CN102180955A - 与马铃薯y病毒属病毒侵染有关的玉米蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与马铃薯Y病毒属病毒侵染有关的玉米蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与马铃薯Y病毒属病毒侵染有关的蛋白,是如下(a)或(b)的蛋白质;(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与马铃薯Y病毒属病毒侵染有关的由(a)衍生的蛋白质。半定量RT-PCR检测发现在玉米叶片上瞬时沉默ZmTrm2促进了甘蔗花叶病毒的系统侵染，在普通烟上表达ZmTrm2可以抑制烟草脉带花叶病毒的复制。
Description
技术领域
本发明涉及与马铃薯Y病毒属病毒侵染有关的玉米蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
在过去的十年中，植物病毒和寄住之间的分子间相互作用取得了很大的进展。但是病毒侵染是如何在生化和生理水平上影响植物的细胞，组织乃至整株在植物病毒学的研究中还是个缺口。病毒是如何利用它自身的少数几个蛋白来侵染植物并引起症状的还有很多方面有待研究。病毒在植物体内引起的症状是植物在细胞水平上生理和结构发生的变化结合植物本身的生长发育的减缓而产生的。通过重组DNA技术的应用从而研究病毒的基因产物在症状产生过程中的作用使得我们逐步了解病毒侵染植物的这个过程。目前的研究手段主要有以下几个：I病毒突变的方式来确定与症状表达相关的基因产物和遗传位点，应用这个方法研究病毒的例子很多，但是通过病毒突变的方式研究的结果更倾向于对病毒的研究，而不是对症状产生的生化机制的研究；II通过转基因的方式在寄主植物中异源表达病毒基因，通过转基因的方式可以把单个病毒基因产物的影响和病毒复制的影响区分开。组成型表达花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)的VI基因会诱导转基因植物产生严重的褪绿症状，与花椰菜花叶病毒侵染后的症状非常相似，通过差异分析发现转VI基因的拟南芥和花椰菜花叶病毒侵染的拟南芥的几个基因在表达方式的变化上是一致的，有报道病毒的移动蛋白对寄主植物有重要影响，这些方法为阐明病毒基因产物在症状产生和病毒防卫反应中的作用提供了新的信息，但是还是有相当多的一些控制病毒病的因子没有被发现，通过高通量的方法研究转录水平的变化可以更全面的研究病毒侵染后寄主的变化。
发明内容
本发明的一个目的是提供与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒侵染有关的玉米蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与马铃薯Y病毒属病毒侵染有关的玉米蛋白，名称为ZmTrm2，来源于玉米(Zea mays L.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与马铃薯Y病毒属病毒侵染有关的由(a)衍生的蛋白质。
所述与马铃薯Y病毒属病毒侵染有关的玉米蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述与马铃薯Y病毒属病毒侵染有关的玉米蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；
3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
含有所述编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
序列表中的序列2由516个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1位-第513位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白。
所述重组载体是在载体PVX或载体BMVpF3-5/13’A/G的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组载体。
扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。
本发明的另一个目的是提供序列表中序列1所示的蛋白在抑制植物病毒复制或防治植物病毒病害中的应用。
序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在抑制植物病毒复制或防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；
3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在抑制植物病毒复制或防治植物病毒病害中的应用也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体为在载体PVX的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体；
所述抑制植物病毒复制为抑制植物病毒在植物体中的复制；
所述植物病毒为马铃薯Y病毒属病毒；
所述病毒病害是由马铃薯Y病毒属病毒引起的病害；
所述马铃薯Y病毒属病毒为烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein bandingmosaic virus，TVBMV)或甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)；
所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物为玉米；所述双子叶植物为烟草。
本发明通过半定量RT-PCR技术考察了ZmTrm2在玉米的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、种子中的分布，结果发现它能够在各个组织和器官中分布，通过共聚焦显微镜观察发现ZmTrm2存在于叶肉细胞的叶绿体中。半定量RT-PCR检测发现在玉米叶片上瞬时沉默ZmTrm2促进了甘蔗花叶病毒的系统侵染，在普通烟上表达ZmTrm2可以抑制烟草脉带花叶病毒的复制。
附图说明
图1为半定量RT-PCR检测ZmTrm2的组织分布。
图2为激光共聚焦显微镜观察ZmTrm2的细胞内亚定位。
图3为半定量RT-PCR检测甘蔗花叶病毒的积累水平。
图4为半定量RT-PCR检测烟草脉带花叶病毒的积累水平。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、ZmTrm2的获得
一、玉米抑制性消减杂交文库的构建
1、玉米总RNA的提取
1)取0.1g新鲜的玉米叶片，加液氮研磨成粉末状，移入一灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Tri-Reagent，剧烈振荡摇匀或将1ml的Tri-Reagent加入到-80℃冻存的1×106原生质体中，剧烈振荡3min；冰上放置5min。
2)匀浆用IEC台式冷冻离心机于4℃、12,000g条件下离心10min以除去不溶的成分，将上清转入一新的1.5ml离心管中。
3)在室温下静置5min，加0.2ml氯仿，剧烈震荡15sec，然后在室温下静置2-5min，再于4℃、12,000×g的条件下离心15min。
4)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，混合(上下颠倒)，使样品在室温下静置15min，4℃、12,000×g离心10min，则RNA会在管的侧壁和底部形成沉淀。
5)弃上清，加入75％的乙醇洗涤沉淀，然后4℃、7,500×g离心5min(如RNA沉淀悬浮起来，则用12,000×g)，弃乙醇。
6)RNA在室温下干燥10min或在冷冻离心浓缩机上浓缩5min，加入30μl DEPC处理的超纯水溶解沉淀，-70℃保存备用。
2、从植物总RNA中分离mRNA
1)首先对总RNA定量，把定量的总RNA加入1.5ml的离心管中。注意不要超过试剂盒所要求的量。
2)加250μl OBB buffer和15μl Oligotex suspension，并且充分混合。
3)把混合后的样品放到70℃的水浴锅中温浴3分钟(破坏RNA的二级结构)。
4)取出样品在室温下放置10分钟(让poly(A)和poly(T)充分的杂交)。
5)16,000×g，离心2分钟，沉淀Oligotex和mRNA。弃上清。
6)用400μl的OW2缓冲液涡旋重悬Oligotex和mRNA的沉淀，然后转移至分离柱中最大转速离心1分钟。
7)再把离心柱转移至新的1.5ml离心管中，加400μl的OW2缓冲液，用最大的转速离心1分钟。
8)再转移离心柱至新的1.5ml的离心管中，加60μl预热(70℃)的OEB缓冲液。来回抽动3-4次，重悬沉淀。最大离心力离心1min。
9)为了得到更大的产量，再重复步骤8一次。
2、第一链cDNA合成
1)取3个灭菌的PCR管，分别标记上driver、tester和control，将对应的mRNA按照下表的比例混匀。
*对应于Control的合成，加入2μl skeletal muscle PolyA+RNA，不足的体积用不含RNase的水补齐。
2)将上述管子在PCR仪上42℃反应2min。
3)在冰上冷浴2min。
4)在微型离心机上微离。
5)在上述各反应管中依次加入以下组分：
6)在气体保温的保温箱里42℃保温1.5h。
7)把反应管置于冰上，终止第一链的合成，然后立即进行第二链的合成。
3、第二链cDNA合成
以下操作是将Driver、Tester和control的第一链cDNA为模板合成各自的第二链cDNA。
1)在第一链合成的反应管中依次加入以下组分：
2)混匀溶液，最后的体积应该是80μl。
3)在PCR仪上42℃反应2h。
4)加2μl(3u/μl)的T4DNALigase，混合均匀。
5)在热循环仪上16℃保温30min。
6)加4μl 20×EDTA/Glycogen混合物，终止第二链的合成。
7)加100μl的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)。
8)充分涡旋，14,000rpm，室温下离心10min。
9)小心吸取上清液，放到已灭菌的0.5ml的离心管中，弃除中间相和下相。
10)加100μl的氯仿∶异戊醇(24∶1)到上清液中。
11)重复步骤8和步骤9。
12)加40μl的4M醋酸胺和400μl 95％乙醇。
13)涡旋均匀，室温下，14,000rpm，离心20min，弃上清。
14)加500μl 80％的乙醇，涡旋均匀，室温下，14000rpm，离心10min，弃上清。
15)风干沉淀，加50μl的水溶解。
16)取出6μl至一新的离心管中，保存于-20℃，待ds(double-standed)cDNA RsaI酶切后用于琼脂糖凝胶电泳检测ds cDNA产物的产量和大小范围。
5、Rsa I酶切反应
以下操作是将合成的tester、driver和control的ds cDNA用Rsa I进行酶切。酶切后产生的短的、平端的ds cDNA片段，这些片段将在后续的实验中用作消减杂交和接头连接。
1)在做好标记的反应管中配制如下的反应体系：
2)混匀后37℃温浴1.5h。
3)加入2.5ul 20×EDTA/Glycogen Mix终止反应。
4)纯化Rsa I酶切产物(反应体系缩小1倍)。
5)加入5.5μl水溶解沉淀，冻存于-20℃。这5.5μl Rsa I酶切产物将作为experimental driver cDNA和control skeletal muscle driver cDNA)，并且在后续的实验中，也会将与不同的接头连接后作为tester cDNA，进行正向、control和反向杂交。
4、接头连接
1)取出1μl tester cDNA，稀释到5μl无菌水中。
2)制备control skeletal muscle tester cDNA：
a)将含有Hae III消化的ΦX174 DNA(3ng/μl)的离心管轻微离心。
b)取出上述DNA2μl，加入38μl无菌水中，稀释至浓度为150ng/μl。
c)将1μl skeletal muscle cDNA和1μl Hae III消化的ΦX174 DNA(150ng/μl)混合在一起。
至此，control skeletal muscle tester cDNA制备完成。它含有0.2％Hae I消化的ΦX174 DNA；每条片段对应于总cDNA的0.02％。当control skeletal muscle tester cDNA与control skeletal muscle driver cDNA消减后，最终PCR产物中主要条带与这些对照的条带相对应。
以下为experimental tester cDNA接头的连接：
3)在0.5ml离心管里准备如下连接Master Mix。
4)对于每个experimental tester cDNA和control skeletal muscle tester cDNA，在0.5ml离心管中加入如下试剂，混匀。
*，用同样的方法建立Tester 2-1和Tester 2-2，Tester 3-1和Tester 3-2反应体系。
5)将各反应管轻微离心，16℃反应过夜。
6)每个反应中加1μl的EDTA/glycogen，终止反应。
7)将反应管在72℃反应5min，使连接酶失活。
8)在一个新的离心管中，将连接好的Tester 1-1和Tester 1-2各2μl混匀，这就是Unsubtracted tester control 1-c。用同样的方法处理加完接头的experimental tester cDNA和control skeletal muscle tester cDNA，得到Unsubtracted tester control 2-c和Unsubtracted tester control 3-c。
9)将Unsubtracted tester control 1-c、2-c和3-c各取出1μl稀释到1ml水中。将用作PCR扩增。其余冻存于-20℃。
5、第一次杂交
在杂交之前，4×Hybridization buffer在室温下放置20min，确保沉淀完全溶解。此外，由于作为tester的cDNA样品中含有SCMV的序列，那么在后续的消减杂交过程中，SCMV的序列势必会筛选出来，但病毒的基因组序列并不是我们预期的。为了解决这个问题，在进行杂交的过程中，将Driver cDNA中混入Rsa I消化的SCMV基因组cDNA，那么，在两轮杂交中，Tester cDNA中的SCMV的基因组cDNA将被消减掉，这样就达到了在抑制消减文库中不引入SCMV基因组序列的目的了。
1)在每个反应管中，配置如下experimental和control消减杂交体系：
*以同样的方法配制Tester 2-1和2-2，3-1和3-2的消减杂交体系。
2)在反应管中加入一滴矿物油，轻微离心。
3)在PCR仪上，98℃反应1.5min。然后68℃反应8h-12h。然后立即进行第二次消减杂交。
6、第二次杂交
在本次杂交中，第一次杂交产物混匀在一起，然后加入新鲜变性的driver cDNA以进一步富集差异表达的序列。这样产生的新的杂交分子就是那些特异表达的、且两端连接了不同接头的cDNA。
本次杂交中，第一次杂交的产物不再变性。除必须向样品中加入新鲜变性的driver cDNA，反应管移出PCR仪的时间必须短。
对于experimental tester cDNAs和control tester cDNA重复以下步骤：
1)在一个新的无菌的离心管中，配制如下反应液：
2)在一个新的无菌的0.5ml离心管中，加入1μl反应液，并加入l滴矿物油。
3)反应管于PCR仪中98℃反应1.5min。
4)从PCR仪中取出反应管。用下面的步骤将上述新鲜变性的driver同时和消减杂交样品1和2混合在一起。以确保这两个消减杂交样品是在新鲜变性的driver的存在下混合在一起的。
a.将移液器调至15μl。
b.将枪头尖轻轻地深入到矿物油和Hybridization Sample 2的中间界面。
c.小心将全部样品(4μl)吸入到枪头中，无需担心少量矿物油会带入到样品中。
d.将枪头从反应管中移出，并打入少量空气，在样品液滴的下方留出少许空气空隙。
e.重复步骤b-d，吸入新鲜变性的driver，至此，枪头中同时含有两种样品，中间被一薄层空气隔开。
f.将枪头中的所有混合液移入到含有Hybridization Sample 1的反应管中。
5)若有必要，轻微离心。68℃反应过夜。
6)加入200μl dilution buffer到反应管中，并轻轻地吸打混匀。
7)PCR仪上，68℃反应7min。冻存于-20℃。
7、PCR扩增
在这一步，差异表达的cDNAs将被选择性扩增。在第一轮PCR中，只有那些两头连接有不同接头的ds cDNA得到指数扩增。在第二轮PCR中，巢式PCR进一步降低背景，富集差异表达的序列。
为了进行后续实验，至少7个PCR是必需的，反应的模板分别是：(1)消减的正向experimental cDNA，(2)未消减的tester control(1-c)，(3)消减的反向experimental cDNA，(4)未消减的反向tester control(2-c)，(5)消减的control skeletal muscle cDNA，(6)未消减的control skeletal muscle cDNA，(7)消减的cDNA(Hae III消化的ΦX174 DNAcDNA)，作为阳性对照。
1)准备PCR模板
取出1μl稀释好的消减的cDNA和未消减的cDNA，以及试剂盒提供的消减过的cDNA加入到各个标记好的PCR反应管中。
2)在各个反应管中，按照如下所示配制第一轮PCR的预混合反应液(Master Mix)：
PCR Primer 1：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’。
3)将上述PCR Master Mix取出分装到各个装有PCR模板的反应管中。混匀，轻微离心。
4)加入50μl矿物油覆盖液面。
5)反应管放入到PCR仪中，75℃反应5min，补平接头。
6)立即启动第一轮PCR，程序如下：
7)取出8μl第一轮PCR产物，用于PCR产物分析。
8)取出3μl第一轮PCR产物稀释到27μl水中。稀释的第一轮PCR产物，将用于后续的选择差异筛选。
9)取出1μl稀释的第一轮PCR产物，加入到对应的标记好的PCR管中。
10)按照如下所示配制第二轮PCR的Master Mix。
Nested PCR Primer 1：5’-TCGAGCGGCCCGGGCAGGT-3’，
Nested PCR Primer 2R：5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’。
11)重复步骤3)和步骤4)。
12)启动第二轮PCR，程序如下：
13)取出8μl第二轮PCR产物，用于PCR结果分析及消减效率分析。
14)将两轮PCR产物冻存于-20℃。
9、序列测定
将两轮抑制PCR扩增的特异性产物，连接T载体转化后，选取克隆进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳分析，将PCR扩增大小在500bp以上的的菌液送样测序(请说明阳性克隆的鉴定方法和结果)，测序引物为T7-Promotor和SP6-Promotor，引物序列如下：
T7-Promotor：5′-(TAATACGACTCACTATAGGG)-3′，
SP6-Promotor：5′-(TATTTAGGTGACACTATAG)-3′。
测序结果首先通过Nested PCR primer1和Nested PCR primer 2R的序列将载体序列去掉，然后得到目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由516个碱基组成，自5’端第1位-第513位为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列1由171个氨基酸残基组成。将该基因命名为ZmTrm2，将其编码的蛋白命名为ZmTrm2。
二、ZmTrm2基因的组织特异性表达分析
玉米各个组织RNA的提取和RT-PCR反应：
1)提取了玉米综31(购自中国农业大学国家玉米改良中心)的根、茎、叶、雄蕊、雌蕊和种子的总RNA，具体操作步骤如实验一中步骤1相同。
2)37℃ 1μl DNA酶(5U/μl)处理20-30分钟。
3)将所有的RNA样品浓度调整至0.5μg/μl，以Oligo-d(T)作为反向引物，进行RT反应。RT反应过程如下：
在反应管中依次加入以下样品或试剂：
反应管在65℃反应5min，冰上至少放置1min。然后依次加入以下试剂：
在42℃反应1h，70℃灭活M-MLV Reverse Transcriptase(购自Promega)。
4)PCR反应体系，取1μl上述RT产物，加入到下列预先混合后分装的反应液中：
ZmTrm2和ubiquitin的扩增条件一致，为94℃，变性3min；94℃，变性30sec；60℃，退火30sec；72℃，延伸30sec；扩增循环数：25～35；最后于72℃延伸5min。PCR反应完成以后，取3μl反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。ZmTrm2的特异性引物为：F 5′-GCTAAACACCGACGAGAACC-3′；R5′-GCCCATCCTTGAATCCCT-3′，ubiquitin 的特异性引物为：F 5’-GGAAAAACCATAACCCTGGA-3；R 5’-ATATGGAGAGAGGGCACCAG-3’。
Ubiquitin作为内参为了表明各个组织中的cDNA的量是一致的，从该基因的转录水平可以发现该基因在根、茎、叶、雄蕊、雌蕊、种子中都有存在，在根和种子中的表达水平相当较低(图1)。
实施例2、ZmTrm2蛋白特性表征及其在病毒防治中的应用
一、ZmTrm2在玉米叶肉细胞中的定位
1、构建ZmTrm2表达载体
以人工合成的序列表中序列2为模板，设计引物扩增ZmTrm2全长阅读框，通过SalI/SacI双酶切PCR产物并回收516bp的基因片段，同时用SalI/SacI双酶切pcEmGFP-DEST载体(购自Invitrogen，产品目录号为V35520)，回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的516bp的基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pcEmGFP-DEST的SalI/SacI酶切位点间插入了序列表中序列2第1到516位所示的ZmTrm2基因序列，证明质粒构建正确，将构建得到的重组质粒命名为pcEmGFP-DESTZmTrm2。
引物序列为：
F 5′-ATAGTCGACGGATGGCCTCCCGCCTCGCCG-3′，
R 5′-CGCGAGCTCTCACCTCCCACCAACGTACTTG-3′。
2、玉米原生质体的分离和转化
1)选取玉米综31幼苗第2片叶中间部分(6-8cm)切下，共用20片叶，并将其叠在一起切成0.5mm宽的条。
2)将切下的叶片放在15ml酶溶液(2×酶母液：1.2M mannitol(甘露(糖)醇)，20mM MES，pH 5.7)中真空抽气30min，然后在40rpm摇床中继续消化2h，这时酶溶液会变成黄色，表明原生质体基本释放完全，这时在80rpm摇床消化5min。
3)用35μm尼龙网过滤含原生质体的酶溶液到圆底离心管中，150g离心2min，沉淀原生质体，用W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl，2mM MES，pH5.7)洗涤1-2次。
4)离心，去上清，加入适量MMg溶液(0.6M mannitol，15mM MgCl2)悬浮，用血球计数板计数使原生质体浓度达到2×106/ml。
5)在离心管中分别加入待转化的质粒pcEmGFP-DESTZmTrm2 20μg，然后加入200μl原生质体，轻混，加入220μl PEG/Ca溶液(每10mlPEG/Ca溶液加入4g PEG4000(Fluka，Cat.81240)，3ml H2O，2.5ml1.2M mannitol，1ml 1M CaCl2)，用移液器吸打混匀，在室温放置10min。
6)加入800μl W5溶液，混匀，离心去上清。
7)加入1ml W5溶液，混匀，室温培养16h，激光共聚焦显微镜观察定位，结果如图2(图2中A为YFP荧光；B为明场；C为叶绿体自发荧光；D为前三者叠加效果)所示，从图中可见，ZmTrm2定位于叶绿体。
二、ZmTrm2在玉米植株上的瞬时沉默及其对SCMV侵染的影响
1、构建ZmTrm2瞬时沉默载体
以人工合成的序列表中序列2为模板，设计引物扩增ZmTrm2138bp序列，通过HindIII酶切PCR产物并回收138bp的基因片段，同时用HindIII酶切雀麦花叶病毒侵染性克隆载体BMVpF3-5/13’A/G(公众可从中国农业大学获得，记载过该载体的非专利文献是：Ding，X.S.，Schneider，W.L.，Chaluvadi，S.R.，Mian，M.A.R.，&Nelson，R.S.(2006). Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monoc
引物序列为：
F 5′-ACTAAGCTTTCGTGTGCCAGGCCCAG-3′，
R 5′-GTGAAGCTTTACACGGTCCACACCATG-3′。
2、在玉米植株上瞬时沉默ZmTrm2
1)利用雀麦花叶病毒侵染性克隆在玉米Va35(购自中国农业大学国家玉米改良中心)上瞬时沉默ZmTrm2。具体方法为：
体外转录模板的制备：
在体外转录之前，用SpeI线性化载体BMVF1-11、用PshAI线性化载体BMVF2-2(公众可从中国农业大学获得，记载过载体BMVF1-11和载体BMVF2-2的非专利文献是：Ding，X.S.，Schneider，W.L.，Chaluvadi，S.R.，Mian，M.A.R.，&Nelson，R.S.(2006).Characterization of a Brome mosaic virus strain and its use as a vector for gene silencing in monocotyledonous hosts.Molecular Plant-Microbe Interactions，19，1229-1239.)、用PshAI线性化重组载体pF3-5/13’A/G-ZmTrm2和用PshAI线性化载体BMVpF3-5/13’A/G。线性化后的质粒DNA用琼脂糖凝胶电泳分析线性化完全程度，确定线性化完全以后，用DNA回收试剂盒进行回收，测定DNA浓度，所有DNA浓度调整到500ng/μl。
体外转录：
以Spe I线性化的BMVF1-11为模板，进行体外转录，得到BMVF1-11体外转录产物；以PshA I线性化的BMVF2-2为模板，进行体外转录，得到BMVF2-2体外转录产物；以PshA I线性化的pF3-5/13’A/G-ZmTrm2为模板，进行体外转录，得到pF3-5/13’A/G-ZmTrm2体外转录产物；以PshA I线性化的BMVpF3-5/13’A/G为模板，进行体外转录，得到BMVpF3-5/13’A/G体外转录产物。体外转录体系参照
and RiboMAX(TM)In Vitro Transcription Systems(Promega，美国)，并进行修改，体外转录体系如下所示：
最后用无RNA酶的ddH2O补足20μl，在37℃反应1h。体外转录完成以后，取出1μl用琼脂糖凝胶电泳分析体外转录产率和体外转录物的降解情况。
将载体BMVF1-11、载体BMVF2-2和重组载体pF3-5/13’A/G-ZmTrm2三者的体外转录产物等量混匀后摩擦接种玉米Va35三叶期的第三片叶，即为沉默接种(C-BMVA/GTrm2)。将载体BMVF1-11、载体BMVF2-2和载体BMVpF3-5/13’A/G三者的体外转录产物等量混匀后摩擦接种玉米三叶期的第三片叶片，即为空载体对照接种(C-BMVA/G)；用无RNase的ddH2O接种的植株作为模拟接种(Mock)。
接种后将玉米植株在人工气候室中培养，培养条件为：23℃光照16h和21℃黑暗8h，培养10d。
2)在以上步骤1)接种的叶片上二次接种甘蔗花叶病毒，具体方法为：在步骤1)接种10d后，分别在沉默接种(C-BMVA/G Trm2)、空载体对照接种(C-BMVA/G)和模拟接种(Mock)的玉米叶片上等量接种(等量是指沉默接种、空载体对照以及模拟接种的叶片上接种的SCMV侵染的玉米汁液量是相等的)SCMV侵染的玉米汁液。接种方法为：将SCMV侵染的玉米汁液通过机械摩擦方式接种到三叶期玉米的第三片叶上，接种后将玉米植株放在人工气候室中培养，培养条件为：23℃光照16h和21℃黑暗8h。在接种8d左右时在接种叶上部新长出的系统叶片上出现花叶症状。
SCMV侵染的玉米汁液的制备方法如下：
从北京郊区显矮花叶症状的玉米叶片经鉴定为SCMV侵染后，通过机械摩擦方式接种到玉米(综31)植株上，保存在防虫温室中。接种的玉米植株发病后采上部花叶症状明显的幼嫩叶片，称取0.1g该幼嫩叶片，加入1ml接种缓冲液，充分研磨后转移到Eppendorf管中，4℃，5000g离心5min，取上清，即得到SCMV侵染的玉米汁液。
接种缓冲液的配制：将1.362g KH2PO4溶于1000ml蒸馏水中，再将1.781gNa2HPO4·2H2O溶于1000ml蒸馏水中，然后将490ml KH2PO4溶液和510mlNa2HPO4溶液混合，4℃保存备用。
3)二次接种5d后，提取第一片系统叶的总RNA，DNA酶处理后，回收总RNA，溶于20μl DEPC水中，利用微量分光光度计对总RNA进行定量，取1μg总RNA进行反转录反应，反转录产物进行半定量PCR。PCR条件为：94℃3min，94℃30s；58℃30s；72℃30s，72℃10min。
甘蔗花叶病毒检测的特异性引物为：
F 5’-GGCGAGACTCAGGAGAATACA-3’，
R 5’-ACACGCTACACCAGAAGACACT-3’。
通过半定量RT-PCR以Ubiquitin为内参检测ZmTrm2基因的沉默水平。
ZmTrm2基因的特异性引物：
5′-GCTAAACACCGACGAGAACC-3′，
5′-GCCCATCCTTGAATCCCT-3′；
Ubiquitin的特异性引物：
5′-GGAAAAACCATAACCCTGGA-3′，
5′-ATATGGAGAGAGGGCACCAG-3′。
结果如图3(图3中，Mock+SCMV代表二次接种后模拟接种的叶片上甘蔗花叶病毒的水平和ZmTrm2基因的水平；C-BMVA/G+SCMV代表二次接种后空载体对照接种的叶片上甘蔗花叶病毒的水平和ZmTrm2基因的水平；C-BMVA/G Trm2+SCMV代表二次接种后沉默接种的叶片上甘蔗花叶病毒的水平和ZmTrm2基因的水平)所示，从图3可见，沉默接种的玉米叶片中ZmTrm2部分沉默，同时其甘蔗花叶病毒SCMV的RNA水平要显著高于空载体对照接种和模拟接种。此结果表明，沉默ZmTrm2明显促进了甘蔗花叶病毒的复制。
三、ZmTrm2抑制烟草脉带花叶病毒的系统侵染
1、构建ZmTrm2表达载体
以人工合成的序列表中序列2为模板，设计引物扩增ZmTrm2基因全长阅读框，通过ClaI/SalI双酶切PCR产物，回收516bp的基因片段，同时用ClaI/SalI双酶切马铃薯X病毒侵染性克隆载体PVX(公众可从中国农业大学获得，记载过该载体的非专利文献是：Hong，Y.G.，Stanley，J.，van Wezel，R.(2003).Novel system for the simultaneous analysis of germinivirus DNA replication and plant interactions in Nicotiana benthamiana.Journal of Virology.77：13315-13322.)，回收载体大片段，将回收的6.5kb的载体片段与回收的516bp的基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体PVX的ClaI/SalI酶切位点间插入了序列表中序列2第1到516位所示的ZmTrm2基因序列，证明质粒构建正确，将构建的重组质粒命名为PVXZmTrm2。
引物序列为：
F 5′-ATAATCGATATGGCCTCCCGCCTCGCCG-3′，
R 5′-AGCGTCGACTCACCTCCCACCAACGTACTTG-3′。
2、过量表达ZmTrm2抑制烟草脉带花叶病毒的复制
1)利用马铃薯X病毒侵染性克隆在珊西烟(Nicotiana tabacum cv.Xanthi-nc)(购自北京菲尔曼生物技术有限公司，产品目录号为Xanthi-nc011)上表达ZmTrm2。以SpeI线性化重组载体PVXZmTrm2为模板，利用T7RNA聚合酶进行体外转录，取10μl体外转录产物接种五叶期烟草叶片，即为过表达接种(PVXTrm2)；同时，以SpeI线性化载体PVX为模板，利用T7RNA聚合酶进行体外转录，通过用载体PVX的体外转录产物接种烟草叶片，即为空载体对照接种(PVX)；用RNase-Free的ddH2O接种的植株作为模拟接种(Mock)。接种后将烟草植株在人工气候室中培养，培养条件为：23℃光照16h和21℃黑暗8h。
体外转录体系如下所示：
最后用无RNA酶的ddH2O补足20μl，在37℃反应1h。
在以上步骤1)接种叶片上二次接种烟草脉带花叶病毒(TVBMV)，具体方法为：在步骤1)接种5d后，分别在过表达接种(PVXTrm2)、空载体对照接种(PVX)和模拟接种(Mock)接种叶片上再等量摩擦接种烟草脉带花叶病毒侵染的烟草汁液。接种方法为：将TVBMV侵染的烟草汁液通过机械摩擦方式接种到五叶期期烟草叶上，接种后将烟草植株放在人工气候室中培养，培养条件为：23℃光照16h和21℃黑暗8h，
烟草脉带花叶病毒侵染的烟草汁液的制备方法如下：
用烟草脉带花叶病毒标样(购自北京菲尔曼生物技术有限公司，产品目录号为TVBMV-SD01)通过机械摩擦方式接种到珊西烟植株上，保存在防虫温室中。选取显镶脉和花叶症状明显的烟草植株，采上部症状明显的幼嫩叶片，称取0.1g该幼嫩叶片，加入1ml接种缓冲液(接种缓冲液的组成与上述实验二相同)，充分研磨后转移到Eppendorf管中，4℃，5000g离心5min，取上清，即得到烟草脉带花叶病毒侵染的烟草汁液。
2)在第二次接种3d后，提取接种叶片的总RNA，DNA酶处理后，回收总RNA，溶于20μl经DEPC处理的水中，利用微量分光光度计对总RNA进行定量，取1μg总RNA进行反转录反应，反转录产物进行半定量PCR。PCR条件为：94℃3min，94℃30s；58℃30s；72℃30s，72℃10min。
烟草脉带花叶病毒检测的特异性引物为：
F 5′CACTGCCACAGATGTCAATCG 3′，
R 5′CCAAGCGTCACCTACAAGAATAG 3′。
扩增Actin的特异性引物为：
F 5′GTGTTGGATTCTGGTGATGGTG 3′，
R 5′TGTCAAGCTCCTGCTCGTAGT 3′。
结果如图4(图4中，Mock代表二次接种后模拟接种的叶片上烟草脉带花叶病毒的病毒的水平；PVX代表二次接种后空载体对照接种的叶片上烟草脉带花叶病毒的病毒的水平；PVXTrm2代表二次接种后过表达接种的叶片上烟草脉带花叶病毒的水平)所示，从图4可见，过表达接种的烟草叶片中烟草脉带花叶病毒的水平显著低于空载体对照接种和模拟接种，此结果表明，ZmTrm2的瞬时表达抑制了烟草脉带花叶病毒的积累。
Claims (10)
1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与马铃薯Y病毒属病毒侵染有关的由(a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；
3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是在载体PVX或载体BMVpF3-5/13’A/G的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组载体。
6.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任一片段的引物对，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。
7.序列表中序列1所示的蛋白在抑制植物病毒复制或防治植物病毒病害中的应用。
8.序列表中序列1所示的蛋白的编码基因在抑制植物病毒复制或防治植物病毒病害中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；
3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。
9.含有序列表中序列1所示蛋白的编码基因的重组表达载体在抑制植物病毒复制或防治植物病毒病害中的应用。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于：
所述重组表达载体为在载体PVX的多克隆位点插入序列表中序列1所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体；
所述抑制植物病毒复制为抑制植物病毒在植物体中的复制；
所述植物病毒为马铃薯Y病毒属病毒；
所述病毒病害是由马铃薯Y病毒属病毒引起的病害；
所述马铃薯Y病毒属病毒为烟草脉带花叶病毒或甘蔗花叶病毒。
所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物为玉米；所述双子叶植物为烟草。
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