CN105420264B - 一种抗烟草马铃薯y病毒疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗烟草马铃薯Y病毒疫苗的制备方法，该方法包括如下步骤：1)制备pCaPVX440‑eIF4E‑6质粒；2)将pCaPVX440‑eIF4E‑6转化至农杆菌中制备获得抗烟草马铃薯Y病毒疫苗。本发明方法制备的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗适于烟草PVY病毒的预防及防治，对于烟叶生产过程中PVY病毒引起的病害防治具有重要的实用价值。与现有技术相比，本发明的病毒疫苗具有特异性强、安全性好、操作简便快速、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种烟草抗病毒疫苗的制备及应用，属于植物病害预防与保护领域。
背景技术
马铃薯Y病毒(Potato Virus Y,PVY)是马铃薯Y病毒属(Potyviruses)的典型代表，最早是1931年由K.M.Smith在马铃薯上首次发现。马铃薯Y病毒在自然条件下主要依靠蚜虫传播，可以在世界范围内侵染茄科植物，是目前我国烟草生产中普遍发生的重要病毒病之一。烟草感染马玲薯Y病毒后，表现出明显黄化、矮化、脉坏死、叶片斑驳、整株凋萎，根系严重变褐、坏死，叶片失去烘烤价值，造成严重的减产、降质，直至绝产。
利用病毒抗性基因进行病毒防治是作物抗病育种研究的重要研究手段，这些抗性基因包括能诱发植物过敏反应或极端抗性的显性基因(R基因)。它们主要属于R基因核酸结合位点-亮氨酸富集的重复序列超家族(nucleotide binding site,leucine-richrepeat,NBS-LRR)，包括N、Rx1、Rx2和Sw-5基因等。其他类型的R基因则不诱发植物过敏反应或极端抗性，但却能阻止病毒在植物体内的远距离扩散，包括RTM1和RTM2基因等。隐性抗病基因编码的蛋白常常不能促进病毒的增殖和/或移动，而它们相应的显性感病基因的功能则相反。迄今，已从多个植物物种中分离出多个隐性抗病基因，包括pvr1/pvr2、mol1/mol2、sbm1、rym4/5、pot1、rymv1、nsv和pvr2+pvr6等。这些隐性抗病基因都编码真核生物翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor,eIF)，包括eIF4E、eIF4G以及它们的异构体。多项研究表明，PVY病毒5′端的病毒基因组连接蛋白(viral genome-linkedprotein,VPg)能通过与eIF4E家族成员中的一个蛋白相互作用来启动病毒基因组的翻译，从而促进病毒的增殖。
烟草PVY病毒目前还没有有效的防治药剂，生产上主要以预防为主，一些常规防病毒药剂受环境等因素影响一方面很难对PVY病毒进行有效防治，另一方面过量使用易造成大量的农药残留，对环境和其他生物安全具有很大危害。因此，防治效果好、安全性高的生物药剂对烟叶生产中PVY病毒的防治具有重要意义。本发明基于烟草eIF4E基因，利用pCaPVX440载体构建一种抗烟草马铃薯Y病毒的疫苗，用于马铃薯Y病毒的防治。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗烟草马铃薯Y病毒疫苗的制备方法。
为解决本发明的第一个技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种抗烟草马铃薯Y病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备pCaPVX440-eIF4E-6质粒，其含有的eIF4E-6基因的DNA片段，该DNA片段序列如序列表SEQ ID No.1所示；
2)将pCaPVX440-eIF4E-6质粒转化至脓杆菌中制备获得抗烟草马铃薯Y病毒疫苗。
优选地，步骤2)制得的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗可以进一步扩增。
所述pCaPVX440-eIF4E-6质粒的制备方法包括如下步骤：
1)获得c-DNA扩增模板；
2)扩增eIF4E-6基因，获得DNA片段；
3)分别酶切所述DNA片段和pCaPVX440质粒；
4)连接步骤3)酶切后的DNA片段和pCaPVX440质粒；
5)转化步骤4)的连接产物并获得pCaPVX440-eIF4E-6质粒。
c-DNA模板为从烟草中提取RNA，然后通过反转录获得c-DNA扩增模板。
扩增eIF4E-6基因的方法为如下：以步骤1)获得的c-DNA为模板、以上游引物：PVX-BF：CCTTCGAACTGATACCAGCTGGCTATAC(序列如SEQ ID NO：2所示)和下游引物：PVX-MR：GCACGCGTGCCTCATTGAGTCGTCATG(序列如SEQ ID NO：3所示)来扩增eIF4E-6基因，获得eIF4E-6基因的DNA片段。其中上游引物和下游引物分别加入BstBⅠ和MiuⅠ酶酶切位点。优选地，扩增获得的eIF4E-6基因片段可以连接至用于克隆的T载体，以提高酶切效率。
步骤3)中获得酶切后的eIF4E-6基因DNA片段，可以通过酶切扩增获得的eIF4E-6基因DNA片段获得，也可以通过酶切连接有eIF4E-6基因DNA片段的T载体来获得。
本发明方法制备的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗中的目标片段是通过比对分析烟草基因组中eIF4E基因家族成员后选择的eIF4E-6基因特异序列，以该片段制备的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗可以特异地降解eIF4E-6基因，从而阻断其与PVY病毒的互作，减少PVY病毒在烟株内的复制，达到防治烟草PVY病毒的目的。
本发明的有益效果如下：
本发明方法制备的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗适于烟草PVY病毒的预防及防治，对于烟叶生产过程中PVY病毒引起的病害防治具有重要的实用价值。与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势和积极效果：
1、特异性强：本发明方法制备的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗可以特异地降解eIF4E-6基因，从而阻断其与PVY病毒的互作，减少PVY病毒在烟株内的复制，达到防治烟草PVY病毒的目的。
2、安全性好：可以有效减少化学农药防治对环境及生物的危害及影响，属于生防范畴，不属于转基因，不存在转基因安全性问题。
3、操作简便快速：抗烟草马铃薯Y病毒疫苗，稀释后在烟草大棚苗期可以直接利用喷壶喷施烟苗，进行烟草PVY病害预防。
4、成本低：抗烟草马铃薯Y病毒疫苗进行PVY病毒的预防，可以有效减少人工、机械防病成本。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出PCR扩增eIF4E-6基因片段的电泳检测图片。
图2示出PCaPVX440载体和目的基因片段双酶切的电泳图片。
图3示出eIF4E-6-PVX VIGS重组载体菌落PCR验证的电泳图片。
图4示出不同处理组LJ911烟苗接种PVY病毒后发病情况照片。
图5示出荧光实时定量PCR检测eIF4E-6基因转录水平及PVY病毒量扩增曲线。
图6示出荧光实时定量PCR检测接种PVY病毒后各种处理烟叶中eIF4E-6基因和PVY病毒表达量。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1：
1.c-DNA模板的制备
应用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini kit提取烟草LJ925鲜叶片RNA，利用TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0试剂盒逆转录合成c-DNA作为模板。具体操作参见试剂盒的说明书。
2.eIF4E-6基因的扩增
在0.5mL的PCR管中加入10×PCR缓冲液(Buffer)2.5μL、10pmol/μL的PVX-BF和PVX-MR引物各0.5μL、2.5U/μL的pfu DNA聚合酶0.5μL、dNTPs(每种dNTP 10mM)1μL、c-DNA模板2μL、超纯水18μL。PCR扩增程序见表1：
表1：PCR反应条件
3.构建pMD18-T-eIF4E-6质粒
将25μL eIF4E-6基因的扩增产物用1.5％琼脂糖电泳分离，紫外分析仪中切胶回收目标片段；将所述目标片段回收纯化后克隆至pMD18-T Simple Vector(大连宝生物公司)中并转化大肠杆菌，然后涂布于含有100mg/L氨卞霉素的LB培养板；挑取单菌落进行测序验证；获得具有正确eIF4E-6基因片段序列的pMD18-T-eIF4E-6质粒。
4.连接获得pCaPVX440-eIF4E-6质粒
分别用BstBⅠ和MiuⅠ限制性内切酶对PCaPVX440质粒和pMD18-T-eIF4E-6质粒进行酶切，获得线性化PCaPVX440质粒和eIF4E-6基因片段；然后分别回收线性化PCaPVX440质粒和eIF4E-6基因片段，并用T4 DNA聚合酶将二者连接，将连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5±；挑取单菌落进行PCR鉴定，获得具有正确DNA序列的pCaPVX440-eIF4E-6质粒。
5.制备抗烟草马铃薯Y病毒疫苗
电击转化pCaPVX440-eIF4E-6质粒至脓杆菌EHA105内，即获得抗烟草马铃薯Y病毒疫苗。
实施例2：抗烟草马铃薯Y病毒疫苗的扩增
分别取50μL实施例1制备的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗，加入到50mLYEP液体培养基中(含卡那霉素50mg/mL，各菌液摇菌后取10mL)，28℃摇菌至对数生长期，8000rpm离心5分钟后，菌体利用渗透培养基缓冲液(10mmol/L MES,10mmol/L MgCl2,100μmol/L乙酰丁香酮)悬浮，菌液浓度调整到OD600＝1.5，28℃静止3h待用。
实施例3：烟草马铃薯Y病毒的接种方法及抗烟草马铃薯Y病毒疫苗的使用
将实施例3中抗烟草马铃薯Y病毒疫苗悬浮液稀释50倍，于烟苗移栽前喷施烟草品种LJ911(感PVY)幼苗(5片真叶期)两次，喷洒间隔5天，作为测试组。同时设置不接种及接种PVX空载体对照。每个处理分别盆栽9盆，待烟苗长至团棵期(12片真叶期)，摩擦接种PVY病毒。接种方法为：取经LJ912(抗TMV)烟苗繁育的新鲜PVY病叶，放到研钵中捣碎，加入2倍于病叶质量相等的磷酸缓冲液(取亚硫酸钠0.5g，磷酸二氢钾5g，溶于500ml水中)研磨捣碎成糊状，用纱布过滤后取滤液，滤液稀释50倍。吸取制备好的PVY病毒汁液，用1mL的移液器滴到烟苗上，用牙刷摩擦接种，每盆烟苗接两片叶。接种两周后，调查不同处理组PVY感病情况、采集病叶样品并对目的基因eIF4E-6及病毒进行荧光实时定量PCR检测。各处理样品发病情况见图4。
实施例4PVY病毒及eIF4E-6基因荧光实时定量PCR检测
采集的各处理病叶样品，应用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini kit提取总RNA，测定浓度后，进行荧光实时定量PCR检测。荧光实时定量PCR反应体系以及反应条件参照TaKaRa公司One Step SYBR PrimerScript RT-PCR Kit II试剂盒说明书，反应在LifeTechnologies公司ABI7500 Real Time PCR System上进行。以烟草Actin基因作内参，Actin、eIF4E-6、eIF4E-10基因和PVY病毒PCR扩增引物见表2。每种样本设三次重复。
表2 Actin、eIF4E-6基因和PVY病毒荧光实时定量PCR扩增引物
注：“eIF4E-6F*”设计于eIF4E-6基因非编码区的上游区域
荧光实时定量PCR实验结果(见表3)显示：接种抗烟草马铃薯Y病毒疫苗的烟苗相对于无处理对照(只接种PVY病毒)及空载体对照，eIF4E-6基因转录量分别降低了85.8％和85.3％，同时PVY病毒量降低了4个数量级。表明抗烟草马铃薯Y病毒疫苗可有效降低龙江911的eIF4E-6基因转录水平，而eIF4E-6基因转录水平降低的龙江911中PVY病毒量与对照组相比极显著减少。证明eIF4E-6基因是烟草PVY病毒病的感病基因。荧光实时定量PCR检测eIF4E-6基因转录水平及PVY病毒量见图5和图6。
表3接种PVY病毒后eIF4E-6基因转录水平及PVY病毒量
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (6)
1.一种抗烟草马铃薯Y病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备pCaPVX440-eIF4E-6质粒，其含有的eIF4E-6基因的DNA片段，该DNA片段序列如序列表SEQ ID No.1所示；
2)将pCaPVX440-eIF4E-6质粒转化至农杆菌中制备获得抗烟草马铃薯Y病毒疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：可进一步对步骤2)获得的抗烟草马铃薯Y病毒疫苗进行扩增。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述pCaPVX440-eIF4E-6质粒的制备方法包括如下步骤：
1)从烟草LJ925中提取RNA，逆转录获得c-DNA扩增模板；
2)扩增eIF4E-6基因，获得DNA片段；
3)分别酶切所述DNA片段和pCaPVX440质粒；
4)连接步骤3)酶切后的DNA片段和pCaPVX440质粒；
5)转化步骤4)的连接产物并获得pCaPVX440-eIF4E-6质粒。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤2)使用SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示的特异性引物对扩增eIF4E-6基因。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤2)获得的DNA片段连接到用于克隆的T-载体，获得连接有DNA片段的T载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：酶切连接有DNA片段的T载体，来获得酶切后的DNA片段。
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