因工程领域，具体地，本发明涉及抗烟草脉带花叶病毒和马铃薯Y病毒新靶标PsbO1的筛选及其在抗病毒侵染中的应用。

背景技术

病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。种植抗病品种是防治作物病毒病最经济有效的方法。

近年的研究发现，植物也有“阿克琉斯的脚踝”。有些植物蛋白在病毒侵染中起关键作用，如果将编码这些蛋白的基因敲除，植物就会获得对病毒的抗性。

马铃薯Y病毒属(Potyvirus)是植物病毒中最大的属，约占已知植物病毒种类的30％，寄主范围广泛，危害严重。马铃薯Y病毒属病毒与其他属多种病毒间存在协生作用，一旦复合侵染会引起更为严重的症状，造成更大损失。该属许多病毒的VPg可以和植物的真核生物翻译起始因子eIF4E互作；如果eIF4E发生突变或者编码基因被敲除，植株就可以产生对马铃薯Y病毒属病毒的抗性。

烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)都属于马铃薯Y病毒属，主要侵染马铃薯、烟草、番茄和辣椒等茄科作物。本发明通过免疫沉淀和质谱技术，获得了1个能与烟草脉带花叶病毒6K2互作的光系统Ⅱ放氧复合体蛋白PsbO1；降低PsbO1基因的表达可使植物产生对TVBMV和PVY的抗性。因此，PsbO1是一种新的抗病毒靶标。

发明内容

本发明提供了一种植物抗马铃薯Y病毒属病毒的新靶标。首先，利用免疫沉淀技术和质谱技术鉴定到可能与TVBMV蛋白互作的寄主蛋白PsbO1；然后通过免疫共沉淀和双分子荧光互补试验证明PsbO1和TVBMV 6K2互作；最后，利用病毒诱导的基因沉默技术将PsbO1基因沉默后，植株能抵抗TVBMV和PVY的侵染。

本发明实施的具体技术方案是：

A.与TVBMV蛋白潜在互作寄主蛋白的筛选。TVBMV的侵染性克隆中连入6K1GFP基因。通过农杆菌浸润法将该克隆接种到寄主植物本氏烟，7天后提取植物总蛋白。利用GFP抗体偶联的琼脂糖珠进行免疫沉淀，纯化6K1寄主互作蛋白复合体，SDS-PAGE分离蛋白，切取特异性蛋白条带。经质谱鉴定发现6K1互作蛋白复合体中含有PsbO1。

b.PsbO1基因的获得：根据PsbO1序列设计特异性引物。提取植物总RNA,利用反转录PCR扩增PsbO1基因并测序验证。

c.PsbO1和TVBMV 6K1、6K2互作的验证：将PsbO1基因克隆到免疫共沉淀和双分子荧光互补载体,利用免疫共沉淀和双分子荧光互补验证其互作。

d.PsbO1基因沉默对马铃薯Y病毒属病毒作用测定：将特定的PsbO1基因片段连接到TRV基因沉默载体，PsbO1沉默后再接种TVBMV或PVY。

采用本发明所述的技术方案，可以获得如下的技术效果：

1)获得了一种抗病毒靶标PsbO1；

2)降低PsbO1基因表达可使植株抗马铃薯Y病毒属病毒的侵染。

附图说明

图1 PsbO1和TVBMV 6K1、6K2互作的验证

a：CO-IP实验证明PsbO1可以和TVBMV 6K2直接互作，但不能与TVBMV 6K1直接互作，PsbO1通过6K2与6K1间接互作；b：BiFC实验证明PsbO1可以和TVBMV 6K2直接互作。

图2 PsbO1基因沉默后接种TVBMV第6天的症状、荧光分布和病毒积累水平

a：PsbO1基因沉默后可抑制TVBMV侵染；b：本氏烟PsbO1基因沉默后，植株阻碍了病毒的系统移动和复制；c：PsbO1基因沉默效果；d：PsbO1基因沉默对TVBMV复制水平的影响；e：PsbO1基因沉默TVBMV病毒粒子积累的影响。

图3 PsbO1基因沉默后接种PVY第10天的症状、荧光分布和病毒积累水平

a：本氏烟PsbO1基因沉默后，植株阻碍了PVY的系统移动和复制；b：PsbO1基因沉默效果；c：PsbO1基因沉默对PVY复制水平的影响；d：PsbO1基因沉默PVY病毒粒子积累的影响。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：

F代表正向引物，R代表反向引物。利用表中引物可以分别扩增PsbO1编码区全长和用于病毒诱导基因沉默的片段。

实施例1：免疫沉淀

取TVBMV-GFP或TVBMV-6K1GFP侵染7天后的本氏烟叶片，在研钵中加入液氮充分研磨至粉末状，加入Extraction Buffer提取植物总蛋白。

Extraction Buffer组成成分如下：

50mM Tris-Cl,pH 7.5,

150mM NaCl,

10％[v/v]glycerol,

0.5％[v/v]Nonidet P-40,

1tablet protease inhibitor cocktail

4℃,20000g离心10min，取上清液加入GFP抗体偶联的琼脂糖珠，4℃孵育3小时，用不含Nonidet P-40的Extraction Buffer洗5次，加入2×SDS上样缓冲液，沸水中煮10分钟，SDS-PAGE电泳分离各蛋白条带。

将蛋白条带切下送上海基云生物技术公司进行质谱鉴定。结果表明，有4个肽段和PsbO1同源，说明通过免疫沉淀筛选到的6K1GFP蛋白复合体中存在PsBO1。

实施例2：基因扩增

以植物总RNA为模板，利用反转录PCR扩增PsbO1基因。所用反转录酶为M-MLV,DNA聚合酶为Phusion高保真聚合酶。

反转录反应体系如下：

PCR反应体系如下：

得到的PsbO1基因长999bp，其序列如Seq ID No.7所示，编码的氨基酸序列Seq IDNo.8所示。

实施例3：PsbO1和TVBMV 6K1、6K2互作的验证

6K1和6K2可以相互作用。6K1GFP复合体中存在的PsbO1可能与6K1直接互作，也可能与6K2直接互作，通过6K2与6K1间接互作。将PsbO1、TVBMV 6K1和6K2基因分别克隆到免疫共沉淀载体pCam35S:HA和pCam35S:GFP,双分子荧光互补载体pYN和pYC。

将重组的免疫共沉淀载体转化农杆菌后，浸润本氏烟叶片。3天后提取植物总蛋白，加入GFP抗体偶联的琼脂糖珠进行免疫沉淀。利用HA抗体通过Western blot检测蛋白互作。PsbO1与6K2发生免疫共沉淀反应，而与6K1发生免疫共沉淀反应(图1，a)，说明PsbO1与6K2能直接互作，而与6K1无直接互作。

将重组的双分子荧光互补载体转化农杆菌后，浸润本氏烟叶片。2天后取叶片表皮层在激光扫描共聚焦显微镜下观察荧光。用波长为514nm的氩离子激光激发，在530-600nm波长处检测YFP荧光。结果表明，PsbO1只与6K2共同表达发出黄色荧光(图1，b)，证明PsbO1在体内也可以与6K2相互作用。

实施例4：PsbO1基因沉默对TVBMV和PVY侵染的影响

将PsbO1基因克隆到病毒沉默载体TRV的RNA2后接种本氏烟，然后将病毒载体TRV1,TRV2和TRV2-PsbO1分别转化农杆菌GV3101。经菌落PCR验证后，挑单斑接种于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四环素(50μg/mL)的液体LB培养基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L 2-(N-吗啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三种抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养至对数生长期。离心收集菌体并重新悬浮于10mmol/LMgCl₂，10mmol/L MES，150μmol/L AS中，调整浓度使其OD₆₀₀为1.0左右，室温静置3小时。取1mL一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液。将携带TRV1和TRV2，或TRV1和TRV2-PsbO1的农杆菌按照1∶1的比例浸润本氏烟。每株浸润2片叶。浸润的植株置于23℃光照培养箱中培养(16小时光照/8小时黑暗交替)。每个处理接种10棵本氏烟，重复3次。14天后，摩擦接种TVBMV-GFP或PVY-GFP。

TVBMV-GFP在对照本氏烟植株(烟草脆裂病毒空载体TRV1和TRV2侵染)系统叶上引起明显的花叶症状，而在PsbO1沉默的本氏烟植株(TRV1和TRV2-PsbO1侵染)系统叶几乎不表现症状(图2，a和b)。紫外灯下，TVBMV-GFP在对照本氏烟系统叶上有强烈的绿色荧光，而在在PsbO1沉默的本氏烟上只有点状荧光(图2，a和b)。荧光定量PCR结果表明，在PsbO1基因沉默的本氏烟上(图2，c；图3，b)，TVBMV基因组RNA的积累水平叶显著下降(图2，d)。免疫印迹实验结果表明，TVBMV外壳蛋白(coat protein，CP)表达量显著降低(图2，e)。

PVY-GFP在对照本氏烟植株(烟草脆裂病毒空载体TRV1和TRV2侵染)系统叶上引起明显的花叶症状，而在PsbO1沉默的本氏烟上无明显症状(图3，a和b)。紫外灯下，PVY-GFP在对照本氏烟系统叶上有强烈的绿色荧光，而在在PsbO1沉默的本氏烟上只有点状荧光(图3，a和b)。荧光定量PCR结果表明，在PsbO1基因沉默的本氏烟上，PVY的基因组RNA的积累水平叶显著下降(图3，c)。免疫印迹实验结果表明，PVY CP表达量也显著降低(图3，d)。

以上结果表明，降低PsbO1基因的表达量可使植物抵抗烟草脉带花叶病毒和马铃薯Y病毒的侵染。

<110>山东农业大学

<120>一种植物抗病毒基因的筛选与应用

<160>15

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ATGGCTGTCT CTTTACAAGC AG 22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

TCATTCAAGT TGGGCATACC AG 22

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

GCTCTAGACC CCAGATTTCC AGAAAACTAA G 32

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

CGGGATCCCA CATCCTTGGG GACCTTTG 28

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

GCTCTAGAAT GGCTGTCTCT TTACAAGCAG 30

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

CGGGATCCTT CAAGTTGGGC ATACCAG 27

<210>7

<211>999

<212>DNA

<213>PsbO1基因序列

<400>7

ATGGCTGTCT CTTTACAAGC AGCTGCTACT CTTATGCAAC CAACAAAGGT TGGTGTTGCC 60

CCAGCTAGAA ACAACCTGCA GTTGAGGTCT GCTCAAAGTG TGTGCAAAGC ATTTGGTGTT 120

GAACCAGCTG CAGCTAGGCT TACTTGCTCT TTGCAAACTG AACTCAAGGA CTTGGCTCAA 180

AAGTGCACTG ATGCTGCGAA GGTTGCTGGT TTTGCTCTGG CCACTTCCGC CCTTGTCGTC 240

TCAGGAGCAA ATGCTGAAGG AGCTCCAAAA CGTCTAACCT TCGACGAAAT TCAAAGCAAG 300

ACATACATGG AAGTAAAGGG AACTGGAACT GCTAACCAGT GCCCTACCAT AGAAGGAGGT 360

GTTGCCAGCT TTGCCTTCAA GCCAGGCAAA TACAATGCCA AGAAATTCTG CTTAGAGCCC 420

ACATCATTCA CGGTCAAGGC AGAGAGTGTG AACAAGAATG CACCCCCAGA TTTCCAGAAA 480

ACTAAGCTCA TGACACGCTT AACCTACACC CTTGATGAGA TTGAGGGACC ATTCGAAGTG 540

TCTTCTGATG GCACTGTTAA GTTTGAGGAG AAGGATGGAA TTGATTATGC TGCTGTTACA 600

GTTCAGCTTC CTGGTGGTGA GCGTGTGCCC TTCCTCTTCA CTATCAAACA GCTAGTGGCA 660

AGCGGCAAAC CAGAAAGCTT TAGCGGTGAA TTCCTTGTGC CATCATACAG AGGTTCATCC 720

TTCCTTGACC CAAAGGGACG GGGTGGATCT ACTGGCTATG ACAACGCTGT TGCACTGCCT 780

GCTGGAGGGA GAGGAGACGA GGAGGAGCTT GAGAAGGAGA ACGTAAAGAA TACTGCATCT 840

TCTACAGGAA AAATCACCCT GAGTGTTACC CAGAGCAAGC CAGAGACCGG TGAGGTCATT 900

GGAGTATTTG AGAGCATCCA GCCATCTGAT ACTGATCTCG GTGCAAAGGT CCCCAAGGAT 960

GTGAAAATCC AGGGTATCTG GTATGCCCAA CTTGAATGA 999

<210>8

<211>332

<212>PRT

<213> PsbO1蛋白序列

<400>8

MET Ala Val Ser Leu Gln Ala Ala Ala Thr Leu MET Gln Pro Thr 15

Lys Val Gly Val Ala Pro Ala Arg Asn Asn Leu Gln Leu Arg Ser 30

Ala Gln Ser Val Cys Lys Ala Phe Gly Val Glu Pro Ala Ala Ala 45

Arg Leu Thr Cys Ser Leu Gln Thr Glu Leu Lys Asp Leu Ala Gln 60

Lys Cys Thr Asp Ala Ala Lys Val Ala Gly Phe Ala Leu Ala Thr 75

Ser Ala Leu Val Val Ser Gly Ala Asn Ala Glu Gly Ala Pro Lys 90

Arg Leu Thr Phe Asp Glu Ile Gln Ser Lys Thr Tyr MET Glu Val 105

Lys Gly Thr Gly Thr Ala Asn Gln Cys Pro Thr Ile Glu Gly Gly 120

Val Ala Ser Phe Ala Phe Lys Pro Gly Lys Tyr Asn Ala Lys Lys 135

Phe Cys Leu Glu Pro Thr Ser Phe Thr Val Lys Ala Glu Ser Val 150

Asn Lys Asn Ala Pro Pro Asp Phe Gln Lys Thr Lys Leu MET Thr 160

Arg Leu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Ile Glu Gly Pro Phe Glu Val 180

Ser Ser Asp Gly Thr Val Lys Phe Glu Glu Lys Asp Gly Ile Asp 195

Tyr Ala Ala Val Thr Val Gln Leu Pro Gly Gly Glu Arg Val Pro 210

Phe Leu Phe Thr Ile Lys Gln Leu Val Ala Ser Gly Lys Pro Glu 225

Ser Phe Ser Gly Glu Phe Leu Val Pro Ser Tyr Arg Gly Ser Ser 240

Phe Leu Asp Pro Lys Gly Arg Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Asp Asn 255

Ala Val Ala Leu Pro Ala Gly Gly Arg Gly Asp Glu Glu Glu Leu 270

Glu Lys Glu Asn Val Lys Asn Thr Ala Ser Ser Thr Gly Lys Ile 285

Thr Leu Ser Val Thr Gln Ser Lys Pro Glu Thr Gly Glu Val Ile 300

Gly Val Phe Glu Ser Ile Gln Pro Ser Asp Thr Asp Leu Gly Ala 315

Lys Val Pro Lys Asp Val Lys Ile Gln Gly Ile Trp Tyr Ala Gln 330

Leu Glu ***

Claims

1.一种植物抗病毒新靶标的筛选与应用，其特征在于可通过以下步骤获得：

(1)利用免疫沉淀从植物中获得光系统Ⅱ放氧复合体蛋白PsbO1。

(2)利用反转录PCR技术从植物总RNA中扩增获得PsbO1基因，其核苷酸和编码氨基酸序列分别如Seq ID No.7和Seq ID No.8所示。

(3)利用免疫共沉淀和双分子荧光互补实验证明PsbO1可以与6K2互作。

(4)降低PsbO1基因的表达可使植物获得对马铃薯Y病毒和烟草脉带花叶病毒的抗性。

2.权利要求1所述的PsbO1在防治马铃薯Y病毒和烟草脉带花叶病毒侵染方面的应用。